CN112961246B - 一种纳米微球抗生物膜肽cramp及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米微球抗生物膜肽CRAMP及其制备方法和应用，纳米微球抗生物膜肽CRAMP制备方法如下：将CRAMP制成溶液，活化CRAMP羧基，然后加入壳聚糖溶液使壳聚糖与CRAMP羧基偶联，形成壳聚糖‑CRAMP偶联物，再将壳聚糖‑CRAMP偶联物的氨基活化后加入氧化石墨烯胶体溶液，充分反应得到纳米微球抗生物膜肽CRAMP。该纳米微球抗生物膜肽CRAMP能显著减少生物被膜量，有更好的稳定性，以及更低的细胞毒性，有望开发成为可供内服的抗生物被膜感染的新型纳米制剂。

Description

一种纳米微球抗生物膜肽CRAMP及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及具体涉及一种纳米微球抗生物膜肽CRAMP，还涉及纳米微球抗生物膜肽CRAMP的制备方法，以及该纳米微球抗生物膜肽CRAMP在制备抗铜绿假单胞菌药物中的应用。
背景技术
细菌生物膜(biofilm，BF)是多个细菌黏附于非生物或生物表面，分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)，并将自身包裹其中形成的一种有组织的细菌集团，包含多糖、蛋白质、胞外DNA和脂质等，是一个具有三维立体空间结构的生态系。生物膜形式的细菌有了EPS的保护，可以逃避机体免疫系统的攻击以及抗菌药物的杀伤，耐药性增强，同时生物膜还能持续释放细菌，造成感染反复发作并且久治不愈。据报道，形成生物膜的细菌可以呈现出比浮游菌高达1000倍的抗生素耐药，使得生物膜在临床更易引发难治性慢性感染，严重威胁人类和动物健康。
公开号为CN108752433A的中国专利公开了一种抗微生物肽CRAMP及其环肽，对对铜绿假单胞菌的成熟生物被膜有显著清除作用，清除率达50％。但是仍然有50％左右的生物被膜未被清除，而且CRAMP的作用最佳时间只有1-2小时，干预成熟生物被膜4小时左右时，生物被膜又重新发育至和空白组相差无几。Karin Sauer等于2020年在《naturereviews microbiology》报道了，成熟生物被膜细菌分散成为浮游菌后，将恢复其代谢活性，有利于敏感抗生素的杀灭，因此促进成熟生物被膜的分散将是当前最有前途的控制生物被膜感染的策略。因此，亟需一种将CRAMP修饰优化后更有利于其在成熟生物被膜的“水道”内自由穿梭，使其到达生物被膜根部后释放出来，发挥其抑菌作用，为抗微生物肽进入临床应用提供基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纳米微球抗生物膜肽CRAMP；本发明的目的之二在于提供一种纳米微球抗生物膜肽CRAMP的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种纳米微球抗生物膜肽CRAMP在制备抑制铜绿假单胞菌药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种纳米微球抗生物膜肽CRAMP，所述纳米微球抗生物膜肽CRAMP由多肽CRAMP与壳聚糖、氧化石墨烯偶联制成；所述多肽CRAMP的氨基酸序列为GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPEQ。
优选的，纳米微球抗生物膜肽CRAMP，所述CRAMP与壳聚糖的质量比为1：1～1：3，所述CRAMP与氧化石墨烯的质量比为1：1～1：20。
2、一种纳米微球抗生物膜肽CRAMP的制备方法，包含如下步骤：
将CRAMP制成溶液，活化CRAMP羧基，然后加入壳聚糖溶液使壳聚糖与CRAMP羧基偶联，形成壳聚糖-CRAMP偶联物，再将壳聚糖-CRAMP偶联物的氨基活化后加入氧化石墨烯胶体溶液，充分反应得到壳聚糖-CRAMP-氧化石墨烯偶联物，透析冻干，即得纳米微球抗生物膜肽CRAMP。
优选的，所述活化CRAMP羧基的方法是使用EDC和NHS活化。
优选的，所述氨基活化的方法是将壳聚糖-CRAMP偶联物先加入四乙烯五胺溶液，再加入EDC和NHS反应。
优选的，所述CRAMP溶液的浓度为1mg/mL；所述壳聚糖溶液是壳聚糖浓度为20mg/mL的乙酸溶液；所述氧化石墨烯胶体浓度为0.5mg/ml。
优选的，所述活化CRAMP羧基的条件是在4℃避光搅拌30min；所述壳聚糖与CRAMP羧基偶联的条件是4℃避光搅拌24h；所述氨基活化的条件是在22℃以250rpm的转速下反应10小时；所述壳聚糖-CRAMP-氧化石墨烯偶联物制得的反应条件为250rpm的转速反应2h。
更优选的，所述活化CRAMP羧基加入EDC和NHS后终浓度分别为6.8mg/mL和11.9mg/mL。
优选的，所述透析使用的透析袋大小8000Da。
3、纳米微球抗生物膜肽CRAMP在制备清除细菌生物被膜的药物中的应用。
4、纳米微球抗生物膜肽CRAMP在制备抑制铜绿假单胞菌的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：将壳聚糖-CRAMP-氧化石墨烯偶联后，发现该偶联物能显著减少生物被膜量，激光共聚焦显微镜观察70％以上的生物被膜已经被根除。进一步研究发现，该纳米偶联物在生物被膜极性水道中可以自由穿梭，更有利于将CRAMP输送进入生物被膜根部。另外，还发现壳聚糖-CRAMP-氧化石墨烯偶联物可以通过减少生物被膜c-di-GMP水平和提高鼠李糖脂含量双途径作用促使生物被膜提前解聚转变为浮游菌，并使生物被膜空泡化，真正实现了根除生物被膜。同时，细胞毒性试验和溶血性试验发现安全性提高了，热稳定性、pH稳定性、盐离子稳定性，特别是消化酶稳定性(胃蛋白酶、胰蛋白酶)试验均发现稳定性明显优于CRAMP，有望开发成为可供内服的抗生物被膜感染的新型纳米制剂。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为激光共聚焦显微镜表征PAO1成熟生物被膜；
图2为不同处理组的抑菌效果；
图3为纳米微球抗生物膜肽CRAMP的稳定性和安全性检测。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.a)是一种常见的机会致病菌，是囊性纤维化(Cystic fibrosis，CF)等肺部慢性感染的主要致病菌，也是引起免疫力低下机体慢性反复感染的常见病原体。该菌对多种常见抗生素耐药，感染易反复发作，难以清除，究其原因主要是极易形成生物被膜(BF)，并能在动植物中引起广泛的感染，是目前所知种类最多，具有明显生态意义的细菌之一。因此本发明实施例以铜绿假单胞菌PAO1菌株为例研究对BF具有生物活性的物质。
本发明实施例中使用的抗微生物肽CRAMP的氨基酸序列如下：GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPEQ。
实施例1、纳米微球抗生物膜肽CRAMP的制备
a)壳聚糖溶液配制
取0.5g壳聚糖到25mL的0.5mol/L乙酸溶液中，作为工作药液，制成壳聚糖浓度为20mg/mL的溶液，并制备无壳聚糖的相同pH值空白组溶液作为对照组。
b)活化CRAMP的羧基
取2mL浓度为1mg/mL的CRAMP溶液，加入13.6mg的EDC和23.8mg的NHS，4℃避光搅拌30min，活化羧基。
c)壳聚糖-CRAMP偶联：
吸取250μL步骤a)制备的壳聚糖溶液，加入步骤b)制备的羧基活化后的CRAMP溶液中，4℃避光搅拌24h。
d)活化CRAMP的氨基：
将浓度为75mM的四乙烯五胺(TEPA)溶液稀释25倍并取1mL，加入到步骤c)制备的壳聚糖-CRAMP偶联物溶液中，再加入10μL浓度为50mM的EDC，10μL浓度为100mM的NHS，将以上溶液在22摄氏度下以250rpm的转速旋转和反应10小时。
e)稀释氧化石墨烯胶体
将浓度为2mg/ml的氧化石墨烯胶体稀释成0.5mg/ml。
f)壳聚糖-CRAMP-氧化石墨烯偶联
g)取步骤e)中制备的稀释后的氧化石墨烯胶体溶液200μL加入步骤d)中氨基活化后的CRAMP溶液中，继续放入摇床以250rpm的转速反应2h，反应完的液体经透析袋孔径为8000Da透析、冷冻干燥，得到壳聚糖-CRAMP-氧化石墨烯偶联物，配成合适的浓度使用。
实施例2、纳米微球抗生物膜肽CRAMP对PAO1菌株生物膜量及生物膜菌数的影响
1.体外构建成熟生物被膜
取100μL稀释好的工作菌液加入各个试验孔，将96孔板用保鲜膜封装好置于37℃恒温培养24小时，形成生物膜后，弃去上层培养液，PBS(pH＝7.4)液，洗涤3次，吸净PBS液，同时设置不同浓度的纳米CRAMP干预组、不同浓度CRAMP对照组、不同浓度抗菌药恩诺沙星对照组，以及未干预的空白对照组，干预时间为1h。以生物膜量为考察指标，筛选最佳作用浓度。
2.生物膜量的检测
取上述1制备好的生物膜，弃去上层培养液，PBS(pH＝7.4)液，洗涤3次，吸净PBS液；甲醇液固定10min，再加入100μL结晶紫染液20min，吸净结晶紫染液，PBS液洗3次；加入100μL醋酸溶液，吹打混匀，转移至另一96孔细胞培养板，在酶标仪630nm处测定吸光值。独立重复3次以上试验。
3.生物膜活菌计数
取上述1制备好的生物膜(37℃培养14h后)弃去上层培养液，PBS液洗三次，加入0.1％Triton溶液100μL，溶解生物膜，在96孔细胞培养板加入的MHB(1:1000)225μL，吸取25μL作10倍稀释至10-5梯度，取15μL进行滴板后培养计数。独立重复3次以上试验。
纳米微球抗生物膜肽CRAMP(即纳米CRAMP)在2MIC、MIC浓度下极显著减少了PAO1生物膜活菌数，Log值减少大于2，说明>99％生物膜细菌被抑杀；CRAMP仅在2MIC浓度下显著减少了生物膜活菌数，Log值减少大于1，说明>90％生物膜细菌被抑杀；而恩诺沙星几乎对生物膜活菌数没有影响，详见表1。
表1、PAO1株生物被膜活菌数(Log10)
Figure BDA0002940965250000041
Figure BDA0002940965250000051
备注：纳米CRAMP和CRAMP的MIC为15.625μg/ml。
结果如表2所示。结果显示纳米微球抗生物膜肽CRAMP在2MIC、MIC浓度下极显著减少了生物膜的量，1/2MIC浓度下显著减少了生物膜量；CRAMP在2MIC浓度下能显著减少生物膜量；恩诺沙星未能显著减少生物被膜量。
表2、PAO1株生物被膜量(OD630，x±SD)
Figure BDA0002940965250000052
注：*表示与未干预阴性对照孔对比差异显著(P＜0.05)；**表示与未干预阴性对照孔对比差异极显著(P＜0.01),***表示与未干预阴性对照孔对比差异极显著(P＜0.001)。
实施例3、激光共聚焦显微镜表纳米微球抗生物膜肽CRAMP对PAO1的抑菌效果
参照实施例2的实验方法，对经过纳米微球抗生物膜肽CRAMP(浓度为4MIC)处理、对照组(CRAMP，浓度4MIC)的PAO1成熟生物膜，采用SYTO 9/PI进行染色，SYTO 9发绿色荧光代表活菌数量，PI发红色荧光代表死菌。至少4次独立重复试验，每个样品至少观察4个不同视野，选择对照孔和实验孔有代表性的视野之一。在10倍、63倍物镜下分别进行z-stacks分层扫描。
对所有层扫(Z-Stack)的图像文件进行荧光强度统计学分析，结果见图1。图1中，每张图片的底部和右侧分别表示沿十字交叉的横切和竖切剖面图，A：对照孔的10×物镜下的CLSM图；B：对照孔的63×油镜下的CLSM图；C：纳米微球抗生物膜肽CRAMP干预后的10×物镜下的CLSM图；D：纳米微球抗生物膜肽CRAMP干预后的63×油镜下的CLSM图。结果显示，纳米微球抗生物膜肽CRAMP组与本试验组的对照孔比较，能显著的减少细菌总荧光强度，细菌总数减少了72.69％(P＜0.05)。纳米微球抗生物膜肽CRAMP组与对照孔比较，PI/PI+SYTO(死菌荧光强度/总荧光强度)，比值极显著增大(P＜0.01)，且显著大于未修饰CRAMP(P＜0.05)，见图2。图2中，Control：未经任何处理PAO1菌株荧光图；纳米CRAMP：纳米微球抗生物膜肽CRAMP处理的PAO1菌株荧光图；CRAMP：未修饰CRAMP处理的PAO1菌株荧光图。表明，纳米微球抗生物膜肽CRAMP对PAO1菌株生物被膜内的活菌有显著的抑杀作用，对PAO1成熟生物被膜具有明显的清除作用。
此外，还观察到纳米微球抗生物膜肽CRAMP处理的PAO1生物被膜大部分都被清除掉了。部分生物被膜在进行Z-stack扫描时发现每一层的细菌几乎都是死菌，说明纳米CRAMP能有效进入生物被膜内部进行杀灭细菌，而且能明显观察到生物被膜有中空的现象，见如图1，D。表明CRAMP经壳聚糖和氧化石墨烯修饰后能进入生物被膜底部，从而发挥其促进生物被膜释放解聚的功能，促使生物被膜从内部开始释放，进而空泡化。
实施例4、纳米微球抗生物膜肽CRAMP的安全性和稳定性
将蛋白酶根据说明书进行配制储备液。将反应终浓度为1mg/ml的蛋白酶分别与125μg/ml的CRAMP、纳米化CRAMP在37℃水浴条件下加热30min，未经酶处理的CRAMP、纳米CRAMP为对照组。最后采用打孔法在营养琼脂中测定抑菌圈的大小。
热稳定考察结果，见图3，A。图3A中，CRAMP：未经修饰CRAMP，纳米CRAMP：纳米微球抗生物膜肽CRAMP。纳米微球抗生物膜肽CRAMP在温度25℃、50℃、75℃、100℃处理后，MIC均未发生变化，且较未修饰的CRAMP更稳定。纳米微球抗生物膜肽CRAMP经过中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶三种蛋白酶处理后，抑菌效果较未经处理前差异较小(P＜0.05)，稳定性较好(见图3，B)。安全性考察中，纳米微球抗生物膜肽CRAMP后对家兔红细胞的溶血率更低(见图3，C)。壳聚糖-CRAMP-氧化石墨烯偶联物的浓度在0～160μg/mL范围内对鼠RAW264.7细胞无毒性，而未修饰的CRAMP在160μg/mL有一定的细胞毒性(P＜0.05)(见图3，D)。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一种纳米微球抗生物膜肽CRAMP及其制备方法和应用
<140> 202110176904X
<141> 2021-02-07
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Leu Leu Arg Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Glu Lys Leu Lys Lys
1               5                   10                  15
Ile Gly Gln Lys Ile Lys Asn Phe Phe Gln Lys Leu Val Pro Gln Pro
            20                  25                  30
Glu Gln

Claims (9)

1.一种纳米微球抗生物膜肽CRAMP，其特征在于：所述纳米微球抗生物膜肽CRAMP由多肽CRAMP与壳聚糖、氧化石墨烯偶联制成；所述多肽CRAMP的氨基酸序列为GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPEQ；所述CRAMP与壳聚糖的质量比为 1︰1~1︰3，所述CRAMP与氧化石墨烯的质量比为 1︰1~1︰20，所述生物膜为铜绿假单胞菌的生物被膜；
所述纳米微球抗生物膜肽CRAMP通过如下步骤制备：
将多肽CRAMP制成溶液，活化CRAMP羧基，然后加入壳聚糖溶液使壳聚糖与CRAMP羧基偶联，形成壳聚糖-CRAMP偶联物，再将壳聚糖-CRAMP偶联物的氨基活化后加入氧化石墨烯胶体溶液，充分反应得到纳米微球抗生物膜肽CRAMP，透析冻干，即得纳米微球抗生物膜肽CRAMP。
2.权利要求1所述纳米微球抗生物膜肽CRAMP的制备方法，其特征在于，所述制备方法包含如下步骤：
将多肽CRAMP制成溶液，活化CRAMP羧基，然后加入壳聚糖溶液使壳聚糖与CRAMP羧基偶联，形成壳聚糖-CRAMP偶联物，再将壳聚糖-CRAMP偶联物的氨基活化后加入氧化石墨烯胶体溶液，充分反应得到纳米微球抗生物膜肽CRAMP，透析冻干，即得纳米微球抗生物膜肽CRAMP。
3.根据权利要求2所述纳米微球抗生物膜肽CRAMP的制备方法，其特征在于：所述活化CRAMP羧基的方法是使用EDC和NHS活化。
4.根据权利要求2所述纳米微球抗生物膜肽CRAMP的制备方法，其特征在于：所述氨基活化的方法是将壳聚糖-CRAMP偶联物先加入四乙烯五胺溶液，再加入EDC和NHS反应。
5.根据权利要求2所述纳米微球抗生物膜肽CRAMP的制备方法，其特征在于：所述CRAMP制成溶液的浓度为1mg/mL；所述壳聚糖溶液是壳聚糖浓度为20mg/mL的乙酸溶液；所述氧化石墨烯胶体浓度为0.5mg/ml。
6.根据权利要求2所述纳米微球抗生物膜肽CRAMP的制备方法，其特征在于：所述活化CRAMP羧基的条件是在4℃避光搅拌30min；所述壳聚糖与CRAMP羧基偶联的条件是4℃避光搅拌24h；所述氨基活化的条件是在22℃以250rpm的转速下反应10小时；所述充分反应得到纳米微球抗生物膜肽CRAMP的反应条件为250rpm的转速反应2h。
7.根据权利要求2所述纳米微球抗生物膜肽CRAMP的制备方法，其特征在于：所述透析使用的透析袋孔径为8000Da。
8.权利要求1所述纳米微球抗生物膜肽CRAMP在制备清除铜绿假单胞菌生物被膜的药物中的应用。
9.权利要求1所述纳米微球抗生物膜肽CRAMP在制备抑制铜绿假单胞菌的药物中的应用。
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