CN109805232A

CN109805232A - 大枣三段式益生菌发酵生产低酸度微生态食品

Info

Publication number: CN109805232A
Application number: CN201910155685.XA
Authority: CN
Inventors: 王海宽; 路福平; 郝忠超; 王伟
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-03-01
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2019-05-28

Abstract

本发明涉及微生物发酵应用领域，具体涉及一种利用大枣进行三段式益生菌发酵生产的低酸度微生态食品及其制备方法。本发明的主要内容是提供一种以大枣与大豆等农产品为原料，通过不同温度分段发酵来生产益生菌功能饮料、益生菌粉及微生态食品及其制备方法，旨在生产制备针对现代人肠道菌群紊乱、便秘、腹泻的益生菌功能饮料、益生菌粉及微生态辅助类食品，并为相关产品的生产研究提供思路。

Description

大枣三段式益生菌发酵生产低酸度微生态食品

技术领域：

本发明涉及微生物发酵应用领域，具体涉及一种利用大枣进行三段式益生菌发酵生产的低酸度微生态食品及其制备方法。

背景技术：

随着科学技术的飞速发展，人们的生活节奏不断加快，现代人的生活压力也随之不断增加，长期的快节奏生活规律、不健康的饮食习惯和抗生素的使用泛滥导致很多人体内肠道微生物稳态遭到不同程度的破坏，以往研究已经证实：肠道微生态的破坏会导致机体免疫力的下降、肠道菌群紊乱(具体表现为便秘腹泻肠鸣等症状)以及糖尿病等现代富贵病的发生，并且最近研究表明肠道微生物稳态的失调还会引起人社交障碍，甚至导致人罹患慢性抑郁症。肠道微生物稳态对人体健康影响的研究是当今科学家们研究的热点之一，对于治疗由肠道微生物稳态失调引起的便秘、间歇性腹泻及肠鸣等肠道菌群紊乱症状，一般是口服微生态制剂、抗生素、以及摄入寡聚糖来进行缓解与治疗，但这些治疗方式具有一定局限性，因此，含有益生菌活菌的益生菌微生态食品越来越受人们关注。

大枣是一种营养丰富的干果，既是一种常见食品，又是一味具保健功效的中药材，古代中医认为大枣味甘、性温、无毒、入心、脾、胃经，有补血益气、健胃益脾，通九窍，润肤养颜，延年养生之功效。现代科学研究证实大枣果体内含有大量果糖、葡萄糖，以及丰富的维生素、环磷酸腺、苷环磷酸鸟苷，还有一定的果酸、膳食纤维、多糖和寡聚糖等，具有促进肠道蠕动，提供肠道微生物生长所需的多种寡糖等功效，是一种发展潜力极大的低脂类健康食品。

大豆也具有很高的营养价值，首先大豆脂肪里含有很多不饱和脂肪酸，容易被人体消化吸收，而且大豆脂肪可以阻止胆固醇的吸收，所以对于动脉硬化患者来说，大豆是一种理想的营养品，除此之外大豆还富含可促进肠道益生菌生长的水苏糖，棉籽糖等低聚糖，可有效促进肠道内益生菌的生长繁殖；豆渣中的膳食纤维则可以促进食物的消化和固体废物的排泄，它可使肠道中的食物增大变软，促进肠道蠕动，加快排便速度，防止便秘和降低肠癌的风险。同时，大豆中的膳食纤维具有明显的降低血浆胆固醇、调节胃肠功能及胰岛素水平等功能。

益生菌是一类通过改善肠道微生态环境从而对宿主产生有益影响的微生物。它可以通过参与肠道微生态平衡来抑制有害病原菌的生长，降低肠道被有害微生物感染的几率，提高机体免疫力，从而避免了抗生素的滥用，减少了耐药性细菌的产生和肠道多重感染的发生，因此，益生菌制剂及益生菌产品近年来备受人们追捧。本产品主要使用的凝结芽孢杆菌是一种典型益生菌，它可以在人体肠道内发酵产生乳酸，具有抑制有害菌群生长而维持肠道微生物稳态的作用。

传统的发酵饮料多以动物乳液为基质，补充糖分后接入益生菌进行发酵生产，而以大枣打浆混入部分大豆粉后进行益生菌分段发酵来生产益生菌功能饮料及益生菌制剂鲜有报道。

发明内容：

本发明的主要内容是提供一种以大枣与大豆等农产品为原料，通过不同温度分段发酵来生产益生菌功能饮料、益生菌粉及微生态食品及其制备方法，旨在生产制备针对现代人肠道菌群紊乱、便秘、腹泻的益生菌功能饮料、益生菌粉及微生态食品，并为相关产品的生产研究提供思路。

本发明的技术方案概述如下：

本发明提供更多技术方案一，是一种大枣益生菌混菌发酵饮料，是将大枣浸泡打浆后获得的枣浆，与大豆粉混合后，采用凝结芽孢杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳酸杆菌和青春双歧杆菌进行混菌分段发酵，再将发酵所得的发酵液上清经调制所得。具体制备方法如下：

1)将去核后的大枣与15℃-25℃的饮用水按质量比1:5-7的比例混合，浸泡 2-3h；

2)将浸泡后的大枣及浸泡液共同加入到打浆机后进行打浆得到大枣浆，

3)在大枣浆中加入其质量0-0.1％的果胶酶处理50-70min，ph自然；

4)将所得大枣浆中加入大豆粉，每1L大枣浆加入100-150g大豆粉与 0.1-0.3％(质量体积比)的食用级碳酸钙混匀，然后进行灭菌制得液态发酵培养基，灭菌条件为：115℃，20min；

5)对于所得大枣灭菌发酵基质，利用三段式发酵进行，第一段发酵首先将凝结芽孢杆菌种子液按接种量为10⁶-10⁸CFU/mL接入，35℃-40℃密闭发酵 12-38h，然后进行第二段混菌发酵，将其他益生菌种子液按动物双歧杆菌 10⁶-10⁷CFU/mL，植物乳杆菌10⁶-10⁷CFU/mL，副干酪乳杆菌10⁶-10⁷CFU/mL，青春双歧杆菌10⁶-10⁷CFU/mL的接种量接种于发酵培养基中，36-40℃密闭发酵12-24h，第三段发酵则采用将温度降低至25℃进行有氧低温发酵，促进凝结芽孢杆菌芽孢的形成，发酵时间为24-36h，通气量为2-3:1(V/V·min)。

6)发酵结束后，发酵液经过离心、调制后即得大枣益生菌微生态饮料。

所述离心条件为：碟片式离心机10000r/min，5-8min；

进一步地，所述大枣益生菌饮料调制过程中添加有稳定剂，所述稳定剂为大豆低聚糖，添加量为0.1％-0.4％，优选0.3％；

优选的，浸泡大枣所用温水温度为20℃；浸泡时间为3h；大枣与所用温水的质量比为1:6；

优选地，所述果胶酶最佳添加比例为0.1％；

优选的，所述发酵液中大枣浆中大豆粉的添加量为150g；

优选的，液态分段发酵温度分别为37℃、37℃与25℃。

优选的，大枣浆与大豆粉混合液液态发酵中，凝结芽孢杆菌发酵时间为24h，混菌发酵时间为12h，25℃后发酵时间为24h；

优选的，所述动物双歧杆菌单菌接种量为5.0×10⁷CFU/mL、植物乳杆菌单菌 5.0×10⁷CFU/mL、副干酪乳杆菌单菌5.0×10⁷CFU/mL、青春双歧杆菌单菌5.0×10⁷CFU/mL、凝结芽孢杆菌单菌的接种量为5.0×10⁷CFU/mL；

优选的，有氧发酵中凝结芽孢杆菌发酵时通气量为2.5:1(V/V·min)；

优选的，调制过程中，添加0.03％大枣香精，0.3％大豆低聚糖，2％的菊粉用作保护剂。

优选的，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33,保藏编号为：CGMCC No.5233；

优选的，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)937，保藏编号为CGMCC No.11892；

优选的，所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501，保藏编号为CGMCC No.13130；

优选的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TK9，保藏编号为CGMCC No.11891；

优选的，所述青春双歧杆菌杆菌为青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)TK99，保藏编号为CGMCC No.12784。

本发明还提供一种益生菌制剂，是将上述技术方案一中发酵液离心后所得不溶性沉淀经真空冷冻干燥并添加保护剂后制备而成；

进一步地，真空冷冻条件为：-30℃～-40℃预冻5-8h，然后再真空度为1-8Pa 条件下进行真空冷冻干燥；优选-40℃预冷6h，真空条件为3Pa冷冻干燥24h。

进一步地，所述保护剂为菊粉与脱脂奶粉，菊粉添加量为5％-15％，优选10％；脱脂奶粉添加量为3％-10％，优选5％。

本发明同时提供一种益生菌固态发酵制作的微生态食品及其制备方法，包括如下步骤：将新鲜大枣粉与大豆粉混合后接入凝结芽孢杆菌进行固态发酵后，再接入动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌进一步混菌发酵，发酵后固态基质混入燕麦葡聚糖，真空冷冻干燥后粉碎、成型后得到微生态食品；

具体制备方法包括如下步骤：

(1)制备固态发酵培养基：制备新鲜大枣粉，加入其重量的10％-40％的大豆粉混合均匀，并添加1％-2％(质量比)的菊粉与0.2％(质量比)的食用级碳酸钙得混合料，最后按照混合料与饮用水1-2:1的比例(m:V)混合制得固态发酵培养基，并在121℃，20min的条件灭菌；

(2)固态发酵：将活化好的种子液接入固态发酵培养基中，每克固态培养基接入凝结芽孢杆菌单菌种子液，凝结芽孢杆菌的接种量为10⁶-10⁸CFU/g，固态密闭发酵12-48h，温度为37℃，pH自然，然后接入混菌发酵，其中动物双歧杆菌，的接种量为10⁶-10⁷CFU/g，植物乳杆菌单菌的接种量为10⁶-10⁷CFU/g，副干酪乳杆菌单菌的接种量为10⁶-10⁷CFU/g，青春双歧杆菌的接种量为 10⁵-10⁶CFU/g，接种后的固态发酵基质进行37-38℃固态密闭发酵12-24h，然后进行25℃低温有氧固态发酵12-48h，通气量为2-3:1(V/V·min)。

(3)发酵结束后，将燕麦葡聚糖按50g/kg发酵基质比例混入混匀，然后在 -30～-40℃条件下预冷6h-7h后，在真空冷冻干燥机内冷冻干燥至含水量不高于 5％-10％，经粉碎、成型后制得微生态食品。

所述大豆粉，燕麦葡聚糖等均为市售，或经粉碎后，过100目筛；

优选的，所用新鲜大枣粉为新鲜红枣去核后于40℃烘干60h后经粉碎机粉碎后过60目筛；优选的，所述固态发酵中大枣渣与大豆粉质量之比为3:1；

优选的，所述固态发酵中混合料：水＝2：1；

优选的，动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和凝结芽孢杆菌的接种量为5.0×10⁷CFU/g。

优选的，凝结芽孢杆菌固态发酵时间为24h；

优选地，所述通气量为2.5:1(V/V·min)。

优选的，所述固态发酵真空冷冻干燥条件为-40℃预冻6.5h后进行真空冷冻干燥，至含水量不大于7％。

优选的，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33,保藏编号为CGMCC No.5233；

优选的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TK9,保藏编号为CGMCC No11891；

优选的，所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501，保藏编号为：CGMCC No.13130；

有益效果：

本发明采用凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和动物双歧杆菌对大枣浆及大枣渣混合大豆粉进行分段式发酵，所用的原材料都富含膳食纤维及适合肠道微生物生长所需的营养物质，经过液态发酵与固态发酵生产出富含益生菌群及膳食纤维的益生菌饮料、益生菌活菌制剂及微生态食品。其中膳食纤维可以促进肠道蠕动，增加饱腹感，降低糖类脂类的吸收，还可以有效缓解便秘，消化不良等现象。而其中的益生菌群则可以调节和维持益生菌稳态，维持肠道健康，有效缓解腹泻便秘肠鸣等肠道菌群紊乱症状，另外，本发明中益生菌制剂与微生态食品含有可供肠道细菌消化代谢的低聚糖，可以促进肠道pH值维持较低状态，有利于肠道益生菌增殖，保持肠道益生菌群稳态，防止肠道疾病的发生。

传统的乳酸菌发酵食品乳酸含量高，对于一些胃功能不好的人群有很强的胃部刺激作用，而本发明采用食品级碳酸钙对产品中的乳酸进行了中和，形成了一种钙元素含量高，酸度较低的乳酸菌发酵微生态食品。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案来具体阐述本发明的目的，技术方案及优点，除非特别注明，本发明中所用的技术手段均为当前在该领域公开的方法，以下结合表格及实施例，对本发明进行具体说明。应当注意，以下所描写具体实施例仅仅解释说明本发明，但本发明并非局限于以下实施例，对本领域技术人员而言，在以本发明的基础上，对下列实施例中的原料及其含量等具体参数进行各种修改或变动也属于本发明的保护范围。

在以下实施例中涉及到的百分号“％”若未特别说明，具体指物料质量百分比，溶液浓度百分比指每100mL溶液中所含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。实施方案中所涉及到的质量体积比“W/V”或“m/V”，若未特别注明，单位均为g/mL；质量比为“m/m”。

以下实施例所采用的菌种活化方法均如下：

(1)配制活化培养基：每100ml水中添加4g大豆粉，得活化培养基；对活化培养基进行灭菌，条件为，121℃，20min；

(2)菌种活化：凝结芽孢杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌和青春双歧杆菌的菌种保藏甘油管分别按1％(v/v活化培养基的体积比)接种于活化培养基进行活化，pH＝6.8-7.4，控制温度为37℃；分别活化20-24h后，按10％(v/v)的接菌量再次转接活化培养基进行二次活化，活化24h后得二级种子液，用于后续发酵。

以下实施例将以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TK9、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)937、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)TK99、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33为例对本发明进行说明，以上选用的菌种应理解为示例性的而非具体限定，本发明方法对于目前已知的具有相同功能的同种属的菌株均适用。

其中，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TK9，该菌株已于2015年12 月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.11891；此株植物乳杆菌具有广泛的抗真菌性，不需要添加额外的防腐剂，也可以延长饮料和食品保藏时间；

其中，动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)937，该菌株已于2015年 12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.11892；

其中，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501，该菌株已于2016年 10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.13130；

其中，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)TK99，该菌株已于2016 年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.12784；

其中，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33，该菌株已于2011年9月9 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为 CGMCC No.5233；此株凝结芽孢杆菌具有较好的抗胃酸、抗胆盐的能力，在pH 为3时2h存活率88.03％，0.3％胆盐4h存活率81.06％，并且在肠道中具有协调双歧杆菌稳定生长的作用。

以下将结合具体实施方式对本发明进行阐述说明。

实施例1：一种大枣发酵益生菌饮料及益生菌活菌制剂

一种大枣发酵益生菌饮料及益生菌活菌制剂，制备方法具体如下：

(1)购买市售脱脂大豆粉备用。

(2)配制发酵培养基：挑选无虫眼，无霉变及其他病害的大枣洗净、去核；将去核后的大枣与20℃的饮用水按质量比1:6的比例混合，浸泡3h；将浸泡后的大枣及浸泡液共同加入到打浆机后进行打浆得到大枣浆，打浆条件为700转每分钟，然后加入其质量的0.05％果胶酶处理65min，ph自然；将所得大枣浆中加入大豆粉，每1L大枣浆加入150g大豆粉与3g食用级碳酸钙混合均匀，混合均匀后进行灭菌制得液态发酵培养基，灭菌条件为：115℃，20min。

(3)益生菌三段发酵：将凝结芽孢杆菌TQ33种子液按接种量为 5×10⁷CFU/mL接种于发酵培养基中，37℃密闭发酵24h，然后将动物双歧杆菌 937、植物乳杆菌TK9、副干酪乳杆菌T1501、青春双歧杆菌TK99种子液均按照5×10⁷CFU/mL接种量接种于发酵罐中，37℃密闭发酵12h；之后将温度降低至25℃进行低温有氧发酵，发酵时间为24h，通气量为2.5:1(V/V·min)。

(4)发酵结束后，发酵液经过碟片式离心机10000r/min，5min离心，上清液加0.03％大枣食用香精，0.3％的大豆低聚糖、2％菊粉、匀质、罐装后即得大枣益生菌饮料。

离心所得不溶性沉淀在-40℃预冻6h，然后在真空度为3Pa条件下进行真空冷冻干燥24h，最后添加10％的菊粉和5％脱脂奶粉作为保护剂，制成益生菌制剂。

(5)测定上述制备过程各阶段中主要营养物质及不同活性物质的变化(可溶性膳食纤维、可溶性多糖、可溶性钙盐、维生素C，皂苷类物质)。

其中，采用苯酚硫酸法测定发酵基质中大枣多糖的含量，采用高效液相法测定可溶性多糖、维生素C的含量，采用紫外-可见光分光光度法测定黄酮类物质的含量，采用原子分光光度法测定钙盐含量，结果见下表。

表1大枣浆混合大豆粉益生菌发酵过程中部分营养物质与活性成分含量的变化

其中，编号表示内容：1.大枣浆混合大豆粉未接入益生菌发酵；2.接入凝结芽孢杆菌密闭发酵24h后；3.接入混菌发酵12h后；4.25℃有氧发酵24h后；5.离心所得上清经过复配制成成品后。

由以上数据可知，大枣浆混合大豆粉液态发酵后可溶性膳食纤维与低聚糖的含量有所增加，可溶性膳食纤维的存在可以促进肠道蠕动，提高食物消化率，但阻遏脂肪的吸收，具有润肠通便吸附毒素的功效，低聚糖的增加则有利于肠道益生菌的生长增殖。同时，随着凝结芽孢杆菌产乳酸量的增加，发酵液中的可溶性钙盐含量也在不断提升，可以在促进肠道微生态稳定的同时为机体提供丰富钙元素来源，降低微生态饮料中乳酸的含量，乳酸含量的降低可减少对胃肠功能较差人群胃部的刺激作用。而低温通气发酵促生的凝结芽孢杆菌芽孢具有很强的抗逆性，它可以穿过人体消化道而进入肠道萌发，发挥益生菌协同作用，达到维护肠道微生态稳定的效果。

实施例2 一种大枣发酵益生菌饮料及益生菌活菌制剂

具体制备方法如下：

1)将去核后的大枣与15℃的饮用水按质量比1:5的比例混合，浸泡2h；

2)将浸泡后的大枣及浸泡液共同加入到打浆机后进行打浆得到大枣浆，打浆条件为700转每分钟；

3)将所得大枣浆中加入大豆粉，每1L大枣浆加入100g大豆粉与1g的食用级碳酸钙混匀，然后进行灭菌制得液态发酵培养基，灭菌条件为：115℃，20min；

4)对于所得大枣灭菌发酵基质，利用三段式发酵进行，第一段发酵首先将凝结芽孢杆菌种子液按接种量为2×10⁶CFU/mL接入，35℃密闭发酵12h，然后进行第二段混菌发酵，将其他益生菌种子液按动物双歧杆菌2×10⁶CFU/mL，植物乳杆菌2×10⁶CFU/mL，副干酪乳杆菌2×10⁶CFU/mL，青春双歧杆菌 2×10⁶CFU/mL的接种量接种于发酵培养基中，36℃密闭发酵20h；第三段发酵则采用将温度降低至25℃进行有氧低温发酵，促进凝结芽孢杆菌芽孢的形成，发酵时间为30h，通气量为2:1(V/V·min)。

5)发酵结束后，发酵液经过碟片式离心机10000r/min，5min离心，上清液加0.03％大枣食用香精，0.3％的大豆低聚糖、2％菊粉、匀质、罐装后即得大枣益生菌饮料。

离心所得不溶性沉淀在-30℃预冻8h，然后在真空度为1Pa条件下进行真空冷冻干燥24h，最后添加10％的菊粉和3％脱脂奶粉作为保护剂，制成益生菌制剂。

实施例3 一种大枣发酵益生菌饮料及益生菌活菌制剂

具体制备方法如下：

1)将去核后的大枣与25℃的饮用水按质量比1:7的比例混合，浸泡2.5h；

3)然后加入其质量的0.1％果胶酶处理50min，ph自然；

4)将所得大枣浆中加入大豆粉，每1L大枣浆加入100g大豆粉与2g的食用级碳酸钙混匀，然后进行灭菌制得液态发酵培养基，灭菌条件为：115℃，20min；

5)对于所得大枣灭菌发酵基质，利用三段式发酵进行，第一段发酵首先将凝结芽孢杆菌种子液按接种量为1×10⁸CFU/mL接入，40℃密闭发酵38h，然后进行第二段混菌发酵，将其他益生菌种子液按动物双歧杆菌1×10⁷CFU/mL，植物乳杆菌1×10⁷CFU/mL，副干酪乳杆菌1×10⁷CFU/mL，青春双歧杆菌 1×10⁷CFU/mL的接种量接种于发酵培养基中，40℃密闭发酵24h；第三段发酵则采用将温度降低至25℃进行有氧低温发酵，促进凝结芽孢杆菌芽孢的形成，发酵时间为36h，通气量为3:1(V/V·min)。

6)发酵结束后，发酵液经过碟片式离心机10000r/min，7min离心，上清液加0.03％大枣食用香精，0.3％的大豆低聚糖、2％菊粉、匀质、罐装后即得大枣益生菌饮料。

离心所得不溶性沉淀在-35℃预冻6h，然后在真空度为5Pa条件下进行真空冷冻干燥24h，最后添加10％的菊粉与5％的脱脂奶粉作为保护剂，制成益生菌制剂。

实施例4：一种益生菌固态发酵制作微生态食品

一种益生菌固态发酵制作的微生态食品，具体步骤如下：

(1)制备固态发酵培养基：新鲜红枣去核后于40℃烘干60h后经粉碎机粉碎后过60目筛制备新鲜大枣粉；然后在大枣粉中加入其重量的三分之一的大豆粉、1％的菊粉、0.2％食品级碳酸钙，将以上混合料与水按质量体积比2:1的比例混合制得固态发酵培养基，并在121℃，20min的条件下对该固态培养基进行灭菌。

(2)固态发酵：将活化好的种子液接入固态发酵培养基中，每克固态培养基接入凝结芽孢杆菌，接种量为5.0×10⁷CFU/g，固态密闭发酵24h，温度37℃， pH自然，后接入动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌以及青春双歧杆菌，接种量均为5.0×10⁷CFU/g，接种后的固态发酵基质进行37℃固态密闭发酵12h，然后进行25℃低温通气有氧固态发酵24h，通气量为2.5:1(V/V·min)。

(3)发酵结束后，按50g/kg发酵基质比例混入燕麦葡聚糖混匀，然后在-40 条件下预冷6.5h后，在真空冷冻干燥机内冷冻干燥至含水量不高于7％，经粉碎、成型后制得微生态食品。

(4)上述大枣渣混合大豆粉固态发酵中部分成分含量的变化(不溶性膳食纤维，可溶性多糖，黄酮类，皂苷类，维生素A)，采用酶重量法对不溶性膳食纤维进行测定，可溶性多糖用苯酚硫酸比色法进行测定，黄酮类、皂苷类以及维生素A采用高效液相色谱进行测定。测定结果如下表：

表格2大枣渣混合大豆粉固态发酵中部分成分含量的变化

各序号所代表不同时期：1-大枣渣混入大豆粉后未接菌；2-接入凝结芽孢杆菌TQ33后发酵24小时后的固态培养基。3-动物双歧杆菌937、副干酪乳杆菌TK1501、植物乳杆菌TK9、青春双歧杆菌TK99混菌发酵12h后发酵基质；4-低温通气有氧发酵24h后。

由上表数据可知，益生菌的接入会使得部分不溶性膳食纤维水解为可溶性的多糖，可溶性多糖的增多有利于固态基质中或肠道微生物的繁殖，有利于人体肠道健康和提高机体免疫力。钙含量的增加代表着发酵基质中酸含量的减少，酸含量的降低有利于对胃不好人群胃部的保护。

实施例5 一种益生菌固态发酵制作微生态食品

一种益生菌固态发酵制作的微生态食品，具体步骤如下：

(1)制备固态发酵培养基：新鲜红枣去核后于40℃烘干60h后经粉碎机粉碎后过60目筛制备新鲜大枣粉，在大枣粉中加入其重量的10％的大豆粉、1％的菊粉、0.2％食品级碳酸钙，将以上混合料与水按质量体积比1:1的比例混合制得固态发酵培养基，并在121℃，20min的条件下对该固态培养基进行灭菌。

(2)固态发酵：将活化好的种子液接入固态发酵培养基中，每克固态培养基接入凝结芽孢杆菌，接种量为1.0×10⁶CFU/g，固态密闭发酵12h，温度37℃， pH自然，后接入动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌以及青春双歧杆菌，接种量均为1.0×10⁶CFU/g，接种后的固态发酵基质进行37℃固态密闭发酵15h，然后进行25℃低温通气有氧固态发酵12h，通气量为2:1(V/V·min)。

(3)发酵结束后，按50g/kg发酵基质比例混入燕麦葡聚糖混匀，然后在-30 条件下预冷7h后，在真空冷冻干燥机内冷冻干燥至含水量不高于10％，经粉碎、成型后制得微生态食品。

实施例6 一种益生菌固态发酵制作微生态食品

一种益生菌固态发酵制作的微生态食品，具体步骤如下：

(1)制备固态发酵培养基：新鲜红枣去核后于40℃烘干60h后经粉碎机粉碎后过60目筛制备新鲜大枣粉，在大枣粉中，加入其重量的40％的大豆粉、2％的菊粉、0.2％食品级碳酸钙，按以上混合料与水按质量体积比1.5:1的比例混合制得固态发酵培养基，并在121℃，20min的条件下对该固态培养基进行灭菌。

(2)固态发酵：将活化好的种子液接入固态发酵培养基中，每克固态培养基接入凝结芽孢杆菌，接种量为1.0×10⁸CFU/g，固态密闭发酵48h，温度37℃， pH自然，后接入动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌以及青春双歧杆菌，接种量均为1.0×10⁷CFU/g，接种后的固态发酵基质进行38℃固态密闭发酵24h，然后进行25℃低温通气有氧固态发酵48h，通气量为3:1(V/V·min)。

(3)发酵结束后，按50g/kg发酵基质比例混入燕麦葡聚糖混匀，然后在-40 条件下预冷7h后，在真空冷冻干燥机内冷冻干燥至含水量不高于5％，经粉碎、成型后制得微生态食品。

实施例7：微生态食品对小鼠肠道细菌的影响

(1)实验动物及分组，选用90只健康昆明种小鼠，随机分为5组，每组18 只。

(2)灌胃微生态食品：第1、2实验组每天通过灌胃给予本发明实施例4所提供的微生态食品与生理盐水(1：1质量比)混合液0.5g/kg、1g/kg。第3、4 实验组则每天分别给予第1、2组相同量的燕麦葡聚糖生理盐水(1:1质量比)混合液，第5小组作为空白对照组，每天灌胃0.2ml的生理盐水。各实验组小鼠均自由取食与饮水，灌胃期28天。

(3)样本的获取与活菌的计数：分别于实验的14天、28天及灌胃完成后一星期(35天)各组取6只小鼠以颈部脱臼处死，在无菌条件下称取其直肠内容物0.1g左右，用无菌生理盐水进行梯度稀释，并取合适梯度在选择性培养基上对大肠杆菌、动物双歧杆菌937、肠道乳酸菌、凝结芽孢杆菌TQ33进行培养，每个梯度做2-3个平行。活菌计数结果如下表：

表3微生态食品对小鼠肠道微生物的影响(CFU/g，数量级10⁶)

菌种及编号：1号为大肠杆菌总菌，2号为双歧杆菌，3号为肠道乳酸菌总菌，4号凝结芽孢杆菌TQ33单菌。

由上表数据可知，采取实施例4制备的微生态食品可以有效改善小鼠肠道内微生物组成比例，促进益生菌的增殖，同时可以提供不易定殖于肠道的凝结芽孢杆菌，促进肠道益生菌稳态与健康。

实施例8：大枣益生菌功能性饮料、益生菌制剂及微生态食品对抗生素诱导的肠道菌群紊乱模型小鼠的影响

(1)模型小鼠的建立，以32只昆明种小鼠为模型小鼠，在适应性饲养7d 后，随机取出4只组成空白对照组，编号为1，剩余小鼠用100mg/mL的头孢曲松钠灌胃，空白对照组用生理盐水灌胃，每次每只灌胃0.2mL，每天两次，连续灌胃8d，建立肠道菌群紊乱昆明种小鼠模型后，随机将剩余小鼠分为7小组，每组四只，编号2-8，取各组建模成功后的小鼠粪便。第2小组小鼠作为模型空白对照组，每天灌胃0.2ml生理盐水，3，4小组小鼠分别每天灌胃2mL/kg， 4.5mL/kg实施例1所得大枣益生菌功能饮料，5，6小组小鼠分别每天灌胃2g/kg， 4.5g/kg实施例1所得益生菌粉，7，8小组每天灌胃2.0g/kg，4.5g/kg实施例4 所得微生态食品，连续灌胃两周，并于灌胃第一、二周后收集各组小鼠粪便。

(2)小鼠粪便中各种活菌的计数，将无菌操作获取的小鼠粪便用无菌生理盐水稀释一定梯度，取合适梯度分别用选择性培养基培养24h后对粪便中的1 号大肠杆菌总菌数，2号双歧杆菌总菌数，3号乳酸菌总菌数及4凝结芽孢杆菌 TQ33单菌数进行计数。计数结果如下表：

表4大枣发酵益生菌制品对肠道微生物紊乱模型小鼠肠道活菌数的影响(logCFU/g)

大枣益生菌发酵功能饮料、益生菌粉及大枣发酵微生态食品含有丰富的益生菌活菌，对肠道微生物紊乱的恢复都具有一定的辅助性作用，其中尤以微生态食品最佳。除此之外，它们还可以提供肠道非固定微生物凝结芽孢杆菌，加快肠道益生菌的繁殖，从而尽快恢复肠道微生物微生态平衡。

实施例9大枣益生菌发酵功能饮料与大枣发酵微生态食品对脾胃虚寒导致的腹泻模型大鼠的影响。

中医理论中脾胃虚寒是指脾胃阳气虚衰，阴寒内盛所表现的证候。包括脾阳虚和胃阳虚(亦有认为单指脾阳虚)，多因饮食失调、过食生冷、劳倦过度、或久病或忧思伤脾等所致，主要表现症状为“泄泻”、“腹痛”、“便秘”，常伴随腹泻与便秘交替症状。

本实验的目的旨在通过给脾胃虚寒模型大鼠灌胃大枣益生菌发酵功能饮料与大枣固态发酵微生态食品来提供一种具有健脾养胃功效的大枣益生菌发酵复合物。

(1)模型大鼠的建立，参考谢建群、陆雄等人的方法，购养Waster大鼠24 只，适应性饲养7天后，随机取大鼠四只组成空白对照组，剩余大鼠采用给灌胃番泻叶煎剂的方式来建立模型大鼠，主要过程为以水煎的方式制备浓度约为 0.3g/mL的番泻叶煎剂，每日每只灌胃3mL番泻叶水煎剂，灌胃1个小时后将大鼠丢入水中任其游泳，直到在水中不动为止，如此2周。与此同时空白组灌胃等量饮用水。

(2)实验分组及灌胃数量，将剩余20只大鼠随机分为5组，编号1-5，空白对照组编号为6。5号设为模型组，1-2组大鼠每日分别灌胃3mL实施例1所得大枣益生菌功能饮料、饮用水混合液(第一组含1.5mL大枣益生菌发酵功能饮料，第二组含3ml大枣益生菌功能饮料)，第3-4组大鼠分别灌胃0.5g/mL， 0.75g/mL实施例4所得大枣固态发酵微生态食品的饮用水稀释物3ml，空白对照组灌胃等量饮用水，5号模型组除进行相同的正常饲喂外不进行其它处理。

(3)观察指标，稀便级表示稀便的程度，以稀便污染滤纸形成的污迹大小定级，共分为0-7八个等级，统计时每组随机抽取三堆大鼠粪便来统计稀便的级数，然后将所有级数相加除以稀便的数目即得到稀便级。实验过程中分别测量给予受试物前一天，给予受试物一个星期后，给予受试物两个礼拜后各组大鼠稀便级变化情况。

(4)观察所得结果

表大枣益生菌发酵功能饮料与大枣微生态食品对脾胃虚寒模型小鼠的影响

传统中医理论认为大枣具有补虚益气、健脾和胃的功效，由上表数据可知，对模型大鼠灌胃大枣益生菌发酵功能性饮料与大枣益生菌发酵食品可以有效缓解脾胃虚寒导致的腹泻症状。而大枣微生态食品在保留大枣基本营养成分的基础上增加了益生菌因子与益生菌活菌，可以有效促进和维持肠道健康。

以上实施实例仅仅代表本发明的几种实施方式，公开了本发明初步优化的实施方式，但本发明仅仅局限于此，任何本领域技术人员在不违背本发明的根本基础上，可做相应增添或简化，本发明保护范围以权利要求书所限定的为准。

Claims

1.一种大枣益生菌混菌发酵饮料，其特征在于，是将大枣浸泡打浆过滤后获得的枣浆，与大豆粉混合后，采用凝结芽孢杆菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳酸杆菌和青春双歧杆菌进行混菌分段发酵，再将发酵所得的发酵液上清经调制所得，具体制备方法如下：

1)将去核后的大枣与15℃-25℃的饮用水按质量比1:5-7的比例混合，浸泡2-3h；

2)将浸泡后的大枣及浸泡液共同打浆得到大枣初浆；

3)在大枣初浆中加入其质量0-0.1％的果胶酶处理50-70min，ph自然；

4)将所得大枣浆中加入大豆粉，每1L大枣浆加入100-150g大豆粉与0.1-0.3％的食用级碳酸钙混匀，然后进行灭菌制得液态发酵培养基，灭菌条件为：115℃，20min；

5)对于所得大枣灭菌发酵基质，利用三段式发酵进行，第一段发酵是将凝结芽孢杆菌种子液按接种量为10⁶-10⁸CFU/mL接入，35℃-40℃密闭发酵12-38h，然后进行第二段混菌发酵，将其他益生菌种子液按动物双歧杆菌10⁶-10⁷CFU/mL，植物乳杆菌10⁶-10⁷CFU/mL，副干酪乳杆菌10⁶-10⁷CFU/mL，青春双歧杆菌10⁶-10⁷CFU/mL的接种量接种于发酵培养基中，36-40℃密闭发酵12-24h，第三段发酵则采用将温度降低至25℃进行有氧低温发酵，发酵时间为24-36h，通气量为2-3:1；

2.如权利要求1所述的一种大枣益生菌混菌发酵饮料，其特征在于，浸泡大枣所用温水温度为20℃；浸泡时间为3h；大枣与所用温水的质量比为1:6；

所述发酵液中大枣浆中大豆粉的添加量为150g；

所述三段式分段发酵的温度分别为37℃、37℃与25℃；

所述三段式分段发酵的时间为：凝结芽孢杆菌发酵时间为24h，混菌发酵时间为12h，25℃后发酵时间为24h；

所述动物双歧杆菌单菌接种量为5.0×10⁷CFU/mL、植物乳杆菌单菌5.0×10⁷CFU/mL、副干酪乳杆菌单菌5.0×10⁷CFU/mL、青春双歧杆菌单菌5.0×10⁷CFU/mL、凝结芽孢杆菌单菌的接种量为5.0×10⁷CFU/mL；

所述有氧发酵中凝结芽孢杆菌发酵时通气量为2.5:1；

所述调制过程中，添加0.03％大枣香精，0.3％大豆低聚糖，2％的菊粉用作保护剂。

3.如权利要求1所述的一种大枣益生菌混菌发酵饮料，其特征在于，将步骤6)发酵液经过离心所得沉淀经真空冷冻干燥并添加保护剂后制备成益生菌制剂，真空冷冻条件为：-30℃～-40℃预冻5-8h，然后再真空度为1-8Pa条件下进行真空冷冻干燥。

4.如权利要求3所述的一种大枣益生菌混菌发酵饮料，其特征在于，所述保护剂为菊粉与脱脂奶粉，菊粉添加量为5％-15％；脱脂奶粉添加量为3％-10％。

5.一种益生菌固态发酵制作的微生态食品，其特征在于，是将新鲜大枣粉与大豆粉混合后接入凝结芽孢杆菌进行固态发酵后，再接入动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌进一步混菌发酵，发酵后固态基质混入燕麦葡聚糖，真空冷冻干燥后粉碎、成型后得到微生态辅助类食品；

具体制备方法包括如下步骤：

(1)制备固态发酵培养基：在鲜大枣粉中加入其重量的10％-40％的大豆粉混合均匀得混合料，并添加1％-2％的菊粉与0.2％的食用级碳酸钙，最后按照混合料与饮用水1-2:1的比例混合制得固态发酵培养基，并在121℃，20min的条件灭菌；

(2)固态发酵：将活化好的种子液接入固态发酵培养基中，每克固态培养基接入凝结芽孢杆菌单菌种子液，凝结芽孢杆菌的接种量为10⁶-10⁸CFU/g，固态密闭发酵12-48h，温度为37℃，pH自然，然后接入混菌发酵，其中动物双歧杆菌的接种量为10⁶-10⁷CFU/g，植物乳杆菌单菌的接种量为10⁶-10⁷CFU/g，副干酪乳杆菌单菌的接种量为10⁶-10⁷CFU/g，青春双歧杆菌的接种量为10⁵-10⁶CFU/g，接种后的固态发酵基质进行37-38℃固态密闭发酵12-24h，然后进行25℃低温有氧固态发酵12-48h，通气量为2-3:1；

(3)发酵结束后，将燕麦葡聚糖按50g/kg发酵基质比例混入混匀，然后在-30～-40℃条件下预冷6h-7h后，在真空冷冻干燥机内冷冻干燥至含水量不高于5％-10％，经粉碎、成型后制得微生态辅助类食品。

6.如权利要求5所述的一种益生菌固态发酵制作的微生态食品，其特征在于，所述大枣粉与大豆粉质量之比为3:1；

固态发酵中混合料：水＝2：1；

所述动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和凝结芽孢杆菌的接种量为5.0×10⁷CFU/g；

所述凝结芽孢杆菌固态发酵时间为24h；混菌发酵时间为12h，25℃后发酵时间为24h；

所述通气量为2.5:1；

所述固态发酵真空冷冻干燥条件为-40℃预冻6.5h后进行真空冷冻干燥，至含水量不大于7％。

7.如权利要求1-6任意一项所述的产品，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)TQ33,保藏编号为CGMCC No.5233；

所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)937，保藏编号为CGMCC No.11892；

所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)TK9,保藏编号为CGMCCNo11891；

所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501，保藏编号为：CGMCC No.13130；

所述青春双歧杆菌杆菌为青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)TK99，保藏编号为CGMCC No.12784。