CN109310644A - 包含植物糖原纳米颗粒的抗感染组合物 - Google Patents

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萨拉·鲁特·斯库林
利萨·苏珊娜·贝托洛
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埃尔兹塞贝特·帕普-绍博
卡尔·迈克尔·克林格尔
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Abstract

提供了包含糖原或植物糖原纳米颗粒的抗感染组合物。

Description

包含植物糖原纳米颗粒的抗感染组合物
本申请要求享有美国申请No.62/322,478的优先权，其结合于本文中作为参考。
技术领域
本发明涉及抗感染组合物。
背景技术
糖原是动物中的短期能量储存物质。在哺乳动物中，糖原出现于肌肉和肝脏组织中。它由1,4-葡聚糖链构成，通过α-1,6-糖苷键高度支化，分子量为106～108道尔顿。糖原存在于动物组织中，并还发现累积于微生物，例如，细菌和酵母中。
植物糖原(Phytoglycogen)是在其结构和物理性质两方面都与糖原非常相似的多糖。基于其基于植物的来源，它有别于糖原。植物糖原的最主要来源是甜玉米粒(kernelsof sweet corn)，以及特定品种的大米，大麦和高粱。
有人已经提出了糖原、植物糖原和相关类糖原物质的应用。
发明内容
本公开涉及包含糖原或植物糖原纳米颗粒(包括改性糖原或植物糖原如用季铵化合物官能化的阳离子化植物糖原(本文中称为“植物糖原纳米颗粒(phytoglycogennanoparticle)”))的抗感染组合物。此外，本公开涉及用作抗感染剂的包含植物糖原纳米颗粒的组合物。
在一个实施方式中，所述植物糖原纳米颗粒用伯、仲、叔或季铵化合物官能化。在优选的实施方式中，所述植物糖原纳米颗粒用季铵化合物官能化。在一个实施方式中，所述植物糖原纳米颗粒用具有以下通用结构的季铵化合物官能化：
P/G-(连接子)-N(R1R2R3)+
其中R1/2/3是C1-C32烷基链。在一些实施方式中，R1/2/3是C1-C30烷基链，优选C1-C24烷基链。在其他实施方式中，所述连接子是可选的，并且所述季铵化合物直接连接至所述纳米颗粒。所述连接子可以包含具有或不具有进一步的官能团的C1-C32烷基链，或低聚物或聚合物如聚环氧乙烷或聚乙烯亚胺。
在一个实施方式中，所述抗感染组合物包含与抗感染组分一起的糖原或植物糖原纳米颗粒和载体，其中所述抗感染组分包含一种或多种赋予所述组合物抗感染活性的分子。
在一个实施方式中，所述抗感染组合物包含通过动态光散射测量的多分散指数(PDI)小于约0.3的单分散植物糖原纳米颗粒的组合物。在一个实施方式中，所述抗感染组合物包含平均粒径为约30nm～约150nm的单分散植物糖原纳米颗粒的组合物。在一个实施方式中，所述抗感染组合物包含平均粒径为约60nm～约110nm的单分散植物糖原纳米颗粒的组合物。
在一个实施方式中，所述抗感染组分包含抗生物、抗真菌、抗寄生虫剂或抗原生动物化合物。
在各个实施方式中，所述植物糖原纳米颗粒与一种或多种抗生物、抗真菌、抗寄生虫和/或抗原生动物化合物结合。在其他实施方式中，所述植物糖原纳米颗粒与一种或多种抗生物、抗真菌、抗寄生虫和/或抗原生动物化合物同时给药。
在一个实施方式中，所述抗感染剂用作生物膜抑制剂。在一个实施方式中，所述组合物降低或抑制生物膜形成、维持或生长。在另一个实施方式中，所述组合物干扰群体感应(quorum sensing)过程和毒力因子的产生。
在一些实施方式中，所述抗感染组合物能够用作皮肤消毒剂或表面消毒剂，其中所述消毒剂为凝胶、洗剂、洗涤剂或喷雾剂的形式。在其他实施方式中，所述抗感染组合物用于治疗细胞内感染。
附图说明
图1显示了通过氰基化(cyanylation)的植物糖原/糖原纳米颗粒衍生。
图2是植物糖原/糖原纳米颗粒的示意图。
图3显示了与聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)相比，通过由Hep2(肝癌细胞)上的单分散糖原纳米颗粒所致的死细胞测量的细胞毒性。
图4显示了与聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)相比，通过在Hep2(肝癌细胞)上的单分散糖原纳米颗粒(nps)释放乳酸脱氢酶(LDH)所测量的细胞毒性。
图5显示了与罗丹明B结合的单分散植物糖原纳米颗粒一起孵育的正常鼠内皮细胞的荧光显微镜检查。
图6显示了与罗丹明B结合的单分散植物糖原纳米颗粒一起孵育的白细胞的荧光显微镜检查。
图7显示了在存在或不存在天然植物糖原(深灰色条)及其阳离子化形式(空心条)的情况下在生长期间铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的绿脓菌素(pyocyanin)生产。数据是三次独立实验的平均值，采取内部一式三份重复(n＝9±SEM)。
图8显示了铜绿假单胞菌PAO1的(图8a)游泳(swimming)，(图8b)颤搐(twitching)和(图8c)群集运动(swarming motility)受阳离子化植物糖原(□)的负面影响，而不受天然植物糖原(■)的负面影响。数据相对于在非补充条件下获得的平均值进行归一化。结果通过独立的三次重复实验以分析内一式三份重复和每个孔板记录三次测量(n＝27±SEM)进行确证。
图9显示了铜绿假单胞菌在补充有天然或阳离子化植物糖原的改良M9培养基中形成的生物膜的代表性图像。
图10显示了铜绿假单胞菌在补充有天然植物糖原的改良M9培养基(■)或King'sA培养基(◆)中的生物膜增生(biofilm accretion)的定量。比率数据是n＝9±SEM的平均值；吸光度值相对于仅在培养基中生长的生物膜的平均吸光度值归一化。
图11显示了铜绿假单胞菌在补充有阳离子化植物糖原的改良M9培养基(□)或King's A培养基(◇)中的生物膜形成的定量。比率数据是n＝9±SEM的平均值；吸光度值相对于仅在培养基中生长的生物膜的平均吸光度值归一化。
图12显示了在用阳离子化植物糖原对预形成生物膜处理后铜绿假单胞菌的生物膜增生的代表性图像。
图13显示了在用阳离子化植物糖原处理后铜绿假单胞菌预形成的生物膜的去除。实验以分析测试内一式四份重复进行，并重复三次。数据相对于所述20hT生物膜子集获得的所述平均A570进行归一化(n＝12±SEM)。
图14表明20h铜绿假单胞菌生物膜短期暴露于阳离子化植物糖原导致生物膜减少。20h生物膜仅暴露于培养基(黑色条)，和含有1mg天然植物糖原/mL(灰色条)或1mg阳离子化植物糖原/mL(空心条)的培养基。这些值是n＝12±SEM的平均值。
图15表明阳离子化植物糖原会防止增强的生物膜形成，这是所选抗生素的亚-MIC的不希望的特性。吸光度数据针对不含抗生素的相应培养基条件归一化。分析测试在穆勒-亨顿(Mueller-Hinton)培养基(●)或补充有1(●)或10mg(○)阳离子化植物糖原/mL的培养基中进行。这些值是n＝12±SEM的平均值。
图16表明阳离子化植物糖原和抗生素托普霉素(tobramycin)的组合会增强生物膜根除。吸光度数据针对无抗生素的相应培养基条件归一化。分析测试在穆勒-亨顿(Mueller-Hinton)培养基(●)或补充有1(●)或10mg(○)阳离子化植物糖原/mL的培养基中进行。这些值是n＝12±SEM的平均值。
图17表明阳离子化植物糖原和所述抗生素环丙沙星(ciprofloxacin)的组合增强了生物膜根除。吸光度数据针对不含抗生素的相应培养基条件归一化。分析测试在穆勒-亨顿(Mueller-Hinton)培养基(●)或补充有1(●)或10mg(○)阳离子化植物糖原/mL的培养基中进行。这些值是n＝12±SEM的平均值。
图18表明阳离子化而非天然植物糖原会导致细胞从悬浮液中沉积。代表性的图像呈现了含有在补充有天然或阳离子化植物糖原的培养基中孵育的细胞悬浮液的微量离心管。应该注意的是，在含有阳离子化植物糖原的管底部形成材料(细胞)，其伴随着所述上部液相的澄清。
图19显示了用天然或阳离子化植物糖原孵育的铜绿假单胞菌细胞的代表性透射电子显微照片。黑色箭头指示植物糖原。要注意阳离子化植物糖原在所述细胞表面的定位；白色箭头指示细胞表面扰动的区域。所述比例尺表示1μm。
图20显示了THP-1单核细胞对Cy5.5标记的PHX颗粒的内化：用Cy5.5-植物糖原纳米颗粒(1mg/mL)在4℃下孵育24h(A)，37℃下6h(B)和37℃下24h的THP-1细胞的荧光共聚焦图像。Cy5.5-植物糖原纳米颗粒，细胞核用DAPI染色，而细胞膜用AF488染色。
图21显示了取自裸CD-1小鼠的重复血液取样的Cy5.5-植物糖原的药代动力学曲线。
图22显示了在天然裸CD-1小鼠中i.v.注射后30分钟和24h之时离体成像的器官中荧光信号的定量。所述平均荧光浓度数据表明，除肝脏和肾脏外，还能够在肺和心脏中检测到高信号。30min时的荧光浓度高于24h之时。预扫描数据表示未注射Cy5.5-植物糖原的小鼠的所述荧光浓度数据(即，背景自发荧光)。数据表示为平均值+/-SD。
图23显示了在天然裸CD-1小鼠中i.v.注射Cy5.5-植物糖原之后30min和24h之时离体成像的脑中的荧光信号的定量。所述数据表明，与预扫描(自发荧光水平)相比，Cy5.5-植物糖原在大脑中存在可测量的信号。所述信号在30分钟之时最高，并在24h随时间缓慢下降。
具体实施方式
正如本文所用，所述术语“抗感染剂”是指限制感染进展或传播的药剂。抗感染剂包括抗微生物剂如抗菌剂，抗真菌剂和抗寄生虫剂，它们通过限制细胞生长或导致细胞死亡而起作用。抗感染剂还包括通过除生长抑制和细胞死亡之外的机制限制感染进展或传播的那些药剂。抗感染剂可以通过改变感染因子和靶宿主的生理反应而起作用。群体感应抑制剂(Quorum sensing inhibitor)是前者的一个实例；后者的疫苗。正如本文所用的所述术语“抗感染剂”可以通过抗微生物活性起作用，也可以通过减弱或修改毒力因子生产而起作用。正如本文所用的所述术语“毒力因子(virulence factor)”是由细胞产生的有助于所述生物体引起感染的能力的那些因子。毒力因子可以从所述细胞中排出，分泌或脱落(例如，酶，毒素)，可以是细胞的部件(例如，膜修饰)，或所述细胞的行为(例如，运动，生物膜形成)
所述术语“抗生素”和“抗菌剂”可互换使用，是指用于治疗或预防细菌感染或细菌传播的药剂，并包括杀死细菌或抑制细菌生长的药剂。所述术语“抗真菌”用于指用于治疗或预防真菌感染或真菌传播的药剂，并包括杀死真菌或抑制真菌生长的药剂。
正如本文所用，所述术语“生物膜”是指微生物的聚集体，包括细菌，古细菌，病毒，原生动物，真菌或藻类，其中细胞经常嵌入自身产生的细胞外聚合物质(EPS)的基质中，并彼此粘附和/或粘附至表面上。
正如本文所用，所述术语“阳离子化植物糖原”是指经改性从而包含带正电荷的官能团的植物糖原，如含有短链季铵化合物的那些。所述短链季铵化合物包括至少一个具有1～32个碳原子，优选1～30个碳原子，更优选1～24个碳原子，未取代或被一个或多个N、O、S或卤素原子取代的烷基部分。在优选的实施方式中，所述短链季铵化合物包括至少一个具有1～16个碳原子的烷基部分。在一个实施方式中，所述改性剂是3-(三甲基氨基)-2-羟基丙-1-基，具有取代度为0.05～2.0，优选0.3～1.2。
正如本文所用，所述术语“细胞外聚合物质(extracellular polymericsubstance)”(EPS)是指微生物自身产生的基质，以及任何结合的外来物质，通常由各种结构形式的细胞外生物聚合物构成，包括，例如，细胞外DNA，蛋白质，脂类和多糖。
正如本文所用，“治疗有效量”是指在必要的剂量和特定时间段内有效实现所需治疗结果的量。所述药理学试剂的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及所述药理学试剂在所述个体中引发所需反应的能力而变化。治疗有效量也是药理学试剂的任何毒性或有害作用被所述治疗有益效应超过的量。
正如本文所用，“患者”是指针对感染受到治疗的动物，其在一个实施方式中可以是脊椎动物，在一个实施方式中是哺乳动物，在一个实施方式中是人类患者。正如本文所用，所述术语“治疗”是指给予本发明的组合物以实现疾病或病症的改变或改善，其可以包括缓解其一种或多种症状。所述用途可以是预防性的。预防、改善和/或治疗可能需要定期给予多个剂量，或在疾病或病症发作之前给药从而改变所述疾病或病症的进程。
本公开涉及包含糖原或植物糖原纳米颗粒(包括经改性的糖原或植物糖原，如用短链季铵化合物官能化的阳离子化植物糖原(“植物糖原纳米颗粒”))的抗感染组合物。此外，本公开涉及用作抗感染剂的包含植物糖原纳米颗粒的组合物。在一个实施方式中，所述抗感染剂用作生物膜抑制剂。
在一个实施方式中，所述纳米颗粒可以用作抗生素治疗的组分，从而减少实现所需治疗结果所需的抗生素的量。
植物糖原由α-D葡萄糖链的分子构成，具有平均链长11～12，具有1→4键和出现于1→6的支化点，并具有支化度约6％～约13％。在一个实施方式中，植物糖原包括源自天然来源的植物糖原和合成植物糖原。正如本文所用，所述术语“合成植物糖原”包括在包括植物衍生物质，例如，淀粉的底物上使用酶促方法制备的类糖原产物。
用于获得糖原和植物糖原的大多数已知方法的产率和糖原和植物糖原的大多数商业来源是高度多分散产物，其包括糖原或植物糖原颗粒，以及糖原或植物糖原的其他产物和降解产物，这将使它们在本文所述的组合物和方法中不太有效。因此，使用合适的基本上单分散的糖原或植物糖原。这些基本上单分散的糖原或植物糖原纳米颗粒具有较低的多分散指数。在优选的实施方式中，使用单分散的植物糖原纳米颗粒。在一个实施方式中，所述单分散植物糖原纳米颗粒是Mirexus Biotechnologies，Inc.的PhytoSpherixTM。
在一个实施方式中，植物糖原是指根据本文描述的方法制备的单分散植物糖原纳米颗粒。所描述的方法能够产生基本上球形的纳米颗粒，其是单一植物糖原分子。
在优选的实施方式中，使用了单分散阳离子化植物糖原纳米颗粒。
以下详述的是植物糖原纳米颗粒的单分散组合物。本文所述组合物的单分散性质和颗粒性质与使其非常适合用于抗感染应用的性质相关。此外，这些植物糖原纳米颗粒合适地具有约30～150nm的尺寸，在一个实施方式中，具有约60～110nm的尺寸。
因此，在优选的实施方式中，使用了单分散植物糖原纳米颗粒的抗感染组合物。
正如本文所教导的植物糖原纳米颗粒具有许多使其特别适用于抗感染组合物的特性。许多现有药物迅速从所述体内消除，导致需要剂量增加。所述植物糖原纳米颗粒的致密球形性质与有效的细胞摄取相关，同时植物糖原的高支化性质和高分子量据信分别与缓慢酶降解和血管内保留时间增加相关。
正如图2所示，每个植物糖原颗粒是单分子，由特征为非常高分子量(最高达107Da)的高度支化的葡萄糖均聚物制成。这种均聚物由具有1→4键和出现于1→6处的支化点并具有约10％的支化度的α-D-葡萄糖链构成。这些颗粒是球形的，并能够通过改变所述起始材料和过滤步骤制成直径在30至150nm的范围内的不同尺寸。所述植物糖原纳米颗粒上的高密度表面基团导致植物糖原纳米颗粒的各种独特性质，如在水中的快速溶解，低粘度和在高浓度植物糖原纳米颗粒下对水溶液的剪切稀化效应。这与具有可比较分子量的线性和低支化多糖的高粘度和较差溶解度形成对比。此外，它允许在水或DMSO中配制高浓度(最高达30％)的稳定分散体。
正如所述实施例证实的，本发明人发现，植物糖原纳米颗粒能够被不同类型的细胞在细胞内积累。
当植物糖原纳米颗粒进行内化时，所述纳米颗粒被细胞水解酶消化。分解速率能够通过小分子的植物糖原衍生化程度，例如，甲基化，羟丙基化(其影响水解酶对多糖链的亲和力，因此影响水解速率)进行控制。
所述植物糖原纳米颗粒能够用特异性组织靶向分子进一步改性。
植物糖原纳米颗粒是无毒的，没有已知的变应原性(allergenicity)，并能够被人体的糖原分解酶(例如，淀粉酶和磷酸化酶)降解。酶促降解的产物是无毒的葡萄糖分子。
植物糖原纳米颗粒通常是光稳定的，并在很宽的pH，电解质，例如，盐浓度范围内是稳定的。
美国专利申请公开No.US 2010/0272639 A1(受让于本发明所有者并且其公开内容以其全部引入本文中作为参考)，提供了从细菌和贝壳类鱼生物质生产糖原纳米颗粒的方法。所公开的方法通常包括以下步骤：机械细胞崩解或通过化学处理；通过离心分离不溶性细胞组分；通过酶处理从细胞裂解物中除去蛋白质和核酸，然后进行透析，产生含有粗多糖、脂质和脂多糖(LPS)的提取物，或可替代地，苯酚-水提取物；通过弱酸水解或通过用多价阳离子盐处理消除LPS，这导致不溶性LPS产物的沉淀；通过超滤和/或尺寸排阻色谱法纯化所述富含糖原部分；和采用合适有机溶剂或浓缩糖原溶液沉淀糖原能够通过超滤或超速离心获得；和冷冻干燥从而产生糖原粉末。由细菌生物质产生的糖原纳米颗粒特征在于Mwt5.3～12.7×106Da，具有直径35～40nm的粒径，并是单分散性的。
制备植物糖原的单分散组合物的方法公开于以国际申请公开号WO 2014/172786出版的题为“植物糖原纳米颗粒及其制备方法(Phytoglycogen Nanoparticles andMethods of Manufacture Thereof)”的国际专利申请中，其公开内容以其全部结合于本文中作为参考。在一个实施方式中，所述单分散植物糖原纳米颗粒的制备方法包括：a.将崩解的含有植物糖原的植物材料浸入温度约0℃～约50℃的水中；b.将步骤(a.)的产物进行固液分离从而获得水性提取物；c.使步骤(b.)的水性提取物通过最大平均孔径为约0.05μm～约0.15μm的微滤材料；和d.使来自步骤c.的所述滤液进行超滤处理从而除去分子量小于约300kDa的杂质，在一个实施方式中，小于约500kDa的杂质，以获得包含单分散植物糖原纳米颗粒的水性组合物。在所述方法的一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料是选自由玉米，大米，大麦，高粱或其混合物的谷物。在一个实施方式中，步骤c.包括使步骤(b.)的所述水性提取物通过(c.1)最大平均孔径为约10μm～约40μm的第一微滤材料；(c.2)最大平均孔径为约0.5μm～约2.0μm的第二微滤材料，和(c.3)最大平均孔径为约0.05至0.15μm的第三微滤材料。所述方法能够进一步包括使用淀粉蔗糖、糖基转移酶、支化酶或其任何组合对包含单分散植物糖原纳米颗粒的所述含水组合物进行酶处理的步骤(e.)。所述方法避免使用降解植物糖原材料的化学、酶促或热处理。所述水性组合物能够进一步干燥。
在一个实施方式中，所述纳米颗粒由甜玉米起始材料(Zea mays var.saccharata和Zea mays var.rugosa)产生。在一个实施方式中，所述甜玉米是标准(su)型或含糖增强型(se)型甜玉米。在一个实施方式中，所述组合物由甜玉米的凹痕阶段(dent stage)或灌浆阶段(milk stage)籽粒产生。与来自动物或细菌来源的糖原不同，使用植物糖原会降低朊病毒或内毒素污染的风险，其可能与这些其他来源有关。
所述纳米颗粒组合物的多分散指数(PDI)能够通过动态光散射(DLS)技术测定，并在这个实施方式中，PDI被确定为标准偏差与平均直径之比的平方(PDI＝(σ/d)2。PDI也能够通过聚合物分子量的分布表示，并且在这个实施方式中，定义为Mw/Mn比率，其中Mw是重均摩尔质量，Mn是数均摩尔质量(此后这PDI测量称为PDI*)。在第一种情况下，单分散材料具有零(0.0)的PDI，并且在第二种情况下，所述PDI*将为1.0。
在一个实施方式中，提供了包含单分散植物糖原纳米颗粒的组合物，基本上由其组成或由其组成的抗感染组合物。合适的是，这些纳米颗粒按照如下文进一步的描述进行改性。在一个实施方式中，所述抗感染组合物包含具有通过动态光散射测量的小于约0.3，小于约0.2，小于约0.15，小于约0.10，或小于0.05的PDI的单分散植物糖原纳米颗粒的组合物，基本上由其组成，或由其组成。在一个实施方式中，所述抗感染组合物包含具有通过SECMALS测量的小于约1.3，小于约1.2，小于约1.15，小于约1.10，或的小于1.05的PDI*的单分散植物糖原纳米颗粒的组合物，基本上由其组成，或由其组成。
在一个实施方式中，所述抗感染组合物包含平均粒径约30nm～约150nm的单分散植物糖原纳米颗粒的组合物，基本上由其组成，或由其组成。在一个实施方式中，所述抗感染组合物包含平均粒径约60nm～约110nm的单分散植物糖原纳米颗粒的组合物，基本上由其组成，或由其组成。在其他实施方式中，提供了包含平均粒径约40～约140nm，约50nm～约130nm，约60nm～约120nm，约70nm。nm～约110nm，约80nm～约100nm的纳米颗粒的组合物，基本上由其组成，或由其组成。这些纳米颗粒可以按照下文进一步的描述进行改性。
如实施例1和题为“植物糖原纳米颗粒及其制备方法(PhytoglycogenNanoparticles and Methods of Manufacture Thereof)”以国际申请公开号WO/2014/172786公开的国际专利申请No.PCT/CA2014/000380中详细描述的所述生产植物糖原纳米颗粒的方法，适于在药物等级条件下制备。
植物糖原纳米颗粒的化学改性
为了赋予植物糖原纳米颗粒特异性性质，它们能够通过糖化学常用的许多方法进行化学改性。
因此，在优选的实施方式中，所述植物糖原纳米颗粒进行了改性。所获得的产物在本文中可互换地称为官能化纳米颗粒或衍生物。官能化能够在所述纳米颗粒的表面上进行，或在所述颗粒的表面和内部进行，但保持了所述糖原或植物糖原分子作为单一支化均聚物的结构。在一个实施方式中，所述官能化在所述纳米颗粒的表面上进行。正如本领域技术人员所理解的那样，化学改性应该是无毒的并通常对于人类消费是安全的。根据上述方法制备的植物糖原纳米颗粒的化学特性可以由其亲水、微带负电荷的天然状态变为带正电和/或带负电，或部分或高度疏水。多糖的化学处理在本领域内是熟知的。参见，例如，J.FRobyt，Essentials of Carbohydrate Chemistry，Springer，1998；和M.Smith，andJ.March，March’s Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and StructureAdvanced Organic Chemistry,Wiley,2007。
正如下文将进一步描述的，经改性而具有正电荷的纳米颗粒证实具有抗感染活性，包括抗微生物活性。
所述纳米颗粒能够直接或间接地官能化，其中能够使用一种或多种中间连接基或间隔基。所述纳米颗粒能够进行一个或多个官能化步骤，包括两个或更多个，三个或更多个，或四个或更多个官能化步骤。
通过化学官能化植物糖原的羟基(通过用适当官能化的烷基醚化，通过羟基相互转化成另一个官能团，或通过氧化)能够产生各种衍生物。这种官能团包括，但不限于，亲核和亲电基团，以及酸性和碱性基团，例如，羰基，胺基，巯基，羧基及其衍生物如酰胺或酯，叠氮，腈，卤化物(halogenide)和假卤化物(pseudo-halogenide)如甲苯磺酰基，甲磺酸基或三氟甲磺酸酯，以及烃基如烷基，乙烯基，苯基，苄基，炔丙基和烯丙基。氨基能够是伯氨基，仲氨基，叔氨基或季氨基，优选季氨基。
功能化纳米颗粒能够进一步与各种所需分子结合，所述各种所需分子是对于多种应用感兴趣的，如生物分子，小分子，治疗剂，微米和纳米颗粒，药学活性部分，大分子，诊断标记，螯合剂，分散剂，电荷改性剂，粘度调节剂，表面活性剂，凝结剂和絮凝剂，以及这些化学化合物的各种组合。在某些实施方式中，使用了两种或更多种不同的化合物生产多官能衍生物。
在一个实施方式中，所述官能化纳米颗粒使用季铵化合物改性。
葡萄糖亚基上的羟基的反应活性较低。即便如此，在高pH下与环氧化物，烷基卤化物或酸酐有可能反应，形成所述相应的醚键或酯键。具有环氧化物或酸酐官能团的水溶性化学品在碱性pH(8～13)下与植物糖原纳米颗粒(在合适的催化剂存在下)反应。虽然通常优选在水性环境中进行衍生，但一些反应(例如，与烷基卤化物)最好在有机溶剂如二甲基亚砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF)，二甲基乙酰胺或吡啶，或前述溶剂与盐如氯化锂或四丁基氟化铵的混合物中进行。对于本领域技术人员显而易见的是，在相对温和的条件下具有低毒性和反应性的水溶性化合物是特别合适的。
一种提高羟基反应性的简单方法是选择性氧化葡萄糖在C-2，C-3，C-4和/或C-6位置上的羟基，产生羰基或羧基基团或羧基。可以使用多种氧化还原引发剂，如过硫酸盐，高碘酸盐(例如，高碘酸钾，溴，亚氯酸钠(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧代基(2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1yl)oxidanyl)，通常称为TEMPO，和戴斯-马丁-高碘烷(Dess-Martin periodinane)。
用羰基官能化的植物糖原纳米颗粒对带有伯胺或仲胺基团的化合物易于反应。这导致亚胺形成(方程式1)，其能够用还原剂，例如，硼氢化钠进一步还原成胺(方程式2)。这个还原步骤提供了比所述亚胺中间体更稳定的氨基产物，并还将未反应羰基转化成羟基。羰基的消除显著降低了衍生的纳米颗粒与非靶向分子(例如，血浆蛋白)的非特异性相互作用的可能性。
(方程式1)P/G NANO-CH＝O+H2N-R→P/G NANO-CH＝NH-R+H2O
还原剂
(方程式2)P/G NANO-CH＝NH-R→P/G NANO-CH2-NH-R
羧基能够使用偶联剂如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)或1,1'-羰基二咪唑(CDI)，采用或不采用辅助试剂，如1-羟基苯并三唑(HOBt)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化。然后，所述活化的羧酸酯在非常温和的条件下与亲核试剂如氨基或羟基反应(实施例9，10)。这种类型的活化能够用于活化小分子上的羧基，并使其与天然植物糖原的羟基或胺化植物糖原的氨基进行反应；或它能够用于活化氧化的植物糖原上的羧基并使含氨基小分子与之连接(实施例12)。
在某些实施方式中，所述纳米颗粒通过氰基化的过程进行官能化。这个过程会导致多糖羟基上形成氰酸酯和亚氨基碳酸酯。这些基团在非常温和的条件下很容易与伯胺反应，形成共价键(图1)。氰化试剂如溴化氰和1-氰基-4-二乙氨基-吡啶鎓(CDAP)能够用于所述纳米颗粒的官能化。
带有能够结合至存在于植物糖原或改性植物糖原上的官能团的官能团的化学化合物能够直接连接至所述纳米颗粒上。然而，对于一些应用，化学化合物可以通过聚合物间隔基或“连接基”连接。这些能够是带有官能团如氨基、羰基、羧基、巯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、异氰酸酯的均-或杂-双官能连接基，(例如，二氨基己烷，亚乙基糖基双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)，二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯，二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)，氨基乙硫醇等)。
通过改变其疏水性能够进一步增强用季铵化合物官能化的改性植物糖原纳米颗粒的抗微生物活性。因此，在优选的实施方式中，所述糖原或植物糖原纳米颗粒用季铵和疏水基团进行双重改性。所述疏水相互作用能够通过选择合适的取代度和疏水性官能团进行精细调节。官能团实例包括但不限于，脂族烷基，烯基，炔基或苄基醚和酯或链长1～24的三烷基甲硅烷基醚(实施例5～7)。
在一个实施方式中，提供了治疗患有微生物感染的受试者的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的如本文所述的组合物。在一个实施方式中，所述组合物包含具有表面正电荷的官能化植物糖原纳米颗粒。在一个实施方式中，所述植物糖原纳米颗粒用仲、叔或季铵基团官能化。在一个实施方式中，所述组合物包含用两亲性基团官能化的植物糖原纳米颗粒。在一个实施方式中，所述组合物包含用季铵化合物官能化的糖原或植物糖原纳米颗粒。在某些实施方式中，如上所述的植物糖原纳米颗粒可以进行官能化并且无需进一步结合就能够使用。
在其他实施方式中，所述纳米颗粒可以进一步与其他化学化合物结合，该其他化学化合物能够包括生物分子、小分子、治疗剂、药学活性部分、大分子、诊断标记、螯合剂、分散剂、表面活性剂、电荷改性剂、粘度调节剂、凝结剂和絮凝剂(仅举几例)，以及上述的各种组合。
能够结合的生物分子包括肽，酶，受体，神经递质，激素，细胞因子，细胞应答化学化合物如生长因子和趋化因子，抗体，疫苗，半抗原(haptens)，毒素，干扰素，核酶，反义试剂和核酸。
根据一个实施方式的抗感染组合物包括与其他分子结合的官能化单分散植物糖原纳米颗粒。在各种实施方式中，所述植物糖原纳米颗粒进一步与药物结合。在各种实施方式中，所述纳米颗粒与抗生素、抗真菌剂、抗寄生虫和/或抗原生动物化合物中的一种或多种结合。用作改性剂的药学上有用的部分包括疏水性改性剂，药代动力学改性剂和生物活性改性剂。
与植物糖原纳米颗粒结合的化学化合物可以具有光吸收，光发射，荧光，发光，拉曼散射，荧光共振能量转移和电致发光性质。
两种或多种不同化合物能够用于生产多官能衍生物。例如，一种化合物能够选自特异性结合生物分子的列表，如抗体和适体，而所述第二种化合物将会选自抗感染剂的列表。例如，一种化学化合物可以是阳离子物质，而所述第二种化合物可以是抗生素。
负载效率取决于待结合的所述分子的分子量和性质(电荷，疏水性等)。取代度表示为用所述药物衍生的脱水葡萄糖单元的％。例如，如果所述药物具有100Da的分子量，所述取代度为50％，则1g植物糖原纳米颗粒将携带0.31g所述药物。对于小分子(<100Da)，通常实现>30％的取代度，对于甲基基团则高达100％。较大的分子(其不能穿透所述颗粒的孔结构)能够仅结合于所述植物糖原纳米颗粒的表面上，并且所述取代度较低，通常为0.1％～2.0％。
抗感染活性
正如实施例中的详细描述，本发明人开发出了植物糖原纳米颗粒的组合物，包括其功能化形式(具有使其非常适合用于抗感染应用的特性)。
在一个实施方式中，提供了一种包含带正电荷的植物糖原纳米颗粒、由其组成或基本上由其组成的抗感染组合物。正如以上所述，通过许多技术能够使植物糖原纳米颗粒的表面成为阳离子性的。
在一个实施方式中，描述了包含植物糖原的抗感染组合物，优选带正电荷的植物糖原纳米颗粒。在一个实施方式中，所述组合物进一步包含载体，在一个实施方式中，所述载体是药用载体。
在一个实施方式中，所述纳米颗粒用两亲化合物进行改性。
能够使其适用作抗感染剂的植物糖原纳米颗粒的阳离子改性，可以包括仲氨基，叔氨基或季氨基，特别是采用季铵衍生物的改性。在一个实施方式中，所述季铵衍生物能够选自羟丙基-三甲基铵和羟丙基-烷基-二甲基铵，其中烷基为脂族C2-C32脂族烃，例如但不限于，月桂基-，肉豆蔻基-或硬脂基-。在另一个实施方式中，所述烷基是C2-C32烃，优选C2-C30，更优选C2-C24。
细菌表面通常是阴离子性的，并且不希望受理论束缚，本发明人假设在植物糖原纳米颗粒的表面上产生局部高密度的阳离子化基团会产生能够影响细菌生长和生理的基于累积电荷的效应。
正如实施例所证，在植物糖原纳米颗粒的组合物存在下显示出抗大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和产朊假丝酵母(Candida utilis)的抗感染活性。
在一个优选的实施方式中，所述植物糖原纳米颗粒改性成用短链季铵化合物官能化的阳离子化形式。
正如实施例中所示，在阳离子化植物糖原存在下培养后，针对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和产朊假丝酵母显示出各种类型抗生素的增强的抗感染易感性。
在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒与抗生素共同给药，所述抗生素可以选自，但不限于，青霉素类，羧基青霉素类，氨基青霉素类，糖肽类，喹诺酮类，头孢菌素类，大环内酯类，氟喹诺酮类，利胆醇类(Phenicol)，磺胺类，四环素类，氨基香豆素类，脂肽类或氨基糖苷类。
在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒与抗真菌剂共同给药，所述抗真菌剂可以选自，但不限于，多烯，咪唑，三唑，噻唑，烯丙胺或棘球白素(Echinocandin)抗真菌剂。
在一个实施方式中，提供了包含植物糖原纳米颗粒和抗生素的抗感染组合物，所述抗生素可以选自，但不限于，青霉素类，羧基青霉素类，氨基青霉素类，糖肽类，喹诺酮类，头孢菌素类，大环内酯类，氟喹诺酮类，利胆醇类，磺胺类，四环素类，氨基香豆素类，脂肽类，阳离子型抗微生物肽类或氨基糖苷类。
在一个实施方式中，提供了包含植物糖原纳米颗粒和抗真菌剂的抗感染组合物，所述抗真菌剂可以选自，但不限于，多烯，咪唑，三唑，噻唑，烯丙胺或棘球白素抗真菌剂。
在一个实施方式中，所述纳米颗粒与抗生素结合，所述抗生素可以选自，但不限于，青霉素类，羧基青霉素类，氨基青霉素类，糖肽类，喹诺酮类，头孢菌素类，大环内酯类，氟喹诺酮类，利胆醇类，磺胺类，四环素类，氨基香豆素类，脂肽类，阳离子型抗微生物肽类或氨基糖苷类。
在一个实施方式中，所述纳米颗粒与抗真菌剂结合，所述抗真菌剂可以选自，但不限于，多烯，咪唑，三唑，噻唑，烯丙胺或棘球白素抗真菌剂。
在一个实施方式中，所述抗感染组合物进一步包含药用载体或赋形剂。
正如本文所述的抗感染组合物可以用于治疗细菌、真菌或寄生虫感染，并还可以预防性使用。
本发明还提供了治疗微生物感染的方法，包括向对此需要的受试者给予治疗有效量的如本文所述的抗感染组合物。在一个实施方式中，所述微生物感染是真菌感染。在一个实施方式中，所述微生物感染是细菌感染。
在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒用作共治疗剂而不是用作抗生素，但是用作调节微生物毒力和致病性的抗感染剂。
所述感染可以是细胞内感染。
植物糖原纳米颗粒的所述抗感染活性可以通过减少或抑制生物膜的形成、维持或生长而整体或部分起效，这在下文更具体地进行讨论。
在一些实施方式中，植物糖原纳米颗粒的所述抗感染活性可以通过对由感染剂如细菌，酵母，真菌或寄生虫生产毒力因子的减弱或改变，导致引起感染的能力降低而起起效。
在各个实施方式中，所述感染在肝脏，上呼吸道和下呼吸道(例如，鼻窦炎，百日咳，肺炎)，眼睛，耳朵，牙龈和/或口腔(例如，牙周炎和牙龈炎)，肾脏，肠道，生殖泌尿道和膀胱，血液(例如，菌血症)，脑，脑膜，脊髓，骨，肠和/或心脏系统。在另一个实施方式中，所述感染是伤口或皮肤感染。
在一个实施方式中，提供了治疗细胞内感染的方法，包括向对此需要的受试者给予治疗有效量的如本文所述的组合物。在各个实施方式中，所述细胞内感染可以由微生物引起，所述微生物包括，但不限于，嗜肺性军团杆菌(Legionella pneumophila)，念珠菌属(Candida spp.)，沙门氏菌属(Salmonella spp.)，侵入性大肠杆菌属(invasive E.colispp.)，单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，立克氏体立克次氏体(Rickettsia rickettsii)，衣原体(Chlamydia)，志贺氏菌(Shigella spp.)，土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)，奈瑟氏球菌(Neisseria)，布鲁氏菌属(Brucella spp.)，巴尔通体属(Bartonella spp.)，金黄色葡萄球菌，贝纳特考克斯氏体(Coxiella burnettii)，新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)，荚膜组织包浆菌(Histoplasmata capsulatum)，和/或伊氏/卡氏肺孢子菌(Pneuomcystis jirovecii/carinii)。
上呼吸道和/或下呼吸道和/或气管的感染本质上可以是细菌或真菌性的。细菌肺部感染的常见原因包括肺炎链球菌，嗜血杆菌，肺炎克雷伯菌，金黄色葡萄球菌，结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌。引起真菌性肺部感染的常见病原体包括荚膜组织胞浆菌，粗球孢子菌(Coccidioides immitis)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)，巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)，伊氏/卡氏肺孢子菌(Pneumocytis jirovecii/carinii)，念珠菌属(Candida spp.)，曲霉菌属(Aspergillus spp.)，毛霉菌属(Mucorspp.)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)。
在一个实施方式中，提供了治疗肺内细胞内感染的方法，包括向对此需要的受试者给予治疗有效量的如本文所述的组合物。
在一个实施方式中，所述抗感染剂可以起效从而降低或抑制生物膜形成、维持或生长。
向所述肺给药可以是通过，但不限于，吸入给药。
在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒用作共治疗剂或作为结合的抗感染剂的一部分用于治疗肺部感染。
在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒能够用作共治疗剂，用于治疗铜绿假单胞菌的慢性肺部感染，其是具有囊性纤维化的个体的典型情况。
胃肠炎可以由许多微生物引起，包括但不限于，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，艰难梭菌(Clostridiumdifficile)，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)，金黄色葡萄球菌，志贺氏菌属(Shigellaspp)，铜绿假单胞菌，沙门氏菌属，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)，大肠埃希氏菌属(Escherichia coli)，念珠菌属(Candida spp.)。在一个实施方式中，如本文所述的组合物能够用于治疗胃肠炎。
在一个实施方式中，所述抗感染剂可以起效从而降低或抑制所述肠中的生物膜形成、维持或生长。
向所述肠道给药可以通过口服或通过栓剂进行，但不限于此。
在一个实施方式中，所述感染是皮肤感染并且所述组合物进行局部施用。细菌性皮肤感染包括，但不限于，痤疮，脓疱病，蜂窝织炎和链球菌感染。真菌性皮肤感染包括，但不限于，足癣(Tinea pedis)(脚癣(athlete's foot))，股癣(Tinea cruris)(股癣(jockitch))，体癣(Tinea corporis)(金钱癣(ringworm))和酵母感染。
在各个实施方式中，所述感染可以与割伤，水疱，烧伤，昆虫叮咬，手术伤口，注射部位或导管插入部位相关。
在一个实施方式中，所述感染是毛发或指甲的感染。在一个实施方式中，提供了包含如本文所述组合物的抗感染洗发剂。
正如下文进一步所述，本文所述的组合物能够适当地配制成粉末，洗剂，凝胶，泡沫，喷雾剂或软膏。
用途还包括抗菌性皮肤消毒剂和表面消毒剂。在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒可以与抗菌剂或消毒剂的活性化合物结合。使用植物糖原纳米颗粒作为表面消毒剂可以通过抑制细胞生长或细胞死亡，抑制生物膜形成，生物膜溶解，或破坏群体感应而起效，这在下文中更具体地讨论。
在另一个实施方式中，正如本文所述的抗感染组合物可以用作医疗器件如诊断器件，植入器件如起搏器，人造关节，支架和导管的抗感染涂层。在其他实施方式中，所述组合物可以浸入或涂覆到绷带，手术缝合线，伤口敷料，擦拭物，药巾，贴剂或海绵上，或掺入骨接合剂中。在一个实施方式中，所述感染与植入器件如留置导管，起搏器，人工关节，听觉植入物和支架相关。
在一个实施方式中，本发明的抗感染组合物用于治疗细胞内感染。许多致病细菌能够在宿主细胞内感染和存活，包括认为用于杀死它们的所述免疫系统的细胞(单核细胞/吞噬细胞)。治疗这种感染更具挑战性，因为一旦所述病原体处于细胞内部，就会在一定程度上受保护避免抗生素的作用。许多抗生素无论在吞噬细胞和组织或非吞噬细胞和组织中一般由于细胞膜渗透性低，外排快等表现出缺乏积聚。通常而言，需要更高的抗生素剂量才能有效杀死细胞内部的细菌。正如本文所述的植物糖原纳米颗粒通过向宿主细胞，例如，巨噬细胞，提供靶向递送抗生素并达到有效浓度以杀死细胞内细菌，从而提供了这个问题的解决方案。正如实施例佐证，植物糖原纳米颗粒能够跨过细胞膜携带化合物并且已经证明会累积于所述细胞质内。
正如本文所述的植物糖原纳米颗粒能够稳定肽，例如，抗微生物肽。储存于溶液中或冷冻或配制成干燥制剂(例如，喷雾干燥或冷冻干燥)的蛋白质和肽由于聚集、分解、变性、氧化和脱酰胺作用而倾向于随时间丧失其功效。虽然稳定的活性能够有助于改进保质期，它也可能允许较少的繁重的存储要求，例如，限制冷冻需求。植物糖原纳米颗粒能够稳定有机化合物。正如上所述，糖原和植物糖原的高度支化性质与缓慢的酶促降解有关。不希望受理论束缚，正如本文所述的单分散植物糖原纳米颗粒能够为蛋白质和肽溶液提供结构稳定性，以及能够通过酶促降解的空间位阻而抑制降解。
正如实施例的佐证，所述结合的抗生素-植物糖原可以在未受切割的情况下起效；同样的是，它可以作为切裂产物起效。
生物膜是微生物的固着群落，其中所述细胞彼此粘附并还经常粘附到表面上。这些贴附细胞在生理上不同于作为悬浮于液体培养基中的单细胞的浮游微生物细胞。在生物膜中发现的所述贴附细胞会嵌入自身产生的细胞外聚合物(EPS)的基质中；所述EPS也可以包含结合的外来材料。这种EPS是通常由各种结构形式的细胞外生物聚合物组成的聚集体。所述EPS允许生活在这种类型环境中的所述微生物在某些情况下不易敏受抗感染剂作用。所述EPS赋予微生物的益处，包括但不限于，使之能够实现3-D结构，细胞组织化，产生微环境，以及产生过多表型。这些共同构成了生物膜群落的关键特征，包括降低对抗感染药和其他有害试剂的易感性，减少捕食和入侵，逃避免疫应答的组分，以及随之而来的根除感染困难。
生物膜存在于自然环境中，并且在医院和工业环境中是常见的。生物膜能够形成于生物和非生物表面，包括天然组织和医疗器件。在微生物成功地在宿主(包括人宿主)上或宿主内形成生物膜的情况下，可能导致慢性和无法治愈的感染。
正如实施例中的详细描述，本发明人开发出了植物糖原纳米颗粒的组合物(包括其功能化形式)，具有使其非常适合用于降低或抑制生物膜形成、维持和生长的特性。
不希望受理论束缚，本发明人假设，用功能化的植物糖原纳米颗粒处理生物膜可以通过基于电荷的机制减降低或抑制生物膜的形成、维持和生长，这会导致生物膜形成的破坏和/或降低和/或增强的生物膜溶解。
此外，正如下文的讨论，基于电荷的相互作用可以干扰群体感应相关的过程，导致毒力因子的生产减弱。
毒力因子生产的改变或减弱可以改变调节细胞-细胞外相互作用或降低或抑制毒素、生物膜或酶生产的细胞表型。
群体感应是调节一定范围内的细菌过程的密度依赖性细胞-细胞信号传导系统。这是涉及细菌向所述环境产生和释放信号并通过受体检测信号('感应')的两步过程。当达到阈值浓度，指示群体数时，这会指导基因上调或下调，从而实现单个细胞的协调反应和协同的群体反应。
群体感应对于许多细菌过程，包括感染，毒力因子的产生，表面的定殖和生物膜形成，都是关键的。由于群体感应被确定为微生物致传染病进展的核心因素，因此一直存在开发干扰群体感应的策略，从而减弱毒力的动因。
除了群体感应在调节毒力因子的生产和与毒力和发病机理一致的表型的生产中的作用之外，群体感应信号还可以与所述宿主交界(interface)。产生的某些群体感应信号具有改变所述宿主免疫系统响应并协调宿主防御瓦解的免疫调节特性。
不希望受理论束缚，本发明人假设，植物糖原纳米颗粒可以干扰群体感应过程从而调节毒力因子的生产并与所述宿主交界从而改变宿主免疫系统的所述应答。
正如实施例中的佐证，铜绿假单胞菌中的群体感应调节过程的下调和破坏发生于阳离子化植物糖原存在的情况下。此外，正如实施例中的佐证，在阳离子化植物糖原的存在下发生了绿脓菌素生产降低，生物膜形成减少，生物膜溶解增强和生物膜增生降低。
在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒用作如上所述的皮肤或表面消毒剂。在一个实施方式中，所述植物糖原纳米颗粒能够作为如上所述的凝胶或半固体状态进行使用。
在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒能够以喷雾形式，可选地以气溶胶形式使用。在一个实施方式中，所述组合物是可以局部用于人体或非生命表面的喷雾产品。在另一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒能够以气溶胶形式吸入。
在另一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒能够内部使用以减少或抑制生物膜形成、维持或生长。
正如所述实施例中所示，在阳离子化植物糖原的存在下观察到铜绿假单胞菌的运动性和绿脓菌素生产的降低。群集运动性和绿脓菌素生产是由铜绿假单胞菌中的群体感应过程调节的两种毒力因子。阳离子化植物糖原可以作为管理囊性纤维化患者呼吸道中典型的慢性铜绿假单胞菌感染的助疗剂，并不作为抗生素本身，但是作为调节毒力和致病性的抗感染剂起效。
在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒与如上所述的抗生素、抗真菌剂或抗寄生虫剂结合使用。在另一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒与如上所述的抗生素、抗真菌剂、抗寄生虫和/或抗原生动物化合物，抗粘附分子、镇痛剂、抗凝血剂、局部麻醉剂和成像剂中的一种或多种结合。
在一个实施方式中，植物糖原纳米颗粒作为助疗剂而非抗生素，但是用作调节微生物毒力和致病性的抗感染剂使用。在一个实施方式中，所述微生物处于浮游群体中。在另一个实施方式中，所述微生物处于生物膜群落中。
制剂和给药
本发明的纳米颗粒还可以与其他分子，分子结构或化合物的混合物共混，包封或以其他方式结合，并可以与任何药用载体或赋形剂组合。正如本文所用，“药用载体”或“赋形剂”能够是药用溶剂，悬浮剂或任何其他药理学惰性载体，用于将无论是单独的还是与生物活性的或诊断上有用的分子结合的功能化植物糖原纳米颗粒递送至动物。所述赋形剂可以是液体或固体，并以想到的计划给药方式进行选择从而在与植物糖原纳米颗粒和给定药物组合物的其他组分组合时提供所需的体积，稠度等。药用载体的实例包括水，盐水，磷酸盐缓冲盐水，甘油，乙醇，丙二醇，1,3-丁二醇，二甲基亚砜，N,N-二甲基乙酰胺等中的一种或多种，及其组合。药用载体可以进一步包含少量辅助物质如润湿剂或乳化剂，防腐剂或缓冲剂，这些会增强所述药理学试剂的保质期或有效性。
本发明的药物制剂(其可以方便地以单位剂型形式提供)，可以根据制药行业中熟知的常规技术制备。这些技术包括使活性成分与所述药物载体或赋形剂结合的步骤。通常而言，通过将活性成分与液体载体，细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后，如果需要，使所述产品成型(例如，成为用于递送的特定粒径)从而制备所述制剂。
出于配制药物组合物的目的，如本文所教导制备的单分散植物糖原纳米颗粒可以以干燥的颗粒/粉末形式提供或可以溶解于，例如，水溶液中。
在需要低粘度的各个实施方式中，正如本文所述的植物糖原纳米颗粒组分可以合适地以最高达约25％w/w，约20％w/w，约15％w/w，约10％w/w，约5％w/w，约1％w/w和约0.05％～0.5％的浓度用于所述抗感染组合物中。
在需要高粘度的应用中，所述植物糖原纳米颗粒组分可以以高于约25％w/w的浓度用于制剂中。在需要凝胶或半固体的应用中，能够使用最高达约35％w/w的浓度，或所述植物糖原纳米颗粒组分能够以与粘度增强剂(viscosity builder)或胶凝剂的混合物形式使用。
所述组合物可以是水基制剂或醇基制剂。合适的醇包括乙醇，丙醇，异丙醇，乙二醇，丙二醇，丁二醇，二丙二醇，乙氧基二甘醇，或甘油，或其组合。
正如本文所述的抗感染组合物可以以多种方式给药，这取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。在不限制前述的一般性的情况下，所述给药途径可以是局部的，例如，给药于所述皮肤或通过吸入或以眼科或眼部组合物的形式给药；肠内，如口服(包括但不限于，片剂、胶囊或滴剂形式)或以栓剂形式；或肠胃外的，包括，例如，皮下、静脉内、动脉内或肌肉内；或以吸入的形式递送至所述呼吸道和/或所述肺部。
在一个实施方式中，所述抗感染组合物是用于施用于皮肤，用于透皮递送的局部制剂。本文公开的所述单分散纳米颗粒特别适用作成膜剂。因为所述纳米颗粒是单分散的，则均匀的紧密堆积膜是可能的。所述组合物形成具有低水分活度的稳定膜。因此，当进行化学改性时，它们可以用于附着和携带生物活性物质横穿皮肤。在各个实施方式中，所述局部制剂可以是凝胶，霜剂，泡沫，洗剂，喷雾或软膏的形式。
在另一个实施方式中，本发明的所述抗感染组合物是植入物形式。在一个实施方式中，如本文所述的生物医学组合物用于形成生物医学制品。合适的是，这些植入物和生物医学制品可以是生物相容的，这意味着它们对细胞、组织或体内功能没有显著的不利影响。合适的是，这些植入物和生物医学制品可以是(全部或部分)生物可吸收的或可生物降解的。使用如本文所述的组合物能够整体或部分地形成的生物医学制品的实例包括，但不限于：组织工程设计支架和相关器件，伤口敷料和绷带，缝合线，可植入线涂层，植入器件如导管、支架、血管成形术气囊和其他器件。
在一个实施方式中，本发明的所述抗感染组合物是涂层或膜的形式。这些涂层和膜能够，例如，用于涂层剂型，包括药丸。它们还能够合适地用于局部应用，包括作为保护膜或用于伤口愈合膜敷料制剂。所述植物糖原纳米颗粒能够用于水分散体中，或能够与其他成膜聚合物，增塑剂如多元醇、甘油、山梨糖醇、丙二醇和聚乙二醇以及疏水改性剂(例如，脂类，轻油脂(stearopten)和蜂蜡)，粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮，活性药物成分(API)和抗感染剂混合。在这方面，具有可电离基团，例如，羧基、氨基或疏水基团的改性糖原和植物糖原纳米颗粒能够提供更好的保湿，对表面的粘附，API分散和抗感染性质。
在用于导管、支架等的涂层的情况下，如本文所述的植物糖原纳米颗粒组合物也能够提供润滑作用。
在各个实施方式中，改性植物糖原纳米颗粒能够用于包封重要物质(例如，另一种API)从而提供增强的热稳定性，氧化稳定性和UV稳定性，例如，API能够分散于糖原或植物糖原溶液中并喷雾干燥(所述封装提供保护避免热和/或氧化降解)。
在一个实施方式中，进一步的API能够首先包封于植物糖原纳米颗粒中，然后将其引入所述制剂中。
实施例
实施例1.从甜玉米粒中提取植物糖原
在20℃下将1kg冷冻甜玉米粒(75％水分含量)与2L去离子水混合，并在共混器中以3000rpm粉碎3min。将糊状物(mush)以12,000×g在4℃下离心15min。使用具有0.1μm孔径的膜滤器对所述合并的上清液部分进行错流过滤(cross flow filtration)(CFF)。通过使用具有500kDa的MWCO的膜并在室温下以透析体积6进行间歇透析进一步纯化所述滤液，其中所述透析体积是透析期间引入所述操作中的总milliQ水体积与保留物体积的比率。
所述保留物部分与2.5体积的95％乙醇混合，并在4℃下以8,000×g离心10min。所述保留物与2.5体积的95％乙醇混合，并在4℃下以8,000×g离心10min。所述含植物糖原的颗粒在50℃的烘箱中干燥24h，并随后研磨至45目。所述干燥的植物糖原的重量为97g。
根据动态光散射(DLS)测量术，所述产生的植物糖原纳米颗粒具有83.0nm的粒径和0.081的多分散指数。
实施例2. 3-(三甲基铵基)-2-羟丙-1-基衍生的植物糖原的合成
将225g植物糖原分散于1500mL 0.5M NaOH水溶液中。然后在5h内向所述混合物中加入346mL 69％的2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液。所述混合物在室温下搅拌24h，然后用6.2M HCl调节pH至7.0。通过加入2L乙醇使所述产物沉淀，并在-20℃下储存过夜。收集所述沉淀物，用乙醇洗涤三次，并在80℃下烘箱干燥至干燥。使用NMR光谱法评价所述产物的取代度(DS)，并据发现为0.73。
使用两种方法之一获得无菌植物糖原和改性植物糖原的制剂。
方法1—溶液过滤灭菌(不超过2％wt/vol)
通过注射器驱动过滤穿过无菌0.2μm孔径过滤器对溶液进行灭菌，并将所述滤液收集在无菌容器中。然后测定滤液的干重从而解释浓度的任何降低。
方法2—干物质的γ照射
将预称重的植物糖原及其衍生物样品等分式样于玻璃小瓶中并照射于6kGy剂量。经γ-照射的材料(20mg/mL胰蛋白酶大豆液体培养基(trypticase soy broth))在25℃或37℃下孵育。48h后未显示出生长，此时所述材料被认为是无菌的。
实施例3. 3-(三甲基铵)-2-羟丙-1-基衍生植物糖原的合成，替代方法
将1g植物糖原与氢氧化钠水溶液(不同的实施例，0.125～2.5mmol NaOH溶解于1～5mL水中)混合并加热至45℃。在30min内，加入3.07mL69％的2,3-环氧丙基三甲基氯化铵水溶液，并将所述混合物在45℃下再搅拌2～6h。在所述反应时间结束时，加入5～9mL水，将所述混合物冷却至室温并用1M HCl中和。然后，通过在80mL乙醇中沉淀分离出所述产物。用乙醇洗涤所述固体，再溶解于20mL水中，并通过透析进一步纯化。冷冻干燥获得白色固体产物。
实施例4.长链3-(N-烷基-N,N-二甲基铵)-2-羟丙-1-基衍生植物糖原的合成
在45℃下将8.23mmol(3-氯-2-羟丙-1-基)二甲基烷基氯化铵(烷基＝月桂基，椰油烷基(cocoalkyl)，硬脂基)与0.82mL 50％NaOH混合。搅拌5min后，加入3.33mL 20％植物糖原水溶液，并将所述混合物在45℃下搅拌6h。所述反应混合物冷却至25℃并用1M HCl中和。然后，通过在50mL己烷中沉淀分离出所述产物。将所述固体用己烷洗涤，再溶解于20mL水和10mL饱和NaCl中，并通过透析进一步纯化。冷冻干燥获得白色固体产物。
实施例5.阳离子化植物糖原的烷基化
将0.5g来自实施例4的DS＝0.88的阳离子化植物糖原在80℃下溶于10mL无水二甲基亚砜中。加入0.5mL水和50％NaOH(不同用量，a.0.021，b.0.083，c.0.206，d.0.495，e.1.235)并剧烈搅拌10min。然后，加入不同用量的烷基卤化物(乙基碘化物，苄基溴化物，十二烷基碘化物，十八烷基碘化物；用量：a.0.255mmol，b.1.02mmol，c.2.55mmol，d.6.12mmol，e.15.3mmol)。将所述混合物在60℃下搅拌2h，然后将其冷却至室温并用冰醋酸中和。然后，将所述反应混合物用乙醚和/或己烷萃取数次，并再悬浮于饱和NaCl水溶液中。透析并冻干后，获得白色粉末状产物。在所述十二烷基和十八烷基改性的情况下，所述干燥产物用乙醚洗涤从而除去残留的长链醇。
实施例6.阳离子化植物糖原的酰化
将0.5g来自实施例4的DS＝0.88的阳离子化植物糖原称入带有隔膜(septum)的玻璃小瓶中。通过注射器，在搅拌下逐滴加入30.5mmol纯酰氯(丁酰氯，月桂酰氯)。将所述形成的悬浮液再搅拌1h，随后通过加入30mL己烷使其沉淀。将所述沉淀物用己烷洗涤三次，溶于10mL饱和NaHCO3中并搅拌1h。用1M HCl中和过量的NaHCO3，并随后加入20mL饱和NaCl并将所述混合物进行透析。在60℃下烘箱干燥获得白色粉末状产物。
实施例7.阳离子化植物糖原的甲硅烷基化
将0.5g来自实施例4的DS＝0.88的阳离子化植物糖原在105℃下烘箱干燥16h，并通过在80℃下加热1h溶解于10mL二甲基亚砜中。用橡胶隔膜盖住所述反应容器并冷却至0℃。加入三乙胺(不同量：a.0.16mL，b.0.662mL，c.1.65mL，d.397mL，e.9.53mL)，然后滴加甲硅烷基氯化物(三甲基甲硅烷基氯化物，三乙基甲硅烷基氯化物；用量：a.0.36mmol，b.1.46mmol，c.3.64mmol，d.8.74mmol，e.20.74mmol)。将所述反应混合物搅拌过夜，然后沉淀到乙腈中。用热乙腈洗涤所述固体数次，然后在60℃和100mbar下干燥过夜。
表1.实施例4～7的取代度、流体动力学半径和ζ电位
*宽NMR峰，不精确的DS测定。
实施例8.植物糖原用2-溴乙胺胺化
将200mg植物糖原溶解于2mL二甲基亚砜中，并缓慢加入250mg粉末状NaOH且搅拌15min。加入324.9mg 2-溴乙胺·HBr在1.5mL二甲基亚砜中的溶液。10min后，加入另外的0.5mL二甲基亚砜并将所述反应在25℃下再搅拌4h。4h后，向所述反应混合物中加入10mL水。将所述产物沉淀到28mL乙醇中，冷却至0℃，并用冷乙醇洗涤三次。在室温下干燥，得到白色固体产物。
实施例9.胺化植物糖原与Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯结合
将100mg胺化植物糖原(根据实施例8制备)悬浮于pH 8.4的19.8mL 0.1M碳酸氢钠缓冲液中。加入1mg Cy5.5-NHS酯在2.2mL二甲基亚砜中的溶液并涡旋。将所述反应在室温下黑暗中搅拌过夜。加入45mL冷乙醇沉淀所述样品。用冷乙醇洗涤所述固体直至上清液无色，并风干获得所述产物，为蓝色固体。
实施例10.多糖纳米颗粒与Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯结合
将根据实施例1制备的100mg多糖纳米颗粒悬浮于pH 8.4的20mL 0.1M碳酸氢钠缓冲液中。用对照小瓶(含有0.1M碳酸氢钠缓冲液)中的温度探针，将含有所述溶液的所述反应容器用铝箔包裹并置于35℃的热板上。将1mg Cy5.5-NHS酯(Lumiprobe Corp.)悬浮于4mL DMF中。在1h的时间期间，在1mL-等分试样中加入Cy5.5-NHS酯。在添加之前和之后不断检查所述溶液的pH，通过添加2M HCl溶液调节至8.4。在加入Cy5.5-NHS酯在DMF中的最后等分试样后，监测所述pH并根据需要进行调节。使所述反应进一步进行2h，之后用如上所述的2M HCl溶液将所述pH调节至4.0。
向所述含有所获多糖纳米颗粒-Cy5.5结合物的酸化溶液中加入2体积的乙醇。将所述溶液冷却至4℃并以6000rpm离心15min。离心后，倾倒出所述上清液，并将所述颗粒再悬浮于15mL去离子水中。向所述再悬浮的颗粒中加入2体积的乙醇，并如前所述将其冷却并离心。将其再重复一次，直至倾出的所述上清液澄清且无色。通过使用均化器将所述颗粒最后再悬浮于10mL无水乙醚中。通过采用微热(trace heat)蒸发至干燥，获得所产生的结合物。
实施例11.多糖纳米颗粒的TEMPO氧化
将50mg根据实施例1制备的多糖纳米颗粒悬浮于pH 10.0的15mL 0.05M甘氨酸缓冲液中。将所述溶液置于冰浴中冷却至4℃长达30min。将0.3mg(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧代基(2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-yl)oxidanyl)(TEMPO)和3.5mg溴化钠悬浮于250μL 0.05M甘氨酸缓冲液(pH 10)中。30min后，将两者滴加到所述多糖纳米颗粒溶液中。随后将0.08mL次氯酸钠加入到所述多糖纳米颗粒溶液中并随后将其密封进行反应。使所述氧化持续26h。通过加入40μL乙醇终止氧化。在室温下将所述氧化再搅拌30min。
将含有氧化的多糖纳米颗粒的所述溶液移至透析袋(Spectrum Laboratories，Inc.；MWCO 12-14,000)从而与去离子水交换2天。然后，将来自所述透析袋的所述残余溶液冷冻干燥至干燥，从而提供所述结合物，为干燥化合物。
实施例12.TEMPO-氧化的多糖纳米颗粒与两性霉素B结合
在反应之前，制成含有1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)，pH 5.5的溶液(13.5mL 0.5M MES缓冲液，pH 5.5；270μL EDC)备用。将27mg如前所述通过TEMPO氧化产生的氧化多糖纳米颗粒溶解于10mL上述EDC/MES溶液中。使所述溶解的多糖纳米颗粒与9mg两性霉素B(在3.5mL EDC/MES中)在室温下反应2h。此后，将所述反应混合物升温至37℃再反应24h。
24h后，将所述结合反应溶液转移至透析袋并用去离子水透析2天。将包含于所述透析袋中的所获溶液冻干至干燥从而获得所述结合物。
使用UV-Vis光谱法分析所述产物，并据发现，1mg结合物含有73μg两性霉素B。这对应于0.015的DS。
实施例13.细胞培养物中的糖原/植物糖原的细胞毒性
分析所述糖原/植物糖原纳米颗粒对细胞活力的影响从而评价所述颗粒的细胞毒性。使用冷水从兔肝，贻贝和甜玉米中提取糖原/植物糖原纳米颗粒，并如实施例1中所述进行提取。
使用的细胞系：虹鳟鳃上皮(rainbow trout gill epithelium)(RTG-2)。
为了测量细胞活力的变化，使用了两种荧光指示剂染料，阿尔玛蓝(alamar blue)(ThermoFisher)和CFDA-AM(Thermofisher)；这些染料分别测量了细胞代谢和膜完整性。对于这些染料，荧光越多表明活细胞越多。
所述结果显示于图3和图4中。在0.1～10mg/mL浓度的植物糖原存在下孵育48h后，没有一个分析测试检测到这些细胞中的任何细胞毒性作用。
实施例14.糖原/植物糖原纳米颗粒组合物的细胞摄取
对暴露于与罗丹明B(橙色荧光)结合的植物糖原纳米颗粒的正常鼠内皮细胞实施了荧光显微镜检查。如图5中所示，所述纳米颗粒仅在所述细胞质中聚集。
对暴露于与罗丹明B结合的植物糖原纳米颗粒的白细胞实施了荧光显微镜检查。
通过含有50μg/mL防止凝结的肝素的5-mL注射器收集来自所述翼静脉(wingvein)的2mL血液。通过密度梯度分离外周血单核细胞。简言之，将2mL与等体积PBS混合的肝素化血液小心地加入到10mL锥形管中的2mL西斯塔克(Histopaque)1083(Sigma-Aldrich)的所述表面上，并随后以500×g在室温下离心20min。离心后，收集所述第一层和西斯塔克(Histopaque)1083培养基之间界面上的含单核的细胞。通过以500×g离心5min，用5mL 38℃加热的PBS洗涤3次后，所述沉淀颗粒用含有90％RPMI 1640(Invitrogen)和10％胎牛血清的所述完全培养基进行再悬浮。
将铜绿假单胞菌PAO1在32℃下于摇床上以180rpm培养于胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基中。通过以3000×g离心15min从过夜培养物中收获细菌细胞。并且随后重新悬浮于TSB中，至密度约109个细胞/mL。
将单核细胞悬浮液与纳米PG-罗明丹B(最终浓度约0.1％)和/或细菌(至最终细菌细胞浓度约108个细胞/mL)混合，并将所述混合物在38℃下孵育2h之后进行CLSM研究。
如图6中所示(所述箭头P表示具有细菌细胞和PG罗明丹B的吞噬体)，所述与罗丹明B结合的植物糖原纳米颗粒被所述单核细胞摄取并定位于吞噬体中。在该实验中，所述单核细胞被所述细菌活化，并随后内化了所述细菌和纳米PG-罗明丹B。因此，罗丹明B与细菌一起共定位于所述吞噬体中。相对而言，当单核细胞不通过暴露于细菌进行刺激时，单核细胞不存在内化和聚集纳米PG-罗明丹B。这表明纳米PG-罗明丹B不会激活单核细胞吞噬作用，因此不会被单核细胞从血流中清除。
实施例15.阳离子化植物糖原的抗感染性质
抗感染剂限制或阻止感染的传播。抑制细胞生长或引起细胞死亡的试剂具有作为抗感染剂的潜力。实施最小抑制浓度(MIC)分析测试从而评价阳离子化植物糖原的抗菌性质。所述MIC定义为“在琼脂或肉汤稀释液敏感性测试中阻止微生物可见生长的抗感染剂的最低浓度”。
根据临床和实验室标准研究所文件M07-A9：有氧生长的细菌的稀释液抗菌药物敏感性测试的方法；批准标准(Clinical and Laboratory Standards Institute documentM07-A9:Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteriathat Grow Aerobically；Approved Standard.A)，在肉汤微稀释之后进行针对细菌的MIC评价。革兰氏阳性生物，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168和两种革兰氏阴性生物，大肠杆菌(Bacillus subtilis)AB264(K-12)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PAO1，进了评价。生物的长期储存培养物在-80℃下保持于甘油(15％vol/vol)中。通过在胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂平板(trypticase soy agar plate)上进行传代培养恢复种群(stock)，在37℃下生长18h，然后在4℃下储存最长达一周。通过用来自储备板(stockplate)的3～4个菌落接种Mueller-Hinton肉汤培养过夜培养物，并在37℃和150rpm下孵育20～24h。过夜培养物用于接种新鲜的Mueller-Hinton肉汤(2％vol/vol)。然后将所述培养物培养至所述中等指数期，约(2～4)×107CFU.mL-1，此时培养物用于制备MIC孔板的接种物。通过在无菌Mueller-Hinton肉汤中所需的重构和稀释制备γ-照射的天然植物糖原和阳离子化植物糖原的无菌溶液。使用匹配的过滤灭菌材料进行并排比较(side-by-sidecomparison)。MIC在100～1000μg天然或阳离子化植物糖原/mL的最终分析测试内的浓度下，以100μg/mL的增量增加进行评价。阴性生长对照包含无菌培养基。阳性生长对照含有接种培养基。在使用前立即通过在无菌Mueller-Hinton肉汤中稀释从而制备所述接种物。在所述分析测试中进一步稀释会产生5×105CFU.mL-1的分析测试内的最终细胞密度。将孔板在37℃下孵育20h，此时对各孔的生长进行评分。记录MIC作为导致无生长(光学透明的)的试剂的最低浓度。在每个实验中一式三份完成MIC分析测试，并重复两次以核验数据(n＝6)。根据实施例3中详述的替代方法制备的阳离子化植物糖原也以19～10000μg/mL的双稀释增量进行评价。MIC分析测试以单次重复进行实施，并重复三次以核验数据(n＝3)。
实施MIC分析测试从而评价阳离子化植物糖原对所述酵母产朊假丝酵母(yeastCandida utilis)ATCC9950的抗真菌活性。根据临床和实验室标准研究所用于酵母肉汤稀释抗真菌药敏试验的文献M27-A2参考方法；批准标准—第二版(the Clinical andLaboratory Standards Institute document M27-A2Reference Method for BrothDilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts；Approved Standard—Second Edition)，进行肉汤微量稀释分析测试。产朊假丝酵母的长期原种培养物(stockculture)在-80℃下保持于甘油(15％vol/vol)中。使用不含碳酸氢钠，且补充有0.165MMOPS并调节至pH 7.0的RPMI 1640培养基(Sigma-Aldrich；加拿大)进行所述分析测试。通过在无菌肉汤中根据需要重构和稀释从而制备γ-照射的天然植物糖原和阳离子化植物糖原(实施例2)的无菌溶液。使用匹配的过滤器灭菌材料进行并排比较。在30～100μg阳离子化植物糖原/mL RPMI 1640的分析测试内的最终浓度下，以10μg/mL增量增加来评价MIC。阴性生长对照包括无菌培养基。阳性生长对照含有接种培养基。在使用前立即制备所述接种物。将在胰蛋白酶大豆肉汤(tryptic soy broth)(35℃，150RPM)中生长的产朊假丝酵母ATCC9950的过夜培养物稀释，从而在除所述阴性生长对照孔之外的所有孔中产生0.5×103CFU.mL-1的最终孔内浓度。一旦接种后，将所述孔板在35℃静态孵育48h。在所述分析测试结束时，对孔进行生长评分。记录所述MIC作为导致无生长(光学透明)的试剂的最低浓度。实验在分析测试内一式三份进行并重复三次(n＝9)。
枯草芽孢杆菌168和大肠杆菌K-12都对阳离子化植物糖原敏感，分别在≥200和300μg/mL的浓度下抑制细胞生长。在所有分析测试浓度下，天然植物糖原不会引起生长抑制。在测试的浓度下，铜绿假单胞菌PAO1的生长不受阳离子化植物糖原的影响。这可能是由于所述强健的细胞壁结构和这种生物的适应性所致，且并不排除在较高浓度下的潜在抑制作用。
类似的是，≥60μg阳离子化植物糖原/mL的浓度会导致所述酵母产朊假丝酵母ATCC9950的生长抑制。在所有测试的浓度下，天然植物糖原不会引起生长抑制。
所述替代合成方案(在实施例3中描述)也用于产生阳离子化植物糖原，其被取代成不同取代度(DS)，并且这被发现对生长抑制很重要。这种阳离子化植物糖原的所述MIC与使用所述实施例3合成方案获得的并具有0.7的相似DS的MIC相匹配，对于枯草芽孢杆菌168保持相对相似，所述值为312.5μg.mL-1。针对所述两种革兰氏阴性细菌，大肠杆菌K-12和铜绿假单胞菌PAO1的MIC实质上产生了改变，均具有10000μg/mL的值。将所述DS增加到1.34的值会将这些MIC值分别降低到2500和312.5μg.mL-1。铜绿假单胞菌PAO1所显示的敏感度增加可能是由于所述细菌细胞外表面脂多糖核心区域之间的相互作用增加所致，并且这使得铜绿假单胞菌PAO1中的净负电荷比大肠杆菌中更大，阳离子化植物糖原带有更大的净正电荷。
实施例16.植物糖原的双重改性改进了阳离子化植物糖原的生长抑制性质
根据实施例5～7对植物糖原进行改性从而带上阳离子基团和其他取代基。根据先前在实施例15中描述的方案建立MIC值。以单次分析测试内重复并重复三次(n＝3)的方式实施实验。相对于所述单改性(即，阳离子化)植物糖原的MIC，具有四倍或更大变化的MIC值代表MIC值的统计学显著性变化。只有对于相对于所述单改性阳离子化植物糖原的MIC引起四倍变化的阳离子化植物糖原组合的那些双重改性才指示导致统计学上显著性改进(MIC值为统计学显著地较低)。
来自导致阳离子化植物糖原针对枯草芽孢杆菌168的所述MIC的统计学显著性增强的所述评价组的所述两个改性是所述丁酰基或QUAB426取代基。在两种情况下，当在所述合成方案期间分别以6和2摩尔当量比使用所述试剂时，所述MIC降低了≥8倍浓度。
对于革兰氏阴性大肠杆菌K-12没有发现显著增强，而当针对铜绿假单胞菌PAO1进行测试时，许多改性导致了MIC降低。值得注意的是，当以摩尔当量比0.15和9使用时，所述苄基改性导致8倍降低，当以摩尔当量比0.6，1.5和3.6使用时，导致32倍降低。当在合成期间以摩尔当量比为0.15，0.6和9使用时，所述乙基改性导致8倍降低。所述丁酰基和月桂基改性(摩尔当量比6)，两者都导致MIC 8-倍降低。三甲基甲硅烷基双改性的产生降低了MIC8倍(试剂以0.07，0.28摩尔当量比使用)和4倍(4.3)。阳离子化植物糖原双重改性从而带有三乙基甲硅烷基，使MIC降低8倍(摩尔当量比为0.07)。
实施例17.阳离子化植物糖原增强了浮游细胞对抗生素的敏感性
根据临床和实验室标准研究所文件M07-A9：用于有氧生长细菌的稀释抗菌药物敏感性试验的方法；批准的标准(the Clinical and Laboratory Standards Institutedocument M07-A9:Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests forBacteria that Grow Aerobically；Approved Standard)和文件M27-A2，用于酵母的肉汤稀释抗真菌药敏试验参考方法；批准的标准—第二版(document M27-A2Reference Methodfor Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts；ApprovedStandard—Second Edition)中描述的肉汤微量稀释技术，除了在指出的情况下，培养基另外补充有天然或阳离子化植物糖原，在无菌和未处理的96孔微量滴定板中进行实施例15中定义的MIC分析测试。使用产朊假丝酵母ATCC9950，枯草芽孢杆菌168和大肠杆菌AB264完成的评价使用了天然或阳离子化植物糖原，其浓度为阳离子化植物糖原各自MIC值的1/8、1/4、1/2。所述机会致病菌(opportunistic pathogen)铜绿假单胞菌PAO1的评价是在0.5、1或10mg天然或阳离子化植物糖原/mL的分析测试内的最终浓度下进行的。实验以分析测试内重复方式进行实施，并重复最少三次(n＝6)。
筛选的抗生素代表许多不同的类别并总结于表2中。在每个实验中一式两份进行MIC分析测试，并重复最少三次以核验数据(n＝6)。相对于所述未补充的培养基MIC具有四倍或更大变化的MIC值代表MIC值的统计学显著性变化。只有相对于未补充培养基MIC引起四倍变化的那些抗生素-阳离子化植物糖原组合才被认为是导致增效(potentiation)(MIC值较小)或耐受(MIC值增加)的指示。
对于所有测试的生物体，补充所述天然植物糖原导致MIC值相对于在未补充培养基中获得的MIC值保持相同或显示出两倍的变化。也就是说，天然植物糖原不影响来自不同类别抗生素的代表性实例的MIC。这突出了天然植物糖原作为中性平台用于开发针对微生物的定制纳米技术，例如，递送高剂量和局部剂量的结合抗生素的潜力。
表2.用于抗生素分析测试致敏中的抗生素总结
相对而言，补充阳离子化植物糖原导致了对于所有分析测试的生物体的所选抗生素的MIC值发生数倍的变化(表3，4)。在所有情况下，这些值变化是倍数降低，即，细胞对抗生素敏感。对抗生素的致敏性也是浓度依赖性的，并且在低浓度时，这会丧失(表3)或降低(表4)。正如预期的，当在亚-MIC浓度下使用阳离子化植物糖原时(表3)，增强效应小于在较高浓度下使用时的情况(表4)。此外，并非所有抗生素-阳离子化植物糖原组合都显示出致敏作用；这既是浓度依赖性的，也与筛选中使用的所述抗生素和生物体的靶有关。也就是说，存在需要根据经验建立的抗生素和阳离子化植物糖原的最佳组合。总体而言，对所测试的所有生物体和阳离子化植物糖原-抗生素组合的评价表明，14种不同类别的抗生素中有13种显示出统计学上显著性的倍数降低。
表3.亚-MIC阳离子化植物糖原使微生物对抗生素致敏
*CP表示补充阳离子化植物糖原，所述数字表示进行补充的亚MIC强度，例如，CP0.5表示MIC的半强度。所述表中的数字表示相对于MIC(未补充培养基)的MIC倍数变化降低。
表4.补充阳离子化植物糖原增强了铜绿假单胞菌对多种多样抗生素的敏感性
*MIC0.5，MIC1和MIC10是指当补充0.5、1或10mg阳离子化植物糖原/mL Mueller-Hinton肉汤时获得的MIC值的所述倍数变化降低。这些值报告为相对于未补充的Mueller-Hinton肉汤中获得的所述MIC值的倍数变化。
为了在所述分析测试中实现生长抑制，需要对于不同种类的抗生素和较低浓度的抗生素的起作用的阳离子化植物糖原致敏细菌和酵母。MIC值的这种变化也表明潜在的基本作用机制，并包括所述细胞渗透屏障的扰动，以及还有导致更疏水细胞表面的响应性变化。此外，细胞特性如渗透性的变化也可能使所述细胞对免疫系统的组分更敏感。用诸如EDTA的透化剂处理细胞已证明了对溶菌酶增强的作用，溶菌酶是攻击细菌细胞壁的先天免疫系统的组分，会导致细胞裂解。因此，阳离子化植物糖原纳米颗粒可以用作助疗剂，由此使得诸如细菌和酵母的感染剂对化学治疗方案如抗生素以及宿主免疫系统更易处理。
实施例18.具有抗微生物活性的抗生素-植物糖原结合物的合成
在实施例12中详述了两性霉素B与植物糖原纳米颗粒的结合方法。
使用改良的肉汤微量稀释分析测试法(CLSI M27-A2；实施例15)，针对酵母，产朊假丝酵母菌ATCC9950，分析测试了所述两性霉素B-植物糖原结合物(PHG-AMB)的活性。所述分析测试使用了不含碳酸氢钠，补充有0.165M MOPS并调节至pH 7.0的RPMI 1640培养基(Sigma-Aldrich；加拿大)。将1600μg AMB/mL DMSO的原种(stock)储存于-80℃并在使用前进行稀释。在所述分析测试之日，新制500μg PHG-AMB/mL RPMI 1640。简而言之，通过在RPMI 1640中连续两倍稀释从而制备16μg AMB/mL RPMI 1640和500μg PHG-AMB/mL RPMI1640的2倍稀释液。对照物包含补充有植物糖原，经过调节以模拟所述孔中PHG-AMB的所述变化浓度的AMB。阴性生长对照孔含有无菌培养基。阳性生长对照孔含有补充有植物糖原的培养基或培养基。记录所述MIC作为导致所述孔中没有生长(光学透明)的试剂的最低浓度。以两次重复进行这些分析测试，最少三次独立重复。
在产朊假丝酵母菌ATCC9950在35℃下生长48h后，获得在RPMI1640和补充有植物糖原的RPMI 1640中0.5μg AMB/mL的MIC值。也就是说，与先前对抗菌抗生素的观察一致，植物糖原对抗真菌剂的MIC没有影响。
所述结合物PHX-AMB显示出生长抑制特性，MIC为31.25μg PHG-AMB/mL。紫外-可见分光光度法用于测定所述结合物含有73μg两性霉素B/mg结合物，这产生2.28μg两性霉素B/mL的绝对MIC值。也就是说，两性霉素B能够与植物糖原结合并保持活性，MIC有一些降低，并且强调了植物糖原可以用作抗生素的纳米颗粒递送系统。
实施例19.阳离子化植物糖原负面影响绿脓菌素(一种通过群体感应途径(quorumsensing pathway)严格调节的毒力因子)的生产。
绿脓菌素是由许多铜绿假单胞菌菌株产生的色素，并且在氧化还原过程中作为毒力因子以及在群体感应途径中作为末端信号而产生各种作用。重要的是，绿脓菌素的生产通过群体感应信号传导系统的层级结构严格调节。这些系统和其他系统形成了复杂的调节网络，其共同控制对于铜绿假单胞菌的毒力至关重要的其他关键表型和其引起急性和慢性感染的能力。培养物中绿脓菌素的易于辨别的蓝绿色使其成为评价对群体感应系统的干扰以及随后的毒力因子生产的改变的初始筛选中的常见选择。虽然抗菌活性是合乎需要的，但减弱毒力的能力也是一种优点(asset)。大环内酯类抗生素如阿奇霉素已被用作治疗囊性纤维化患者呼吸道内铜绿假单胞菌感染的助疗剂，不是作为抗生素，而是作为调节毒力和致病性的手段。
根据先前已知的方法稍作修改对绿农菌素生产进行分析测试和定量。铜绿假单胞菌培养物在Mueller-Hinton肉汤中37℃和150rpm下于不同浓度的天然植物糖原或阳离子化植物糖原的存在下进行生长。在20h时，通过与1.2mL氯仿剧烈混合从而提取2mL培养物。相分离后，将所述氯仿相转移到新管中，加入0.4mL 0.2N HCl并剧烈混合所述相。一旦分离所述相后，将200μL所述HCl相的等分式样转移到96孔板的孔中，用BioTek EL800读板仪测量所述A550；使用校准曲线将值转换为μg绿脓菌素/mL。实验一式三份进行，并在独立的一式三份实验中重复(n＝9)。
在天然或阳离子化植物糖原存在下孵育20h后绿脓菌素生产的定量表明仅阳离子化植物糖原影响绿脓菌素的生产(图7)。在0.5～2.5mg/mL的阳离子化植物糖原浓度下，相对于未补充培养基，测量出绿脓菌素生产减少50％～90％。在10mg/mL下，存在约75％的绿脓菌素生产恢复。蹊跷的是，当超过上限时，绿脓菌素生产未超过未补充条件下的情况。
也就是说，铜绿假单胞菌与阳离子化植物糖原的孵育影响了毒力因子绿脓菌素的生产。而且，这导致U形浓度依赖性响应，指示出功效阈值的下限和上限，以及相对于所述改性纳米颗粒损害毒力因子绿脓菌素生产的能力的最佳功效的浓度范围。
实施例20.阳离子化植物糖原对细菌运动(一种对细菌迁移、定殖和感染很重要的过程)产生负面影响
铜绿假单胞菌显示出三种形式的运动性-游泳(Swimming)，群集(Swarming)和颤搐(Twitching)-所有这些都有助于所述生物体引起传染病的能力，并且对于迁移，附着和定殖以及生物膜形成和成熟，和从生物膜群或感染病灶分散是重要的。
改良的游泳运动性分析测试法用于评价阳离子化植物糖原对铜绿假单胞菌的游泳运动性的抑制作用。通过继代培养将原种复苏于改良的M9中并生长20～24h(150rpm，37℃)。如下制备了改良的M9培养基—20mM NH4Cl，12mM Na2HPO4，22mM KH2PO4，8.6mM NaCl，0.5％wt/vol酪蛋白氨基酸(casamino acid)。通过在121℃高压灭菌30min对所述培养基进行灭菌，并在冷却至约45℃之后，补充最终浓度11mM葡萄糖，1mM MgSO4，1mM CaCl2·2H2O。使用用0.3％(wt/vol)Bacto琼脂(Becton-Dickson；Fisher Scientific，加拿大)固化的mM9培养基在这天制备运动板(Motility plate)。高压灭菌后，向冷却的琼脂中补充以上所示补充剂以及0.1、0.5、0.75、1.0、2.5或10.0mg无菌天然或阳离子化植物糖原/mL培养基。所述对照物包括没有添加植物糖原的游泳琼脂。将25mL等分试样倒入无菌培养皿中，同时在层流条件下在生物安全柜中工作，并使盖子打开(1h)。1h后，将所述板用过夜培养物穿刺接种(stab-inoculate)于琼脂表面下方数毫米处，并随后在没有倒置的情况下孵育(37℃，24h)。在生长期结束时，每个游泳区记录三个直径测量，并用于计算所述游泳区表面积的扩展。实验以分析测试内一式三份方式进行并重复三次(n＝27)。
铜绿假单胞菌的群集运动使用含有0.5％wt/vol琼脂的改良M9培养基制备的群集板琼脂(swarm plate agar)进行测定。加入无菌天然或阳离子化植物糖原从而达到0.1、0.5、0.75、1.0、2.5或10.0mg/mL培养基的终浓度。所述对照包括未补充的群集琼脂。在生物安全柜中工作，将20mL等分试样倒入无菌培养皿中，并使盖子打开进行凝固。15min后，使所述琼脂凝固长达总计60min。通过从在37℃和150rpm下于改良M9培养基中生长24h的铜绿假单胞菌PAO1培养物中收获细胞从而制备接种物。细胞形成颗粒，将所述颗粒再悬浮并在无菌0.9％wt/vol NaCl中洗涤两次。将所述洗涤的细胞颗粒再悬浮至3.0单位的最终OD600。通过将3μL接种物移液到所述板中央对这些板接种。将这些板在室温下放置2h，然后在37℃下培养24h。24h后，进行观察并将所述板在室温下再孵育24h。在实验结束时，记录观察结果和图像。在每个板上进行三次直径扩展(mm)测量(n＝27)。实验一式三份地进行，并在独立的一式三份实验中重复(n＝27)。
在补充有1％(wt/vol)细菌学琼脂(Becton-Dickson：Fisher Scientific，加拿大)的Luria-Bertani培养基(Becton-Dickson；Fisher Scientific，加拿大)中测定颤搐运动。在适当的情况下，所述颤搐运动琼脂(the twitching motility agar)冷却至约45℃并加入无菌天然或阳离子化植物糖原从而达到0.1、0.5、0.75、1.0、2.5或10.0mg植物糖原/mL的终浓度。所述对照包括未补充的颤搐琼脂。在生物安全柜中工作，将10mL等分试样的颤搐运动琼脂分散到无菌培养皿中，并使盖子盖上进行凝固1h。铜绿假单胞菌PAO1原种通过在胰蛋白酶大豆琼脂板(Becton-Dickson；Fisher Scientific，加拿大)上进行继代培养从而复苏，并在37℃下生长20h。使用无菌移液器尖端从所述胰蛋白酶大豆琼脂板的表面刮下数个菌落并将其搅拌成稠浆液制备接种物。所述浆液用于刺穿接种每个运动分析测试板的中央，一直到达所述板的底部。将所述板在37℃下孵育(48h)。实验一式三份地进行，每次评价进行三次测量，并独立重复三次(n＝27)。由于高浓度植物糖原的不透明性，在切除所述上覆琼脂后要重新测定所述琼脂:板界面处的所述颤搐区域(twitch zone)。这些值处于±1mm内。
对于所有三种形式的运动，阳离子化植物糖原而非所述天然未衍生植物糖原(图8)。此外，这显示出浓度依赖性，并且阳离子化植物糖原浓度的增加会对阻碍运动具有更大的影响。
补充植物糖原或低浓度的阳离子化植物糖原会导致运动性中度(<10％增加)至高度(>20％)增加(图8)，这表明潜在的应用限制，这是因为群集和颤搐运动与生物膜形成和生长正相关。然而，当分析测试生物膜形成时，这并不被支持(更多细节参见实施例22)。有可能的是，功效的限制有可能与所述分析测试方法有关，并且运动性有可能将在比本文中发现的浓度更低的浓度下受阻。所述根本原因尚不清楚，然而植物糖原令人难以置信的保水能力可能是细胞在空气暴露的琼脂板上所致。
在≥0.75mg/mL的浓度下，阳离子化植物糖原明显阻碍所有形式的细菌运动。由于细菌运动对许多有助于传染病传播和进展的过程很重要，我们还假设阳离子化植物糖原能够作为影响运动性和基于运动性过程的抗感染剂起效。
实施例21.天然植物糖原限制生物膜的形成和增生
生物膜是微生物的固着群落(sessile community)，其中细胞彼此粘附并通常也粘附到表面。所述群落成员可能来自病毒，细菌，酵母，真菌，藻类，原生动物，线虫。所述生物膜通常包裹于由细胞外聚合物质组成的基质中。这通常由所述生物膜产生，但也可以结合来自外源的物质。
生物膜存在于自然环境中，并且在医院和工业环境中是常见的。生物膜能够在生物和非生物表面上形成，包括天然组织和医疗器件。与自由游泳的浮游细胞相比，生物膜群落更具持久性和顽固性。观察到的差异包括对抗感染药和其他有害试剂的敏感性降低，捕食和侵袭减少，以及避开免疫响应的组分。也就是说，一旦感染剂采用生长的生物膜模式，感染剂的清除或处理更加困难。在微生物成功地在宿主(包括人宿主)上或宿主内形成生物膜的情况下，能够导致慢性和无法治愈的感染。因此，合乎需要的是能够限制和控制生物膜的形成和生长。
通过在改良M9或King's A培养基(22～24h，37℃，150rpm)中继代培养铜绿假单胞菌PAO1从而复苏铜绿假单胞菌PAO1原种。正如实施例19所述制备改良M9培养基，不同之处在于不加入琼脂；King's A培养基含有2％朊间质蛋白胨(proteose peptone)，1％K2SO4，0.164％MgCl2、1％甘油。清洁无菌的玻璃管(18×150mm)用于所述分析测试。制备了补充有无菌天然植物糖原的培养基或培养基的原种培养基溶液。将原种溶液用所述预生长培养物(1:2000稀释)接种，充分混合并将2mL等分试样转移至无菌管中。将所述管孵育20h(37℃，150rpm)。通过在室温下用Hucker结晶紫(分析测试内最终浓度为0.1％wt/vol)染色15min从而显现累积的生物膜。通过倾析除去过量的染色，然后用水大量漂洗从而除去未保留的染料。将所述管倒置并风干。所述增生的生物质保留染色，并且在所述管壁上观察到是紫色物质(图9)。图像经过记录和存档。保留的染色用33％乙酸(vol/vol)溶解，并使用PerkinElmer Lambda 25UV/Vis分光光度计通过分光光度法(λ＝570nm)定量。实验在一式三份分析测试中进行，并作为独立的一式三份实验重复(n＝9)。
天然植物糖原改变生物膜形成和增生的能力据发现取决于生长条件(图10)。虽然在使用改良M9时注意到生物膜变化很小，用植物糖原补充King's A培养基，会使最终生物质的量值降低最多达53％。
正如所观察，最高达10mg植物糖原/mL改良M9培养基的浓度会导致所形成的生物膜仅有少量降低(图10)。然而，当植物糖原的浓度增加至100mg植物糖原/mL时，生物膜形成显著减少(改良M9培养基；图9)。这得到了定量测定结果的支持，这种定量测定结果证实，补充100mg植物糖原/mL培养基会导致生物膜具有的增生生物质的量达到在未补充培养基中生长的所述相应生物膜所述量的17.7％±3.3(改良M9培养基)和59.0％±8.0(King′s A培养基)(n＝14±SEM)。King's A培养基的％降低在10和100mg植物糖原/mL浓度下都是相似的，表明这可能就是这种培养基中的功效程度。
也就是说，天然植物糖原能够限制初始形成过程和后续生物膜生长。此外，这种能力部分取决于所述局部环境条件，如本文中所示，取决于改变生长条件，并且是浓度依赖性的，浓度越高则会导致更大的降低。类似于有关其他多糖如葡聚糖限制表面定殖和生物膜形成的能力的报道，天然未改性植物糖原会损害铜绿假单胞菌形成生物膜的能力。这可能够发生于生物膜形成和生长的任何或所有步骤中，包括细胞附着和粘附，细胞分裂和微集落形成，微集落扩张和生物膜的成熟，以及生物膜分散。铜绿假单胞菌被认为是生物膜研究的模型生物，并预期所获得的所述数据将适用于其他生物。
实施例22.阳离子化植物糖原在抑制生物膜形成和发育方面比植物糖原更有效
实施例21传达了关于天然和未改性植物糖原用于阻碍生物膜研究的所述模型生物铜绿假单胞菌形成生物膜的能力的知识。在这个实施例中，我们使用了植物糖原的阳离子化形式。
通过在改良M9或King's A培养基(22～24h，37℃，150rpm)中继代培养铜绿假单胞菌PAO1从而复苏铜绿假单胞菌PAO1原种。配方和制备都描述于实施例21中。除了培养基补充有无菌阳离子化植物糖原之外，基本上如实施例21中所述进行所述实验。实验在一式三份测定中进行，并作为独立的一式三份实验重复(n＝9)。
在阳离子化植物糖原存在下的生长会导致形成的生物膜的量产生显而易见的视觉和定量差异。图9显示了由采用不同浓度的阳离子化植物糖原生长的铜绿假单胞菌形成的代表性染色生物膜的图像。图11显示采用增加量的阳离子化植物糖原的补充导致了生物膜增生的稳定降低。两种不同的培养基经过评价，具有相似的结果(空心方块代表改良M9培养基，空心菱形代表King′s A培养基)。
虽然天然植物糖原会降低生物膜生长(实施例21)，但是阳离子化植物糖原需要较低的浓度就能产生可比较的生物膜预防。如图10和图11所示，通过定量测定结果佐证了视觉观察结果。
阳离子化植物糖原在限制生物膜增生方面具有优于天然植物糖原的能力。需要约十倍更多的天然植物糖原才能导致类似于阳离子化植物糖原的降低。在这方面，天然和改性形式的植物糖原可以用作抗生物膜和防污剂，或作为制剂的部分使用。
实施例23.阳离子化植物糖原限制细胞附着于表面
生物膜形成的所述定义步骤始于细胞附着于表面。这是一个多因素过程，其结果由诸如细胞、细胞表型、细胞表面特性和附属物、表面特性和局部环境条件等参数决定。干扰细胞附着于表面的能力是合乎需要的，因为它将会限制下游生物膜生长。
通过在Mueller-Hinton肉汤(Oxoid；Fisher Scientific，加拿大)中继代培养铜绿假单胞菌PAO1并使其生长20～22h(37℃，150rpm)从而复苏铜绿假单胞菌PAO1原种。细胞附着分析测试在无菌96孔聚苯乙烯孔板中进行。简而言之，将未补充或补充有1或10mg阳离子化植物糖原/mL的肉汤的母液接种至5×105CFU的最终细胞密度。将100μL等分试样移液到8孔/条件中。阴性生长对照包含未接种的培养基。将孔板在37℃下静态孵育5h，然后转移到生物安全柜中。用移液器吸出孔内容物，弃去，并用0.9％(wt/vol)NaCl冲洗所述孔。附着细胞用0.1％ Hucker结晶紫(100μL/孔)在室温下染色15min。抽吸孔内容物并用水过量洗涤所述孔从而除去任何未结合的染色。使所述板风干。保留的染色用33％乙酸溶解(vol/vol；100μL/孔)，然后使用BioTek EL800读板仪在λ＝600nm下定量。实验以一式八份重复进行并重复三次(n＝24±sem)。
在孵育5h后，在未补充的生长培养基存在下孵育的铜绿假单胞菌细胞产生的附着值，如染色保留吸光度值所示，为1.023±0.049，而在1或10mg阳离子化植物糖原/mL存在下的孵育导致了降低，具有的值分别为0.345±0.012和0.536±0.041。
在1mg阳离子化植物糖原/mL下观察到铜绿假单胞菌附着于聚苯乙烯孔板的降低比10mg/mL的更高浓度的情况更大。所述最可能的解释涉及纳米颗粒和细胞之间产生的相互作用的平衡，以及所述表面材料的性质，聚苯乙烯是相对更疏水的。在这种情况下，预期带有净正电荷的阳离子化植物糖原会结合至所述疏水性聚苯乙烯表面和所述带负电荷细胞。
可能会存在一些最佳条件，其导致细胞和表面之间产生最大排斥，并且将受到其他参数如纳米颗粒组成和浓度的影响。据推荐，对于给定的应用，所述制剂应该根据经验建立，并考虑任何表面，环境性条件，细胞，以及纳米颗粒组成和浓度。
实施例24.用阳离子化植物糖原对表面进行预处理会限制细胞附着
虽然初始细胞附着是生物膜形成中的决定性时刻(a defining moment)，但所述表面的性质也是重要的。原始表面特性会影响所述所谓的调理膜(conditioning film)的形成，所述调理膜简单地由从所述局部环境吸附到表面上的部分组成，并可以包括脂质和蛋白质。因此，所述调理膜是至关重要的，因为它有助于所述整个表面性能；一种限制生物膜的方法是通过经由调理膜(其对附着和粘附产生排斥性)专门改变表面性质。
通过在Mueller-Hinton肉汤(Oxoid；Fisher Scientific，加拿大)中继代培养铜绿假单胞菌PAO1并使其生长20～22h(37℃，150rpm)从而复苏铜绿假单胞菌PAO1原种。细胞附着分析测试在无菌96孔聚苯乙烯孔板中进行。简而言之，通过将100μL肉汤或补充有1或10mg阳离子化植物糖原/mL的肉汤移液到相应的孔中从而对孔进行预处理。使用ParaFilmTM密封所述孔板，并在4℃下孵育20h。在20h后，将所述孔板转移到生物安全柜中，吸出孔内容物，弃去，并用0.9％NaCl(wt/vol)洗涤孔。此时，按照实施例23中所述进行细胞对预调理孔的附着。实验以一式八份重复进行并重复三次(n＝24±sem)。
在用未补充培养基或1mg阳离子化植物糖原/mL进行预处理的孔中的细菌附着具有分别为1.023±0.049和1.036±0.045单位的相似吸光度值(表5)。然而，用10mg阳离子化植物糖原/mL预处理孔使细菌附着降低了约75％(测量的吸光度值为0.251±0.016)。
表5.底层(substratum)的预处理和向所述附着培养基中添加阳离子化植物糖原均降低了细胞与表面的粘附
n＝24±sem；值是吸光度单位(λ＝600nm)。
据进一步发现，将表面预处理和用含有阳离子化植物糖原的溶液孵育组合，会限制细胞附着(表5)。存在一个功效的趋势是，其中采用10mg阳离子化植物糖原mL的表面预处理发现降低最大，并且遵循0>1>10mg阳离子化植物糖原/mL的附着肉汤的趋势。与所述1mg阳离子化植物糖原/mL表面预处理的无效效能相反，所述附着肉汤的补充恢复了防止附着的能力，并比单独使用附着肉汤孵育略微更有效。
实施例25.阳离子化植物糖原破坏生物膜成熟
通过在改良M9培养基中继代培养铜绿假单胞菌PAO1并使其生长22～24h(37℃，150rpm)从而复苏铜绿假单胞菌PAO1原种。按照实施例21中所述制备改良M9培养基。将无菌玻璃管(18×150mm)用于所述生物膜形成分析测试。用所述固定相培养物(1:2000稀释)接种原种溶液，充分混合并将2mL等分试样转移到无菌管中。将所述管在37℃和150rpm下孵育6h。在所述6h转移时间点之前，制备补充改良植物糖原的培养基或培养基的原种无菌溶液。在6h时，用移液器抽吸除去所述培养物，并立即用适当的预热溶液替换。将所述管返回培养箱中，另外14h，整个孵育时间为20h(37℃和150rpm下)。阴性对照包括未转移和转移的未补充培养基样品管，并用于分析测试由所述转移步骤产生的差异。在20h时，按照实施例14中所述定量所述累积的生物膜。实验在一式三份分析测试中进行，并作为独立的一式四份实验重复(n＝12)。
用阳离子化植物糖原处理6h的生物膜导致20h时的增生模式改变。图12显示了用不同浓度的阳离子化植物糖原处理后由铜绿假单胞菌形成的代表性生物膜的所记录的图像。图13描述了在用不同浓度的阳离子化植物糖原处理后来自铜绿假单胞菌的预形成生物膜的增生的定量。在6h时，形成了相当大量的生物膜，但仍比20h时少。所述20h和20hT生物膜代表了允许生物膜累积20h，20h不交换培养基(未转移)和所述相关的培养基在6h交换并随后允许孵育总共20h(20hT-转移)的样品。在两种情况下，存在相似量的生物膜，并表明所述转移步骤没有破坏事件的正常进展。相反，培养基已经用补充有不同浓度的阳离子化植物糖原的培养基交换的所有样品都显示出生物膜增生损失20h(图12和图13)。
阳离子化植物糖原能够防止新生生物膜的继续成熟。这种效应是浓度依赖性的，并且浓度增加与更高的功效相关。这可以通过所述带电纳米颗粒与所述生物膜内的细胞之间的相互作用或与所述细胞外基质的组件之间的相互作用而发生。这种成熟停止还可能与细胞的有限运动性有关，影响微集落扩张和特异化。在实施例20中，阳离子化植物糖原被证明会阻碍运动性，所述运动性对于生物膜的标志性3-D结构的发育是重要的，并对于微环境的发展和过量表型(plethora of phenotypes)的产生是至关重要的。
实施例26.用阳离子化植物糖原短期处理生物膜导致生物膜质量减少
阳离子化植物糖原可以与生物膜内的细胞相互作用，也可以与细胞外基质的组分相互作用。然后，通过这种相互作用，阳离子化植物糖原可以破坏生物膜。这已经被证明：对于其他带正电荷的物质，如金属阳离子，以及对于螯合剂，其会从生物膜中除去或置换阳离子，随后损害细胞和基质之间的所述精细结构的排列和组织。
通过在改良M9培养基中继代培养铜绿假单胞菌PAO1并使其生长22～24h(37℃，150rpm)从而复苏铜绿假单胞菌PAO1原种。制备了改良M9培养基(实施例21)。无菌玻璃管(18×150mm)用于生物膜形成分析测试。原种溶液用固定相培养物(1:2000稀释)接种，充分混合并将2mL等分试样转移到无菌管中。将所述管在37℃和150rpm下孵育20h。在20h时，将多组管转移到生物安全柜中，通过抽吸除去培养物并立即用含有1mg天然或阳离子化植物糖原/mL的合适预热转移溶液替换。未补充的培养基用作阴性对照。将这些管返回培养箱并在转移后5、10、30和60min取样。通过抽吸除去管的内容物并丢弃。用无菌的0.9％(wt/vol)NaCl轻轻冲洗所述管从而除去松散附着的细胞，并定量所述剩余的生物膜生物质(实施例21)。实验一式三份进行并重复四次(n＝12)。
实施短期暴露评价从而评价补充阳离子化植物糖原对由铜绿假单胞菌PAO1形成的生物膜的影响。这具有潜在的应用，包括作为用于处理生物结垢的非生物或生物表面的抗生物膜剂。生物膜用天然或阳离子化植物糖原处理5、10、30或60min(图14)。在培养基或补充天然植物糖原的培养基中简单孵育后，没有发生生物膜损失(图14)。相反，阳离子化植物糖原刺激了平均40％的减少。值得注意的是，这种减少在整个评价时间段内保持相对稳定(分别在5、10、30和60min时平均减少了43％、40％、40％、39％)并表明这种减少是一个快速事件并且延长孵育最长达1h并未增加所述测量的生物质损失。
这种效应与实施例22和25中描述的阳离子化植物糖原处理后的结果形成对比。据认为，阳离子化植物糖原通过不同的机制作用于生物膜形成和发育的阶段，包括但不限于，底层上调理膜的形成，运动性受阻，细胞表面性质改变，基于群体感应的过程的干扰，与生物膜细胞外基质物质和生物膜内的细胞的相互作用。这种生物膜的多阶段靶向赋予阳离子化植物糖原作为抗生物膜剂或防污剂的通用性。
实施例27.阳离子化植物糖原抑制所选择抗生素刺激生物膜生长的亚-MIC的能力
抗生素是用于预防或限制宿主内微生物感染的药剂。许多参数对于成功结果是至关重要的，包括抗生素和抗生素浓度的选择。在向患者给药抗生素后，所述浓度将上升达到最大值，然后随着抗生素从体内清除而下降。治疗方案寻求维持治疗浓度。然而，在抗生素浓度可能处于亚-最小抑制浓度(MIC)水平的时间段内是很常见的。抗生素的亚-MIC已被证明会引起细菌细胞的反应；重要的是，这些包括生存和持久性策略。例如，亚-MIC氨基糖苷类抗生素会刺激所述机会致病菌铜绿假单胞菌的生物膜增加。
在无菌96孔聚苯乙烯孔板中评价了阳离子化植物糖原在氨基糖苷类托普霉素的亚-MIC浓度下限制增强的生物膜形成的潜力。通过在Mueller-Hinton肉汤(Oxoid；FisherScientific，加拿大)中继代培养铜绿假单胞菌PAO1并使其生长20～22h(37℃，150rpm)从而复苏铜绿假单胞菌PAO1原种。γ-照射的阳离子化植物糖原的无菌溶液通过在无菌Mueller-Hinton肉汤中按需要重构和稀释而制备。在不存在或存在1或10mg/mL阳离子化植物糖原下，孔含有所述MIC值的0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25、1.5倍的最终浓度，所述MIC值根据经验确定为0.4μg托普霉素/mL。阴性生长对照包括无菌培养基，未补充或补充1或10mg阳离子化植物糖原/mL。阳性生长对照包含接种的培养基，未补充或补充1或10mg阳离子化植物糖原/mL。接种物在使用前立即通过在无菌Mueller-Hinton肉汤中以分析测试内最终细胞密度5×105CFU/mL稀释而制备。将这些孔板在37℃静态孵育。在20h时，根据先前描述的方案(实施例23)对生物膜进行染色和定量。实验以一式四份重复进行并重复三次(n＝12)。
与出版的文献一致，所述氨基糖苷托普霉素的亚-MIC浓度导致生物膜形成增加(图15)。相对于仅培养基的对照，据发现，生物膜累积1.33倍(1/4-MIC)，>2.00倍(1/2-MIC)和1.5倍(3/4-MIC)。只有在≥MIC的值时，生物膜积累才会减少。
当没有添加托普霉素时，数据集也相对于它们对应的生物膜积累值进行归一化(图15)。当培养基补充阳离子化植物糖原时，在1/4-MIC托普霉素时形成的生物膜没有增加，并且表明由于亚-MIC抗生素增强的生物膜的抑制。在1/2-MIC托普霉素时，相对于相应补充培养基中形成的生物膜，阳离子化植物糖原降低生物膜约70％。在托普霉素的3/4-MIC时，这种降低更大，达到90％的水平。在未补充培养基中直至托普霉素浓度超过MIC才观察到类似效果。
当阳离子化植物糖原与低于其治疗浓度的抗生素组合使用时，其逆转了增强的生物膜生长。生物膜是急性和慢性传染病发展过程中确定的关键步骤，对化疗方案也不太易处理，并且受保护避免宿主免疫防御和反应能力。因此，当抗生素浓度小于引起抑制细胞生长或细胞死亡的治疗所需的抗生素浓度时，与阳离子化植物糖原的组合疗法代表了防止增强的生物膜形成的方法。通过防止生物膜形成和增殖，这些微生物细胞仍然对抗生素的作用敏感，特别是一旦递送下一剂量时。另外，由于微生物细胞不进入生物膜的遮蔽状态，则这些细胞仍然可以进入宿主免疫系统的保护性动作。
实施例28.阳离子化植物糖原和抗生素的组合增强了生物膜根除
先前已经表明，阳离子化植物糖原能够干扰细胞运动性，细胞附着，生物膜形成和成熟，并还使细菌更易受各种抗生素的作用(实施例17，19，20，22～26)。此外，阳离子化植物糖原逆转了亚-MIC抗生素增强生物膜增殖的倾向(实施例27)。我们证实，阳离子化植物糖原与抗生素的组合是生物膜降低和处理的改进方法。
生物膜生长和处理在无菌96孔聚苯乙烯孔板中进行实施。γ-照射的阳离子化植物糖原的无菌溶液通过在无菌Mueller-Hinton肉汤中按需要重构和稀释而制备。通过在Mueller-Hinton肉汤(Oxoid；Fisher Scientific，加拿大)中继代培养铜绿假单胞菌PAO1(37℃，150rpm，16～18h)从而复苏铜绿假单胞菌PAO1原种。接种物在使用前立即通过在无菌Mueller-Hinton肉汤中稀释至5×105CFU/mL的分析测试内最终细胞密度而制备。将100μL这种溶液转移至孔中并孵育(37℃，150rpm)。无菌肉汤是阴性生长对照。在20h时，将孔板转移到生物安全柜中，轻轻吸出孔内容物，并用无菌0.9％(wt/vol)NaCl冲洗孔。然后将所述20h生物膜暴露于在具有0、1或10mg阳离子化植物糖原/mL的Mueller-Hinton肉汤中的0、0.125、0.25、0.5、1、2和4×MIC的环丙沙星或托普霉素。对于托普霉素和环丙沙星，MIC值分别凭经验建立为0.4和0.125μg/mL。阴性生长对照包括在先前已经包含无菌生长培养基的孔中无菌培养基，未补充或补充1或10mg阳离子化植物糖原/mL。阳性生长对照包含接种的培养基，未补充或补充1或10mg阳离子化植物糖原/mL。将这些孔板在37℃下再孵育24h，之后如前所述对生物膜进行定量。实验以一式四份重复进行并重复三次(n＝12)。
在所选择的两种抗生素中，阳离子化植物糖原使细胞对环丙沙星的作用致敏而对托普霉素的作用并未敏感(实施例17)。在用抗生素和阳离子化植物糖原的不同组合处理24h之前，生物膜生长了20h(图16，图17)。
当用托普霉素处理20h生物膜时，类似于通过亚-MIC托普霉素诱导生物膜形成，存在生物膜增殖的净增加(对于所述MIC值的0.125～2倍范围)(图16)。在托普霉素MIC的4倍时，相对于所述初始生物膜，生物膜减少了40％。虽然已知生物膜对抗生素的敏感性较低，但所述数据表明抗生素可以刺激生物膜生长。对于亚-MIC环丙沙星也发现了类似且未预料到的趋势(图17)。在所述MIC下生物膜没有变化，在两倍和四倍所述MIC值下分别降低64％和73％。
用托普霉素或环丙沙星与1mg阳离子化植物糖原/mL组合处理生物膜，足以防止抗生素诱导的生物膜积累增加(图16，图17)。补充10mg阳离子化植物糖原/mL导致托普霉素和环丙沙星在亚-MIC浓度下的生物膜积累都降低(图16，图17)。例如，在托普霉素的所述MIC下，这导致生物膜为在单独培养基对照中相应MIC托普霉素的约10％。在环丙沙星的0.5MIC下，生物膜为仅培养基中所述相应0.5MIC的20％。
总之，当阳离子化植物糖原与抗生素组合使用时，它逆转了抗生素诱导的生物膜增殖的程度。生物膜是急性和慢性传染病发展过程中已经确定的关键步骤，对化疗方案也不易处理，并且受保护避免宿主免疫防御和反应能力。因此，与阳离子化植物糖原的组合疗法代表了防止由于抗生素所致的增强的生物膜生长的方法(当抗生素浓度低于引起抑制细胞生长或细胞死亡的治疗所需的浓度时)。当较高浓度的阳离子化植物糖原与抗生素组合使用时，这会降低生物膜的量。
实施例29.阳离子化植物糖原导致细胞从悬浮液中沉积
来自细胞悬浮液的细胞沉积可以通过许多机制发生，包括絮凝或导致颗粒之间的排斥减少的总表面电荷减少。细颗粒的沉积对于诸如水净化和处理的过程是很重要的。此外，通过改变溶液中细胞之间或细胞和基底之间的相互作用，可以影响定殖、附着和生物膜形成的进展。
γ-照射的阳离子化植物糖原的无菌溶液通过在无菌Mueller-Hinton肉汤中根据需要重建和稀释而制备。通过在Mueller-Hinton肉汤(Oxoid；Fisher Scientific，加拿大)中继代培养铜绿假单胞菌PAO1(37℃，150rpm，16～18h)从而复苏铜绿假单胞菌PAO1原种。将1mL等份试样的细胞以6000×g离心5min，用5mM HEPES缓冲液(pH 6.8)洗涤两次，并再悬浮于含有0、1或10mg天然或阳离子化植物糖原/mL的HEPES缓冲液中。然后将所述样品置于实验台顶部30min，之后观察沉积物形成。全部装制(mount)的阴性染色的样品制备使用透射电子显微镜进行观察。高浓度背景颗粒通过简单细胞成颗粒(3000×g，5min)而降低，除去所述上清液，并将所述颗粒轻轻再悬浮于5mM HEPES缓冲液(pH 6.8)中。浮上(float)Formvar-和碳-涂覆的铜栅格(200目；Marivac)，膜面朝下，在10μL样品上，10秒。所述栅格被取出，所述边缘接触至Whatman no.1滤纸吸去多余物。所述栅格随后通过漂浮(样品侧)于50μL纳滤纯水上进行洗涤，吸干(blot)，漂浮于10μL 2％(wt/vol)铀酰乙酸酯(uranylacetate)上10秒，并吸干。使用在标准操作条件下以80kV的加速电压操作的Philips CM10透射电子显微镜检查这些栅格。
据发现，补充阳离子化植物糖原导致铜绿假单胞菌细胞从所述溶液中沉积出来而补充天然植物糖原却并不如此(图18)。这是一个快速的过程，在10min内就可见沉积物。细胞的显微镜检查表明阳离子化植物糖原直接与细胞相互作用而天然植物糖原并未如此(图19)。预期这可能导致整个细胞表面电荷变化，导致细胞沉积。此外，这会干扰诸如附着和生物膜形成的过程。
还应该注意的是，用阳离子化植物糖原处理的细胞显示出细胞壁受扰动的迹象(图19)。这可能部分解释了阳离子化植物糖原对抗生素的增敏作用(实施例17)，并还可能引起对扩散过程如抗生素摄取或群体感应信号可能具有重要意义的膜参数的变化。
实施例30.植物糖原纳米颗粒的皮肤刺激潜力
实施人重复性损伤试验(Human Repeat Insult Test)(HRIPT)从而评价含有植物糖原的乳膏制剂在3周时间内接着是休息期和挑战期的皮肤刺激(接触性皮炎)和致敏潜力(接触性过敏)。这个研究设计为单中心随机研究；双盲于以下测试制剂之间进行个体间治疗比较：含有和不含植物糖原的乳膏基质(cream base)。实施例31中描述了具有植物糖原的乳膏基质的配制。在没有植物糖原的乳膏基质的情况下，后者用相应量的水代替。
选择了总共50名年龄24～76岁的两种性别的健康志愿者(平均年龄＝46.88)进行该研究。
将含有所述测试制剂和对照物(纯凡士林USP)的贴剂施用于所述测试区域并使其与所述皮肤接触。在48h后移除所述第一个贴剂并且在检测之后，施用具有新鲜测试制剂的新贴剂。每隔一天将所述测试制剂施用于所选区域，每周三次，连续3周。这被称为诱导阶段。
在完成上述诱导阶段后，安排10～14天的休息期。然后开始挑战阶段。对于这个阶段，所述贴剂施用于与诱导期中使用的位点不同的位点。施用48h后，移除所述贴剂，清洁所述测试部位并由皮肤科医生检查不耐受或刺激的任何迹象。
表6中总结了含植物糖原制剂的HRIPT的所述结果。
表6皮肤病学研究
0＝无可见反应
+＝几乎觉察不到的红斑
1＝轻度(轻微)红斑
2＝中度且明显的红斑和存在轻微水肿
3＝明显的红斑，存在水肿和水泡
4＝严重红斑，存在水泡、水疱和溃疡
基于本文所述研究的结果，可以推断，植物糖原不产生皮肤刺激和皮肤致敏的迹象。因此，它被认为是无刺激性和低过敏性物质。
实施例31.包含植物糖原的药物组合物
这种乳膏形式的制剂含有植物糖原作为活性成分，且更适合局部给药。
表7中描述了具有植物糖原的乳膏配方。
表7包含植物糖原的药物组合物
*滴加至pH达到5.5
所述组合物制备如下：
将水和甘油在烧杯中合并。然后分散植物糖原和黄原胶。将所述混合物加热至75℃。将B相成分在单独的烧杯中合并，并加热至75℃。将B相加入A相中并以1200rpm混合直至均质。当温度降至40℃时，将C相成分加入所述混合物中。以400rpm继续混合10min从而确保混合充分。
实施例32.TCP-1单核细胞对Cy5.5-标记糖原/植物糖原颗粒的内化
按照实施例10中所述制备Cy5.5-标记糖原/植物糖原颗粒。近红外荧光染料(Cy5.5)与本研究中使用的所述颗粒结合，能够通过共聚焦荧光显微镜分析纳米颗粒摄取。
将MCP-1细胞与Cy5.5-标记糖原/植物糖原颗粒在1mg/mL的浓度下在4℃(阴性对照)和37℃下孵育0.5，2，6和24h。然后用PBS洗涤细胞，在10％缓冲福尔马林溶液中固定并再次用PBS洗涤。所述固定的细胞用DAPI(细胞核)和AF488(细胞膜)染色。糖原/植物糖原颗粒的内化通过Olympus Fluoview FV1000激光扫描共聚焦显微镜进行评价。
当内吞和吞噬过程不再有活性时在4℃孵育不会导致任何与THP-1细胞相关的颗粒(图20)。这证实，由于所述表面结合，THP-1细胞没有积累纳米颗粒。相比之下，在37℃下6h内孵育显示Cy5.5-标记糖原/植物糖原颗粒在细胞质中大量积累(图20)。然而，在0.5～2h的时间间隔内摄取非常低。
实施例33.注射Cy5.5-植物糖原结合物后天然小鼠的药代动力学(PK)曲线
按照实施例10中所述合成了Cy5.5-标记植物糖原(0.08μM Cy5.5/mg)。
向裸CD-1小鼠(n＝3)，18～20g，以剂量300mg/kg小鼠注射分散于PBS中的Cy5.5-植物糖原。使用肝素化管按照多个时间间隔(15min，1h，2h，6h和24h)从所述小鼠(下颌下静脉(submandibular vein))收集小血样(50μL)。这些时间点使用细胞荧光计读板器通过荧光进行分析。使用由在血液中稀释的已知浓度的Cy5.5-植物糖原纳米颗粒构成的标准曲线内插纳米颗粒浓度。
正如图21中可以看出，血液中的Cy5.5-植物糖原浓度以指数方式随时间降低并且到24h时消除。所述消除半衰期确定(计算)为2h。半衰期是指所述身体将所述化合物的初始血液浓度降低50％所需的时间。
所有光学成像实验使用小动物时域eXplore Optix MX2临床前成像仪(small-animal time-domain eXplore Optix MX2pre-clinical imager)完成，并使用ART OptixOptiview分析软件2.0(Advanced Research Technologies，Montreal，QC)分析或重构图像作为荧光浓度图。使用重复频率80MHz和时间分辨率12ps光脉冲的670nm脉冲激光二极管进行激发。700nm处的荧光发射通过高灵敏度的时间相关单光子计数系统进行收集，并通过快速光电倍增管进行检测。
按照实施例10中所述合成了Cy5.5-标记植物糖原(0.8μM Cy5.5/mg)。
在天然动物中，体内成像在肝、肺(在所有时间点)、肾(15min～6h)、膀胱(15min～6h)和脑(15min～2h)中都显示出Cy5.5-植物糖原的强信号(图22和图23)。
在30min和24h的体外数据证实，在肺中确实有显著的Cy5.5-植物糖原摄取，在脑中程度次之(图22和图23)。与较晚的时间点(24h)相比，所述脑中的信号在早期时间点(30min)最高。由于所述Cy5.5-植物糖原纳米颗粒是葡萄糖聚合物，已知的葡萄糖转运非常活跃的器官如脑和肺有可能通过葡萄糖转运蛋白积累Cy5.5-植物糖原。
所述体内成像数据证实，肝脏主要负责所述Cy5.5-植物糖原的代谢。此外，肝脏纳米颗粒的代谢有可能产生能够重新进入所述血流，然后通过所述肾系统消除的较小Cy5.5-标记葡萄糖衍生物。

Claims (46)

1.一种抗感染组合物，包含糖原或植物糖原纳米颗粒；抗感染组分，其中所述抗感染组分包含赋予所述组合物抗感染活性的一种或多种分子；和载体。
2.根据权利要求1所述的抗感染组合物，其中所述纳米颗粒具有通过动态光散射测量的小于约0.3的PDI和约30nm～约150nm，优选60～110nm的平均粒径。
3.根据权利要求1或2所述的抗感染组合物，其中所述组合物中至少90％的所述纳米颗粒具有约30nm～约150nm的平均粒径。
4.根据权利要求3所述的抗感染组合物，其中所述纳米颗粒具有约40nm～约140nm、约50nm～约130nm、约60nm～约120nm、约70nm～约110nm、约80nm～约100nm、约30nm～约40nm、约40nm～约50nm、约50nm～约60nm、约60nm～约70nm、约70nm～约80nm、约80nm～约90nm、约90nm～约100nm、约100nm～约110nm、约110nm～约120nm、约120nm～约130nm、约130nm～约140nm、或约140nm～约150nm的平均直径。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的抗感染组合物，其中所述抗感染组分包含抗生素、抗真菌化合物或抗原生动物化合物。
6.根据权利要求5所述的抗感染组合物，其中所述抗生素、抗真菌化合物或抗原生动物化合物与所述糖原或植物糖原纳米颗粒结合。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的抗感染组合物，其中所述抗感染组分包含结合至所述糖原或植物糖原纳米颗粒表面的带正电荷分子。
8.根据权利要求7所述的抗感染组合物，其中所述纳米颗粒用伯、仲、叔或季铵化合物进行官能化。
9.根据权利要求8所述的抗感染组合物，其中所述纳米颗粒用季铵化合物进行官能化。
10.根据权利要求9中任一项所述的抗感染组合物，其中所述纳米颗粒用C2～C32季铵化合物进行官能化。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的抗感染组合物，其中所述纳米颗粒进一步用疏水性官能团进行官能化。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的抗感染组合物，其中所述组合物用于局部给药。
13.根据权利要求1～4中任一项所述的抗感染组合物，其中所述纳米颗粒与一种或多种药剂或诊断剂结合。
14.根据权利要求1～4中任一项所述的抗感染组合物，其中所述纳米颗粒与抗感染剂结合。
15.根据权利要求1～4中任一项所述的抗感染组合物，其中所述纳米颗粒与抗真菌剂结合。
16.一种植入物或生物医学器件或用于植入物或生物医学器件的涂层，包含权利要求1～15中任一项所述的抗感染组合物。
17.一种植入物或生物医学器件，全部或部分地用权利要求1～15中任一项所述的抗感染组合物涂覆。
18.根据权利要求16或17所述的植入物或生物医学器件，其中所述植入物或生物医学器件是组织工程支架、伤口敷料或绷带、线、缝合线、或植入器件如起搏器、人造关节、导管、支架、或血管成形术球囊。
19.根据权利要求16或17所述的用于植入物或生物医学器件的涂层，其中所述纳米颗粒以总重量计0.5％～95％的浓度存在。
20.根据权利要求1～15中任一项所述的抗感染组合物，其中所述组合物溶于水基溶剂或醇基溶剂中，并且其中所述纳米颗粒以总重量计0.1％～20％的浓度存在。
21.一种治疗感染的方法，包括将治疗有效量的权利要求1～15中任一项所述的组合物给予需要其的受试者。
22.根据权利要求21所述的方法，其中微生物感染是真菌感染。
23.根据权利要求21所述的方法，其中微生物感染是细菌感染。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述细菌感染是由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)引起的。
25.根据权利要求24所述的方法，其中患者患有囊性纤维化。
26.根据权利要求21～25中任一项所述的方法，其中所述组合物降低或抑制生物膜形成、维持或生长。
27.根据权利要求21～26中任一项所述的方法，其中所述组合物干扰群体感应过程。
28.一种治疗细胞内感染的方法，包括将治疗有效量的权利要求1～15中任一项所述的组合物给予需要其的受试者。
29.一种包含权利要求1～15中任一项所述的抗感染组合物的皮肤消毒剂。
30.根据权利要求29所述的皮肤消毒剂，包含：
a.按总重量计约25％～约75％的消毒醇；
b.按总重量计约0.1％～5.0％的所述抗感染组合物；
c.杀病毒有效量的有机酸；和
d.水。
31.根据权利要求29或30所述的皮肤消毒剂，其中所述皮肤消毒剂是凝胶、洗剂或气溶胶喷雾剂的形式。
32.一种包含权利要求1～15中任一项所述的抗感染组合物的表面消毒剂。
33.根据权利要求32所述的表面消毒剂，包含：
a.按总重量计约50％～90％的消毒醇；
b.按总重量计约0.5％～10.0％的所述抗感染组合物；
c.按总重量计约0.1％～约5％，足以使所述组合物pH值保持低于约5的酸组分；和
d.水。
34.根据权利要求32或33所述的表面消毒剂，其中所述表面消毒剂是凝胶、洗剂或喷雾剂的形式。
35.一种抑制表面上生物膜形成的方法，包括向所述表面给予权利要求1～15中任一项所述的抗感染组合物。
36.一种增强抗生素的抗微生物活性的方法，包括共同给予阳离子化的糖原或植物糖原纳米颗粒和抗生素。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述纳米颗粒具有通过动态光散射测定的小于约0.3的PDI和约30nm～约150nm，优选60～110nm的平均粒径。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中组合物中至少90％的所述纳米颗粒具有约30nm～约150nm的平均粒径。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述纳米颗粒具有约40nm～约140nm、约50nm～约130nm、约60nm～约120nm、约70nm～约110nm、约80nm～约100nm、约30nm～约40nm、约40nm～约50nm、约50nm～约60nm、约60nm～约70nm、约70nm～约80nm、约80nm～约90nm、约90nm～约100nm、约100nm～约110nm、约110nm～约120nm、约120nm～约130nm、约130nm～约140nm、或约140nm～约150nm的平均直径。
40.根据权利要求36～39中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒是植物糖原的纳米颗粒。
41.根据权利要求36～40中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒和所述抗生素同时给予。
42.根据权利要求36～40中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒和所述抗生素顺序地给予。
43.根据权利要求36～42中任一项所述的方法，其中所述抗生素是β-内酰胺、氟喹诺酮、氨基香豆素、大环内酯、利胆醇、四环素、糖肽或喹诺酮。
44.根据权利要求36～43中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒使用伯、仲、叔或季铵化合物进行阳离子化。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述纳米颗粒使用季铵化合物进行阳离子化。
46.根据权利要求36～45中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒进一步用疏水性官能团进行官能化。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017190248A1 (en) * 2016-05-04 2017-11-09 Mirexus Biotechnologies Inc. Glycogen and phytoglycogen nanoparticles as immunosuppressive compounds, and compositions and methods of use thereof
MA53323A (fr) * 2018-07-31 2021-11-03 Bayer Ag Utilisation d'un composé polysaccharide cationique comme fongicide, pesticide, algicide, déshydratant et pour prolonger la durée de conservation de fruits et légumes
US10927397B2 (en) 2018-10-16 2021-02-23 Sterilex, Llc Compositions, devices and methods for detecting biofilms
CN109897120B (zh) * 2019-01-30 2020-12-01 江南大学 一种植物糖原季铵化改性产物的制备方法和产物及其应用
JP7304835B2 (ja) * 2020-04-22 2023-07-07 キユーピー株式会社 呼吸器系医薬品粉末及びその製造方法
WO2023201119A1 (en) * 2022-04-15 2023-10-19 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Corn phytoglycogen formulations for stabilizing proteins
WO2023227708A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Bayer Aktiengesellschaft Biobased larvicides

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101235098A (zh) * 2008-01-09 2008-08-06 浙江大学 功能性植物多糖的修饰方法
US20100272639A1 (en) * 2007-12-21 2010-10-28 John Robert Dutcher Polysaccharide nanoparticles
US20140066363A1 (en) * 2011-02-07 2014-03-06 Arun K. Bhunia Carbohydrate nanoparticles for prolonged efficacy of antimicrobial peptide
CN104080812A (zh) * 2012-03-15 2014-10-01 方济各安吉利克化学联合股份有限公司 糖原基阳离子聚合物
WO2014172786A1 (en) * 2013-04-26 2014-10-30 Mirexus Biotechnologies Inc Phytoglycogen nanoparticles and methods of manufacture thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8372384B2 (en) * 2007-01-08 2013-02-12 Ndsu Research Foundation Quaternary ammonium functionalized cross-linked polyalkylsiloxanes with anti-fouling activity
WO2010054083A2 (en) * 2008-11-05 2010-05-14 Pharmacaribe Inhalation formulation for treating and prophylatic use in bacteria, mycobacterial and fungal respiratory infections
JP2015519312A (ja) * 2012-04-19 2015-07-09 パーデュー・リサーチ・ファウンデーションＰｕｒｄｕｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 高度分岐α−Ｄ−グルカン

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100272639A1 (en) * 2007-12-21 2010-10-28 John Robert Dutcher Polysaccharide nanoparticles
CN101235098A (zh) * 2008-01-09 2008-08-06 浙江大学 功能性植物多糖的修饰方法
US20140066363A1 (en) * 2011-02-07 2014-03-06 Arun K. Bhunia Carbohydrate nanoparticles for prolonged efficacy of antimicrobial peptide
CN104080812A (zh) * 2012-03-15 2014-10-01 方济各安吉利克化学联合股份有限公司 糖原基阳离子聚合物
WO2014172786A1 (en) * 2013-04-26 2014-10-30 Mirexus Biotechnologies Inc Phytoglycogen nanoparticles and methods of manufacture thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周伟主译: "《儿科学最新诊断与治疗》", 31 August 2014, 人民军医出版社 *
李本高主编: "《现代工业水处理技术与应用》", 30 June 2004, 中国石化出版社 *
王润玲主编: "《药物化学》", 31 October 2014, 中国医药科技出版社 *
马俊主编: "《实用尘肺病临床学》", 31 August 2007, 煤炭工业出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019513837A (ja) 2019-05-30
US20190125896A1 (en) 2019-05-02
EP3442510A1 (en) 2019-02-20
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