CN115777832A - 一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法及其应用。本发明以黄芪茎叶为主要原料，采用混合微生物固态发酵，首先筛选出了最佳的混菌发酵种子液：体积比为3:1:3的黑曲霉:枯草芽孢杆菌:产朊假丝酵母；并筛选出最佳的黄芪茎叶发酵基质：质量比为3:2的黄芪茎叶和麦麸；并筛选出了最佳发酵条件：料液比2:3，接种量30％，发酵温度30℃，发酵时间5d。发酵结束后烘干，粉碎，过18～40目筛即得黄芪茎叶混菌固态发酵物。本发明可显著降低黄芪茎叶粗纤维含量，提高其总蛋白含量。黄芪茎叶混菌固态发酵物可显著提高小鼠生长性能，且安全可靠，有效提高了黄芪茎叶的营养价值，为黄芪茎叶及其他中药非药用部位的资源化利用提供了一种新途径。
Description
技术领域
本发明涉及天然植物饲用化技术领域，更具体地，涉及一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法及其应用。
背景技术
饲料中抗生素的滥用导致了动物出现耐药性、超级病菌传播等一系列负面问题，阻碍了动物养殖行业乃至整个社会的发展。近几年国家陆续出台了饲料“减抗”、“替抗”政策，饲料行业亟需新的替代品来代替抗生素的作用。中药来源于天然植物，自古以来就被应用于动物的饲养以及疾病防治，具有疗效确切、绿色天然、毒副作用小等优点，是目前热门的抗生素替代品。但是，随着大健康产业的发展，人类对中药的需求也与日俱增，故存在着人与动物“争药”的隐患。而且，将中药作为抗生素替代品存在成本相对较高的问题，导致经济效益较差。因此需要在此基础上寻找新的替代品。黄芪茎叶来自于豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceusvar.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的地上部分，其年产量近20万吨。作为传统非药用部位，黄芪茎叶在原产地就被大量丢弃或者焚烧，造成了资源的浪费及环境的污染。现代研究表明黄芪茎叶含有黄酮类、皂苷类、多糖类等功效成分以及蛋白质、氨基酸、微量元素等多种营养成分，具有抗氧化、免疫调节、抑菌抗炎、改善肠道微生态等多种生物学活性，是潜在的“替抗”资源。
前期研究发现黄芪茎叶中的粗纤维含量较高，而总蛋白含量较低，畜禽直接采食后营养转化率较低，利用单一菌种发酵无法同时兼顾粗纤维的降解和总蛋白的提升，限制了黄芪茎叶在饲料行业的发展。
发明内容
本发明的目的在于，为提高黄芪茎叶的饲用价值，提供了一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法及其应用。经过发酵，提高黄芪茎叶的总蛋白含量，同时降低粗纤维含量，增加黄芪茎叶作为畜禽饲料的营养价值、适口性和利用率。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，制备发酵种子液，选取枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、黑曲霉、平菇中一种或多种进行制备。
步骤二，用步骤一中的发酵种子液对黄芪茎叶发酵基质进行固态发酵，得到黄芪茎叶混菌固态发酵物。黄芪茎叶单菌发酵具体方法为：
作为优选方案，以上所述的一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，发酵种子液为黑曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母的混合种子液。
作为优选方案，以上所述的一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，所述的黑曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母三者的种子液按照体积比为1:1:1、1:2:2、1:3:3、2:1:2、2:2:3、2:3:1、3:1:3、3:2:1、3:3:2中任一比例进行混合。
作为优选方案，以上所述的一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，所述的黑曲霉、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母的体积比例为3:1:3。
作为优选方案，以上所述的一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，黄芪茎叶发酵基质由质量比为5:0～3:2的黄芪茎叶和麦麸组成。
作为优选方案，以上所述的一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，所述黄芪茎叶发酵基质由质量比为3:2的黄芪茎叶和麦麸组成；黄芪茎叶为烘干后粉碎，过18～40目筛网所得。
作为优选方案，以上所述的黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，发酵条件为：黄芪茎叶发酵基质与水的料液质量比为2:1～2:5，发酵种子液的接种量10％～30％，发酵温度28～35℃，发酵时间2～6d；发酵结束后烘干，粉碎，过18～40目筛，即得黄芪茎叶混菌固态发酵物。
作为更加优选方案，以上所述的一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，发酵条件为：黄芪茎叶发酵基质与水的料液质量比为2:3，发酵种子液的接种量30％，发酵温度30℃，发酵时间5d。
本发明所述方法制备所得的黄芪茎叶混菌固态发酵物在提高动物生长性能和饲料转化率中的应用。作为优选，黄芪茎叶混菌固态发酵物的添加量为1％～10％。
与现有技术相比，本发明提供的黄芪茎叶混菌固态发酵物具有以下有益效果：
本发明以黄芪茎叶为主要原料，采用混合微生物固态发酵，首先筛选出了最佳的发酵种子液(体积比为3:1:3的黑曲霉:枯草芽孢杆菌:产朊假丝酵母)；并筛选出最佳的黄芪茎叶发酵基质(质量比为3:2的黄芪茎叶和麦麸)；并筛选出了最佳发酵条件(料液质量比2:3，接种量30％，发酵温度30℃，发酵时间5d)。发酵后黄芪茎叶固态发酵基质粗纤维含量为18.76％，总蛋白含量为15.35％，与发酵前相比分别降低了34.02％、增加了82.55％，提高了黄芪茎叶的营养价值。
附图说明
图1为不同发酵因素对黄芪茎叶发酵基质粗纤维降解率和总蛋白提升率的影响。其中图1-A为基质比对粗纤维降解率和总蛋白提升率的影响，图1-B为料液比对粗纤维降解率和总蛋白提升率的影响，图1-C为接种量对粗纤维降解率和总蛋白提升率的影响，图1-D为发酵时间对粗纤维降解率和总蛋白提升率的影响。
图2为各组小鼠肝组织切片图(200×)。
图3为各组小鼠肾组织切片图(200×)。
具体实施案例
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的菌种、材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到。下述实施例所用黄芪茎叶均采自甘肃省定西市岷县，经55℃干燥后粉碎，过28目筛。所用黑曲霉(ACCC 32589)、产朊假丝酵母(ACCC 1314)、枯草芽孢杆菌(ACCC 11025)购自中国国家微生物资源平台。
实施例1黄芪茎叶固态发酵混菌比例的筛选
本实施例通过比较效果优异的混菌的不同添加比例对发酵后黄芪茎叶发酵基质粗纤维降解率、总蛋白提升率的影响，获得最佳的混菌比例。
1.不同混菌比例固态发酵
以黑曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母为混菌发酵菌种，经过活化、扩增后制备各菌种种子液，种子液浓度均不低于106CFU/mL。混菌种子液的体积比例按照黑曲霉:枯草芽孢杆菌:产朊假丝酵母＝1:1:1、1:2:2、1:3:3、2:1:2、2:2:3、2:3:1、3:1:3、3:2:1、3:3:2进行配比。将黄芪茎叶与麦麸按质量比为7:3混合制备发酵基质，分装于锥形瓶中，料液比1:2，混匀，于121℃高压湿热灭菌20min，冷却后，将制备好的混菌发酵种子液按20％的接种量接种到黄芪茎叶发酵基质中，30℃恒温静置发酵4d。发酵结束后烘干，粉碎，过18～40目筛。
2.指标测定及评价
以发酵前的黄芪茎叶发酵基质作为对照，参照国家标准GB/T 6434—2006，采用过滤法测定不同混菌比例发酵后黄芪茎叶发酵基质粗纤维含量；采用BCA法测定总蛋白含量。并计算不同混菌比例发酵后黄芪茎叶发酵基质粗纤维降解率和总蛋白提升率。参照2018年5月Wang在IntJBiolSci发表的Improvement of animal feed additives of Ginkgoleaves through solid-state fermentation using Aspergillusniger中的方法，采用综合评分加权法进行赋分：粗纤维降解率为0.5，总蛋白提升率为0.5。满分100分。综合评分＝(粗纤维降解率×0.5/粗纤维降解率最大值+总蛋白提升率×0.5/总蛋白提升率最大值)×100，结果见表1。当黑曲霉:枯草芽孢杆菌:产朊假丝酵母＝3:1:3时，综合评分最高，在此混菌比例下，粗纤维降解率达到28.24％，总蛋白提升率高达106.11％。据此选择黑曲霉:枯草芽孢杆菌:产朊假丝酵母＝3:1:3为最佳混菌比例。
表1混菌比例筛选结果
实施例2黄芪茎叶固态发酵条件的筛选
本实施例以粗纤维降解率、总蛋白提升率为评价指标，先通过单因素试验挑选较好的单因素水平，然后进行正交试验，筛选出最佳发酵工艺。本实施例所用混菌发酵种子液为黑曲霉:枯草芽孢杆菌:产朊假丝酵母按3:1:3比例混合。黄芪茎叶的固态发酵基础工艺为：以黄芪茎叶:麦麸＝7:3比例混合作为发酵基质，料液比1:2，混匀，于121℃高压湿热灭菌20min，冷却后加入20％混菌种子液，于30℃发酵4d。发酵结束后烘干，粉碎，过18～40目筛。
1.单因素试验
(1)基质比对粗纤维降解率和总蛋白提升率的影响
在黄芪茎叶固态发酵基础工艺中，将黄芪茎叶:麦麸的质量比分别设定为5:0、9:1、4:1、7:3、3:2进行发酵。结果如图1-A所示，当黄芪茎叶:麦麸质量比＝7:3时，粗纤维降解率和总蛋白提升率均达到最大值，分别为30.41％和48.80％。
(2)料液比对粗纤维降解率和总蛋白提升率的影响
在黄芪茎叶固态发酵基础工艺中，将料液比分别设定为2:1、1:1、2:3、1:2、2:5进行发酵。结果如图1-B所示，随着含水量的增加，粗纤维降解率和总蛋白提升率呈先上升后下降的趋势，当料液比为1:2时，粗纤维降解率和总蛋白提升率均达到最大值，分别为33.65％和67.06％。
(3)接种量对粗纤维降解率和总蛋白提升率的影响
在黄芪茎叶固态发酵基础工艺中，将接种量分别设定为10％、15％、20％、25％、30％进行发酵。结果如图1-C所示，粗纤维降解率和总蛋白提升率随着接种量的增加呈先上升后下降的趋势，当接种量为25％时达到最大值，分别为32.94％和65.88％。
(4)发酵时间对粗纤维降解率和总蛋白提升率的影响
在黄芪茎叶固态发酵基础工艺中，将发酵时间分别设定为2d、3d、4d、5d、6d进行发酵。结果如图1-D所示，随着发酵时间的延长，粗纤维降解率和总蛋白提升率呈先上升后下降的趋势，在发酵至第5d时达到最大值，分别为30.70％和59.68％。
2.正交试验
结合单因素试验结果，选择接种量(A)、料液比(B)、基质比(C)、发酵时间(D)为考察因素，以粗纤维降解率和总蛋白提升率为评价指标，采用正交试验设计法进一步优化黄芪茎叶固态发酵工艺。指标评价方法参照2018年5月Wang在IntJBiolSci发表的Improvement ofanimal feed additives ofGinkgo leaves through solid-statefermentation usingAspergillusniger中的方法，采用综合评分加权法进行赋分：粗纤维降解率为0.5，总蛋白提升率为0.5。满分100分。综合评分＝(粗纤维降解率×0.5/粗纤维降解率最大值+总蛋白提升率×0.5/总蛋白提升率最大值)×100。正交试验因素及水平见表2，设计方案以及结果见表3。以综合评分值对正交试验结果进行方差分析，结果见表4。以极差最小的B因素为误差项，各因素作用主次为C>A>D>B，对粗纤维降解率和总蛋白提升率影响最大的因素为基质比，其次为接种量。根据试验结果得出黄芪茎叶混菌发酵最佳工艺为接种量30％、料液比2:3、基质比3:2、发酵时间5d。以上述优化后的最佳发酵条件平行制备3份黄芪茎叶混菌固态发酵物，测定其粗纤维降解率和总蛋白提升率，结果见表5，粗纤维平均降解率为34.02％，总蛋白平均提升率为82.55％，RSD值分别为5.56％、4.58％，表明该优化后的发酵工艺稳定可靠。
表2黄芪茎叶固态发酵工艺因素水平表
表3正交实验设计方案及直观分析
表4方差分析表
| 方差来源 | 差方和 | 自由度 | F值 | 显著性 |
| A | 515.41 | 2 | 18.19 | / |
| B | 28.34 | 2 | 1.00 | / |
| C | 1053.40 | 2 | 37.17 | P<0.05 |
| D | 97.26 | 2 | 3.43 | / |
表5验证实验结果
| 试验号 | 粗纤维降解率(％) | 总蛋白提升率(％) |
| 1 | 33.95 | 78.77 |
| 2 | 35.94 | 86.33 |
| 3 | 32.16 | 82.56 |
| 平均值 | 34.02 | 82.55 |
| RSD(％) | 5.56 | 4.58 |
。
实施例3黄芪茎叶固态发酵产物对小鼠生长性能的影响
本实施例以黑曲霉:枯草芽孢杆菌:产朊假丝酵母＝3:1:3为混菌发酵种子液，按照筛选后的最佳发酵工艺进行发酵：发酵基质质量比为黄芪茎叶:麦麸＝3:2，接种量30％，料液比2:3，发酵时间5d。发酵结束后烘干，粉碎，过28目筛。另取发酵前的黄芪茎叶发酵基质，过28目筛。以小鼠空白维持饲料为对照，评价黄芪茎叶发酵前后对小鼠生长性能的影响。
选择48只SPF级ICR健康刚断奶小鼠，雌雄各半，体重15～18g。在屏障内常规饲养管理，自由饮食、饮水。适应性喂养3天后将小鼠随机分成3组，分别为空白组、发酵前组(在小鼠维持饲料中添加4％黄芪茎叶发酵基质)、发酵后组(在小鼠维持饲料中添加4％黄芪茎叶混菌固态发酵物)，每组16只，分4笼饲养，每笼4只。空白组小鼠每天饲喂常规维持饲料，其他各组小鼠分别饲喂相应的受试物饲料，连续饲喂30d。
1.对小鼠生长性能的影响
对各组小鼠的生长性能进行检测、统计，结果如表6所示，与空白组相比，黄芪茎叶发酵前及发酵后组小鼠平均日增重均显著提高。此外，与发酵前组相比，发酵后组雄性小鼠平均日增重显著提高。
表6各组小鼠生长性能结果
a：与空白对照组相比，P<0.05；b：与发酵前组相比，P<0.05。
2.黄芪茎叶混菌固态发酵物安全性初步评价
末次饲喂24h后，小鼠眼眶取血，迅速转移至EP离心管中。同时取出其肝、肾组织。通过测定血常规、血液生化指标以及观察组织切片，初步评价黄芪茎叶混菌固态发酵物的安全性。
(1)对小鼠血常规指标的影响
测定各组小鼠血液白细胞数目、淋巴细胞数目、红细胞数目、血红蛋白、红细胞积压和血小板数目，结果如表7所示，与空白组相比，发酵前及发酵后组小鼠各血常规指标均无明显变化。
表7小鼠血常规指标测定结果
(2)对小鼠血液生化指标的影响
测定各组小鼠血液肝功能指标(丙氨酸氨基转移酶、白蛋白、总蛋白、葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯)和肾功能指标(尿素、肌酐)，结果如表8、表9所示，与空白组相比，发酵前及发酵后组小鼠各血液生化指标均无明显变化。
表8小鼠肝功能指标测定结果
表9小鼠肾功能指标测定结果
(3)对小鼠肝组织的影响
取各组小鼠肝组织，于4％多聚甲醛中保存，制作组织切片，HE染色，于显微镜下观察。结果如图2所示，空白组小鼠的肝组织切片可见，肝组织结构较完整，未见纤维组织增生，汇管区及小叶内无炎性细胞浸润，肝细胞排列及形态正常，未见明显肿胀、变性和坏死。与空白组相比，发酵前及发酵后组小鼠肝组织切片无明显差异。
(4)对小鼠肾组织的影响
取各组小鼠肾组织，于4％多聚甲醛中保存，制作组织切片，HE染色，于显微镜下观察。结果如图3所示，空白组小鼠的肾组织切片可见，皮质中肾小球分布均匀，肾小球中细胞数量以及基质均匀，肾小管上皮细胞圆润、饱满，刷状缘排列整齐规则，无明显肿胀与变性情况；髓质未见明显异常；泌尿小管之间结缔组织为肾间质，间质无明显增生；未见明显的炎性改变。与空白组相比，发酵前及发酵后组小鼠肾组织切片无明显差异。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一，制备发酵种子液，发酵种子液为枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、黑曲霉、平菇中一种或多种进行制备。
步骤二，用步骤一中的发酵种子液对黄芪茎叶发酵基质进行固态发酵，得到黄芪茎叶混菌固态发酵物。
2.根据权利要求1所述的一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，其特征在于：发酵种子液为黑曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母混合种子液。
3.根据权利要求1所述的一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，其特征在于：所述的黑曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母三者的种子液按照体积比为1:1:1、1:2:2、1:3:3、2:1:2、2:2:3、2:3:1、3:1:3、3:2:1、3:3:2中任一比例进行混合。
4.根据权利要求1所述的一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，其特征在于：黑曲霉、枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母三者的种子液按照体积比为3:1:3进行混合得到混合菌种发酵种子液。
5.根据权利要求1所述的一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，其特征在于：黄芪茎叶发酵基质由质量比为5:0～3:2的黄芪茎叶和麦麸组成。
6.根据权利要求5所述的一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，其特征在于：所述黄芪茎叶发酵基质由质量比为3:2的黄芪茎叶和麦麸组成；黄芪茎叶为烘干后粉碎，过18～40目筛网所得。
7.根据权利要求1～6任一项所述的黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，其特征在于：发酵条件为：黄芪茎叶发酵基质与水的料液质量比为2:1～2:5，发酵种子液的接种量10％～30％，发酵温度28～35℃，发酵时间2～6d；发酵结束后烘干，粉碎，过18～40目筛，即得黄芪茎叶混菌固态发酵物。
8.根据权利要求1所述的一种黄芪茎叶混菌固态发酵物的制备方法，其特征在于：发酵条件为：黄芪茎叶发酵基质与水的料液质量比2:3，发酵种子液的接种量30％，发酵温度30℃，发酵时间5d。
9.权利要求1～8任一所述方法制备所得的黄芪茎叶混菌固态发酵物在提高动物生长性能和饲料转化率中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：黄芪茎叶混菌固态发酵物的添加量为1％～10％。
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