CN109310704A - 作为免疫抑制化合物的糖原和植物糖原纳米颗粒、和组合物及它们的使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了包含糖原或植物糖原纳米颗粒的化合物或组合物，其抑制I型干扰素的先天免疫响应。该组合物中的糖原或植物糖原纳米颗粒被适当地阳离子化，在一个实施方式中，被氨基官能化。

Description

作为免疫抑制化合物的糖原和植物糖原纳米颗粒、和组合物 及它们的使用方法
本申请要求美国申请号62/331,662和美国申请号62/454,424的优先权，它们通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及免疫调节剂组合物。
背景技术
糖原是动物的短期储能材料。在哺乳动物中，糖原出现在肌肉和肝脏组织中。它由1,4-葡聚糖链组成，通过α-1,6-糖苷键高度支化，分子量为106-108道尔顿。糖原以直径为20-200nm的致密颗粒的形式存在于动物组织中。还发现糖原在微生物中积累，例如在细菌和酵母中。
无论是在结构还是物理性质方面，植物糖原是一种与糖原非常相似的多糖。基于其植物来源而与糖原不同。植物糖原最重要的来源是甜玉米粒，以及特定品种的大米、大麦和高粱。
发明内容
在一个实施方式中，提供了一种有效量的糖原或植物糖原纳米颗粒用于抑制细胞、细胞培养物、组织或受试者中的抗病毒响应的用途。还提供了一种抑制细胞、细胞培养物、组织或受试者中的抗病毒响应的方法，其包含向细胞、细胞培养物、组织或受试者中引入或施用有效量的糖原或植物糖原纳米颗粒。
在一个实施方式中，糖原或植物糖原纳米颗粒是阳离子化的。
在一个实施方式中，糖原或植物糖原纳米颗粒是胺修饰的。
在一个实施方式中，糖原或植物糖原纳米颗粒修饰有短链季铵化合物，该短链季铵化合物包含至少一个未被取代的或由一个或多个N、O、S或卤素原子取代的具有1至16个碳原子的烷基部分。
在一个实施方式中，纳米颗粒的平均颗粒直径为约30nm至约150nm。在一个实施方式中，至少90％或基本上所有纳米颗粒的平均直径为约40nm至约140nm，约50nm至约130nm，约60nm至约120nm，约70nm至约110nm，约80nm至约100nm，约30nm至约40nm，约40nm至约50nm，约50nm至约60nm，约60nm至约70nm，约70nm至约80nm，约80nm至约90nm，约90nm至约100nm，约100nm至约110nm，约110nm至约120nm，约120nm至约130nm，约130nm至约140nm，或约140nm至约150nm。
在一个实施方式中，纳米颗粒未与另一分子进一步结合。
在另一实施方式中，纳米颗粒进一步与一个或多个小分子结合，其中分子是亲水性修饰剂、药代动力学修饰剂、生物活性修饰剂或可检测的修饰剂。
在一个实施方式中，受试者是基于病毒载体的基因疗法患者。
如本文描述的用途和方法可以用于治疗或预防疾病或病症。
在一个实施方式中，疾病或病症是自身免疫性疾病。
在一个实施方式中，疾病或病症是炎性疾病。
在一个实施方式中，疾病或病症是疼痛。
在一个实施方式中，疾病或病症是败血症(sepsis，脓毒症)。
在一个实施方式中，组合物用于局部给药。
在一个实施方式中，组合物用于全身给药。
如本文描述的用途和方法可用于制造疫苗。
在一个实施方式中，用途是用于在疫苗制造中增强感染细胞培养物中的病毒生长和复制。
还提供了一种联合疗法，其包含基于病毒载体的基因疗法和糖原或植物糖原纳米颗粒。在一个实施方式中，糖原或植物糖原纳米颗粒是阳离子化的。在一个实施方式中，糖原或植物糖原纳米颗粒是胺修饰的。在一个实施方式中，糖原或植物糖原纳米颗粒修饰有短链季铵化合物，该短链季铵化合物包含至少一个未被取代的或由一个或多个N、O、S或卤素原子取代的具有1至16个碳原子的烷基部分。
在一个实施方式中，基于病毒载体的基因疗法是腺病毒。
附图说明
图1是植物糖原/糖原纳米颗粒的示意图。
图2示出了植物糖原(PHX)和化学修饰的植物糖原对虹鳟鱼性腺细胞(RTG-2)细胞系成活力的影响。AB–阿尔玛蓝，CFDA-羧基荧光素二乙酸酯，乙酰氧基甲基酯。PHX–植物糖原OSA3–OSA-植物糖原，DS＝0.02NH2–氨基-植物糖原，DS＝0.1Q151–N-(2-羟基)丙基-3-三甲基铵-植物糖原，DS＝1.00。
图3示出了在存在或不存在PHX-NH2的情况下使用VHSV-IVb感染72小时或144小时后，RTgill W-1细胞中MX1(代表性的先天免疫基因)转录物表达的变化。使用单独培养基(对照)、VHSV-IVb和具有0.5ng/mL或0.05ng/mL PHX-NH2的VHSV-IVb将RTgill W-1细胞处理72或144小时。使用qRT-PCR测量MX1转录物水平。
图4示出了在存在或不存在PHX-NH2的情况下使用鲑鱼呼肠孤病毒(CSV)(CSV；TCID50＝1.995x104)感染24小时后，RTG-2细胞中Mx1转录物表达的变化。使用单独培养基(对照)、CSV和具有0.5ng/mL PHX-NH2的CSV将RTG2细胞处理24小时。使用qRTPCR测量感染后二十四小时的Mx1转录水平。使用ΔΔCq方法、归一化到β-肌动蛋白并且相对于CSV感染的细胞计算表达。以图基(Tukey)事后检验法使用单因素ANOVA分析数据，***P≤0.001。
图5示出了在存在或不存在未修饰的PHX或PHX-NH2的情况下用CSV感染72小时后，CHSE-214细胞的细胞病变效应。使用CSV、具有0.05ng/mL未修饰的PHX的CSV、或具有0.05ng/mL PHX-NH2的CSV将CHSE-214细胞处理72小时。然后将CHSE-214细胞固定，染色并且对合胞体覆盖的面积/总面积(＝％合胞体)进行定量。
图6示出了RTG-2细胞对Cy5.5-标记的PHX颗粒的内在化。用Cy5.5-植物糖原纳米颗粒温育的RTG-2细胞的荧光共聚焦图像。用单独的PBS(未处理的对照细胞)将RTG-细胞处理2小时或20小时，或者用PHX-CY5处理细胞。
图7示出了在幼稚的裸CD-1小鼠静脉注射后30分钟和24小时，离体成像器官中荧光信号的定量。平均荧光浓度数据表明，除肝脏和肾脏外，还可在肺和心脏中检测到高信号。30分钟时的荧光浓度高于24小时时的荧光浓度。预扫描数据指示了未注射Cy5.5-植物糖原的小鼠的荧光浓度数据(即背景自发荧光)。数据表示为平均值+/-SD。
图8示出了在幼稚的裸CD-1小鼠静脉注射Cy5.5-植物糖原后30分钟和24小时，离体成像脑中荧光信号的定量。数据表明，与预扫描(自发荧光水平)相比，Cy5.5-植物糖原在大脑中存在可测量的信号。信号在30分钟时最高，并在24小时内随时间缓慢下降。
图9示出了使用摇动法定量PHX-NH2对CHSE-214细胞中CSV生产的影响。与单独的CSV相比，PHX-NH2导致CSV滴度增加了943.96％(SEM＝43.97)。(p>0.05)。
图10示出了使用两种处理(摇动法和预处理方法)定量PHX-NH2对鲤丘疹性上皮瘤(epithelioma papulosum cyprinid)(EPC)细胞中VHSV-IVb生产的影响。使用预处理方法，与单独的VHSV-IVb相比，PHX-NH2导致VHSV-IVb滴度增加了147.96％(SEM＝125.2)。使用摇动法，PHX-NH2使VHSV-IVb滴度降低了26％(SEM＝25.88％)。(p<0.05)。
图11示出了使用预处理方法定量PHX-NH2对CHSE-214中传染性胰腺坏死病毒(IPNV)生产的影响。与单独的IPNV相比，PHX-NH2导致IPNV滴度增加了4.72％(SEM＝1.99)。(p＝0.62)。
具体实施方式
如本文所使用的，“免疫疗法”是指通过诱导、增强或抑制免疫响应来治疗或预防疾病。设计用于引发或放大免疫响应的免疫疗法可称为激活免疫疗法，而设计用于减少或抑制的免疫疗法被称为抑制性免疫疗法。本文使用的免疫调节剂是指用于免疫疗法的活性剂。免疫抑制剂是指用于抑制性免疫疗法的免疫调节剂。
如本文使用的，“治疗有效量”是指在必要的剂量和特定时间段内实现所需治疗结果的有效量。药理学试剂的治疗有效量可根据诸如疾病状态，个体的年龄、性别和体重以及药理学试剂在个体中引发所需响应的能力而变化。治疗有效量也是治疗有益效果超过药理学药剂的任何毒性或有害作用的量。
如本文所使用的，“受试者”是指给予免疫疗法的动物，在一个实施方式中为哺乳动物，在一个实施方式中为人类患者。如本文所使用的，“治疗”及其语法变化是指施用本发明的化合物或组合物以抑制免疫响应。这种治疗可以是实现疾病或病症的改变或改善，其可以包括缓解其一种或多种症状，或者这种用途可以是预防疾病或病症的预防措施。该治疗可能需要定期或在疾病或病症发作之前给药多个剂量，以改变疾病或病症的进程。
本公开涉及用于免疫抑制的糖原或植物糖原纳米颗粒。例如，纳米颗粒可用于器官移植。
本公开涉及用于免疫疗法的药物和生物医学组合物，其包含糖原或植物糖原纳米颗粒。
本公开涉及用于制造疫苗的糖原或植物糖原纳米颗粒。
本公开涉及联合疗法，其包含基于病毒载体的基因疗法和糖原或植物糖原纳米颗粒。
在一个实施方式中，提供了能够抑制脊椎动物中I型干扰素响应的化合物和组合物。由于先天免疫响应在脊椎动物之间高度保守，因此实施例的发现可以扩展到其它动物，包括人类。本文描述的化合物和组合物的IFN抑制能力具有许多潜在的治疗用途，包括但不限于治疗败血性休克和与腺病毒联合用于基因治疗。
植物糖原由α-D葡萄糖链的分子组成，平均链长为11-12，具有1→4键并且支化点出现在1→6并且支化度为约6％至约13％。在一个实施方式中，植物糖原包括源自天然来源的植物糖原和合成植物糖原。如本文所使用的，术语“合成植物糖原”包括在包括植物衍生材料(例如淀粉)的底物上使用酶促方法制备的糖原样产物。
大多数已知的用于生产糖原或植物糖原的方法的产率和大多数商业来源是高度多分散的产品，其包括糖原或植物糖原颗粒以及其它产物和糖原或植物糖原的降解产物。
在一个实施方式中，使用单分散糖原或植物糖原纳米颗粒。在优选的实施方式中，使用植物糖原纳米颗粒。在进一步优选的实施方式中，使用单分散植物糖原纳米颗粒。在一个实施方式中，单分散植物糖原纳米颗粒是Mirexus Biotechnologies,Inc.生产的PhytoSpherixTM。
如图1所示，每个植物糖原/糖原颗粒是单个分子，由高度支化的葡萄糖均聚物制成，特征在于非常高的分子量(高达107Da)。通过改变起始材料和过滤步骤，可以制造球形并且可以具有直径在30至150nm范围内的不同尺寸。植物糖原/糖原颗粒上的高密度表面基团导致了植物糖原/糖原纳米颗粒的各种独特性质，例如在水中快速溶解、高浓度植物糖原/糖原纳米粒水溶液的低粘度和剪切稀化效应。这与具有相当分子量的线性和低支化多糖的高粘度和差溶解度形成对比。此外，它允许在例如水或DMSO中配制高浓度(高达30％)的稳定分散体。
在一个实施方式中，植物糖原是指根据本文描述的方法制造的单分散植物糖原纳米颗粒。所描述的方法能够产生基本上球形的纳米颗粒，每个纳米颗粒是单个植物糖原分子。
如本文所教导的纳米颗粒具有许多特性，使得它们特别适用于免疫抑制药物组合物。
这些植物糖原纳米颗粒是无毒的，不具有已知的致敏性，可以被人体的糖原分解酶(例如淀粉酶和磷酸化酶)降解。酶促降解的产物是无毒的葡萄糖分子。
糖原和植物糖原纳米颗粒一般都是光稳定的并且在很宽范围的pH、电解质(例如盐)浓度下是稳定的。
此外，许多现有药物迅速从体内排出，导致需要增加剂量。植物糖原和糖原纳米颗粒的紧密球形性质与有效的细胞摄取相关，而糖原和植物糖原的高度支化性质与缓慢的酶促降解相关。另外，认为高分子量(106-107Da)与更长的血管内滞留时间相关。
与淀粉相比，基于较慢的体内消化速率，糖原和植物糖原纳米颗粒可特别地用于针对糖尿病的组合物中。
植物糖原/糖原纳米颗粒具有满足制药和生物医学应用中所用材料的许多要求的性质：可预测的在不同组织中的生物分布和相关的药代动力学；亲水性；生物可降解性；和无毒性。
如实施例中所证明的，本发明人发现本文提供的免疫抑制化合物可以由不同类型的细胞在细胞内积累。
转让给本申请的所有者并且公开内容通过引用以其整体并入的美国专利申请公开号US20100272639 A1提供了一种从细菌和贝壳鱼生物质生产糖原纳米颗粒的方法。所公开的方法通常包括以下步骤：机械细胞分解，或通过化学处理；通过离心分离不溶性细胞组分；通过酶处理然后透析从细胞裂解物中消除蛋白质和核酸，产生含有粗多糖、脂质和脂多糖(LPS)的提取物，或者替代地，酚-水提取；通过弱酸水解或通过用多价阳离子的盐处理(产生不溶性LPS产物的沉淀)来消除LPS；和通过超滤和/或尺寸排阻色谱法纯化富含糖原的级分；和用合适的有机溶剂沉淀糖原，或者可通过超滤或超速离心获得浓缩的糖原溶液；和冷冻干燥，产生糖原粉末。由细菌生物质产生的糖原纳米颗粒的特征在于MWt 5.3-12.7x106Da，粒径为35-40nm(直径)并且是单分散的。
在以国际申请公开号WO2014/172786公布的标题为“植物糖原纳米颗粒及其制造方法”的国际专利申请中描述了生产植物糖原的单分散组合物的方法，该国际专利申请转让给了本申请的所有者并且其公开内容通过引用以其整体并入。在一个实施方式中，所描述的生产单分散植物糖原纳米颗粒的方法包括：a.将碎裂的含有植物糖原的植物材料浸入温度为约0至约50℃的水中；b.使步骤(a.)的产物经受固-液分离以得到含水提取物；c.使步骤(b)的含水提取物通过最大平均孔径为约0.05μm至约0.15μm的微滤材料；和d.使来自步骤c的滤液经受超滤以除去分子量小于约300kDa的杂质，在一个实施方式中小于约500kDa，获得含有单分散植物糖原纳米颗粒的含水组合物。在该方法的一个实施方式中，含有植物糖原的植物材料是选自玉米、大米、大麦、高粱或其混合物的谷物。在一个实施方式中，步骤c.包含使步骤(b.)的含水提取物通过(c.1)最大平均孔径为约10μm至约40μm的第一微滤材料；(c.2)最大平均孔径为约0.5μm至约2.0μm的第二微滤材料；和(c.3)最大平均孔径为约0.05至0.15μm的第三微滤材料。该方法可以进一步包含步骤(e.)：使包含单分散植物糖原纳米颗粒的含水组合物经受使用淀粉蔗糖、糖基转移酶、分支酶或其任何组合的酶处理。该方法避免使用降解植物糖原材料的化学、酶促或热处理。可以进一步干燥该含水组合物。
在一个实施方式中，组合物获自甜玉米(Zea mays var.saccharata和Zea maysvar.rugosa)。在一个实施方式中，甜玉米是标准(su)型或含糖增强(se)型。在一个实施方式中，该组合物获自甜玉米的凹陷阶段(dent stage)或乳阶段粒。与动物或细菌来源的糖原不同，植物糖原的使用降低了可能与这些其它来源有关的朊病毒或内毒素污染的风险。
如实施例1和标题为“植物糖原纳米颗粒及其制造方法”的国际专利申请中详述的生产植物糖原纳米颗粒的方法适于在药学级条件下制备。
可通过动态光散射(DLS)技术测定纳米颗粒的组合物的多分散指数(PDI)，并且在这一实施方式中，PDI被确定为标准偏差与平均直径之比的平方(PDI＝(σ/d)2)。PDI也可以通过聚合物分子量的分布来表达，并且在这一实施方式中定义为Mw与Mn的比，其中Mw是重均摩尔质量且Mn是数均摩尔质量(此后，此PDI测量称为PDI*)。在第一种情况下，单分散材料所具有的PDI为零(0.0)，且在第二种情况下，PDI*会为1.0。
在一个实施方式中，提供了一种药物组合物，包含单分散糖原或植物糖原纳米颗粒的组合物，或由其基本组成或组成。合适地，如下面进一步讨论的，纳米颗粒被官能化，特别是阳离子化。在一个实施方式中，药物组合物包含所具有的通过动态光散射测量的PDI小于约0.3，小于约0.2，小于约0.15，小于约0.10，或小于0.05的单分散糖原或植物糖原纳米颗粒的组合物，或由其基本组成或组成。在一个实施方式中，药物组合物包含所具有的通过SEC MALS测量的PDI*小于约1.3，小于约1.2，小于约1.15，小于约1.10，或小于1.05的单分散糖原或植物糖原纳米颗粒的组合物，或由其基本组成或组成。
在一个实施方式中，药物组合物包含平均颗粒直径为约30nm至约150nm的单分散糖原或植物糖原纳米颗粒的组合物，或由其基本组成或组成。在一个实施方式中，药物组合物包含平均颗粒直径为约60nm至约110nm的单分散糖原或植物糖原纳米颗粒的组合物，或由其基本组成或组成。在其它实施方式中，提供了包含纳米颗粒、基本由纳米颗粒组成或由纳米颗粒组成的组合物，该纳米颗粒的平均颗粒直径为约40至约140nm，约50nm至约130nm，约60nm至约120nm，约70nm至约110nm，约80nm至约100nm。
植物糖原和糖原纳米颗粒的化学修饰
为了赋予糖原和植物糖原纳米颗粒特定的性质，它们可以通过碳水化合物化学常用的多种方法进行化学修饰。
因此，在一个实施方式中，纳米颗粒被修饰。所得产物在本文中可互换地称为官能化的或修饰的纳米颗粒或衍生物。官能化可以在纳米颗粒的表面上进行，或者在颗粒的表面和内部两者进行，但是保持作为单一支化均聚物的糖原或植物糖原分子的结构。在一个实施方式中，官能化在纳米颗粒的表面上进行。如本领域技术人员所理解的，化学修饰应该是无毒的并且通常对于人类消费是安全的。
在本发明的一些实施方式中，有利的是将糖原/植物糖原的化学特性从其亲水性、略带负电荷的天然状态改变为带正电荷或者部分或高度疏水性。J.F Robyt,Essentialsof Carbohydrate Chemistry,Springer,1998；以及M.Smith,and J.March,March'sAdvanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure AdvancedOrganic Chemistry,Wiley,2007提供了多糖的化学处理的某些例子。
纳米颗粒可以直接官能化或可以使用一种或多种中间接头或间隔物间接官能化。纳米颗粒可以经受一个或多于一个的官能化步骤，例如，两个或更多个。
通过糖原/植物糖原的羟基的化学官能化可以产生各种衍生物。此类官能团包括但不限于亲核和亲电子基团以及酸性和碱性基团，例如羰基、胺基、硫醇基、羧基和烃基例如烷基、乙烯基和烯丙基。
在一个实施方式中，将糖原或植物糖原纳米颗粒修饰为具有至少正表面电荷(阳离子化的)。在一个实施方式中，通过胺(NH2)基修饰纳米颗粒。
适当地，使用氨基修饰糖原或植物糖原纳米颗粒，氨基可以是伯氨基、仲氨基、叔氨基或季氨基。
在一个实施方式中，用短链季铵化合物修饰官能化的纳米颗粒。短链季铵化合物包含未被取代的或由一个或多个N、O、S或卤素原子取代的具有1至16个碳原子的至少一个烷基部分。
在某些实施方式中，使用两种或更多种不同的化学化合物以产生多官能衍生物。
葡萄糖亚基上的伯羟基的反应性较低(在含水环境中)。尽管如此，可以与环氧化物、酸酐或烷基卤化物反应形成相应的醚键或酯键。具有环氧或酸酐官能团的水溶性化学品在碱性pH(例如8-11)下与糖原和植物糖原纳米颗粒反应(在适当的催化剂存在下)。为了保持糖原或植物糖原纳米颗粒的稳定性，pH优选在8至10之间，以及最佳在8至9之间。在这样的条件下羟基反应性低，并且可能需要显著过量的反应化合物(反应物)以获得显著的官能化。尽管在含水环境中衍生化通常是优选的，但是一些反应(例如与烷基卤化物)最好在有机溶剂例如二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)或吡啶中进行。对于本领域技术人员显而易见的是，在相对温和的条件下具有低毒性和反应性的水溶性化合物是特别合适的。
举例来说，激活糖原或植物糖原的羟基的最简单方法是通过在C-2、C-3、C-4和/或C-6位置选择性氧化葡萄糖羟基来引入羰基。存在可以使用的各种氧化还原引发剂，诸如过硫酸盐、高碘酸盐(例如高碘酸钾)、溴、乙酸酐、(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基(TEMPO)、戴斯-马丁氧化剂(Dess-Martin periodinane)等。
用羰基官能化的糖原和植物糖原纳米颗粒容易与带有伯胺或仲胺基团的化合物反应。这导致亚胺形成(等式1)，其可以用还原剂例如硼氢化钠进一步还原成胺(等式2)。该还原步骤提供了比亚胺中间体更稳定的氨基产物，并且还将未反应的羰基转化为羟基。羰基的消除显著降低了衍生纳米颗粒与非靶向分子(例如血浆蛋白)的非特异性相互作用的可能性。
(等式1)P/G NANO-CH＝O+H2N-R→P/GNANO-CH＝NH-R+H2O
在将合适的还原剂引入到相同的反应混合物的情况下，羰基-化合物和氨基-化合物之间的反应以及还原步骤可以在一个容器中同时进行。该反应称为直接还原胺化。此处，可以使用任何在羰基存在下选择性还原亚胺的还原剂(例如氰基硼氢化钠)。
为了从羰基官能化的纳米颗粒制备氨基官能化的纳米颗粒，可以使用任何铵盐或者含伯胺或仲胺的化合物(例如，乙酸铵、氯化铵、肼、乙二胺或己二胺)。该反应可在水或含水极性有机溶剂(例如乙醇、DMSO或DMF)中进行。
纳米颗粒的还原胺化也可以通过以下两步法实现。第一步是烯丙基化，即通过在还原剂(例如硼氢化钠)存在下与烯丙基溴反应以将羟基转化为烯丙基基团。在第二步中，烯丙基基团与双官能氨基硫醇化合物(例如氨基乙硫醇)反应。
氨基官能化的纳米颗粒适于进一步修饰。氨基与羰基化合物(醛和酮)、羧酸及其衍生物(例如酰氯、酯)、琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、磺酰氯等反应。
取代度取决于待结合的分子的分子量和性质(电荷、疏水性等)。取代度表示为衍生的葡萄糖单元的％。例如，如果药物的分子量为100Da，并且取代度为50％，那么1g植物糖原/糖原纳米颗粒将携带0.28克药物。对于小分子(<100Da)，通常达到>30％的取代度，甲基基团高达100％。较大的分子(其不能穿透颗粒的孔结构)只能结合在植物糖原/糖原纳米颗粒的表面，并且取代度较低，通常为0.1-2.0％。
经修饰的纳米颗粒可进一步与从如生物分子、小分子、治疗剂、药物活性部分、大分子、诊断标签以及前述的各种组合中选择的一种或多种化合物结合。可以用特定的组织靶向分子(例如叶酸、抗体、适体、蛋白质、脂蛋白、激素、带电分子、多糖和低分子量配体)进一步修饰纳米颗粒。可使用两种或更多种不同的化学化合物生产多官能衍生物。例如，一种化学化合物可以从特异性结合生物分子(例如抗体和适体)列表中选择，而第二修饰剂会选自诊断标签或治疗剂的列表。
携带能够与经修饰的糖原或植物糖原纳米颗粒的胺基或者未修饰的纳米颗粒的羟基结合的官能团的化学化合物，可以直接连接到官能化的植物糖原/糖原纳米颗粒上。然而，对于某些应用，化学化合物可通过聚合物间隔物或“接头”连接。这些可以是带有官能团的同型或异型双官能接头，官能团诸如氨基、羰基、巯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基和异氰酸酯，(例如二氨基己烷)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)、氨基乙硫醇等。
结合到植物糖原/糖原纳米颗粒的分子的位置取决于该分子的分子量。小分子(MW<100Da)可以进入颗粒结构，并因此位于颗粒表面内和颗粒表面。MW>100Da的分子主要位于颗粒表面。
当植物糖原纳米颗粒被内化时，结合的分子通过细胞水解酶释放。释放速率可以通过小分子对植物糖原衍生化如甲基化、羟丙基化的程度来控制(这影响水解酶对多糖链的亲和力，从而影响水解速率)。
在一个实施方式中，糖原或植物糖原纳米颗粒是阳离子化的，在一个实施方式中，是胺修饰的，但没有进一步与另一个分子结合。
在一个实施方式中，糖原或植物糖原纳米颗粒是阳离子化的，在一个实施方式中，是胺修饰的，并且进一步结合到选自疏水性修饰剂、药代动力学修饰剂、生物活性修饰剂或可检测的修饰剂中的药学上有用的部分。
在一个实施方式中，提供了一种免疫抑制组合物，基本上包含单分散糖原或植物糖原纳米颗粒；和药学上可接受的载体。在一个实施方式中，糖原或植物糖原纳米颗粒与至少一种诱导、增强或抑制受试者中免疫响应的分子结合。在一个实施方式中，该分子是免疫抑制剂。
如本文所描述的化合物和组合物可用作免疫抑制剂。
如实施例中所证明的，阳离子化的糖原/植物糖原纳米颗粒，且特别是胺修饰的纳米颗粒，充当1型IFN依赖性先天抗病毒响应的抑制剂。
I型干扰素系统由I型干扰素(IFN)、由结合其受体的IFN引发的信号路径、由这些路径激活的转录因子、由于转录因子激活而导致表达改变的基因(称为干扰素刺激的基因或ISG)和最后是细胞功能的变化组成。导致发现IFN的功能是它们在感染细胞以及邻近的未感染细胞中建立“抗病毒状态”的能力。IFN分为两类，I型和II型。经典地，I型IFN参与先天性抗病毒机制，而II型IFN促进适应性免疫。已显示I型干扰素抑制病毒复制的每个阶段。这包括病毒进入和脱壳、转录、RNA稳定性、翻译起始、成熟、装配和释放。
I型IFN的抗病毒作用是由干扰素与在所有有核细胞表面上发现的其同源受体的结合引发的。哺乳动物中的IFNa/b信号路径涉及五个主要步骤。IFN结合导致IFN受体的二聚化(1)。这种受体缔合通过激活Janus激酶Jak1和Tyk2而触发通过Janus激酶(Jak)/信号转导和转录激活因子(STAT)路径的信号传导(2)。与IFN受体相关的这些酪氨酸激酶使STAT1和STAT2磷酸化，导致它们的活化和二聚体形成(3)。激活的STAT 1-2异二聚体易位至细胞核(4)并且与p48(IRF-9)缔合形成ISGF3，其是与干扰素刺激基因(ISG)的启动子区域中的干扰素刺激的响应元件(ISRE)序列结合的转录因子(5)(Stark et al.,1998)。I型干扰素通常在相同细胞类型内诱导相同的基因组。正是这些ISG在靶细胞中积累，建立“抗病毒状态”。
I型干扰素的主要目的是刺激ISG的表达，其进而在未感染的细胞中赋予抗病毒状态。干扰素诱导因子倾向于直接限制病毒复制或调节细胞周期和细胞死亡。由一些ISG刺激的程序性细胞死亡或凋亡被认为是控制病毒复制的策略。许多IFN刺激的蛋白质是在暴露于dsRNA之前以无活性形式表达的酶，确保保持休眠的抗病毒状态并因此在细胞被感染之前无害。
先天免疫在脊椎动物之间是高度保守的。参考实施例，本发明人已证明，处于未经修饰的或阳离子化形式的糖原和植物糖原纳米颗粒，并且特别是当胺修饰时，能够抑制脊椎动物细胞中的I型干扰素响应。因此，提供了用于抑制I型干扰素响应的免疫抑制化合物和组合物。
虽然自身免疫性疾病可能与遗传易感性有关，但自身免疫可能仅在环境因素(包括病毒感染)刺激后触发。IFN依赖性抗病毒响应的免疫抑制剂可用于治疗或预防许多疾病或病症，详见下文。
败血症是一种危及生命的病症，当身体对感染的响应损害其自身的组织和器官时就会出现这种病症。严重败血症是入住重症监护室(ICU)的患者中最常见的诊断之一，在美国影响超过750,000名患者/年，并且每年花费超过170亿美元。败血症通常用静脉输液和抗生素来治疗，但是没有批准用于阻断细胞因子产生以减少患者的败血症症状的药物。败血症仍需要额外的治疗选择。在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗败血症的新方法，包括使用本文描述的化合物或组合物阻断I型干扰素的产生。在一个实施方式中，将本文描述的化合物和组合物全身性地引入到严重败血症患者中以减少全身细胞因子的产生。
在一个实施方式中，免疫抑制组合物用于预防移植器官或组织的排斥。
在一个实施方式中，免疫抑制组合物用于治疗炎性疾病，例如肠易激病症。
在另一方面，本文描述的免疫抑制化合物和组合物用于治疗自身免疫性疾病。在各种实施方式中，自身免疫性疾病是类风湿关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、系统性红斑狼疮、结节病、局灶性节段性肾小球硬化、克罗恩病、白塞病、天疱疮和溃疡性结肠炎。
在另一实施方式中，本文描述的化合物和组合物用于治疗疼痛，即炎性疼痛。
除了单独使用外，本文描述的免疫调节剂可以与其它治疗剂(例如抗微生物剂或抗癌剂、疫苗或其它免疫调节剂)组合使用。
在一个实施方式中，本文描述的免疫抑制化合物和组合物可与转染配方组合使用，并且在特定实施方案中，使用病毒载体转染。在一个实施方式中，本发明的化合物和组合物可以与基因疗法同时给药，或在基因疗法之前或之后不久给药。基于病毒载体的基因疗法可以在免疫抑制疗法之前或之后进行，以防止对病毒的免疫反应。例如，阿利泼金(alipogene tiparvovec)(以商品名Glybera销售)经欧洲药品管理局批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)。Glybera使用腺相关病毒载体，其将人类脂蛋白脂酶(LPL)基因的拷贝传递给肌肉细胞。对于通过注射给药治疗的前3天以及注射后的12周，给患者施用免疫抑制治疗。
因此，在一个实施方式中，提供了一种基于病毒载体的基因疗法与如本文描述的糖原或植物糖原纳米颗粒的联合疗法。
在另一方面，本文描述的免疫抑制化合物和组合物用于制造疫苗。疫苗生产涉及几个阶段，首先是抗原本身的产生。在病毒疫苗的情况下，通过感染培养的细胞产生病毒。由于如本文描述的细胞的先天免疫系统和/或响应倾向于对抗病毒，这种程序的产量通常很低。通过抑制细胞的免疫系统和/或响应，病毒可以更容易地复制，导致提高的产量和/或允许产生更高的病毒滴度。
因此，在一个实施方式中，提供了本文描述的免疫抑制化合物和组合物用于制造疫苗的用途，特别是通过增加或改善病毒和病毒抗原的生长和培养来增强病毒疫苗的制造。例如，在一个优选的实施方式中，本文描述的糖原或植物糖原纳米颗粒可用于使用CHSE-214(奇努克鲑鱼胚胎)细胞系制造传染性胰腺坏死病毒(IPNV)疫苗。
在一个实施方式中，使用细胞系作为病毒来源的疫苗开发中的限制因素是减少病毒产生的IFN路径。以较低的水平添加PHX-NH2(例如，0.005ng/mL)时，与不存在PHX-NH2感染的细胞相比，病毒滴度增加。
在疫苗制造中使用的可以使用本文描述的糖原或植物糖原纳米颗粒增强的病毒和细胞系的例子列于表1中。
表1：用于PHX介导的病毒生长增强的示例性病毒和细胞系
配方和给药
本发明的纳米颗粒还可以与其它分子、分子结构或者化合物的混合物混合，用它们包封或以其它方式与它们结合，并且可以与任何药学上可接受的载体或赋形剂组合。如本文所用，“药学载体”或“赋形剂”可以是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其它药理学惰性载体，其用于将官能化的糖原或植物糖原纳米颗粒(无论是单独的还是与生物活性分子或诊断上有用的分子结合的)递送到动物。赋形剂可以是液体或固体，并且考虑到计划的给药方式进行选择，以便当与糖原或植物糖原纳米颗粒和给定药物组合物的其它组分组合时提供所需的体积、稠度等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。药学上可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强药理学剂的保质期或有效性。
可以根据制药工业中熟知的常规技术制备本发明的药物配方，该配方可以方便地以单位剂型存在。这些技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体、细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合在一起，然后如果需要，使产品成型(例如，成型为便于递送的特定粒度)来制备配方。
出于配制药物组合物的目的，如本文所教导制备的单分散糖原和植物糖原纳米颗粒可以干燥的颗粒/粉末形式提供或者可以溶解在例如水溶液中。在需要低粘度的情况下，糖原和植物糖原纳米颗粒可适用于浓度至多达约25％w/w的配方中。在需要高粘度的应用中，糖原和植物糖原纳米颗粒可用于浓度高于约25％w/w的配方中。在需要凝胶或半固体的应用中，可以使用至多达约35％w/w的浓度。
本发明的药物组合物可以多种方式给药，这取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。在不限制前述的一般性的情况下，给药途径可以是局部的，例如给药至皮肤或通过吸入或以眼科或耳科组合物的形式给药；肠内给药，如口服(包括但不限于片剂、胶囊或滴剂)或以栓剂形式给药；或肠胃外给药，包括例如皮下、静脉、动脉内或肌肉内。合适地，全身给给予用于治疗败血症的化合物和组合物。
在一个实施方式中，药物组合物是用于透皮递送而用于皮肤施用的局部配方。本文公开的单分散纳米颗粒特别可用作成膜剂。因为纳米颗粒是单分散的，所以均匀的密堆积膜是可能的。该组合物形成具有低水分活性的稳定膜。因此，当化学修饰时，它们可用于附着在皮肤上并且将生物活性物质携带跨过皮肤。在各种实施方式中，局部配方可以是凝胶、霜剂、洗剂或软膏的形式。
在另一个实施方式中，本发明的药物组合物是植入物的形式。适当地，这些植入物可以是生物相容的，这意味着它们对细胞、组织或体内功能没有显著的不利影响。适当地，这些植入物可以是生物可吸收的或可生物降解的(全部或部分)。实例包括但不限于组织工程支架。
在另一个实施方式中，糖原或植物糖原纳米颗粒可以是局部(医疗)配方(例如洗剂、软膏和霜剂)的一部分。
实施例
实施例1.由甜玉米粒制造植物糖原
在20℃下将1kg冷冻甜玉米粒(75％含水量)与2L去离子水混合并且在捣碎机中在3000rpm下粉碎3分钟。在4℃下将糊状物在12,000x g下离心15分钟。使用具有0.1μm孔径的膜滤器对合并的上清液级分进行错流过滤(CFF)。使用MWCO为500kDa的膜并且在室温和透析体积为6的条件下，通过分批渗滤进一步纯化滤液。(透析体积是渗滤过程中引入操作的总mQ水量与保留物体积之比)。
将保留物级分与2.5体积的95％乙醇混合并且在4℃下在8,000x g下离心10分钟。将保留物与2.5体积的95％乙醇混合，并在4℃下在8,000x g下离心10分钟。将含有植物糖原的丸粒在烘箱中在50℃下干燥24小时，然后研磨至45目。干燥的植物糖原的重量为97g。
根据动态光散射(DLS)测量，所生产的植物糖原纳米颗粒的粒径为83.0nm，并且多分散指数为0.081。
实施例2.植物糖原/糖原纳米颗粒的修饰
合成用于不同应用的化学修饰的植物糖原/糖原纳米颗粒的例子及其取代度列于表2中。
表2
P/G纳米–植物糖原/糖原纳米颗粒
Castor-QUAB151-2,3-环氧丙基三甲基氯化铵
*DS-测量的取代度
植物糖原纳米颗粒的胺化
将200mg如实施例1中描述的获得的植物糖原溶解于2mL DMSO中并且向溶液中加入250mg干粉状NaOH。允许P植物糖原在碱性DMSO中搅拌15分钟，然后加入1.5mL 2-溴乙胺氢溴酸盐。使反应进行10分钟，然后将另外的0.5mL DMSO加入到反应小瓶中。然后使反应在室温下继续进行4小时。4小时后，用去离子水将样品稀释至10mL，并且向该溶液中加入2倍体积的乙醇以沉淀胺化的纳米颗粒。重复乙醇沉淀共三次。将所得样品颗粒分散并在乙醚中干燥，得到粉末状最终产物。通过1H-NMR光谱的峰积分，5.2mol％的葡萄糖单元被胺化。
将100g植物糖原分散在500ml 0.45M NaOH水溶液中，然后向该混合物中加入200g的2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(90％,Sigma-Aldrich)。将混合物在40℃下搅拌12小时。反应完成后，加入过量的95％乙醇以终止反应并使产物沉淀。将沉淀物分散在500ml水中，用0.2M HCl中和，并且再用95％乙醇沉淀。在水沉淀操作中使用这种分散将产物洗涤三次，然后在60℃的烘箱中干燥18小时。将干燥的经修饰的植物糖原研磨成200目粉末，然后置于真空过滤漏斗上的过滤器上，在真空下用70％乙醇洗涤两次，用95％乙醇洗涤一次，以除去阳离子化试剂。将滤饼在50℃下干燥18小时。使用NMR光谱法评估产物的DS，测量值为1.072。
辛烯基琥珀酸酐-修饰的植物糖原
将100.0g根据实施例1制备的植物糖原分散在2L玻璃反应容器中的750mL去离子水中。不断搅拌分散体并保持在35℃。将3mL辛烯基琥珀酸酐(OSA,Sigma-Aldrich)加热到40℃并且缓慢地添加到反应容器中。通过使用自动控制系统向反应混合物中添加4％NaOH溶液以将pH保持恒定在8.5。在恒定混合下使反应进行3小时。然后用1M HCl将混合物的pH调节至7.0，并且与3体积的95％乙醇混合，在4℃下在8,500x g下离心15分钟。将丸粒重新悬浮在水中，将pH调节至7.0，且沉淀溶液并使用相同的条件离心两次。最后，将含有OSA-修饰的植物糖原的丸粒在50℃的烘箱中干燥24小时，然后研磨至45目。通过NMR光谱测定的取代度为0.024。
实施例3.糖原/植物糖原在细胞培养中的细胞毒性
分析了糖原/植物糖原纳米颗粒对细胞活力的影响，以评估颗粒的细胞毒性。如实施例1所描述的，使用冷水从兔肝、贻贝和甜玉米中提取糖原/植物糖原纳米颗粒并分离。
如实施例2所描述的，通过使用氨基(NH2)、季铵基团(Quab151)和OSA3官能化植物糖原来制备经修饰的颗粒。
使用未经修饰的和经修饰的植物糖原纳米颗粒将虹鳟鱼鳃上皮(RTG-2)细胞处理3天。在该处理后，除去培养基并测量细胞代谢和膜完整性。为了测量细胞活力的变化，使用两种荧光指示剂染料，阿尔玛蓝(ThermoFisher)(图2a)和CFDA-AM(Thermofisher)(图2b)；这些染料分别测量细胞代谢和膜完整性。对于这些染料，更多的荧光表明更多的活细胞。
对于任何处理，与未处理的对照细胞相比，任一参数的变化都不显著。结果如图2所示。在浓度为0.1-10mg/ml的植物糖原或其衍生物存在下温育72小时后，没有检测方法在细胞中检测到任何细胞毒性作用。
实施例4.先天免疫基因表达水平的变化
进行实验以确定植物糖原纳米颗粒的胺(NH2)官能化的单分散组合物(PHX-NH2)是否具有免疫抑制活性。更具体地，研究了这种组合物抑制I型IFN依赖性先天性抗病毒响应的能力。通过定量(q)RT-PCR测量转录水平的基因表达的变化以及通过使用细胞病变效应(CPE)测定法量化病毒诱导的合胞体形成来测量抗病毒状态建立的变化，研究了这种IFN介导的响应。如果此种组合物能够阻断IFN介导的响应，则IFN刺激的基因(ISG)的转录水平将降低，并且IFN诱导的抗病毒状态将受到损害，从而产生更多的CPE(合胞体形成)。
在本研究中使用了从N.Bols(滑铁卢大学)获得的三种鲑鱼细胞系，RTG-2(虹鳟鱼性腺起源)、RTgill W-1(虹鳟鱼鳃起源)和CHSE-214(奇努克鲑鱼胚胎起源)。在20℃下，在具有补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素(P/S)的Leibovitz的L-15培养基的75cm2塑料组织培养瓶(BD Falcon,Bedford,MA)中常规培养RTG-2、RTgill W-1和CHSE-214。
为了此研究，使用了两种鱼类病毒。在单层奇努克鲑鱼胚胎(CHSE-214)细胞上增殖鲑鱼呼肠孤病毒(CSV)。使用鲤丘疹性上皮瘤(EPC)细胞增殖病毒性出血性败血症(VHSV)-IVb。在4-7天后(当观察到完整的CPE时)，通过0.45μm过滤器过滤两种病毒制剂，含有病毒的培养基(具有5％FBS的L-15)。对于短期储存，病毒制剂在-20℃冷冻，并在-80℃下长期储存。使用Reed和Muench方法，通过在EPC细胞上滴定VHSV-IVb制剂和在CHSE-214细胞上滴定CSV制剂来测定组织培养感染剂量(TCID)50/mL值(50％组织培养感染剂量)。
PHX-NH2(与病毒CSV 1.995x104预先混合，PHX-NH2 0.5ng/mL和VHSV2.5x105TCID50，PHX-NH2 0.5ng/mL和0.05ng/mL；或单独的PBS(没有镁和钙)并且在室温下摇动2小时。对于VHSV，2小时后，向每个样品中加入等体积的具有10％FBS的2X L-15。对于CSV，由于储液滴度不足以首先在PBS中稀释，所以所有温育均在完全培养基中进行，并且在摇动后添加等体积的1X L-15。用CSV感染RTG-2细胞24小时，并且在17℃下用VHSV感染RTgill W-1细胞72小时。
使用GenElute哺乳动物总RNA小量制备试剂盒(Sigma Aldrich)按照制造商的说明进行RNA提取，包括用柱上DNase I消化装置(Sigma Aldrich)处理RNA。使用iScriptcDNA合成试剂盒(Bio-rad)进行cDNA合成，每次反应使用1μg RNA、4μL iScript和至多20μLDNA优质水。在qPCR反应之前，将cDNA在无核酸酶的水中稀释10倍。
所有PCR反应均含有：2μL稀释的cDNA、2X SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad)、0.2μm正向引物、0.2μM反向引物和无核酸酶水至总体积为10μL(管家基因肌动蛋白引物为0.1μM)。qPCR程序为98℃ 2分钟，40个循环的98℃ 5秒、55℃ 10秒和95℃ 10秒。从65℃到95℃完成熔化曲线，每5秒读数一次。将基因表达归一化至管家基因(β肌动蛋白)并且表达为相对于未处理对照组的倍数变化。
将未修饰的和胺官能化的单分散植物糖原纳米颗粒(0.5ng/mL)与处于5％FBS 1XL-15培养基中的CSV(TCID50/mL 6.25x104)预混合并且在室温下摇动2小时。2小时后，将适量的5％FBS 1X L-15充分混合并加入各孔中。以3x104个细胞/孔将CHSE-214接种在96孔板中并且在20℃下生长24小时。之后，用预先混合的纳米颗粒和CSV在17℃下将细胞处理3天。
CHSE-214用75μL/孔的10％福尔马林固定10分钟，用100μL/孔PBS冲洗并用75μL/孔的1％结晶紫染色法染色10分钟。然后用100μL/孔的PBS洗涤孔两次，用MilliQ水洗涤至少5次。使用具有Qi1相机的Nikon Eclipse TiE显微镜以4X放大率拍摄照片。使用NikonNIS元件软件计算合胞体覆盖的面积和图片的总面积。％合胞体是合胞体覆盖的面积/总面积*100％。每孔拍摄了1张照片，每张照片是在孔的中心拍摄的，并且每个处理具有6个孔。
参考图3至图5，这些数据表明，PHX-NH2分别在两种鱼细胞系RTgill-W1和RTG-2中阻断了由两种水生病毒VHSV-Ivb和CSV诱导的ISG表达。还表明，两种天然PHX和PHX-NH2都降低了CHSE-214细胞中的总抗病毒状态，使它们更容易受到CSV诱导的CPE(合胞体形成)的影响。这一数据表明了PHX对I型IFN响应的一般抑制作用。
实施例5.通过TCP-1单核细胞内在化Cy5.5-标记的糖原/植物糖原颗粒
近红外荧光染料(Cy5.5)与本项研究中使用的颗粒的结合，使得能够通过共聚焦荧光显微镜分析纳米颗粒的摄取。如下所描述的制备Cy5.5-标记的糖原/植物糖原颗粒。
将100mg根据实施例1生产的多糖纳米颗粒悬浮于20mL的0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH8.4)中。将温度探针放入对照小瓶(含有0.1M碳酸氢钠缓冲液)中，将含有溶液的反应容器包裹在铝箔中并置于35℃的热板上。将1mg Cy5.5-NHS酯(Lumiprobe Corp.)悬浮在4mLDMF中。在1小时期间，以1mL等分试样加入Cy5.5-NHS酯。在添加之前和之后持续检查溶液的pH，通过添加2M HCl溶液调节至8.4。在加入最终的处于DMF中的Cy5.5-NHS酯等分试样后，监测pH并根据需要进行调节。使反应进一步进行2小时，之后用如上的2M HCl溶液将pH调节至4.0。
向含有所得多糖纳米颗粒-Cy5.5结合物的酸化溶液中加入2体积的乙醇。将该溶液冷却至4℃并在6000rpm下离心15分钟。离心后，倒出上清液，将丸粒重悬于15mL去离子水中。向重新悬浮的丸粒中加入2体积的乙醇，将其冷却并如前离心。将其重复一次，直至倒出的上清液澄清无色。通过使用均化器将丸粒最后一次重悬于10mL无水二乙醚中。通过微量加热蒸发至干燥，得到所得的结合物。
使用浓度为1mg/ml的Cy5.5标记的糖原/植物糖原颗粒将MCP-1细胞在4℃(阴性对照)和37℃下温育0.5、2、6和24h。然后用PBS洗涤细胞，在10％缓冲福尔马林溶液中固定并再次用PBS洗涤。然后用DAPI(细胞核)和AF488(细胞膜)染色固定的细胞。通过OlympusFluoview FV1000激光扫描共聚焦显微镜评估糖原/植物糖原颗粒的内在化。
在内吞和吞噬过程不活跃时在4℃下温育，不会产生任何与THP-1细胞相关的颗粒(图6)。这证实，由于表面结合，THP-1细胞没有纳米颗粒的积累。相反，在37℃温育6小时以上，显示Cy5.5-标记的糖原/植物糖原颗粒在细胞质中大量积累(图6)。然而，在0.5-2小时的时间间隔内摄取非常低。
实施例6.注射Cy5.5-植物糖原结合物后幼稚小鼠中的药代动力学(PK)谱
如实施例2所描述的，合成Cy5.5标记的植物糖原(0.08μM Cy5.5/mg)。
在300mg/kg小鼠的剂量用分散在PBS中的Cy5.5-植物糖原注射18-20克的裸CD-1小鼠(n＝3)。使用肝素化管以多个时间间隔(15分钟，1小时，2小时，6小时和24小时)从小鼠(下颌下静脉)采集小血样(50μl)。使用细胞荧光计读板器通过荧光分析这些时间点。使用由已知浓度的在血液中稀释的Cy5.5-Phytospherix组成的标准曲线内插纳米颗粒浓度。
从图7中可以看出，Cy5.5-植物糖原在血液中的浓度随时间呈指数下降，并在24小时内消失。确定(计算)消除半衰期为2小时。半衰期是指身体将化合物的初始血液浓度降低50％所需的时间。
所有光学成像实验均使用小动物时域eXplore Optix MX2临床前成像仪进行，并使用ART Optix Optiview分析软件2.0(Advanced Research Technologies,Montreal,QC)分析图像或将图像重建为荧光浓度图。采用重复频率为80MHz且时间分辨率为12ps光脉冲的670nm脉冲激光二极管进行激发。通过高灵敏度的时间相关性单光子计数系统收集700nm处的荧光发射，并通过快速光电倍增管进行检测。
如实施例2描述的合成Cy5.5标记的植物糖原(0.8μM Cy5.5/mg)。
在幼稚动物中，体内成像显示Cy5.5-植物糖原在肝脏、肺部(在所有时间点)、肾脏(15分钟-6小时)、膀胱(15分钟-6小时)和脑部(15分钟-2小时)中的强烈信号(图8)。
在30分钟和24小时的离体数据证实，确实在肺中有Cy5.5-植物糖原的大量摄取并且在脑中的摄取程度较小(图8)。与较晚的时间点(24小时)相比，大脑中的信号在较早时间点(30分钟)最高。由于Cy5.5-植物糖原纳米颗粒是葡萄糖聚合物，因此可能的是，已知在葡萄糖转运中非常活跃的器官(如脑和肺)通过葡萄糖转运蛋白积累Cy5.5-植物糖原。
体内成像数据表明，肝脏主要负责Cy5.5-植物糖原的代谢。另外，可能的是，在肝脏中代谢的纳米颗粒产生较小的Cy5.5-标记的葡萄糖衍生物，其可以重新进入血流，然后通过肾脏系统排出。
实施例7.植物糖原纳米颗粒(PHX-NH2)对鲑鱼呼肠孤病毒(CSV)生产、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)-IVb生产和传染性胰腺坏死病毒(IPNV)生产的影响
鲑鱼呼肠孤病毒(CSV)
接种CHSE-214：将CHSE-214(大鳞大麻哈鱼)以3.2x 105个细胞/孔接种在12孔板中并且在处理之前，在具有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素(P/S)的Leibovitz的L-15培养基中使其生长24小时以允许细胞再附着。然后，用单独的PhytoSpherix(PHX-NH2)或用CSV，使用2小时摇动混合物处理细胞。
将CSV和PHX-NH2摇动2小时：将以下混合物摇动2小时，(A)对照：250μL包含具有5％FBS和1％P/S的L-15的处理培养基(TM)；(B)仅为CSV：150μL TM和100μL CSV；和(C)具有PHX-NH2的CSV：125μL TM与25μL 0.1ng/mL PHX-NH2(最终浓度为0.005ng/mL)和100μL CSV。最终的CSV组织培养感染剂量(TCID50/mL)为3.14x104。以0.005ng/mL的浓度使用PHX-NH2。2小时后，向每个微量离心管中加入250μL TM，并用移液管充分混合。将来自每个微量离心管的500μL加入各孔中，并在17℃培养箱中温育约7天。然后收集培养基并储存在-20度直至如下计算TCID50/mL。
使用CHSE-214确定CSV TCID50/mL：将CHSE-214以3x104个细胞/孔接种在96孔板中并且使细胞在具有10％FBS,1％P/S的L-15中生长24小时。然后用单独的病毒或病毒+PHX-NH2的稀释液以稀释度范围为(在TM中10-1-10-11)感染细胞。在对照孔中使用单独的TM。将这些板在17℃下温育7天。7天后，使用Reed Muench方法测定TCID50/mL(1)。
结果如图9所示。
病毒性出血性败血症病毒(VHSV)-IVb
接种EPC：将EPC(鲤丘疹性上皮瘤)以5x 105个细胞/孔接种在12孔板中并且在处理之前在具有10％FBS、1％P/S的L-15中生长24小时以使细胞再附着。使用两种不同的方法使用PHX-NH2处理细胞，两种方法如下：a)1小时预处理或b)用VHSV摇动混合物2小时。所有处理均使用TCID50/mL为1.72x108的VHSV-IVb储液并且PHX-NH2以0.005ng/mL的浓度使用。
a.用PHX-NH2预处理1小时：使用(i)补充有5％FBS、1％P/S的L-15(处理培养基)或(ii)475μL的培养基和25μL 0.1ng/mL的PHX-NH2(最终浓度为0.005ng/mL)处理细胞。将细胞在20℃温育1小时。1小时后，除去培养基并用以下物质替换。(A)对照孔：500μL TM；(B)VHSV与PHX-NH2：475μL TM与25μL 0.1ng/mL的PHX-NH2以及50μL VHSV；和(C)单独的VHSV：450μL TM和50μL VHSV。然后将板置于17℃下7天。将培养基储存在-20℃下直到如下所描述的计算TCID50/mL。
b.将VHSV和PHX-NH2摇动2小时：将以下混合物摇动2小时：(A)对照＝250uL TM，(B)单独的VHSV：200μL TM和50μL VHSV；和(C)VHSV与PHX-NH2：175μL TM与25μL 0.1ng/mLPHX-NH2和50μL VHSV。2小时后，向每个混合物中加入250μL TM并用移液管彻底混合。将500μL每种混合物加入各孔中并且在17℃下温育7天。将培养基储存在-20℃直至如下所描述的计算TCID50/mL。
使用EPC确定VHSV TCID50/mL：对于两种方法，使用相同的协议完成TCID50/mL实验。将EPC以3x104个细胞/孔接种到96孔板中并且在具有10％FBS、1％P/S的L-15中生长24小时以使细胞再附着。然后用单独VHSV或者VHSV+PHX-NH2的稀释液以稀释度范围为(在TM中10-1-10-11)感染细胞。在对照孔上使用常规TM。将细胞在17℃下温育7天，之后使用ReedMuench方法确定TCID50/mL(1)。
结果如图10所示。
传染性胰腺坏死病毒(IPNV)
接种CHSE-214：在12孔板中在具有10％FBS、1％P/S的L-15中生长CHSE-214(大鳞大麻哈鱼)直至它们为约2.4x 105个细胞/孔。然后，在添加IPNV之前，使用PhytoSpherix(PHX-NH2)将细胞处理持续1小时的预处理。所有的处理均使用TCID50/mL为1.09x107的IPNV储液并且以0.005ng/mL浓度使用PHX-NH2。处理培养基是含有2％FBS和1％P/S的L-15。
用PHX-NH2预处理1小时：在CHSE-214细胞已经达到所需的汇合后，除去培养基并且使用PHX-NH2(50μL 0.1ng/mL的PHX-NH2和950uL TM)或单独的培养基(50uL磷酸盐缓冲盐水(PBS)和950μL TM)将细胞处理1小时。1小时后，除去培养基并用PBS洗涤细胞三次。然后使用以下物质处理细胞：(A)对照：950μL TM；(B)单独的IPNV：50μL PBS和100μL IPNV以及850μL TM；和(C)IPNV与PHX-NH2：850μL TM与50μL0.1ng/mL的PHX-NH2以及100μL IPNV。2小时后，从每孔收集100μL作为第0天样品并储存在-80℃。将细胞在14℃下温育7天，之后收集培养基并储存在-80℃直至如下所述的计算TCID50/mL。
使用CHSE-214确定IPNV TCID50/mL：将CHSE-214接种在96孔板中具有10％FBS、1％P/S的L-15中并且生长直至达到2.4x104个细胞/孔的汇合。然后在第0天和第7天，使用处于在TM中范围为10-1-10-11稀释度的单独的IPNV或IPNV+PHX-NH2的稀释样品感染细胞。在对照孔中使用常规TM。将细胞在17℃下温育7天，之后使用Karber方法确定TCID50/mL(2)。
结果如图11所示。
讨论
鲑鱼呼肠孤病毒(CSV)和传染性胰腺坏死病毒(IPNV)具有dsRNA基因组，而病毒性出血性败血症病毒(VHSV)-IVb是负义ssRNA病毒。因此，PHX-NH2能够影响具有不同基因组并因此具有不同基因组复制策略的病毒的复制。认为，这种抑制作用基于PHX-NH2抑制宿主细胞的I型IFN响应的能力。观察了所有三种病毒的抑制趋势；而CSV显示出PHX-NH2的统计学显著影响。优化PHX上NH2取代的程度和/或实验条件可以提供改善的增强。
例如，可在病毒感染前2小时将PHX-NH2加入到细胞培养基中。PHX-NH2本身对细胞活力具有积极影响，支持细胞代谢和细胞分裂。PHX-NH2处理后的病毒滴度将高于单独的病毒，从而增加细胞培养物中的病毒产生率。在I型IFN是混杂因素的情况下，这种处理对于基于细胞系的病毒生产是重要的，以实现高病毒产量。
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Claims (45)

1.有效量的糖原或植物糖原纳米颗粒用于抑制细胞、细胞培养物、组织或受试者中的抗病毒响应的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述糖原或植物糖原纳米颗粒是阳离子化的。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述糖原或植物糖原纳米颗粒是胺修饰的。
4.根据权利要求1所述的用途，其中使用短链季铵化合物修饰所述糖原或植物糖原纳米颗粒，所述短链季铵化合物包含至少一个未被取代的或由一个或多个N、O、S或卤素原子取代的具有1至16个碳原子的烷基部分。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述纳米颗粒具有的平均颗粒直径为约30nm至约150nm。
6.根据权利要求5所述的用途，其中至少90％或基本上全部所述纳米颗粒具有的平均直径为约40nm至约140nm，约50nm至约130nm，约60nm至约120nm，约70nm至约110nm，约80nm至约100nm，约30nm至约40nm，约40nm至约50nm，约50nm至约60nm，约60nm至约70nm，约70nm至约80nm，约80nm至约90nm，约90nm至约100nm，约100nm至约110nm，约110nm至约120nm，约120nm至约130nm，约130nm至约140nm，或约140nm至约150nm。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述纳米颗粒未进一步结合到另一分子。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述纳米颗粒进一步结合到一个或多个小分子，其中所述分子是亲水性修饰剂、药代动力学修饰剂、生物活性修饰剂或可检测的修饰剂。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，用于抑制受试者中的抗病毒响应。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述受试者是基于病毒载体的基因治疗患者。
11.根据权利要求9或10所述的用途，用于治疗或预防疾病或病症。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述疾病或病症是自身免疫性疾病。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述疾病或病症是炎性疾病。
14.根据权利要求11所述的用途，其中所述疾病或病症是疼痛。
15.根据权利要求11所述的用途，其中所述疾病或病症是败血症。
16.根据权利要求9至15中任一项所述的用途，其中组合物用于局部给药。
17.根据权利要求9至15中任一项所述的用途，其中组合物用于全身给药。
18.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，用于抑制细胞培养物中的抗病毒响应。
19.根据权利要求18所述的用途，用于制造疫苗。
20.根据权利要求18或19所述的用途，用于在制造疫苗中增强感染细胞培养物中的病毒生长和复制。
21.一种抑制细胞、细胞培养物、组织或受试者中的抗病毒响应的方法，包括向所述细胞、所述细胞培养物、所述组织或所述受试者引入或施用有效量的糖原或植物糖原纳米颗粒。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述糖原或植物糖原纳米颗粒是阳离子化的。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述糖原或植物糖原纳米颗粒是胺修饰的。
24.根据权利要求21所述的方法，其中使用短链季铵化合物修饰所述糖原或植物糖原纳米颗粒，所述短链季铵化合物包含至少一个未被取代的或由一个或多个N、O、S或卤素原子取代的具有1至16个碳原子的烷基部分。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒具有的平均颗粒直径为约30nm至约150nm。
26.根据权利要求25所述的方法，其中至少90％或基本上全部所述纳米颗粒具有的平均直径为约40nm至约140nm，约50nm至约130nm，约60nm至约120nm，约70nm至约110nm，约80nm至约100nm，约30nm至约40nm，约40nm至约50nm，约50nm至约60nm，约60nm至约70nm，约70nm至约80nm，约80nm至约90nm，约90nm至约100nm，约100nm至约110nm，约110nm至约120nm，约120nm至约130nm，约130nm至约140nm，或约140nm至约150nm。
27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒未进一步结合到另一分子。
28.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒进一步结合到一个或多个小分子，其中所述分子是亲水性修饰剂、药代动力学修饰剂、生物活性修饰剂或可检测的修饰剂。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的方法，包括向所述受试者施用所述糖原或植物糖原纳米颗粒。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者是基于病毒载体的基因治疗患者。
31.根据权利要求29或30所述的方法，用于治疗或预防疾病或病症。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病或病症是自身免疫性疾病。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病或病症是炎性疾病。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病或病症是疼痛。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病或病症是败血症。
36.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中组合物用于局部给药。
37.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，其中组合物用于全身给药。
38.根据权利要求21至28中任一项所述的用途，用于抑制细胞培养物中的抗病毒响应。
39.根据权利要求38所述的用途，用于制造疫苗。
40.根据权利要求38或39所述的用途，用于在制造疫苗中增强感染细胞培养物中的病毒生长和复制。
41.一种联合疗法，包含基于病毒载体的基因疗法以及糖原或植物糖原纳米颗粒。
42.根据权利要求41所述的联合疗法，其中所述糖原或植物糖原纳米颗粒是阳离子化的。
43.根据权利要求41所述的联合疗法，其中所述糖原或植物糖原纳米颗粒是胺修饰的。
44.根据权利要求41所述的联合疗法，其中使用短链季铵化合物修饰所述糖原或植物糖原纳米颗粒，所述短链季铵化合物包含至少一个未被取代的或由一个或多个N、O、S或卤素原子取代的具有1至16个碳原子的烷基部分。
45.根据权利要求41至43中任一项所述的联合疗法，其中所述基于病毒载体的基因疗法是腺病毒。
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