CN111363700B

CN111363700B - 一株地衣芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN111363700B
Application number: CN202010192065.6A
Authority: CN
Inventors: 张兴良
Original assignee: Luzhou Zhengtai Biological Engineering Co ltd
Current assignee: Luzhou Zhengtai Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2020-03-18
Filing date: 2020-03-18
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2040-03-18
Also published as: CN111363700A

Abstract

本发明公开了一株地衣芽孢杆菌及其应用，属于生物发酵与生物转化技术领域。本发明公开的地衣芽孢杆菌LZZT‑002具有木聚糖酶活性及纤维素酶活性，将其用于黄芪提取物发酵转化能够提高黄芪多糖及黄芪皂苷及其衍生物收率。本发明菌株LZZT‑002发酵黄芪制备的发酵黄芪饲料添加剂，是综合了益生菌及中药有效成分的高效微生物菌剂，具有绿色环保，性能优良等特点，具有较好的经济效益和社会效益。

Description

一株地衣芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物发酵与生物转化技术领域，更具体的说是涉及一株地衣芽孢杆菌及其应用。

背景技术

黄芪是传统的中药，药理研究黄芪主要的药用成分为黄芪多糖和黄芪皂苷，可提高免疫功能，具有抗氧化、抗辐射和抗癌、保护心脑血管、提高记忆力等作用。生物催化与转化技术是利用微生物酶的催化性能将已知的化学结构改造成为具有新颖结构或更高活性衍生物质的一种新兴生物技术。传统中药由于其成分复杂，有效成分含量较低，部分中药有效成分的水溶性或稳定性不好,毒副作用太强，导致其药效较低，严重影响了它们的应用,不能达到较好的治疗或保健效果。利用生物转化技术筛选高活性菌株来发酵中药，通过微生物的处理可以提高有效成分的溶解度，和除去中药中的大分子杂质，可以提高中药主要成分的转化与含量，形成新组合型的天然化合物群使药物的功能疗效发生改变，增强其治疗效果。另一方面微生物本身也会形成丰富多彩的次生代谢产物，使发酵后的药物产生新的功效。微生物的次级代谢产物也可能同药物中的各种成分发生化学作用形成新的化合物而产生新的疗效。

因此，提供一株地衣芽孢杆菌及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌及其应用，地衣芽孢杆菌LZZT-002具有木聚糖酶活性及纤维素酶活性，将其用于黄芪提取物发酵转化能够提高黄芪多糖及黄芪皂苷及其衍生物收率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株LZZT-002，其保藏编号为CGMCC No.18673；于2019年10月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；分类命名为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis。

进一步，所述的一株地衣芽孢杆菌LZZT-002在制备发酵黄芪微生物菌剂中的应用。

进一步，制备发酵黄芪微生物菌剂的具体步骤如下：

(1)将地衣芽孢杆菌LZZT-002进行菌种活化，然后转接至装有LB液体培养基的三角瓶中，在振荡器上37℃，转速220转/分钟摇瓶培养48小时，获得摇瓶种子液，菌液浓度为10⁹-10¹⁰CFU/ml；

(2)将摇瓶种子液按液体培养基体积比的0.1-1％接种至含有LB液体培养基的发酵种子罐中进行发酵培养；发酵条件是温度37℃，通气搅拌，通气量为0.5m³/L.min，搅拌速度为200转/分钟；培养48小时后，获得种子罐种子液，菌液浓度为10⁹-10¹⁰CFU/ml；

(3)将种子罐种子液按液体培养基体积比的5-10％接种至发酵培养基中，发酵温度35-37℃、起始pH 6.0-8.0、通气搅拌，通气量为0.4-0.6m³/L.min，搅拌速度为160-220转/分钟，发酵4-6天；黄芪多糖含量>2.348g/L(黄芪多糖含量优选为2.35-2.74g/L)，黄芪总皂苷含量>0.5mg/ml(黄芪总皂苷含量优选为0.5-1mg/ml)，终止发酵反应，经过干燥得到发酵黄芪微生物菌剂；所述发酵黄芪微生物菌剂中地衣芽孢杆菌LZZT-002含量>10⁹CFU/g(发酵黄芪微生物菌剂中地衣芽孢杆菌LZZT-002含量优选为10⁹-10¹¹CFU/g)。

进一步，步骤(3)所述发酵培养基的配方如下：浓度为5g/L的黄芪多糖提取液250ml/L，蛋白胨20g/L，NaNO₃4.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄1g/L，pH值6.0-8.0。

进一步，所述的发酵黄芪微生物菌剂作为饲料添加剂的应用，所述发酵黄芪微生物菌剂的添加量为基础日粮的0.2-0.5％。

本专利利用具有多种水解酶活性益生菌菌株LZZT-002，以黄芪提取物为发酵底物通过生物转化技术开发的发酵黄芪饲料添加剂，既含有生物活性成分，又富含益生菌或饲料复合酶,能作为促生长剂和抗生素的替代品广泛用于猪、鸡、马、牛、鱼、虾等多种畜禽、水产动物中。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株地衣芽孢杆菌及其应用，地衣芽孢杆菌LZZT-002具有木聚糖酶活性及纤维素酶活性，将其用于黄芪提取物发酵转化能够提高黄芪多糖及黄芪皂苷及其衍生物收率。本发明菌株LZZT-002发酵黄芪制备的发酵黄芪饲料添加剂，能够提高家畜与家禽的健康水平，同时提高其抗病能力，促进其生长；是综合了益生菌及中药有效成分的高效微生物菌剂，具有绿色环保，性能优良等特点，具有较好的经济效益和社会效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明菌株LZZT-002系统进化树；

图2附图为本发明菌株LZZT-002的生长曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1地衣芽孢杆菌LZZT-002的分离与鉴定

采集黄芪根部土壤样品，通过稀释平板法分离纯化微生物菌株。利用培养特征及形态学观察挑取多株微生物菌株，并通过革兰氏染色方法及16srRNA基因快速扩增测序方法鉴定菌株，16s rRNA基因鉴定采用菌株DNA为模板，PCR扩增其16S rDNA序列，引物为(27f)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ ID NO.1；和(1492r)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQ ID NO.2。PCR反应程序为：95℃预变性6分钟，95℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸70秒，30个循环。扩增产物经电泳检测其纯度后测序。获得的16S rRNA基因序列通过NCBI Genebank数据库进行比对，与菌株Bacillus licheniformis的相似性最高，同源性为99.8％，结果见图1。结合菌株的生长特征，把该菌株鉴定为Bacillus licheniformis，命名为LZZT-002，并于2019年10月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，保藏编号为CGMCC No.18673。

实施例2菌株LZZT-002木聚糖酶活性检测

LZZT-002菌株在液体培养基(胰蛋白胨5g，燕麦木聚糖5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，pH7.2)发酵培养两天后，离心收集菌体，置于PBS缓冲液中，用超声波破碎仪于功率600W，进行细胞破碎，然后离心获得上清液，即获得粗酶液。

木聚糖酶活性检测参照国标(GB/T 23874—2009)。

标准曲线制备：吸取0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)4ml，加入DNS试剂5.0ml，沸水浴加热5分钟，冷却至室温，加水定容至25ml，制成标准空白样。配制0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml和0.7mg/ml的木聚糖标准液。分别取标准溶液各2ml，加入0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)缓冲溶液2ml，摇匀，沸水浴加热5分钟。以标准空白样为对照，在540nm处测定吸光度，根据测定结果制作标准曲线。

取前述所制备的粗酶液用0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5)适当稀释，取2ml稀释酶液，加入DNS试剂5.0ml，振荡摇匀，加入2ml木聚糖溶液，37℃保温30分钟，然后沸水浴5分钟，冷却后定容至25ml。测定其吸光度，从而根据下列公式计算出其木聚糖酶活性，木聚糖酶活性为14.31-23.23U/mL。

其中X_D为稀释液中的木聚糖酶活力；A_E为酶反应液的吸光度；A_B为空白样的吸光度；K为标准曲线斜率；Co为标准曲线截距；M为木聚糖的摩尔质量；t为酶解反应时间。

实施例3菌株LZZT-002纤维素酶活性检测

将菌株LZZT002点种在羧甲基纤维素钠培养基上，培养48小时。采用0.2％刚果红染色30分钟，然后先用蒸馏水洗去染液，再用浓度为1mol/L的NaCl浸泡1小时，最后用5％(w/v)的醋酸液固定颜色。在菌落周围形成无色透明圈证明此菌分泌纤维素酶。

实施例4菌株LZZT-002液体菌剂的制备

将4℃保存的本发明生产菌株LZZT-002斜面转接至LB培养基平板上37℃培养，然后转接至装有1000ml LB液体培养基的三角瓶中，在振荡器上37℃，转速220转/分钟摇瓶培养48小时，生长曲线见图2，获得摇瓶种子液，菌液浓度为10⁹-10¹⁰CFU/ml。将摇瓶种子液按液体培养基体积比的0.1-1％接种至含有LB液体培养基的发酵种子罐中进行发酵培养。发酵条件是温度37℃，通气搅拌，通气量为0.5m³/L.min，搅拌速度为200转/分钟，培养48小时后，获得种子罐种子液，菌液浓度为10⁹-10¹⁰CFU/ml。

实施例5利用菌株LZZT-002菌剂液态发酵黄芪提取物制备高效发酵黄芪微生物菌剂

将种子罐种子液按液体培养基体积比的5-10％接种至含有黄芪多糖为唯一碳源的发酵培养基(浓度为5g/L的黄芪多糖提取液250ml/L，蛋白胨20g/L，NaNO₃4.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄1g/L)中，发酵温度35-37℃、起始pH 6.0-8.0、通气搅拌，通气量为0.4-0.6m³/L.min，搅拌速度为160-220转/分钟，发酵4-6天时间，根据实施例6和实施例7的检测方法检测黄芪多糖含量及黄芪皂苷含量，黄芪多糖含量>2.348g/L，黄芪总皂苷含量>0.5mg/ml，终止发酵反应。将发酵液分装成为液体制剂，发酵液经板框或离心方式脱水得到可湿性菌剂，经过喷雾干燥得到粉剂，即为发酵黄芪微生物菌剂，发酵黄芪微生物菌剂中地衣芽孢杆菌LZZT-002含量>10⁹CFU/g；发酵黄芪微生物菌剂作为饲料添加剂使用。

实施例6发酵产物中黄芪多糖含量的检测

标准曲线制备：精确称取无水D-葡萄糖100mg，加水溶解定容于100mL容量瓶中，摇匀得1mg/mL的葡萄糖标准液。精密吸取葡萄糖标准液2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL于100mL容量瓶中，定容摇匀。精密吸取上述各溶液2mL于具塞试管中，分别加入5％苯酚溶液1.0mL，摇匀，立即加入浓硫酸5.0mL，振荡2分钟后放入沸水浴中加热15分钟，然后放入冷水浴中冷却30分钟，以蒸馏水作为空白对照，在波长490nm处测定吸光度值，绘制葡萄糖标准曲线。

将黄芪多糖含量为10％的市售黄芪提取物(陕西昂盛生物医药科技有限公司，20171226)以1：20(g：mL)的固液比与蒸馏水混合，然后4000转/分钟离心10分钟，除去残渣后取上清液冷藏备用；种子液以10％的接种量接入100mL黄芪多糖为唯一碳源的发酵培养基(浓度为5g/L的黄芪多糖提取液250ml/L，蛋白胨20g/L，NaNO₃4.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄1g/L)中，发酵温度35℃、起始pH 6.0、摇床转速20转/分钟，发酵5天时间，取样后根据葡萄糖标准曲线回归方程计算发酵液中黄芪多糖的含量可达到2.348g/L。

实施例7发酵产物中黄芪皂苷总含量的测定

精密吸取黄芪甲苷对照溶液0.15、0.30、0.45、0.60、0.75mL分别注入具塞试管中，各加入无水乙醇至0.75mL，再分别加入0.75mL 8％的香草醛试剂，置于冰浴中加入7.5mL质量分数为72％的硫酸摇匀，放入62℃的水浴20min，取出、摇匀。在30min内，于波长544nm处测定吸光度，制作标准曲线。

取实施例5制备得到的发酵液5ml或喷干制剂1g，用20倍量的70％乙醇连续回流2小时，过滤，减压浓缩后用水饱和乙酸乙酯萃取3次，水层再用水饱和正丁醇萃取3次，减压浓缩后用无水乙醇定容至25ml。取0.5ml样品溶液，加入1.5ml无水乙醇，加入0.5ml 8％香草醛试剂，至于冰浴中，加7.5ml72％浓硫酸，摇匀，62℃水浴反应20分钟，冷却，终止反应，摇匀后置于544nm波长处测定光吸收值。根据标准曲线计算出黄芪皂苷的含量，测得发酵液中黄芪总皂苷可达到为0.5-1mg/ml。

实施例8发酵产物中黄芪皂苷类型的检测

取实施例5中发酵液1ml，快速加入4℃正丁醇1ml终止反应。然后用等体积正丁醇萃取2次，4000转/分钟离心20分钟，取正丁醇层，合并后氮气吹干，加入0.5ml甲醇复溶，12000转/分钟离心20分钟，吸取上清进行检测。检测采用安捷伦HPLC系统，色谱柱为Agilent Extend-C18色谱柱(1.8μm，2.1mm×100mm)；柱温45℃；流动相0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱，洗脱梯度设置见表1，流速0.3ml/min；进样量5μl。通过色谱分析，结合标准品分析黄芪皂苷I位于保留时间4.98分钟，黄芪皂苷II洗脱时间是4.55分钟，黄芪皂苷III出峰时间在4.35分钟，黄芪甲苷的保留时间在4.28分钟，环黄芪醇保留时间在5.43分钟。

表1

洗脱时间(min)	0.1％甲酸(％)	乙腈(％)
			0.0-1.0	100％	0％
1.0-4.0	30％	70％
			4.0-8.0	0％	100％
8.0-12.0	0％	100％
			12.0-14.0	100％	0％

实施例9发酵黄芪制备的饲料添加剂应用于家禽

发酵黄芪饲料添加剂使用方法包括拌料(饲料中添加量为0.2-0.5％)和饮水(按0.2-0.5％发酵中药量兑水后可以直接饲喂)。

此处采用拌料，在基础日粮中添加0.2％发酵黄芪饲料添加剂。

在同样的气候条件和相同的饲养管理方式下对两组实验鸡群及一组对照鸡群进行观察与试验。在日常观察中，实验鸡群发生的拉稀、饲料便及水样便极少，而对照组却有不少拉稀、拉饲料便和水样便的现象。试验结果显示，试验的两组实验鸡群平均出栏体重1.81公斤，较对照组的每只1.76公斤重0.05公斤，平均成活率92.79％，较对照组的90.7％增加二个百分点；实验组平均每只鸡药费1.45元，较对照组1.67元/只，节省0.22元/只。

试验结果表明本发明研制的发酵黄芪饲料添加剂针对家禽饲养具有明显的增加免疫力，降低养殖成本，提高养殖效益的作用。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 泸州正泰生物工程有限公司

<120> 一株地衣芽孢杆菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株LZZT-002，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.18673。

2.权利要求1所述的一株地衣芽孢杆菌LZZT-002在制备发酵黄芪微生物菌剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的一株地衣芽孢杆菌LZZT-002在制备发酵黄芪微生物菌剂中的应用，其特征在于，制备发酵黄芪微生物菌剂的具体步骤如下：

(1)将地衣芽孢杆菌LZZT-002进行菌种活化，然后转接至装有LB液体培养基的三角瓶中，在振荡器上37℃，转速220转/分钟摇瓶培养48小时，获得摇瓶种子液；所述摇瓶种子液的菌液浓度为10⁹-10¹⁰CFU/ml；

(2)将摇瓶种子液按液体培养基体积比的0.1-1％接种至含有LB液体培养基的发酵种子罐中进行发酵培养；发酵条件是温度37℃，通气搅拌，通气量为0.5m³/L·min，搅拌速度为200转/分钟；培养48小时后，获得种子罐种子液；所述种子罐种子液的菌液浓度为10⁹-10¹⁰CFU/ml；

(3)将种子罐种子液按液体培养基体积比的5-10％接种至发酵培养基中，发酵温度35-37℃、起始pH 6.0-8.0、通气搅拌，通气量为0.4-0.6m³/L·min，搅拌速度为160-220转/分钟，发酵4-6天；黄芪多糖含量>2.348g/L，黄芪总皂苷含量>0.5mg/ml，终止发酵反应，经过干燥得到发酵黄芪微生物菌剂；所述发酵黄芪微生物菌剂中地衣芽孢杆菌LZZT-002含量>10⁹CFU/g。

4.根据权利要求3所述的一株地衣芽孢杆菌LZZT-002在制备发酵黄芪微生物菌剂中的应用，其特征在于，步骤(3)所述发酵培养基的配方如下：浓度为5g/L的黄芪多糖提取液250ml/L，蛋白胨20g/L，NaNO₃ 4.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，pH值6.0-8.0。

5.根据权利要求2-4任一项所述的发酵黄芪微生物菌剂作为饲料添加剂的应用，其特征在于，所述发酵黄芪微生物菌剂的添加量为基础日粮的0.2-0.5％。