CN112167453A - 一种黄芪茎叶奶牛饲料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄芪茎叶奶牛饲料及其制备方法，包括重量份数的组分包括以下重量份数的组分青贮玉米17‑33份、发酵黄芪茎叶12‑23份、羊草10‑13份、胡萝卜1‑2份、玉米20‑25份、麸皮5‑10份、豆饼10‑15份、磷酸氢钙0.1‑1份、石粉0.5‑1.5份、食盐0.1‑1份。利用黄芪的茎叶等副产品，研制奶牛可食用的饲料，与其他同类产品比较，本方法不仅使黄芪副产品得到很好的开发利用，而且操作方便、无残留，长期应用没有副作用，可显著提高奶品质、增加奶产量、增强奶牛机体免疫力、有效地预防乳房炎的发生，具有很广阔的应用范围和发展前景。

Description

一种黄芪茎叶奶牛饲料及其制备方法

技术领域

本发明涉及畜牧养殖技术领域，特别涉及一种一种黄芪茎叶奶牛饲料及其制备方法。

背景技术

中药是纯天然物质，含有多种生物有效成分，高效低毒、无残留、体内代谢快、不易产生耐药性，已广泛应用于人的和动物临床治疗中。黄芪是临床常用传统的补益类中草药，含有多种生物活性成分，不但预防和治疗人及动物疾病，而且还具有提高机体免疫力、增加动物生产性能等作用，长期使用对机体无不良影响。

根据中兽医理论和中草药作用机理，黄芪作为主药普遍应用于奶牛乳房炎防治上，效果非常理想。奶牛乳房炎是奶牛生产中最常见、最多发的疾病之一，发病率占奶牛各种疾病之首。由于乳房炎能够降低奶牛产奶量和乳汁品质，增加治疗费用，造成废弃奶，重者还影响奶牛的发情和妊娠，有些病牛因产乳量明显减少或失去泌乳能力而被迫淘汰。因此，乳房炎造成的经济损失巨大，对食用者的身体健康危害严重。长期以来，奶牛乳房炎严重制约着奶牛养殖业的发展，对该病防治的研究也有很长的历史，但是由于该病病因复杂，治疗难度较大。自从抗生素被应用到兽医临床以来，近几十年来，该病的治疗一直都采用抗生素为主，也曾取得了很好的效果，但是抗生素的长期使用和滥用使越来越多的病原菌产生了耐药性，疗效也越来越差，用药剂量越来越大，人们逐渐认识到抗生素不能从根本上解决问题，尤其是长期大剂量使用造成的细菌耐药性问题日益严重。大量使用抗生素已带来严重的公共卫生问题，如乳中的抗生素残留，影响乳品质量，使原奶不能发酵成酸奶，奶价降低或遗弃，严重危害奶农的养殖效益，造成巨大的经济损失；而且残留的抗生素会危害人的健康，人食用后可引起发烧、呕吐、过敏等症状，还会诱导耐药菌株的产生，危害人类健康。同时，随着人们对食品安全要求的不断提高和加入WTO后对我国奶产品质量要求的进一步严格，临床治疗常用的抗生素已逐渐被禁用或限用，因此高效低毒、无残留、体内代谢快、不易产生耐药性的中草药被逐渐地开发利用。应用中草药防治奶牛乳房炎，己日益被国内外专家尤其是兽医工作者所关注和使用，尤其是黄芪在治疗和预防奶牛乳房炎方面的所起的作用和表现非常重要。

但是，在应用黄芪时，无论是人药还是兽药，主要选择生物活性成分含量较高的根部，而生物活性成分含量较低的茎叶等部分被当做副产品弃掉，这些大量剩余的副产品基本被当做烧柴使用，其中含有动物可利用的营养及生物活性成分也被随之烧掉。重要的是黄芪在我省种植面积大、产量多，这不仅浪费了大量的自然资源，而且造成了巨大的经济损失。

因此，如何更好的开发利用黄芪茎叶使其充分发挥价值是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种黄芪茎叶奶牛饲料及其制备方法，利用黄芪的茎叶等副产品，研制奶牛可食用的饲料，与其他同类产品比较，本方法不仅使黄芪副产品得到很好的开发利用，而且操作方便、无残留，长期应用没有副作用，可显著提高奶品质、增加奶产量、增强奶牛机体免疫力、有效地预防乳房炎的发生，具有很广阔的应用范围和发展前景。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种黄芪茎叶奶牛饲料，包括以下重量份数的组分：

青贮玉米17-33份、发酵黄芪茎叶12-23份、羊草10-13份、胡萝卜1-2份、玉米20-25份、麸皮5-10份、豆饼10-15份、磷酸氢钙0.1-1份、石粉0.5-1.5份、食盐0.1-1份。

一种黄芪茎叶奶牛饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：黄芪茎叶的发酵

(1.1)在黄芪挖采前一周时收割绿色黄芪的茎叶，茎已干且粗细超2cm的茎叶剔除掉，将收集的黄芪茎叶揉碎至2-3cm长的碎末；

(1.2)将黄芪碎末与黄豆粉、碳酸钙和水混合均匀得到发酵底物；

(1.3)挑取发酵菌种接种于5mL营养肉汤中，37℃摇床中4000r/min培养14-16h，培养至细菌浓度108CFU/mL，然后以1％的接种比例接种于100mL的营养肉汤培养基，继续37℃摇床中4000r/min培养14-16h，至细菌浓度108CFU/mL即得到发酵菌种子液，将发酵菌种子液与玉米面以质量比1:10的比例混合均匀即得发酵菌种；

(1.4)将步骤(1.3)制得的发酵菌种与步骤(1.2)的发酵底物混合均匀后15-30℃发酵20-30d即得发酵黄芪茎叶；

步骤二：饲料的制备

按质量份数称取青贮玉米17-33份、发酵黄芪茎叶12-23份、羊草10-13份、胡萝卜1-2份、玉米20-25份、麸皮5-10份、豆饼10-15份、磷酸氢钙0.1-1份、石粉0.5-1.5份、食盐0.1-1份后混合均匀，即得黄芪茎叶奶牛饲料。

优选的，步骤(1.2)中所述的黄豆粉添加量为黄芪碎末质量的10％，碳酸钙添加量为黄芪碎末质量的0.2％。

优选的，步骤(1.2)中添加水量至发酵底物湿度为60％-65％。

优选的，步骤(1.3)中的发酵菌种筛选过程为：

(5.1)取中药黄芪样品，粉碎后加等重量灭菌蒸馏水，在室温放置4-5d；

(5.2)取黄芪样品接种营养琼脂平板，30℃环境培养，观察有细菌生长时，取不同形态菌落分别接种于营养琼脂纯化培养；

(5.3)取纯化菌种接种黄芪琼脂、点种纤维素刚果红琼脂，分别置30℃环境培养，观察细菌生长情况，筛选能在黄芪琼脂生长，并能在刚果红培养基形成较大降解圈的细菌，得到发酵菌。

优选的，步骤(1.4)中发酵菌种的量为发酵底物重量的4％-5％。

经由上述技术方案，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本申请设计的黄芪茎叶奶牛饲料，通过对中草药黄芪的茎叶营养及生物活性成分分析，及对纤维素生物发酵菌的研究，筛选出纤维素酶活性较高的发酵菌，经对黄芪茎叶生物发酵，使含有的营养及生物活性成分尽可能的全部释放出来，同时，增加奶牛的适口性。饲喂奶牛后，既有丰富的营养，提高奶品质，增加奶产量，其含有的药效成分可提高奶牛机体免疫力，有效地预防乳房炎的发生，对促进奶牛业健康、稳定、可持续发展具有重要意义；并且本申请利用黄芪的茎叶等副产品，研制奶牛可食用的饲料，与其他同类产品比较，本方法不仅使黄芪副产品得到很好的开发利用，而且操作方便、无残留，长期应用没有副作用，可显著提高奶品质、增加奶产量、增强奶牛机体免疫力、有效地预防乳房炎的发生，具有很广阔的应用范围和发展前景。

附图说明

图1为目的基因PCR扩增结果(其中，M：DL2000 DNA Marker；1、2：PCR产物；3：阴性对照)；

图2为菌株16S rRNA基因系统进化树；

图3为葡萄糖标准曲线；

图4为酶活力测定结果；

图5为热稳定性测定结果；

图6为酸碱稳定性测定结果；

图7为菌株形态(1000×)；

图8为温度对菌株生长影响；

图9为酸碱度对菌株生长影响；

图10为菌株生长曲线；

图11为菌株芽孢形成情况；

图12为黄芪茎叶发酵物药物成分检测结果；

图13为黄芪茎叶发酵物营养成分检测结果；

图14为各组奶牛产奶量柱状图；

图15为各组奶牛乳房炎柱状图；

图16为各组奶牛体细胞数变化柱状图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

针对本发明的技术方案，下面将采用具体的试验进行说明和验证。

一、黄芪发酵菌的筛选、鉴定及纤维素酶学性质研究

材料：黄芪购自河北凯达药业有限公司；TakaraMini BEST Bacteria GenomicDNA Extraction Kit Ver.3.0、EX Taq酶和dNTP均购自大连宝生物工程有限公司；MarkerDL2000购自Genstar公司；琼脂糖购自OXOID公司；葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、苯酚均为分析纯。

培养基：

营养琼脂：蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，牛肉汤1000mL，pH 7.2。黄芪琼脂：黄芪粉(过40目筛)100g，葡萄糖20g，琼脂15g，牛肉汤1000mL，pH 7.2。

刚果红琼脂：葡萄糖5g，纤维素2g，明胶2g，刚果红0.2g，KH2PO40.5g，MgSO40.25g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然。

发酵培养基：羧甲基纤维素钠10g，葡萄糖10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，KH2PO41 g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。

0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)缓冲液：

取粘度3-6泊的羧甲基纤维素钠0.5g，加入pH 4.6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液适量，混合均匀，水浴加热溶解，冷却后用2mol/L盐酸或氢氧化钠调节pH至4.6，定溶至100mL，再用二层纱布过滤，置4℃冰箱贮存备用，有效期3d。

DNS试剂：

参照文献方法，取蒸馏水煮沸10min后冷却备用。称取3,5-二硝基水杨酸6.3g，溶于约700mL水浴至40-45℃的蒸馏水中，搅拌溶解，再加入0.2g/mL氢氧化钠溶液100mL，搅拌均匀，然后逐步加入四水酒石酸钾钠182g、苯酚5g和无水硫酸钠5g，并不断搅拌，待完全溶解后停止水浴，冷却至室温，并用蒸馏水定容至1000mL。过滤，滤液储存在棕色瓶中，室温暗处放置1周后使用，使用期20d，使用期储存于冰箱中冷藏，并尽量减少与空气接触。

一)黄芪发酵菌筛选

取中药黄芪样品，粉碎后加等重量灭菌蒸馏水，在室温放置4-5d。取黄芪样品接种营养琼脂平板，置30℃环境培养，观察有细菌生长时，取不同形态菌落接种营养琼脂纯化培养。取纯化菌种接种黄芪琼脂、点种纤维素刚果红琼脂，分别置30℃环境培养，观察细菌生长情况，筛选能在黄芪琼脂生长，并能在刚果红培养基形成较大降解圈的细菌。测量筛选菌水解透明圈直径(H)与菌落直径(C)的比值(H/C)，并初步判定筛选菌降解纤维素的活力。

二)分子生物学鉴定

应用TakaraMini BEST Bacteria Genomic DNA Extraction KitVer.3.0试剂盒，按照说明提取细菌总DNA。应用细菌通用引物扩增16S rRNA，上游引物(P1)：

5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'；下游引物(P2)：

5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'。PCR反应体系为50μL，其中TaqDNA聚合酶0.5μL、10×PCRreactionbuffer 5μL，模板DNA 2μL，dNTP为1μL，上下游引物各2μL，去离子水补至50μL。扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火复性40s，72℃延伸2min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。取5μL扩增产物于0.8％琼脂糖凝胶检测后，送上海英俊生物技术有限公司测序。利用NCBI-BLAST搜索程序从GenBank进行同源性检索，观察所得序列与已知菌株基因序列的覆盖率，并运用CLUSTAL-X软件对所得序列和相似序列建树分析。采用MEGA4.0软件运用邻接法进行聚类分析，并构建16S rRNA基因系统发生树。

三)葡萄糖标准曲线绘制

标准葡萄糖溶液配制：

取葡萄糖在干燥箱中105℃烘干2h至恒重。精确称取葡萄糖100mg，加入100mL容量瓶中，用少量蒸馏水溶解后，定容至刻度，摇匀。葡萄糖溶液浓度为1mg/mL，于4℃保存冷藏，使用期2-3d。

绘制葡萄糖标准曲线：

取16支具塞试管，依次编号为0、1、2、3、4、5、6、7，并作平行试验。分别取1mg/mL标准葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL依次加入各管中，然后再依次加入蒸馏水2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6mL，混匀，使各管液量均为2.0mL。然后各管分别加入DNS试剂2mL，混匀，置沸水浴中显色5min，立即取出，流水冷却。以0号管为对照调零，于490nm处测定其它各管溶液光密度(OD)值。以标准葡萄糖溶液中所含葡萄糖量(mg)为横坐标，以OD值为纵坐标，作出葡萄糖标准曲线。

四)纤维素酶学性质测定

羧甲基纤维素酶酶活力测定方法：

取活化菌接种液体发酵培养基，置37℃环境180r/min振荡培养，取发酵液6000r/min离心15min，收集上清即为粗酶液，置4℃冰箱保存备用。

参照文献酶活力测定方法并改进。取刻度试管3支，其中2支管为平行样品，1支管为对照。各管分别加入3倍稀释的酶液1mL，对照管置沸水浴煮沸灭活20min，样品管置50℃水浴预热1min。然后3支管中分别加入已预热至50℃的0.5％CMC-Na缓冲液(pH 4.6)2mL，摇匀，置50℃水浴反应30min，取出后各管立即加入DNS试剂3mL，混匀，然后置沸水浴中显色5min立即取出，流水冷却，用蒸馏水定容至10mL，以对照调零于490nm处测OD值。依据葡萄糖标准曲线计算还原糖含量，按照公式求得酶活力。

在上述试验条件下，以1mL酶液每分钟水解纤维素生成1μg葡萄糖的量为1个酶活力单位(U)。

纤维素酶活力计算公式为：X＝(5.56×M×n)/V×t

式中：X，CMC酶活力(U/mL)；M，吸光度在标准曲线上计算的葡萄糖量(mg)；n，酶液稀释倍数；V，酶液体积(mL)；t，时间(min)；5.56为1mg葡萄糖的μmol数(1000/180＝5.56)。

五)产酶曲线测定

在菌株发酵培养18-72h期间，每隔6h取样1次，按3.2.2.4.1方法测定发酵液中纤维素酶酶活。试验设3个试验组，每组设2个平行。以时间为横轴，以纤维素酶活力为纵轴绘制曲线，即得该菌产酶曲线。

六)热稳定性测定

取刻度试管8支，各管分别加入酶液3mL，其中7支为试验管，1支为对照管，每组设3个平行。试验管分别置20、30、40、50、60、70、80℃环境，对照管置室温环境，各管在不同温度环境作用1h后，按3.2.2.4.1方法测定相对酶活力。纤维素酶稳定性以存余酶活力与对照酶活力的百分率表示。

七)酸碱稳定性测定

取刻度试管7支，分别加入粗酶液3mL，其中6支为试验管，1支为对照管。分别用2mol/L盐酸或氢氧化钠调各试验管粗酶液pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，对照管不作处理，30℃环境作用1h，各管用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调至9mL，然后按3.2.2.4.1方法测相对酶活力，计算存余酶活力的百分率。

二、结果与分析

一)菌株筛选结果：

样品接种营养琼脂共计分离出5株细菌，菌株纯化后接种黄芪琼脂，点种纤维素刚果红培养基，确定有1株细菌既能在黄芪琼脂生长，又能在刚果红琼脂形成较大清晰降解圈。筛选菌在刚果红培养基形成的降解圈直径为15.3mm，菌落直径为3.8mm，菌株H/C为4.03，据此判断该菌株降解纤维能力较强。

二)PCR扩增、测序及系统发生树分析

以菌株总DNA为模板，采用16S rRNA引物P1、P2进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，扩增获得目的片段约500bp，结果如图1。扩增序列长度为574bp，经BLAST与GenBank中数据库序列比对，结果显示，该序列与解淀粉芽孢杆菌IHB B2284(登陆号：JX099347)及MD33(登陆号：KP059106)同源性达100％。同时将相似度高的典型菌株的有效序列进行同源性分析，并构建系统进化树，见图2，结果表明，筛选菌株与解淀粉芽孢杆菌IHB B2284株及MD33株聚在一分支中，与枯草芽孢杆菌Ag3株(登陆号：JN257095)及蜡样芽孢杆菌EB8株(登陆号：KP209385)距离稍远，进一步确定该菌为解淀粉芽孢杆菌，命名为Bacillusamyloliquefaciens strain SSY1株。

三)葡萄糖标准曲线

依据不同含量葡萄糖溶液在波长490nm处测定的OD值，得回归方程y＝0.8651x-0.0323，相关系数R2＝0.9992，葡萄糖标准曲线标准曲线见图3。

四)酶学性质测定结果

不同培养时间纤维素酶活力测定结果

不同培养时间发酵产物的纤维素酶活力曲线见图4。在菌株发酵培养36h时纤维素酶活力达到最大值，为32.16U/mL，此后至培养72h，纤维素酶活力呈平稳波动状态。

五)热稳定性测定结果

将粗酶液分别置不同温度环境作用1h后，纤维素酶活力测定结果见图5。在低于60℃环境中纤维素酶较为稳定，纤维素酶活力均维持在最高酶活力的90％以上。当温度高于60℃时纤维素酶活力失活加剧，当温度为80℃时，纤维素酶活下降到最高酶活的30％以下。

六)酶酸碱稳定性测定结果

将纤维素酶液分别置不同酸碱度的环境作用1h，酶活测定结果见图6。纤维素酶在pH 7.0最稳定，相对酶活力为99.51％，在pH 6.0-8.0环境中纤维素酶具有较好稳定性，相对酶活力保持在90％以上，在pH 3.0环境最不稳定，相对酶活力仅为22.15％。

本试验从黄芪样品中分离出一株具有降解纤维能力，能在黄芪培养基生长的细菌，经形态及分子生物学鉴定为解淀粉芽孢杆菌。该菌株营养要求低，适应性强，安全性良好，可作为发酵黄芪的候选菌株。

本试验分离的解淀粉芽孢杆菌所产羧甲基纤维素酶活力为32.16U/mL，与李红亚等报道的解淀粉芽孢杆菌产生纤维素酶45.4U/g较近，而远低于崔海洋等报道的解淀粉芽孢杆菌菌株所产羧甲基纤维素酶活力为307.23U/mL，以及王凯等报道的纤维素酶酶活135.8U/mL。由于本试验采用的DNS方法的纤维素浓度、反应体系的加量，以及测定波长的差异性，因此各学者测定的结果可比性也不强。依据筛选菌在刚果红培养基形成的降解圈，初步判断该菌株具有中等降解纤维素活力。

三、产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌分离株的生物学特性研究

一)

产纤维素酶解淀粉芽胞杆菌菌株由上述技术中分离保存；健康小鼠，体重19-21g，雌雄兼有，由齐齐哈尔医学院实验动物中心惠赠。

方法：

1.1)形态观察及生化试验

取在37℃环境培养16、18、24、48和72h的解淀粉芽胞杆菌菌液，涂片，革兰染色，镜检菌体形态。取菌种接种营养肉汤和营养琼脂平板，分别置于有氧和厌氧条件下在37℃环境培养24h、48h和72h，观察菌株培养特性及嗜氧性。取培养18-20h菌液接种生化管置37℃环境培养，测定细菌生化特性。

1.2)适宜生长温度测定

取解淀粉芽胞杆菌菌株18-20h培养液，调整菌液浓度为1.0×106CFU/mL。以1％接种量接种营养肉汤，分别置温度为10、20、30、35、40、45、50、60、70℃环境以200r/min振荡培养。参照文献方法，在培养18，24，42h取样，以无菌营养肉汤作空白对照，于波长600nm处测定各培养温度下菌株培养液的OD值。以培养温度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制菌液含菌量柱形图，比较细菌生长情况。试验设3个重复。

1.3)适宜生长酸碱度测定

取1.2)调整菌液，以1％接种量接种pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9的营养肉汤，置37℃以200r/min振荡培养，18、24、42h取样，于波长600nm处测定各pH条件下菌株培养液的OD值。以无菌营养肉汤作空白对照，以pH为横坐标，OD值为纵坐标，绘制菌液含菌量柱形图。试验设3个重复。

1.4)菌株生长曲线测定

取1.2)调整菌液，以1％接种量接种营养肉汤，37℃以200r/min振荡培养，在培养4、8、12、16、20、24、30、36、42、48、56、72、80、96h取样，于波长600nm处测定不同培养时间菌株培养液的OD。无菌营养肉汤作空白对照，以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制细菌生长曲线。试验设3个重复。

1.5)芽胞形成情况测定

参照文献方法，取培养16、20、24、48、64、72h的菌液，作10倍连续稀释。用无菌移液管分别取108、109、1010。共3个稀释度的稀释菌液0.1mL,，涂布接种于营养琼脂平板培养，计数细菌数。剩余稀释菌液置80℃水浴处理10-15min，无菌吸取0.1mL处理菌液，接种营养琼脂平板培养，计数芽胞形成率。芽胞形成率(％)＝(形成芽胞的菌数/总菌数)×100％。

1.6)药敏试验

应用KB法测定菌株药物敏感性。取菌株接种MH肉汤，37℃培养16-20h，用MH肉汤调整菌液浓度至0.5号麦氏标准管浊度，然后接种MH琼脂平板，贴上药敏片，置37℃培养16-18h，测定抑菌圈直径，依据药敏片判定标准判定细菌的药物敏感性。

1.7)安全性试验

选用健康小鼠20只，随机均分4组，雌雄各半。I组灌服菌液，II组腹腔注射菌液，III组灌服生理盐水，IV组腹腔注射生理盐水。灌服剂量为0.5mL/只，2次/d，连续7d。注射剂量为一次性注射0.3mL/只。试验菌液为菌株18-24h肉汤培养物，菌液浓度约为36×108CFU/mL。每天观察记录小鼠临床表现，死亡鼠剖检，观察2周后处死全部小鼠，剖检内脏器官有无异常变化。

二)结果

2.1)菌株形态及生化特性

菌株为革兰阳性大杆菌，两端钝圆，多单在。老龄菌变长，多呈短链状排列。细菌形成中生或次端生芽胞，芽胞椭圆形，芽胞直径不大于菌体，见图7。

菌株为兼性厌氧菌，在营养琼脂培养24h，形成灰白色、干燥、不透明的大菌落，菌落表面粗糙，有褶皱，边缘不规则，有扩散。营养肉汤静置培养24h，肉汤澄清，不产生沉淀，肉汤表面形成灰白色菌膜。菌株分解葡萄糖、蔗糖，不发酵乳糖、麦芽糖、果糖、木糖、覃糖、山梨醇、甘露醇和水杨苷，水解七叶苷，H2S、VP、吲哚试验阳性，尿素酶、枸橼酸盐、甲基红试验阴性。

2.2)温度对菌株生长的影响

试验结果表明，菌株在环境温度10-60℃能生长，其中适宜生长温度为37-40℃，最适生长温度为35-40℃。在10-40℃范围内，随着培养温度的升高菌株培养液的OD值逐渐增大，至40℃达到峰值，但35℃与40℃菌液OD值差异不显著(P>0.05)。当培养温度大于40℃时，菌株培养液的OD值逐渐降低，当培养温度升至60℃时，菌株培养液的OD值最低，见图8。

2.3)酸碱度对菌株生长的影响

试验结果表明，在pH5.0-8.0的培养基均适宜菌株生长，其中最适pH为6.0。培养基pH为2-4时，菌株培养液的OD值较小，培养基不适宜菌株生长。当培养基pH升至5时，菌液OD值陡然上升。培养基pH升至6时，菌株培养液的OD值达到峰值。培养基pH升至9时，菌液OD值降为0，见图9。

2.4)菌株生长曲线及芽胞形成情况

菌株在37℃环境200r/min振荡培养，其生长曲线为：0-4h为生长延迟期，4-12h为对数生长期，12-24h为稳定期，24h以后为衰亡期，见图10。细菌37℃培养32h开始产生芽胞，且芽胞数量随着培养时间的延长而增多，在培养72h时芽胞形成率达到80.67％，见图11。

2.5)菌株药物敏感性

药敏试验结果表明，在测定的14种常用药物中，除林可霉素耐药外，对其他13种药物均敏感，见表1。

表1药敏试验结果(n＝3)

注：“R”耐药；“I”中介；“S”敏感。

2.6)菌株安全性

试验鼠观察2周均健活，临床未见异常症状。对小鼠进行剖检，组织脏器未见病理变化。试验结果表明，菌株安全性良好。

本试验解淀粉芽胞杆菌菌株仅发酵葡萄糖和蔗糖，对多数糖和醇均不发酵。参照文献模式菌株的生化特性，分离菌株具有与解淀粉芽胞杆菌模式菌相近的生化特性。药敏试验结果表明，菌株对多数抗生素均高度敏感，因此在该菌株发酵与应用过程中应避免与抗菌药物的混合使用。

本试验菌株在环境温度10-60℃范围内均能生长，其中适宜生长温度为30-40℃，最适生长温度为35-40℃。试验菌株在pH 5.0-8.0环境适宜生长，较适宜pH为6.0。

试验菌株的生长延迟期为培养0-4h，对数生长期为4-12h，稳定期为12-24h。试验菌株在培养32h后开始产芽胞，且芽胞数量随时间增加，在培养72h时芽胞含量达到80.67％。

试验菌株在pH 5.0-8.0、环境温度30-40℃范围内均能较好生长，且在培养32h后开始产生芽胞，说明该菌适应性强，生长条件较为宽松，这为该菌的发酵和利用提供了便利。

黄芪具有保健抗病及提高生产性能作用，发酵黄芪较黄芪微粉更具优势，本试验也为解淀粉芽胞杆菌分离菌株发酵黄芪制剂的开发应用奠定了一定的技术基础。

四、黄芪茎叶生物发酵试验的研究

解淀粉芽孢杆菌，按上试验方法筛选、保存。

营养琼脂、营养肉汤，由北京陆桥技术有限责任公司生产。

4.1)菌种的活化

挑取在营养琼脂平板生长的解淀粉芽孢杆菌菌落，革兰氏染色鉴定正确后接种于5mL的营养肉汤中，37℃摇床中4000r/min培养14-16h，培养至细菌浓度108CFU/mL。

4.2)种子液的制备

以1％的接种比例接种于100mL的营养肉汤培养基，继续37℃摇床中4000r/min培养14-16h，至细菌浓度108CFU/mL即可作为解淀粉芽孢杆菌种子液。

4.3)黄芪茎叶的加工处理

在黄芪挖采前一周(最好茎叶青绿，含有较多水分)，收割黄芪的茎叶，茎已干且粗细超2cm的剔除掉(集中堆放，保湿存放，尽量防止太阳光强烈照射)，将其揉碎2-3cm长的碎末。

4.4)中药生物发酵剂的制备

以黄芪茎叶为主要发酵原料，黄豆粉10％，碳酸钙0.2％，水分含量摸索至最优。

调整加工处理好的黄芪茎叶碎末水分含量，使其含水量为50％、55％、60％、65％、70％，将中药生物发酵剂与玉米面按1:10比例混合，充分搅拌均匀，分别按1％、2％、3％、4％、5％的比例均匀撒入上述不同含水量的黄芪茎叶碎末上，充分搅拌均匀，拍实，用塑料薄膜包严、密封，不能留有空隙，也不能通气，分别在室温15-20℃和25-30℃下保存，每组做5个样，分别在保存10、15、20、25、30d时开封，检验发酵物的质量(气味清香、茎叶变柔变软为标准)。

4.5)黄芪茎叶发酵物成分检测

用常规方法检测黄芪茎叶发酵物中总皂苷、多糖含量、黄酮含量等药效成分及干物质、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、粗灰分、无氮浸出物、钙、磷、微量元素含量等营养成分进行检测。

黄芪茎叶发酵试验结果见表2；

表2黄芪茎叶发酵试验结果

注：A为15-20℃，B为25-30℃；+为合格，-为不合格；30d+指30d时合格，20d+指20d时合格。

从表2可以看出，中药生物发酵剂与玉米面按1:10比例混合后，再分别以1％、2％、3％、4％、5％的浓度与黄芪茎叶碎末混合，在湿度50％、55％、70％的情况下，发酵效果不好，达不到要求。而在湿度60％、65％时，1％、2％、3％浓度的发酵效果不好，达不到要求；4％、5％浓度的发酵效果较好，达到要求，在15-20℃时，30d即可，在25-30℃时，20d即可。

黄芪茎叶发酵物药物成分检测结果

见表3及图12。

表3黄芪茎叶发酵物药物成分检测结果

黄芪茎叶发酵物营养成分检测结果

见表4及图13。

表4黄芪茎叶发酵物营养成分检测结果

黄芪茎叶的发酵需适宜的温度、水分、足够的发酵微生物、以及作用时间。本试验表明，湿度在50％、55％和70％情况下，各浓度的生物菌发酵效果都不好，说明湿度过小、或过大，都影响细菌生长繁殖；浓度在1％、2％、3％时，因发酵微生物数量不够，细菌繁殖不起来，不能对黄芪茎叶进行发酵；4％、5％浓度的在15-20℃时30d、25-30℃时20d即可发酵成功，说明温度越高，细菌繁殖速度越快，发酵时间越短，反之温度越低，细菌繁殖速度越慢，发酵时间越长。

微生物可降解由纤维素、半纤维素、果胶质、木质素等大分子物质组成的植物细胞壁，黄芪茎叶通过生物发酵后，不但中药有效成分从胞内得到释放，而且降低纤维素的含量，提高了可溶性多糖以及粗蛋自、粗脂肪等动物机体可吸收利用的小分子物质的含量，因此，其药物有效成分和营养成分都比发酵前增加。

五、黄芪茎叶生物发酵物对奶牛应用效果试验

试验奶牛：

齐齐哈尔市城郊现代化奶牛养殖基地，品种为中国荷斯坦奶牛。选择3-5岁、产犊2-4个月的健康产奶奶牛396头，常规饲养，用全混合日粮TMR饲料饲喂，精饲料与粗饲料搭配均匀，科学合理，营养均匀。饲料配方为青贮玉米43.8％、羊草10.5％、胡萝卜1.2％、玉米22.6％、麸皮6.3％、豆饼13.7％、磷酸氢钙0.5％、石粉0.9％、食盐0.5％，产奶净能6.967MJ/kgDM、粗蛋白质17.6％、酸性洗涤纤维20.1％、钙0.66％、磷0.42％。以舍饲为主，自由运动，供充足饮水，机械化挤奶，3次/d。

试验药品：

黄芪茎叶生物发酵物，本发明技术方案制得；奶牛隐性乳房炎检测诊断液，黑龙江省兽医科学研究所研制生产，生产批号为：20130512。

试验分组与方法：

常规饲养，专人管理。奶牛生产环境、人员饲养管理、饲喂方法、挤奶方法等尽量相同。将试验奶牛随机平均分为六组，每组66头。第1组为对照组，常规日粮，日常饲喂，日粮中不添加黄芪茎叶生物发酵物；第2组日粮中添加替代10％青贮玉米的黄芪茎叶生物发酵物；第3组日粮中添加替代20％青贮玉米的黄芪茎叶生物发酵物；第4组日粮中添加替代30％青贮玉米的黄芪茎叶生物发酵物；第5组日粮中添加替代40％青贮玉米的黄芪茎叶生物发酵物；第6组日粮中添加替代50％青贮玉米的黄芪茎叶生物发酵物。自由采食。试验时间：2013年5月19日-2013年8月17日，预试期10d，试验期为90d。

记录各奶牛每天的产奶量，并于试验前、试验15d、30d、45d、60d、75d、90d时计算每组各奶牛平均产奶量及增产量；于试验前、试验15d、30d、45d、60d、75d、90d时，用奶牛隐性乳房炎检测诊断液检测各奶牛乳房炎发病情况；于试验前、试验15d、30d、45d、60d、75d、90d时，对各奶牛进行体细胞数的检测。对发生乳房炎的发病牛及时进行隔离，清除试验牛群，及时治疗。发病和治疗期间所产的奶弃掉，产奶量不计入试验数据，治愈后，奶达到收购要求时，再回其相应的组，记录其产奶量；乳房炎发病数量和相应的体细胞数量正常记录。

结果：

1)各组奶牛产奶量情况

表5各组奶牛产奶量情况 kg/头

注：同一列或行中上标字母完全相同或部分相同者差异不显著(P>0.05)，完全不同者差异显著(P<0.05)，以下相同。

从表5及图14可以看出，各组产奶量在试验15d时都有所下降，当试验30d时试验I组和试验II组继续下降，其他各组都有所上升。试验I组产奶量从试验前的日均21.32kg/头下降到试验后的日均13.72kg/头，下降了35.65％；试验II组产奶量从试验前的日均20.98kg/头下降到试验后的日均18.76kg/头，下降了10.58％；试验III、IV、V、VI组产奶量分别提高了3.61％、11.71％、7.32％、5.87％；试验IV组奶牛日均产奶量明显高于其他各组，差异显著(P<0.01)；试验III、V、VI组奶牛日均产奶量相近，差异不显著(P>0.05)。

2)各组奶牛乳房炎发生情况

表6各组奶牛乳房炎发生情况 头

从表6及图15可以看出，各组奶牛乳房炎从试验15d开始增多。对照组、试验II组和试验III组奶牛乳房炎的发病数量随着时间的延长继续逐渐增多，其中对照组试验90d时达39头，发病率为59.09％，试验II组和试验III组发病率分别达18头和13头，发病率分别为27.27％和19.69％；而试验IV、V和VI组比较平稳，试验90d时发病率分别为7.58％、7.58％和6.06％，差异不显著(P>0.05)；与对照组、试验II组和试验III组相比差异显著(P<0.05)，乳房炎发病率分别降低51.51％、51.51％、53.03％。

3)各组奶牛体细胞数变化情况

表7各组奶牛体细胞数变化情况 10⁶/mL/头

从表7及图16可以看出，各组奶牛体细胞数量从试验15d开始增多。对照组、试验II组和试验III组奶牛体细胞数量在整个试验过程中都一直增加，试验90d时都超过50万个/mL、试验III组接近50万个/mL，而试验IV、V和VI组逐渐下降，试验90d时都在20万个/mL以下，与对照组、试验II组和试验III组相比差异显著(P<0.05)。

本饲料配方成本2.12元/kg，青贮玉米价格为1.2元/kg，替代30％青贮玉米，每公斤饲料降低了0.16元(43.8％×30％×1.2＝0.16元)，降低了7.55％。

黄芪茎叶生物发酵物含有黄芪多糖及饲料营养成分，补充奶牛营养，提高奶牛机体免疫力，尤其是增强乳腺抗病能力和修复能力，增加产奶量。试验表明，奶牛日粮中黄芪茎叶生物发酵物的添加量要达到一定剂量和一定的时间才能达到理想效果。从奶牛乳房炎发病数量、产奶量、体细胞数量看，奶牛饲喂15d时效果不大，30d以后才会取得效果。日粮中以替代30％青贮玉米的黄芪茎叶生物发酵物效果最佳，替代10％和20％的，虽然有效，但不明显，其对奶牛的产奶量、乳房炎发病率、体细胞影响不大；替代40％和50％的，虽然对乳房炎发病率、体细胞影响很大，减少了乳房炎发病数量、降低了体细胞数量，但产奶量提高不多，这与黄芪茎叶生物发酵物所含的营养有关，不能满足奶牛机体营养需要。替代30％为最佳，乳房炎发病率降低51.51％、体细胞数在20万个/ml以下、产奶量提高11.71％。

奶牛发生乳房炎时，产奶量降低，因对照组和试验II组乳房炎发病率较高，产奶量下降的也多。其他组虽然也有少量的奶牛发生乳房炎，但发病率较低，由于黄芪茎叶生物发酵物可增加奶牛产奶量，因此，产奶总量逐渐增加。

本试验奶牛乳房炎发病依据是用隐性乳房炎检测诊断液进行的，包含了隐性乳房炎病牛，因此，发病率较高，与平时对奶牛乳房炎调查所获得的数据相符。对照组显著高于饲喂黄芪茎叶生物发酵物的各组，表明黄芪茎叶生物发酵物可预防奶牛乳房炎的发生，降低奶牛乳房炎的发病率，使试验IV、V和VI组乳房炎的发病率保持一个较低水平。

体细胞数可准确的反应出奶牛乳房炎的发生情况，奶牛发生乳房炎时，乳汁中体细胞数增加，并且随着病情的严重，体细胞数越来越高。对照组、试验II组和试验III组在第90d时，虽然奶牛没有全部发生乳房炎，但由于发生乳房炎的奶牛较重，又有一定的数量，因此，体细胞数很高。

乳房炎发病率、产奶量和体细胞数，这三者关系密切，对于同一头奶牛来说，这三者应呈正相关，但本试验是一个奶牛群体，数量较多，如果一个组的奶牛乳房炎发病数量较少，而黄芪茎叶生物发酵物对提高奶牛产奶量效果又特别明显，因此，总体产奶量还是增多。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种黄芪茎叶奶牛饲料，其特征在于，包括以下重量份数的组分：

青贮玉米17-33份、发酵黄芪茎叶12-23份、羊草10-13份、胡萝卜1-2份、玉米20-25份、麸皮5-10份、豆饼10-15份、磷酸氢钙0.1-1份、石粉0.5-1.5份、食盐0.1-1份。

2.一种黄芪茎叶奶牛饲料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：黄芪茎叶的发酵

(1.1)在黄芪挖采前一周时收割绿色黄芪的茎叶，茎已干且粗细超2cm的茎叶剔除掉，将收集的黄芪茎叶揉碎至2-3cm长的碎末；

(1.2)将黄芪碎末与黄豆粉、碳酸钙和水混合均匀得到发酵底物；

(1.3)挑取发酵菌种接种于5mL营养肉汤中，37℃摇床中4000r/min培养14-16h，培养至细菌浓度108CFU/mL，然后以1％的接种比例接种于100mL的营养肉汤培养基，继续37℃摇床中4000r/min培养14-16h，至细菌浓度108CFU/mL即得到发酵菌种子液，将发酵菌种子液与玉米面以质量比1:10的比例混合均匀即得发酵菌种；

(1.4)将步骤(1.3)制得的发酵菌种与步骤(1.2)的发酵底物混合均匀后15-30℃发酵20-30d即得发酵黄芪茎叶；

步骤二：饲料的制备

按质量份数称取青贮玉米17-33份、发酵黄芪茎叶12-23份、羊草10-13份、胡萝卜1-2份、玉米20-25份、麸皮5-10份、豆饼10-15份、磷酸氢钙0.1-1份、石粉0.5-1.5份、食盐0.1-1份后混合均匀，即得黄芪茎叶奶牛饲料。

3.根据权利要求2所述的一种黄芪茎叶奶牛饲料的制备方法，其特征在于，步骤(1.2)中所述的黄豆粉添加量为黄芪碎末质量的10％，碳酸钙添加量为黄芪碎末质量的0.2％。

4.根据权利要求2所述的一种黄芪茎叶奶牛饲料的制备方法，其特征在于，步骤(1.2)中添加水量至发酵底物湿度为60％-65％。

5.根据权利要求2所述的一种黄芪茎叶奶牛饲料的制备方法，其特征在于，步骤(1.3)中的发酵菌种筛选过程为：

(5.1)取中药黄芪样品，粉碎后加等重量灭菌蒸馏水，在室温放置4-5d；

(5.2)取黄芪样品接种营养琼脂平板，30℃环境培养，观察有细菌生长时，取不同形态菌落分别接种于营养琼脂纯化培养；

(5.3)取纯化菌种接种黄芪琼脂、点种纤维素刚果红琼脂，分别置30℃环境培养，观察细菌生长情况，筛选能在黄芪琼脂生长，并能在刚果红培养基形成较大降解圈的细菌，得到发酵菌。

6.根据权利要求2所述的一种黄芪茎叶奶牛饲料的制备方法，其特征在于，步骤(1.4)中发酵菌种的量为发酵底物重量的4％-5％。

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