CN105725008A - 一种纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物及其制备方法和应用，该组合物为黄芪经粉碎成黄芪粉，经豆汁浸泡，添加葡萄糖和甜味剂，无机盐，灭菌后经纳豆枯草芽孢杆菌发酵处理，添加聚葡萄糖、低聚果糖浆，即得。该组合物可用于制备预防、辅助治疗心脑血管栓塞症，提高免疫功能，调节肠道菌群平衡，改善胃肠功能的保健品或饮品。本发明提高了黄芪的利用率，优化了工艺流程；制备的组合物口感较好，状态稳定，使黄芪的有效成分变为易于被肠道吸收的活性物质，提高了利用率，减少了人体肠道负担。

Description

一种纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物及其制备方法，属于功能性饮品领域。
背景技术
纳豆芽孢杆菌（Bacillusnatto）是具有耐酸、耐热特性的有益菌,在胃酸下四小时存活率为100%,同时具有强力的病原菌抑制能力,是各种益菌当中,对环境耐受力最好可以直达小肠的菌种之一,口服后可改变人体肠道菌丛生态,帮助消化道机能正常化,以使排便顺畅,维持体内生理环保。可以产酸，调节肠道菌群，增强动物细胞免疫放应，并能生成多种蛋白酶(特别是碱性蛋白酶)、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶等。纳豆芽孢杆菌在通过吞噬大豆蛋白来繁殖的时候,产生出的酵素纳豆激酶(Nattokinase，NK),具有神奇的药效,可以治疗三高(高血糖，高血压，高血脂)和溶解血栓的作用，而且还能产生出氨基酸的美味。
纳豆激酶(Nattokinase，NK)由食品纳豆中提取或纳豆芽孢杆菌发酵生产，是一种分子量远远小于UK、SK、纤溶酶原激活剂(t-PA)的蛋白质，并可由肠道吸收，纳豆激酶的体外、体内溶栓性质通过实验也已得到确定，同时得出纳豆激酶的体内溶栓活性为纤溶酶的四倍，在体内作用迅速、持续时间长，还能激活体内的tPA，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性。日本圣玛丽安娜医科大学疑难病治疗研究中心和日本生物科学研究所最发现，纳豆激酶有抑制血小板凝固的作用，有助于预防高血压和动脉硬化。因而，纳豆激酶成为一种新型的口服性溶血栓药物(第二代溶栓药)，在预防、治疗心脑血管栓塞症及栓塞性老年痴呆症等方面起到积极作用。
黄芪来源于豆科植物黄芪或内蒙黄芪的干燥根。是百姓经常食用的纯天然品，产于中国华北诸省。清朝绣宫内称其为“补气诸药之最”，民间也流传着“常喝黄芪汤，防病保健康”的顺口溜，意思是说经常用黄芪煎汤或用黄芪泡水代茶饮，具有良好的防病保健作用。自2002已是我国保健食品原料（卫法监发【2002】51号）。具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌的功效。用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，痈疽难溃，久溃不敛，血虚萎黄，内热消渴。《本经》记载：“主痈疽，久败疮，排脓止痛。补虚，小儿百病。”《日华子本草》记载：“助气壮筋骨，长肉补血。”
中国的药剂师在长达2000多年的历史中推断并将黄芪用作增进能力和抵抗疾病的良药，现代医学研究表明，黄芪含皂甙、蔗糖、多糖、多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素。有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用。能消除实验性肾炎蛋白尿，增强心肌收缩力，调节血糖含量。黄芪不仅能扩张冠状动脉，改善心肌供血，提高免疫功能，而且能够延缓细胞衰老的进程。
目前心脑血管疾病已成为严重危害人类健康的主要疾病之一，是中老年人的高发病。我国即将进入老龄化社会，心脑血管疾病的防治已迫在眉急。本饮品以保健食品黄芪为原料，利用现代生物技术，经纳豆芽孢杆菌发酵而成，在心脑血管疾病的预防及辅助治疗方面起着巨大积极作用，可满足消费者日益增长的需求，市场空间巨大。
发明内容
本发明一个目的在于提供一种纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物，所述的组合物为黄芪经粉碎成黄芪粉，经豆汁浸泡，添加葡萄糖和甜味剂，添加无机盐，灭菌后经纳豆枯草芽孢杆菌发酵处理，添加聚葡萄糖、低聚果糖浆，得到纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物。
所述的豆汁为豆粕高压提取液。
本发明的另一个目的在于提供一种纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物的制备方法。
制备方法包括以下步骤：
（1）种子培养基制备：种子液体培养基为LB培养基，其组成为蛋白胨10份、酵母提取物5份、氯化钠10份、蒸馏水1000份；种子固体培养基为在酪蛋白培养基，其组成为酪素5份、葡萄糖1份、酵母膏1份、磷酸氢二钾1份、磷酸二氢钾0.5份、硫酸镁0.1份、琼脂1.5份、蒸馏水1000份。
（2）原料处理：将干燥黄芪粉碎为细度为40-60目的黄芪粉。将豆粕加入蒸馏水中，115℃高压30分钟，离心取离心液，得到豆汁。
（3）发酵液制备：将黄芪粉用豆汁浸泡30分钟，添加葡萄糖和甜味剂，添加无机盐，调节pH7.2~7.4。将发酵液于115℃高压50分钟，得到无菌发酵液。
（4）菌种活化：于无菌环境下挑取一接种环纳豆芽孢杆菌CICC20637菌种，划线于种子固体培养基，35℃~40℃恒温培养15~24小时。挑取透明圈最大的单个菌落于种子液体培养基中，35℃-40℃恒温摇床培养12~20小时，得到第一代菌种；将第一代菌种按体积百分比为1%-2%接种于种子液体培养基中，于35℃-40℃恒温摇床培养12~20小时，得到第二代菌种。
（5）接种、发酵：当无菌发酵液温度降至39℃时，按体积百分比为1%~2%接种第二代菌种，于35℃-40℃恒温摇床培养72~120小时，pH6.5时结束发酵，得到纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪液。
（6）过滤、离心：将步骤（5）得到的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪液过管式离心机离心，得离心液。
（7）调配、灌装、灭菌：向步骤（6）得到的离心液中添加聚葡萄糖、低聚果糖浆G55L，搅匀溶解；于无菌条件下灌装，辐照灭菌，得到纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪饮品。
上述制备方法中，在步骤（2）中豆粕与蒸馏水的重量g/体积ml百分比为10-20%。
上述制备方法中，在步骤（3）中黄芪粉与豆汁的重量g/体积ml百分比为5~20%；葡萄糖加入量为重量g/体积ml百分比0.5~2%；所述的无机盐为K2HPO4·3H2O0.1g/100ml、KH2PO40.1g/100ml、MgSO4·7H2O10mg/100ml。
上述制备方法中，为了改善饮品的口感，在步骤（3）中调节pH值前还添加有甜味剂，所述的甜味剂为重量g/体积ml百分比为1~3%的蔗糖、重量g/体积ml百分比为0.004~0.008%的三氯蔗糖。
在步骤（7）中所述聚葡萄糖的重量g/体积ml百分比为1~5%、低聚果糖浆G55L的重量g/体积ml百分比为0.2~0.7%。
在步骤（7）中所述的辐照灭菌为60Co辐射剂量为10KGy。
上述制备方法中，在步骤（4）中所述的透明圈为纳豆枯草芽孢杆菌所产纳豆激酶将酪蛋白水解所致的特殊现象，透明圈的大小和纳豆激酶活力成正比。
本发明的再一个目的是该纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物在制备预防、辅助治疗心脑血管栓塞症，提高免疫功能，调节肠道菌群平衡，改善胃肠功能的保健品或饮品中的应用。
例如，可将本发明的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪或其上清液，按照已知的常规方法，添加一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性，并对基本活性成分表现有辅助或协同作用，但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他药物成份或其混合物，配制成适于口服给药的合剂、乳剂等。
也可将本发明的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪组合物通过适当的干燥方法，制得固体粉末，添加一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性，并对基本活性成分表现有辅助或协同作用，但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他药物成份或其混合物中，配制成适于口服给药的胶囊、片剂、颗粒剂等剂型的药物。
本发明具有以下优点：
1、本发明将黄芪直接加入到纳豆枯草芽孢杆菌发酵液中，经高压、高温提取其有效成分，带原料渣进行发酵，提高了黄芪的利用率，优化了工艺流程。
2、本发明模拟人体肠道环境，利用纳豆枯草芽孢杆菌进行发酵，使黄芪的有效成分变为易于被肠道吸收的活性物质，提高了利用率，减少了人体肠道负担。
3、利用黄芪为纳豆枯草芽孢杆菌生长提供充足的营养，纳豆枯草芽孢杆菌亦使黄芪的效用得到提高。
4、本组合物中加入不被人体吸收的水溶性膳食纤维聚葡萄糖和低聚果糖，口感较好，状态稳定，可极大地改善人体肠道环境。
5、本组合物未添加任何防腐剂，经无菌灌装、辐照灭菌，保质期长，饮用方便、安全。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1：
一种纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪饮品的制备，具体方法如下：
1）种子培养基制备：种子液体培养基为LB培养基，其组成为蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水1L；种子固体培养基为在酪蛋白培养基，其组成为酪素5g、葡萄糖1g、酵母膏1g、磷酸氢二钾1g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.1g、琼脂1.5g、蒸馏水1L。
（2）原料处理：将干燥黄芪粉碎为黄芪粉，细度为60目。将重量g/体积ml百分比为10%豆粕加入蒸馏水中，115℃高压30分钟，离心取离心液，得到豆汁。
（3）发酵液制备：取10000ml豆汁，将重量g/体积ml百分比为10%的黄芪粉用豆汁浸泡30分钟，加入重量g/体积ml百分比为0.5%的葡萄糖、重量g/体积ml百分比为2%的蔗糖、重量g/体积ml百分比为0.004%的三氯蔗糖、K2HPO4·3H2O0.1g/100ml、KH2PO40.1g/100ml、MgSO4·7H2O10mg/100ml，调节pH7.2。将发酵液于115℃高压50分钟，得到无菌发酵液。
（4）菌种活化：于无菌环境下挑取一接种环纳豆芽孢杆菌菌种，划线于种子固体培养基，37℃恒温培养20小时。挑取透明圈最大的单个菌落于种子液体培养基中，37℃恒温摇床培养18小时，得到第一代菌种。将第一代菌种按体积百分比为2%接种于种子液体培养基中，于37℃恒温摇床培养18小时，得到第二代菌种。
（5）接种、发酵：当无菌发酵液温度降至39℃左右时，按体积百分比为2%接种第二代菌种，于37℃恒温摇床培养72小时，pH6.5左右时结束发酵，得到纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪液。
（6）过滤、离心：将（5）中得到的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪液过管式离心机离心，得离心液。
（7）调配、灌装、灭菌：向步骤（6）中得到的离心液中添加重量g/体积ml百分比为5%的聚葡萄糖、重量g/体积ml百分比为0.5%的低聚果糖浆（G55L），搅匀溶解；于无菌条件下灌装，辐照灭菌得纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪饮品成品（规格为100ml/瓶）。检测此发酵组合物含有纳豆芽孢杆菌菌体数量、纳豆激酶活力、黄芪甲苷含量（见表1）。
实施例2：
一种纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪饮品的制备，具体方法如下：
1）种子培养基制备：种子液体培养基为LB培养基，其组成为蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水1L；种子固体培养基为在酪蛋白培养基，其组成为酪素5g、葡萄糖1g、酵母膏1g、磷酸氢二钾1g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.1g、琼脂1.5g、蒸馏水1L。
（2）原料处理：将干燥黄芪粉碎为黄芪粉，细度为50目。将重量g/体积ml百分比为15%豆粕加入蒸馏水中，115℃高压30分钟，离心取离心液，得到豆汁。
（3）发酵液制备：取10000ml豆汁，将重量g/体积ml百分比为15%的黄芪粉用豆汁浸泡30分钟，加入重量g/体积ml百分比为1.0%的葡萄糖、重量g/体积ml百分比为1.5%的蔗糖、重量g/体积ml百分比为0.006%的三氯蔗糖、K2HPO4·3H2O0.1g/100ml、KH2PO40.1g/100ml、MgSO4·7H2O10mg/100ml，调节pH7.3。将发酵液于115℃高压50分钟，得到无菌发酵液。
（4）菌种活化：于无菌环境下挑取一接种环纳豆芽孢杆菌菌种，画线于种子固体培养基，35℃恒温培养22小时。挑取透明圈最大的单个菌落于种子液体培养基中，35℃恒温摇床培养20小时，得到第一代菌种。将第一代菌种按体积百分比为2%接种于种子液体培养基中，于35℃恒温摇床培养20小时，得到第二代菌种。
（5）接种、发酵：当无菌发酵液温度降至39℃左右时，按体积百分比为1.5%接种第二代菌种，于35℃恒温摇床培养96小时，pH6.5左右时结束发酵，得到纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪液。
（6）过滤、离心：将（5）中得到的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪液过管式离心机离心，得离心液。
（7）调配、灌装、灭菌：向步骤（6）中得到的离心液中添加重量g/体积ml百分比为4%的聚葡萄糖、重量g/体积ml百分比为0.7%的低聚果糖浆（G55L），搅匀溶解；于无菌条件下灌装，辐照灭菌得纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪饮品成品（规格为100ml/瓶）。检测此发酵组合物含有纳豆芽孢杆菌菌体数量、纳豆激酶活力、黄芪甲苷含量（见表1）。
实施例3：
一种纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪饮品的制备，具体方法如下：
1）种子培养基制备：种子液体培养基为LB培养基，其组成为蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水1L；种子固体培养基为在酪蛋白培养基，其组成为酪素5g、葡萄糖1g、酵母膏1g、磷酸氢二钾1g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.1g、琼脂1.5g、蒸馏水1L。
（2）原料处理：将干燥黄芪粉碎为黄芪粉，细度为60目。将重量g/体积ml百分比为20%豆粕加入蒸馏水中，115℃高压30分钟，离心取离心液，得到豆汁。
（3）发酵液制备：取10000ml豆汁，将重量g/体积ml百分比为20%的黄芪粉用豆汁浸泡30分钟，加入重量g/体积ml百分比为1.5%的葡萄糖、重量g/体积ml百分比为3%的蔗糖、重量g/体积ml百分比为0.008%的三氯蔗糖、K2HPO4·3H2O0.1g/100ml、KH2PO40.1g/100ml、MgSO4·7H2O10mg/100ml，调节pH7.2。将发酵液于115℃高压50分钟，得到无菌发酵液。
（4）菌种活化：于无菌环境下挑取一接种环纳豆芽孢杆菌菌种，画线于种子固体培养基，40℃恒温培养16小时。挑取透明圈最大的单个菌落于种子液体培养基中，40℃恒温摇床培养15小时，得到第一代菌种。将第一代菌种按体积百分比为2%接种于种子液体培养基中，于40℃恒温摇床培养15小时，得到第二代菌种。
（5）接种、发酵：当无菌发酵液温度降至39℃左右时，按体积百分比为1%接种第二代菌种，于40℃恒温摇床培养72小时，pH6.5左右时结束发酵，得到纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪液。
（6）过滤、离心：将（5）中得到的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪液过管式离心机离心，得离心液。
（7）调配、灌装、灭菌：向步骤（6）中得到的离心液中添加重量g/体积ml百分比为5%的聚葡萄糖、重量g/体积ml百分比为0.6%的低聚果糖浆（G55L），搅匀溶解；于无菌条件下灌装，辐照灭菌得纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪饮品成品（规格为100ml/瓶）。检测此发酵组合物含有纳豆芽孢杆菌菌体数量、纳豆激酶活力、黄芪甲苷含量（见表1）。
对照例1：在制备方法（3）发酵液制备中不加入黄芪粉，其他步骤同实施例1。检测此发酵组合物含有纳豆芽孢杆菌菌体数量、纳豆激酶活力（见表1）。
对照例2：在制备方法（3）发酵液制备中以等量的蒸馏水代替豆汁，其他步骤同实施例1。检测此发酵组合物含有纳豆芽孢杆菌菌体数量、纳豆激酶活力、黄芪甲苷含量（见表1）。
对照例3：取与实施例1相同浓度的黄芪粉，以蒸馏水代替豆汁，只进行高压提取，不发酵。检测黄芪甲苷含量（见表1）。
上述菌体数量采用显微镜直接计数法；纳豆激酶活力测定采用《中国药典》2010年版，第二部，380页，尿激酶活力测定方法进行；黄芪甲苷含量测定采用《中国药典》2015年版，第一部，302页，黄芪药材中黄芪甲苷测定方法进行。
表1实施例中各指标测定结果
结果表明（表1）：由对照例1、对照例2与实施例1相比，单独以豆汁或黄芪粉为原料进行发酵，所得的各项指标均不如将豆汁和黄芪粉共发酵效果好；对照例3与实施例1相比，黄芪甲苷含量亦不如实施例1中黄芪粉经纳豆芽孢杆菌发酵后高。由此说明，纳豆芽孢杆菌与黄芪共发酵后，效价比均得到明显提高。

Claims (10)

1.一种纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物，其特征在于，所述的组合物为黄芪经粉碎成黄芪粉，经豆汁浸泡，添加葡萄糖和甜味剂，添加无机盐，灭菌后经纳豆枯草芽孢杆菌发酵处理，添加聚葡萄糖和低聚果糖浆，得到纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物；
所述的豆汁为豆粕高压提取液。
2.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物，其特征在于，黄芪粉与豆汁的重量g/体积ml百分比为5~20%。
3.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物，其特征在于，葡萄糖加入量为重量g/体积ml百分比为0.5~2%。
4.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物，其特征在于，所述的甜味剂为重量g/体积ml百分比为1~3%的蔗糖、重量g/体积ml百分比为0.004~0.008%的三氯蔗糖。
5.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物，其特征在于，所述的无机盐为K2HPO4·3H2O0.1g/100ml、KH2PO40.1g/100ml、MgSO4·7H2O10mg/100ml。
6.根据权利要求1所述的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物，其特征在于，所述聚葡萄糖的重量g/体积ml百分比为1~5%、低聚果糖浆G55L的重量g/体积ml百分比为0.2~0.7%。
7.权利要求1-6任一项所述的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）种子培养基制备：种子液体培养基为LB培养基，其组成为蛋白胨10份、酵母提取物5份、氯化钠10份、蒸馏水1000份；种子固体培养基为在酪蛋白培养基，其组成为酪素5份、葡萄糖1份、酵母膏1份、磷酸氢二钾1份、磷酸二氢钾0.5份、硫酸镁0.1份、琼脂1.5份、蒸馏水1000份；
（2）原料处理：将干燥黄芪粉碎为细度为40-60目的黄芪粉；将豆粕加入蒸馏水中，115℃高压30分钟，离心取离心液，得到豆汁；
（3）发酵液制备：将黄芪粉用豆汁浸泡30分钟，添加葡萄糖和甜味剂，添加无机盐，调节pH7.2~7.4；将发酵液于115℃高压50分钟，得到无菌发酵液；
（4）菌种活化：于无菌环境下挑取一接种环纳豆芽孢杆菌CICC20637菌种，划线于种子固体培养基，35℃~40℃恒温培养15~24小时；挑取透明圈最大的单个菌落于种子液体培养基中，35℃-40℃恒温摇床培养12~20小时，得到第一代菌种；将第一代菌种按体积百分比为1%-2%接种于种子液体培养基中，于35℃-40℃恒温摇床培养12~20小时，得到第二代菌种；
（5）接种、发酵：当无菌发酵液温度降至39℃时，按体积百分比为1%~2%接种第二代菌种，于35℃-40℃恒温摇床培养72~120小时，pH6.5时结束发酵，得到纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪液；
（6）过滤、离心：将步骤（5）得到的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪液过管式离心机离心，得离心液；
（7）调配、灌装、灭菌：向步骤（6）得到的离心液中添加聚葡萄糖、低聚果糖浆G55L，搅匀溶解；于无菌条件下灌装，辐照灭菌，得到纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪饮品。
8.根据权利要求7所述的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中豆粕与蒸馏水的重量g/体积ml百分比为10-20%。
9.根据权利要求7或8所述的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物的制备方法，其特征在于，步骤（7）中所述的辐照灭菌为60Co辐射剂量为10KGy。
10.权利要求1~6所述的纳豆枯草芽孢杆菌发酵黄芪的组合物在制备预防和辅助治疗心脑血管栓塞症、提高免疫功能、调节肠道菌群平衡、改善胃肠功能的保健品或饮品中的应用。
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