CN103961398B - 四君子散在制备提高兔免疫性能的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了四君子散在制备提高兔免疫性能的药物中的应用，具体为在基础日粮中添加重量百分比为1％～5％的四君子散，然后饲喂家兔，饲喂后能够提高家兔圆小囊指数、胸腺指数、脾脏指数或引突指数，提高家兔的免疫力，同时饲喂后还可以提高抗菌蛋白基因的表达量，为四君子散提高兔免疫性能提供了理论指导。
Description
技术领域
本发明属于中药应用领域，具体涉及四君子散在制备提高兔免疫性能的药物中的应用。
背景技术
兔的回肠末端形成一厚壁的圆形囊状结构，称为圆小囊，是兔特有一个集消化、免疫和神经内分泌为一体的多功能器官，也是兔特有的肠道相关性淋巴组织。研究表明在兔圆小囊组织中发现有大量抗菌肽类物质存在，国内外学者已对家兔体内分离提取抗菌活性物进行了积极探索。比如，1984年，Selsted等应用RP-HPLC结合酸性尿素电泳技术纯化了兔中性粒细胞防御素的六种组分；另外，Ooi等从兔中性粒细胞中分离到了分子量为15KDa的抗菌蛋白等。国内学者佘锐萍和王可洲等用酸提取法从兔子的圆小囊组织中提取到了有抗菌活性的兔小囊肽。
四君子散为党参、白术、茯苓、甘草四味中药的散剂，传统配方中党参、白术、茯苓、甘草的重量比为2:2:2:1，主治脾胃气虚。现代研究表明，四君子散具有调整肠胃、增强机体免疫机能，促进骨骼造血功能，促使血压上升等作用。但是四君子散是对兔免疫性能的影响未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供四君子散在制备提高兔免疫性能的药物中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、四君子散在制备提高兔免疫性能的药物中的应用，所述四君子散由党参、白术、茯苓、甘草的重量比为2:2:2:1制成的散剂。
优选的，所述免疫性能为圆小囊指数、胸腺指数、脾脏指数或引突指数。
优选的，所四君子散在制备提高抗菌蛋白H2bc-like基因表达量的试剂中的应用。
优选的，所述四君子散的添加量为基础日粮中四君子散的重量百分比为1％-5％。
优选的，所述四君子散的添加量为基础日粮中四君子散的重量百分比为1％-5％。
本发明的有益效果在于：本发明公开了四君子散在制备提高兔免疫性能的药物中的应用，通过在兔基础日粮中添加四君子散，能够提高兔圆小囊指数、胸腺指数、脾脏指数或引突指数，由于圆小囊是兔特有的免疫器官，对兔圆小囊进一步研究发现，四君子散能够提高兔圆小囊抗菌蛋白基因的表达量，与空白对照组相比添加3％和5％的四君子散后抗菌蛋白H2bc-like表达量分别提高了90.77％和90.34％，为抗菌蛋白含量与兔免疫性能相关提供了证据(陈红伟，钟文杰，李英伦等，兔抗菌组蛋白对小白鼠生长和细胞免疫功能的影响，中国兽医学报，2014年5月第3卷第5期)，同时也对动物饲料的“无抗生素化”进程具有积极意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为四君子散对家兔圆小囊组织中H2bc-like mRNA表达的影响。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明中的四君子散的由党参、白术、茯苓、甘草按重量比2:2:2:1组成，其制备方法是将处方量的党参、白术、茯苓和甘草用植物粉碎机粉碎成粒径为250μm-850μm粗粉。
基础日粮参照NRC(1977)家兔饲养标准配制而成，具体组分如表1所示。
表1、基础日粮组成及其营养水平(风干基础，％)
| 原料 | 含量 | 营养成分 | 营养水平B |
| 玉米 | 24.9 | 消化能 | 10.46MJ/kg |
| 麸皮 | 17.0 | 粗蛋白质 | 16.00 |
| 花生秧 | 38.3 | 粗纤维 | 10.00 |
| 豆粕 | 17.0 | 粗脂肪 | 2.00 |
| 食盐 | 0.5 | 蛋氨酸+胱氨酸 | 0.60 |
| 磷酸氢钙 | 1.5 | 赖氨酸 | 0.65 |
| 预混料A | 0.8 | 精氨酸 | 0.95 |
| 总计 | 100 | 钙 | 0.40 |
| 磷 | 0.22 |
注：A：预混料为每千克饲粮提供：VA8000IU；VD31000IU；VE50mg；Lys1.59；Met1.5g；Cu50mg；Fe100mg；Mn30mg；Mg150mg；I0.1mg；Se0.1mg。B：营养水平为计算值。
实施例1
选用60只断奶后30日龄新西兰白兔，按体重相近、公母各半原则随机分成5个处理组，每个处理设3个重复，每个重复4只家兔。对照组(处理1)饲喂不添加任何药物的基础饲粮，抗菌药组(处理2)在基础日粮上添加重量百分数为0.025％的磺胺对甲氧嘧啶钠(SMD-Na)，处理3、4、5组分别在基础日粮上添加重量百分数为1％、3％、5％四君子散，饲料充分混合均匀。
饲养试验：饲养试验在西南大学教育部直属高校农林试点实践基地专用兔舍内进行，采取自由采食饲草、饮水，免疫消毒程序按兔场常规方法进行，试验场由专人负责和管理。日喂2次(7：00，19：30)，以食槽中无剩余料为原则，连续饲喂30天。每天清扫笼舍1次，整个笼舍采取自然采光、通风，所有笼舍进行不定期消毒。适应性饲养7天，期间对试验兔进行驱虫、防疫。
饲养试验结束后，通过Real-time PCR检测实验家兔H2bc-like mRNA相对表达量。
根据GenBank中登录的抗菌蛋白H2bc-like(Gene ID:XM_002714148.1)的基因序列和看家基因Gapdh序列，利用Primer5.0软件设计其特异性引物，具体如表2所示：
表2、PCR扩增引物序列特征
将设计的引物送苏州金维智生物有限公司合成。
然后提取实施例1中实验家兔的RNA，具体为：将家兔处死，采集圆小囊组织，用DEPC(焦碳酸二乙酯)水浸泡的剪刀，迅速剪碎，然后根据天根动物组织总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，提取后将总RNA置于-70℃保存备用。将提取的总RNA用Bio-rad公司反转录试剂盒(iSCRIPT Advanced cDNA SYNTHESIS)合成cDNA，操作步骤详见说明书。
将合成的cDNA利用Real-time PCR反应检测H2bc-like基因的表达量，反应体系如表3所示。
表3、Real-time PCR反应体系
并按如下程序检测，95℃预变性2分钟，95℃变性10秒、59℃退火15秒、72℃延伸15秒，循环40次，最后在65℃～95℃(0.5℃/cycle，每个循环保持1秒)分析溶解曲线。每个处理检测6个样本，每个样本重复检测三次，并统计检测结果，结果如表4。
表4、不同处理组H2bc-like mRNA相对表达量的汇总表
根据H2bc-like mRNA表达量统计四君子散对家兔圆小囊组织中H2bc-like mRNA表达的影响，结果如表5和图1所示。
表5、四君子散对家兔圆小囊组织中H2bc-like mRNA表达的影响
| 处理组 | 样本数 | 平均值(Means±SD) |
| 空白对照组 | 6 | 0.168±0.085Bc |
| 抗菌药组 | 6 | 0.576±0.339Bc |
| 5％四君子散组 | 6 | 1.739±0.693Aab |
| 3％四君子散组 | 6 | 1.821±1.236Aa |
| 1％四君子散组 | 6 | 0.960±0.409ABbc |
注：同一列上标不同大写字母的数据间差异极显著(P＜0.01)；标有不同小写字母的数据间差异显著(P＜0.05)；标有相同小写字母的数据间差异不显著(P＞0.05)。
结果表明，对比空白对照组和抗菌药对照组，四君子散三个添加组对家兔圆小囊组织中H2bc-like基因mRNA表达均明显促进作用。其中，3％、5％四君子散添加组H2bc-like基因mRNA表达量，分别比空白对照组提高了90.77％和90.34％(P＜0.01)；与抗菌药组相比，分别提高了68.38％和66.88％(P＜0.01)。另外，3％四君子添加组比1％添加组提高了47.28％(P＜0.05)，但3％和5％四君子散添加组间差异不显著(P＞0.05)，空白对照组和抗菌药对照组间差异不显著(P＞0.05)。同时可见，在家兔日粮中添加四君子散对H2bc-like基因mRNA表达量的影响存在非典型剂量依赖性，3％的添加量影响最明显。
实施例2
按实施例1的方法将四君子散按重量比为5％、3％、1％的添加量分别与和家兔基础日粮进行混合后重新制粒。然后选健康断奶家兔36只，雌雄各半，随即分成4组(四君子散高、中、低三个剂量组和空白对照组)，每个组3个重复，每个重复3只兔子，进行为期30日的动物饲养试验，并进行饲养前、中、后三次体重称量，并计算家兔日增重，结果如表6所示。
表6、家兔平均日增重
结果显示，高、中、低三个剂量组处理家兔平均日增重差异并不显著，但中剂量组的平均日增重比空白组大1g。
动物饲养试验结束后，剖杀兔子，取胸腺、脾脏、圆小囊、引突四个免疫器官，计算器官指数。
胸腺指数＝胸腺重(g)/体重(g)×1000
脾脏指数＝脾脏重(g)/体重(g)×1000
圆小囊指数＝圆小囊重(g)/体重(g)×1000
引突指数＝引突重(g)/体重(g)×1000
计算结果如表7所示，并对结果采用spss19.0对上述试验指标分别进行各用药组与空白组和模型组间的差异显著性分析。
表7、统计棘突免疫器官指数
注：字母不同表示差异显著(p<0.05)
由表7可知，中剂量组的四君子散处理后的圆小囊指数升高最为明显，此结果与实施例1中的检测结果一致，而高剂量组的四君子散处理后的胸腺指数、脾脏指数和引突指数上升最为明显。
血浆中淋巴细胞增殖试验(MTT试验)：取1mL新鲜抗凝血与全血及组织稀释液按体积比为1：1混匀后小心加于等体积的稀释液的液面上；以400g(约1500r/分)离心15分钟(半径15cm水平转子)。此时离心管中由上至下细胞分四层，第一层是血浆层；第二层是为环状乳白色淋巴细胞层；第三层是透明的分离液层；第四层是红细胞层；收集第二层细胞放入含洗涤液(Hank’s液)4～5mL的试管中，充分混匀后，以500g约(1800r/分)离心20分钟，弃去上清液留沉淀细胞重新悬起，重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。加入1640培养液调整细胞浓度为1×106个/mL，接种入96孔板，每孔100μL，每个样品重复8孔，同时用终浓度为10μL/mL的ConA液刺激，另设细胞凋零孔。将细胞板放入5％CO2、37℃培养箱中培养48h后，每孔避光条件下每孔加入20μL MTT液，继续培养3h后取出，每孔吸出上清液，加入100μL裂解液，在微量震荡器上混匀使其颜色变澄清，用酶联免疫仪检测490nm下的吸光度，作为淋巴细胞增殖的指标，结果如表8所示。
表8、淋巴细胞增殖统计结果
| 组别 | OD值 |
| 空白 | 0.202±0.054 |
| 高 | 0.322±0.113 |
| 中 | 0.436±0.176** |
| 低 | 0.286±0.096 |
由表8可知，本试验结果显示，与空白组对比，各试验组对家兔血浆淋巴细胞均具有不同程度的增殖作用，其中中剂量组尤为明显，提示四君子散能提高家兔血浆淋巴细胞增殖活性，有一定程度的剂量依赖。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (4)
1.四君子散在制备提高兔免疫性能的药物中的应用，其特征在于：所述四君子散由党参、白术、茯苓、甘草的重量比为2:2:2:1制成的散剂；所述免疫性能为圆小囊指数、胸腺指数、脾脏指数或引突指数。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述四君子散在制备提高抗菌蛋白H2bc-like基因表达量的试剂中的应用。
3.根据权利要求1-2任一项所述的应用，其特征在于：所述四君子散的添加量为基础日粮中四君子散的重量百分比为1%-5%。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述四君子散的添加量为基础日粮中四君子散的重量百分比为3%。
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