CN111494644B - 含rgd序列肽的纳米载体及其制备方法、载药体系及其制备方法和应用 - Google Patents

含rgd序列肽的纳米载体及其制备方法、载药体系及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种含RGD序列肽的纳米载体及其制备方法、载药体系及其制备方法和应用。本发明提供的含RGD序列肽的纳米载体，由修饰剂对载体材料进行修饰得到，所述修饰剂中含RGD序列肽，所述载体材料为金纳米颗粒‑聚乙二醇羧基或聚天冬氨酸；其中，所述载体材料的尺寸为5～110nm。本发明以金纳米颗粒‑聚乙二醇羧基或聚天冬氨酸为载体材料，利用含RGD序列肽的修饰剂对其进行修饰，在此基础上与PAD4抑制剂(即YW3‑56)自组装构建得到纳米载药体系，能够增强YW3‑56抑制肿瘤增殖活性，改善YW3‑56的生物利用度。

Description

含RGD序列肽的纳米载体及其制备方法、载药体系及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及含RGD序列肽的纳米载体及其制备方法、载药体系及其制备方法和应用。
背景技术
癌症的发病率和死亡率在世界范围内迅速增长，肽酰基精氨酸脱亚氨酶(PAD)家族中的PAD4的激活与肿瘤发生相关，大量的研究和开发工作试图开发PAD4抑制剂以调节PAD4活性。YW3-56(化学名称为N-(1-(苄基氨基)-5-(2-氯乙二酰亚胺基)-1-氧戊烷-2-基)-6-(二甲基氨基)-2-萘酰胺)是一种PAD4抑制剂，能够有效抑制PAD4诱导的H3组蛋白的瓜氨酸化。然而YW3-56具有生物利用度低、在血液中不稳定、水溶性差等缺点，因此提高YW3-56的效能具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含RGD序列肽的纳米载体及其制备方法、载药体系及其制备方法和应用，本发明在金纳米颗粒-聚乙二醇羧基或聚天冬氨酸上修饰RGD序列肽，以此作为纳米载体与PAD4抑制剂自组装构建载药体系，可以增强PAD4抑制剂的生物相容性，改善PAD4抑制剂的生物利用度。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种含RGD序列肽的纳米载体，由修饰剂对载体材料进行修饰得到，所述修饰剂中含RGD序列肽，所述载体材料为金纳米颗粒-聚乙二醇羧基或聚天冬氨酸；其中，所述载体材料的尺寸为5～110nm。
优选地，所述金纳米颗粒-聚乙二醇羧基中的金纳米颗粒包括金纳米球和/或金纳米棒。
本发明提供了上述技术方案所述纳米载体的制备方法，
(i)当所述载体材料为金纳米颗粒-聚乙二醇羧基时，包括以下步骤：
将金纳米颗粒、巯基聚乙二醇羧基和水混合进行配位反应，得到金纳米颗粒-聚乙二醇羧基；
将所述金纳米颗粒-聚乙二醇羧基活化后与c(RGDfK)和PBS缓冲液混合进行第一缩合反应，得到纳米载体；
(ii)当所述载体材料为聚天冬氨酸时，包括以下步骤：
将含有聚天冬氨酸与HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl的反应液进行第二缩合反应，得到聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl；
将所述聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl、三氟乙酸和三氟甲磺酸混合进行保护基脱除反应，得到纳米载体。
优选地，所述金纳米颗粒与c(RGDfK)的用量比为0.9～1.1mg：4.99×10-3mmol；
所述聚天冬氨酸与HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl的摩尔比为0.0055：(0.8～1.2)。
本发明提供了一种载药体系，包括纳米载体和负载在所述纳米载体上的PAD4抑制剂，所述纳米载体为上述技术方案所述纳米载体或上述技术方案所述制备方法制备得到的纳米载体，所述PAD4抑制剂为N-(1-(苄基氨基)-5-(2-氯乙二酰亚胺基)-1-氧戊烷-2-基)-6-(二甲基氨基)-2-萘酰胺。
优选地，所述载药体系的载药量为10～50wt％。
本发明提供了上述技术方案所述载药体系的制备方法，包括以下步骤：
将纳米载体、PAD4抑制剂与溶剂混合，所述PAD4抑制剂与所述纳米载体经自组装，得到载药体系。
优选地，所述纳米载体、PAD4抑制剂与溶剂混合所得反应液中，纳米载体的浓度为25～125μg/mL，PAD4抑制剂的浓度为240～260μg/mL。
本发明提供了上述技术方案所述载药体系或上述技术方案所述制备方法制备得到的载药体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括结肠癌、肺癌、乳腺癌或纤维肉瘤。
本发明提供了一种含RGD序列肽的纳米载体，由修饰剂对载体材料进行修饰得到，所述修饰剂中含RGD序列肽，所述载体材料为金纳米颗粒-聚乙二醇羧基或聚天冬氨酸；其中，所述载体材料的尺寸为5～110nm。本发明以金纳米颗粒-聚乙二醇羧基或聚天冬氨酸为载体材料，利用含RGD序列肽的修饰剂对其进行修饰，在此基础上与PAD4抑制剂(即YW3-56)自组装构建得到纳米载药体系，使YW3-56的活性得到了提升，具体的，与纳米载体结合的YW3-56进入体内后，增强了YW3-56的生物相容性，使其在血液中更加稳定，同时纳米载体表面修饰的RGD序列肽增强了对细胞表面整合素受体的靶向性，使纳米载体-药物结合物(即本发明提供的纳米载药体系)更容易被肿瘤部位识别而摄取，从而增强了YW3-56抑制肿瘤增殖活性，改善了YW3-56的生物利用度。
体外活性评价：本发明测试例1中采用MTT染色法评价纳米载药体系对HCT-116、95D、MCF-7以及S180四株细胞增殖能力的影响，实验结果表明，高浓度的纳米载体不具有明显的细胞毒性，除了添加PD-RGDS的组别仅对S180细胞的抗肿瘤细胞增殖活性有提升，剩下添加纳米载体的组别对4株细胞的抗肿瘤细胞增殖活性均得到提升。
本发明测试例2中采用免疫荧光实验评价纳米载药体系对MCF-7细胞中PAD4的抑制能力，实验结果表明，加入纳米载体的组别与未加入组相比，PAD4酶促反应成成的瓜氨酸减少，同时被细胞摄取的YW3-56的量增加，进而说明纳米载体的加入提升了YW3-56对PAD4的抑制作用。
体内活性评价：本发明测试例3中采用移植性荷S180肉瘤小鼠模型评价纳米载药体系的抗肿瘤活性，实验结果表明，AuNPs-PEG-c(RGDfK)+1.0μmol/kg YW3-56组的抑制率为38％，AuNRs-PEG-c(RGDfK)+1.0μmol/kg YW3-56组的抑制率为43％，与10.0μmol/kgYW3-56组相比，没有显著性差异，活性较好。
本发明测试例4中采用免疫荧光实验评价基于无机载体材料的纳米载药体系对移植性荷S180肉瘤小鼠模型肿瘤组织中PAD4的抑制能力，结果显示，加入纳米载体的组别与未加入组的更高剂量YW3-56相比，红色荧光与蓝色荧光强度没有显著性差异，说明组别间有着相似的抑制效果，纳米载体的加入提升了YW3-56对PAD4的抑制作用。
附图说明
图1为本发明中载药体系制备工艺图；
图2为PD-RGDS的红外光谱(IR)图；
图3为PD-RGDS的氨基酸分析图谱；
图4为PD-RGDS在水中的TEM图；
图5为金纳米颗粒及其修饰物的射电子显微镜图；
图6为AuNPs及其修饰物的UV谱图；
图7为AuNRs及其修饰物的UV谱图；
图8为AuNPs及其修饰物的Zeta电位测定值统计图和AuNRs及其修饰物的Zeta电位测定值统计图；
图9为不同比例条件下AuNPs-PEG-c(RGDfK)与YW3-56结合的UV图；
图10为不同比例条件下AuNRs-PEG-c(RGDfK)与YW3-56结合的UV图；
图11为金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)与YW3-56结合的TEM图；
图12为受试药物体抗HCT-116细胞增殖活性的细胞活力统计图；
图13为受试药物体抗95D细胞增殖活性的细胞活力统计图；
图14为受试药物体抗MCF-7细胞增殖活性的细胞活力统计图；
图15为受试药物体抗S180细胞增殖活性的细胞活力统计图；
图16为细胞免疫荧光实验成像图；
图17为细胞免疫荧光实验灰度分析统计图-红色荧光；
图18为细胞免疫荧光实验灰度分析统计图-蓝色荧光；
图19为体内抗肿瘤增殖活性实验瘤重统计图；
图20为体内免疫荧光实验成像图(放大倍数200x)；
图21为体内免疫荧光实验灰度分析统计图-红色荧光；
图22为体内免疫荧光实验灰度分析统计图-蓝色荧光。
具体实施方式
本发明提供了一种含RGD序列肽的纳米载体，由修饰剂对载体材料进行修饰得到，所述修饰剂中含RGD序列肽，所述载体材料为金纳米颗粒-聚乙二醇羧基或聚天冬氨酸；其中，所述载体材料的尺寸为5～110nm。
本发明提供的纳米载体是采用含RGD序列肽的修饰剂对载体材料进行修饰得到，RGD序列肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)显示出对整合素αvβ3有着选择性的结合能力。整合素是由α单链和β单链构成的细胞粘附受体，有着激活和未激活的形式。整合素αvβ3对肿瘤生长调节、血管生成与转移起着重要的作用。整合素αvβ3在多种细胞中过度表达，比如恶性黑色素瘤、乳腺癌、晚期胶质母细胞瘤和内皮细胞。结合了RGD序列肽的纳米载药体系可以主动地通过靶分子或被动地通过实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR)在肿瘤组织中积累，增加疗效并减少副作用。
在本发明中，所述载体材料为金纳米颗粒-聚乙二醇羧基或聚天冬氨酸，所述金纳米颗粒-聚乙二醇羧基中的金纳米颗粒优选包括金纳米球和/或金纳米棒，更优选为金纳米球或金纳米棒，其中，所述金纳米球的粒径优选为5～50nm，更优选为20～40nm，进一步优选为30nm；所述金纳米棒的长优选为40～60nm，更优选为50nm，宽优选为10～15nm，更优选为12nm，长径比优选为3.5～4.5，更优选为4.0～4.2。在本发明中，所述金纳米颗粒-聚乙二醇羧基具体是由金纳米颗粒和巯基聚乙二醇羧基(HS-PEG-COOH)经配位反应制备得到(后文会详细说明)，其中，所述HS-PEG-COOH的数均分子量(Mn)优选为3.4k。在本发明中，所述聚天冬氨酸(PD)的数均分子量优选为20964g/mol，聚合度优选为91；以聚天冬氨酸作为载体材料时，其被含RGD序列肽的修饰剂修饰后，在水中可自组装形成纳米球，所述纳米球的粒径优选为60～110nm。
在本发明中，RGD序列肽中的氨基与金纳米颗粒表面修饰的PEG末端羧基通过缩合反应键合，得到以金纳米颗粒-聚乙二醇羧基为载体材料的纳米载体；RGD序列肽中的氨基与聚天冬氨酸的侧链羧基通过缩合反应键合，得到以聚天冬氨酸为载体材料的纳米载体。
本发明提供了上述技术方案所述纳米载体的制备方法，工艺流程图如图1所示，下面就载体材料为金纳米颗粒-聚乙二醇羧基或聚天冬氨酸两种情况进行分别说明。在本发明中，若没有特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，当所述载体材料为金纳米颗粒-聚乙二醇羧基时，所述纳米载体的制备方法包括以下步骤：
将金纳米颗粒、巯基聚乙二醇羧基和水混合进行配位反应，得到金纳米颗粒-聚乙二醇羧基；
将所述金纳米颗粒-聚乙二醇羧基活化后与c(RGDfK)和PBS缓冲液混合进行第一缩合反应，得到纳米载体。
本发明将金纳米颗粒、巯基聚乙二醇羧基(HS-PEG-COOH)和水混合进行配位反应，得到金纳米颗粒-聚乙二醇羧基(记为金纳米颗粒-PEG-COOH)。本发明优选将金纳米颗粒的水分散液与HS-PEG-COOH混合；所述金纳米颗粒的水分散液中金的浓度优选为0.08～0.12mg/mL，更优选为01mg/mL；所述金纳米颗粒的水分散液与HS-PEG-COOH的用量比优选为4.5～5.5mL：0.5mg，更优选为5mL：0.5mg。本发明对所述金纳米颗粒的来源没有特殊限定，满足上述粒度要求即可，如可以采用本领域技术人员熟知的方法制备得到。在本发明的实施例中，具体采用经典的柠檬酸钠还原法制备金纳米球(AuNPs)，采用种子生长法制备金纳米棒(AuNRs)。
在本发明中，所述配位反应的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；时间优选为10～15h，更优选为12h；所述配位反应优选在搅拌条件下进行，所述搅拌的速率优选为250～350rpm，更优选为300rpm。在本发明中，所述配位反应过程中，HS-PEG-COOH中的巯基与金纳米颗粒配位键合，生成金纳米颗粒-PEG-COOH；本发明采用HS-PEG-COOH对金纳米颗粒进行表面修饰，便于后续通过PEG末端羧基与RGD序列肽中的氨基键合，而且将聚乙二醇(PEG)引入金纳米颗粒表面可以通过降低调理作用，最大限度地减少网状内皮系统在体内的非特异性摄取，延长血液循环时间，从而实现更好的生物相容性和更低的细胞毒性。
所述配位反应后，本发明优选将配位反应后所得体系离心，以去除未反应的HS-PEG-COOH，离心所得沉淀物即为金纳米颗粒-PEG-COOH；所述离心的转速优选为11000rpm，时间优选为10min。本发明优选将所述金纳米颗粒-PEG-COOH保存于水中备用，具体是将上述离心所得金纳米颗粒-PEG-COOH重悬于水中，避光保存于4℃冰箱中备用。
得到金纳米颗粒-PEG-COOH后，本发明将所述金纳米颗粒-PEG-COOH活化后与c(RGDfK)和PBS缓冲液混合进行第一缩合反应，得到纳米载体。本发明首先将所述金纳米颗粒-PEG-COOH进行活化，得到活化金纳米颗粒-聚乙二醇羧基(记为活化金纳米颗粒-PEG-COOH)。本发明优选将所述金纳米颗粒-PEG-COOH、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和PBS缓冲液(pH值优选为7.4)混合，之后进行活化。在本发明的实施例中，具体是将金纳米颗粒-PEG-COOH、EDC和NHS分别分散于PBS缓冲液中，得到金纳米颗粒-PEG-COOH料液、EDC料液和NHS料液，之后将三者混合；在本发明中，所述金纳米颗粒-PEG-COOH料液中金的浓度优选为0.48～0.52mg/mL，更优选为0.5mg/mL；所述EDC料液的浓度优选为(4.9～5.0)×10-2mmol/mL，更优选为4.98×10-2mmol/mL；所述NHS料液的浓度优选为(4.9～5.0)×10-2mmol/mL，更优选为4.98×10-2mmol/mL；所述金纳米颗粒-PEG-COOH料液、EDC料液和NHS料液的体积比优选为1：0.5：0.5。
在本发明中，所述活化的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃，具体可以在室温条件下进行活化，即不需要额外的加热或降温；在本发明的实施例中，具体是在25℃进行活化；所述活化的时间优选为50～70min，更优选为1h。本发明通过活化实现金纳米颗粒表面羧基的活化，有利于后续与c(RGDfK)侧链的氨基发生第一缩合反应。
所述活化后，本发明优选将活化后所得体系离心，以去除未反应的EDC与NHS，离心所得沉淀物即为活化金纳米颗粒-PEG-COOH；所述离心的转速优选为11000rpm，时间优选为10min。
得到活化金纳米颗粒-PEG-COOH后，本发明将所述活化金纳米颗粒-PEG-COOH与c(RGDfK)和PBS缓冲液混合进行第一缩合反应，得到纳米载体。本发明优选将活化金纳米颗粒-PEG-COOH和c(RGDfK)分别分散于PBS缓冲液中，得到活化金纳米颗粒-PEG-COOH料液和c(RGDfK)料液，之后将二者混合；在本发明中，所述活化金纳米颗粒-PEG-COOH料液中金的浓度优选为0.48～0.52mg/mL，更优选为0.5mg/mL；所述c(RGDfK)料液的浓度优选为(4.9～5.0)×10-2mmol/mL，更优选为4.99×10-3mmol/mL；所述活化金纳米颗粒-PEG-COOH料液和c(RGDfK)料液的体积比优选为优选为1:0.5。在本发明中，所述c(RGDfK)的序列为Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys环肽。在本发明的实施例中，所述c(RGDfK)购买自上海昕浩生物科技有限公司。
在本发明中，所述第一缩合反应的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃，具体可以在室温条件下进行第一缩合反应；所述第一缩合反应的时间优选为5～7h，更优选为6h。在本发明中，所述第一缩合反应过程中，活化金纳米颗粒-PEG-COOH的PEG链末端羧基与c(RGDfK)中Arg的氨基键合形成肽键，以实现将c(RGDfK)修饰到PEG链末端，得到纳米载体(即修饰有c(RGDfK)的金纳米颗粒)。
所述第一缩合反应后，本发明优选将第一缩合反应后所得体系离心，以去除未反应的c(RGDfK)，离心所得沉淀物即为纳米载体；所述离心的转速优选为11000rpm，时间优选为10min。本发明优选将所述纳米载体保存于水中备用，具体是将上述离心所得纳米载体重悬于水中，避光保存于4℃冰箱中备用。
在本发明中，当所述载体材料为聚天冬氨酸时，所述纳米载体的制备方法包括以下步骤：
将含有聚天冬氨酸与HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl的反应液进行第二缩合反应，得到聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl；
将所述聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl、三氟乙酸和三氟甲磺酸混合进行保护基脱除反应，得到纳米载体。
本发明将含有聚天冬氨酸与HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl的反应液进行第二缩合反应，得到聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl。本发明对所述HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法制备得到即可；在本发明的实施例中，具体是按照文献(Chen S,Wang Y,Li S,etal.Poly-α,β-aspartyl-Arg-Gly-Asp-Phe:A novel polymeric nanomedicine[J].Medicinal Chemistry Communication,2015,6(1):182-186)制备得到。
本发明优选将聚天冬氨酸、1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，冰浴条件下搅拌混合均匀，将所得体系与HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl混合，采用N-甲基吗啉调节pH值至8～9，即得到反应液。本发明中聚天冬氨酸的羧基与EDC·HCl形成中间体，再与HOBt形成活性酯，实现对聚天冬氨酸中羧基的活化，有利于后续与HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl的氨基发生第二缩合反应。在本发明中，所述聚天冬氨酸、HOBt、EDC·HCl和HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl的摩尔比优选为0.0055：(0.8～1.2)：(1.8～2.2)：(0.8～1.2)，更优选为0.0055：1：2：1；所述聚天冬氨酸与DMF的用量比优选为0.0055mmol：1～2mL，更优选为0.0055mmol：1.5mL。
得到反应液后，本发明进行第二缩合反应，得到聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl。在本发明中，所述第二缩合反应的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃，具体可以在室温条件下进行第二缩合反应；所述第一缩合反应的时间优选为40～55h，更优选为45～50h。在本发明中，所述第二缩合反应过程中，HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl中Arg的氨基与聚天冬氨酸侧链的羧基键合，从而将HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl修饰到聚天冬氨酸侧链上。
所述第二缩合反应后，本发明优选将第二缩合反应后所得混合物转移至表面皿中，待溶剂挥发后，残留物依次用乙醚洗涤2～3次、4～6wt％的KHSO4水溶液洗涤2～3次、水洗涤2～3次，洗涤后所得物料于35～40℃真空干燥45～55h，得到深黄色固体，即为聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl，直接用于下一步反应。
得到聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl后，本发明将所述聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl、三氟乙酸和三氟甲磺酸混合进行保护基脱除反应，得到纳米载体。在本发明中，所述聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl、三氟乙酸和三氟甲磺酸的用量比优选为0.562g:5.5～6.5mL:1.8～2.2mL，更优选为0.562g:6mL:2mL。在本发明中，所述聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl、三氟乙酸和三氟甲磺酸优选在冰浴条件下混合在本发明中，所述保护基脱除反应优选在冰浴条件下进行，所述保护基脱除反应的时间优选为1～2h，更优选为1.5h。在本发明中，所述保护基脱除反应过程中，三氟乙酸和三氟甲磺酸能够提供强酸性环境使聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl中氨基酸侧链的保护基Tos、OBzl以及Bzl脱除，得到脱除保护基的产物。
所述保护基脱除反应后，本发明优选将保护基脱除反应所得混合物用乙醚洗涤2～3次，洗涤后所得物料用水溶解，用NaOH调节体系的pH值为7，将所得浑浊液于3000rpm条件下离心30min，上清液用截留分子量为5000的透析膜透析72h，将截留所得残留物冷冻干燥，得到白色固体，即为纳米载体。
本发明提供了一种载药体系，包括纳米载体和负载在所述纳米载体上的PAD4抑制剂，所述纳米载体为上述技术方案所述纳米载体或上述技术方案所述制备方法制备得到的纳米载体，所述PAD4抑制剂为N-(1-(苄基氨基)-5-(2-氯乙二酰亚胺基)-1-氧戊烷-2-基)-6-(二甲基氨基)-2-萘酰胺，即YW3-56。在本发明中，所述载药体系的载药量(即YW3-56的含量)优选为10～50wt％，更优选为20～35wt％。
本发明提供了上述技术方案所述载药体系的制备方法，包括以下步骤：
将纳米载体、PAD4抑制剂与溶剂混合，所述PAD4抑制剂与所述纳米载体经自组装，得到载药体系。
本发明将纳米载体、PAD4抑制剂与溶剂混合，得到混合料液；所述混合料液中PAD4抑制剂的浓度优选为240～260μg/mL，更优选为250μg/mL；所述纳米载体的浓度优选为25～125μg/mL，具体的，纳米载体中载体材料为金纳米颗粒时，所述混合料液中纳米载体的浓度优选为25μg/mL，纳米载体中载体材料为聚天冬氨酸时，所述混合料液中纳米载体的浓度优选为125μg/mL。在本发明中，所述混合料液优选由纳米载体分散液和PAD4抑制剂溶液混合得到，所述纳米载体分散液的浓度优选为50～250μg/mL，溶剂优选为水；所述PAD4抑制剂溶液的浓度优选为500μg/mL，溶剂优选为二甲基亚砜(DMSO)和水，所述DMSO和水的体积比优选为0.5：99.5；纳米载体分散液和PAD4抑制剂溶液的体积比优选为1:1。本发明对所述PAD4抑制剂(即YW3-56)的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法制备得到即可，在本发明的实施例中，具体采用US20120108562(Gong Chen,Yanming Wang,Pingxin Li,Jing Hu,Shu Wang,Yuji Wang.Therapeutic compositions andmethods)专利公开的方法制备得到YW3-56。
在本发明中，得到混合料液后，所述PAD4抑制剂与所述纳米载体经自组装，得到载药体系。在本发明中，所述自组装优选在搅拌条件下进行，本发明对所述搅拌的速率没有特殊限定；所述搅拌的温度优选为15～35℃，更优选为20～30℃，具体可以在室温条件下进行；所述搅拌的时间优选为1.5～2.5h，更优选为1h。在本发明中，PAD4抑制剂与纳米载体自组装后，得到含有载药体系以及溶剂的混合物，可经冷冻干燥，得到载药体系的冻干粉末；在本发明的实施例中，自组装后无需去除所述混合物中的溶剂，将载药体系储存于该溶剂中备用即可。
本发明提供了上述技术方案所述载药体系或上述技术方案所述制备方法制备得到的载药体系在制备抗肿瘤药物中的应用。在本发明中，所述肿瘤优选包括结肠癌、肺癌、乳腺癌或纤维肉瘤。在本发明中，所述抗肿瘤药物包括所述载药体系和药学上可接受的辅料；所述抗肿瘤药物中载药体系的含量优选为10～50wt％，所述药学上可接受的辅料优选包括甘露醇、维生素C和维生素B2中的一种或几种；所述抗肿瘤药物的剂型优选包括冻干粉、胶囊或脂质体。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，面不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl的合成
称取0.117g(0.0055mmol)的聚天冬氨酸(PD，数均分子量Mn＝20964g/mol，聚合度为91)、0.135g(1.00mmol)的1-羟基苯并三唑(HOBt)、0.383g(2.00mmol)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)置于茄瓶中，加入1.5mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，冰浴条件下搅拌30min，加入0.833g(1.00mmol)的HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl(按照文献方法制备得到：Chen S,Wang Y,Li S,et al.Poly-α,β-aspartyl-Arg-Gly-Asp-Phe:A novel polymeric nanomedicine[J].Medicinal ChemistryCommunication,2015,6(1):182-186.)，滴加N-甲基吗啉(NMM)，将反应液的pH值调节为9，室温(25℃)条件下搅拌反应48h；将反应所得混合物转移至表面皿中，待溶剂挥发后，残留物依次用乙醚洗涤3次、5wt％的KHSO4水溶液洗涤3次、水洗涤3次，洗涤后所得物料于37℃真空干燥48h，得到0.562g深黄色固体，即为聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl，直接用于下一步反应。
(2)聚天冬酰-RGDS(PD-RGDS)的合成
将0.562g聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl加入茄瓶中，冰浴条件下加入6mL三氟乙酸溶解，再加入2mL三氟甲磺酸，冰浴条件下搅拌反应1.5h；将反应所得混合物用乙醚洗涤3次，洗涤后所得物料用50mL水溶解，用2mol/L的NaOH调节体系的pH值为7，将所得浑浊液于3000rpm条件下离心30min，上清液用截留分子量为5000的透析膜透析72h，将截留所得残留物冷冻干燥，得到147mg白色固体，即为PD-RGDS。
PD-RGDS的表征
图2为PD-RGDS的红外光谱(IR)图，图2中3279cm-1处为N-H不对称伸缩振动，1644cm-1处为羧基、酰胺中羰基的不对称伸缩振动，1540cm-1处为CH2弯曲振动，1406cm-1处为羰基对称伸缩振动、C-N伸缩振动。
图3为PD-RGDS的氨基酸分析图谱，通过氨基酸分析得到PD-RGDS中Asp:Ser:Gly:Arg＝3.2:1.0:1.2:1.2，RGDS的接枝率为46％；计算得到PD-RGDS的数均分子量Mn＝55708g/mol。
图4为PD-RGDS在水中的TEM图，由图4可知，PD-RGDS在水中可自组装成直径为60～110nm的小球。
实施例2
(1)金纳米球(AuNPs)的制备
将100mL浓度为0.01wt％的HAuCl4水溶液加热至沸腾，之后在500rpm搅拌条件下加入1mL浓度为1wt％的柠檬酸钠水溶液，沸腾状态下保持15min，之后自然冷却至室温，将所得体系(含有柠檬酸包覆的AuNPs)以11000rpm转速离心10min，去掉上清液加入去离子水，进行离心洗涤(共进行两次离心洗涤，每次离心完成后去掉上清液加入去离子水进行下次离心)，所得沉淀重悬于去离子水中，得到AuNPs分散液；使用ICPOES测定金元素含量。
(2)AuNPs-PEG-COOH的制备
称取0.5mg的巯基聚乙二醇羧基(HS-PEG-COOH，数均分子量为3.4k)加入到5mLAuNPs分散液(CAu＝0.1mg/mL)中，加入搅拌子后于25℃、300rpm搅拌过夜；将所得体系以11000rpm转速离心10min，除去未反应的HS-PEG-COOH，所得沉淀重悬于5mL去离子水中，得到AuNPs-PEG-COOH分散液，避光保存于4℃冰箱中备用；使用ICPOES测定金元素含量。
(3)AuNPs-PEG-c(RGDfK)的制备
将AuNPs-PEG-COOH分散液以11000rpm转速离心10min，用相同体积的PBS缓冲液重悬沉淀，使体系的pH值为7.4；分别将4.98×10-2mmol的EDC和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于1mLPBS缓冲液中，得到EDC溶液和NHS溶液；分别向上述pH值为7.4的1mL的AuNPs-PEG-COOH分散液(CAu＝0.5mg/mL)中加入500μLEDC溶液和500μLNHS溶液，室温条件下静置1h，以活化AuNPs表面的羧基，将所得体系以11000rpm转速离心10min，除去未反应的EDC与NHS，用相同体积的PBS缓冲液重悬沉淀，得到活化AuNPs-PEG-COOH分散液。将4.99×10-3mmol的c(RGDfK)溶解于1mLPBS缓冲液中，得到c(RGDfK)溶液(所述c(RGDfK)购买自上海昕浩生物科技有限公司)，向1mL所述活化AuNPs-PEG-COOH分散液(CAu＝0.5mg/mL)中加入500μL c(RGDfK)溶液，室温条件下反应6h；将反应所得料液以11000rpm转速离心10min，以去除未反应的c(RGDfK)，用相同体积的去离子水重悬沉淀，避光保存于4℃冰箱中备用；使用ICPOES测定金元素含量。
实施例3
(1)金纳米棒(AuNRs)的制备
种子溶液的制备：将5mL浓度为0.5mmol/L的HAuCl4水溶液加入到5mL浓度为0.2mol/L的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液中，25℃、300rpm温和搅拌，之后维持该条件，向所得Au-CTAB混和液中加入利用冰水配制的0.6mL浓度为0.01mol/L的NaBH4溶液，1200rpm条件下剧烈搅拌2min，之后25℃、300rpm温和搅拌2h，得到种子溶液。
AuNRs的制备：将1.1mL浓度为10mmol/L的AgNO3水溶液加入到95mL浓度为0.1mol/L的CTAB水溶液中，25℃、300rpm温和搅拌，之后维持该条件，向所得Au-CTAB混和液中加入5mL浓度为10mmol/L的HAuCl4水溶液和0.55mL浓度为0.1mol/L的抗坏血酸水溶液，之后加入120μL种子溶液，30s后停止搅拌，25℃条件下静置过夜；将静置后的体系以11000rpm转速离心10min，去掉上清液加入去离子水，进行离心洗涤(共进行两次离心洗涤，每次离心完成后去掉上清液加入去离子水进行下次离心)，以去除过量的CTAB，将离心所得沉淀重悬于去离子水中，得到AuNRs分散液；使用ICPOES测定金元素含量。
(2)AuNRs-PEG-COOH的制备
按照实施例2中步骤(2)方法制备AuNRs-PEG-COOH，不同之处在于将AuNPs替换为AuNRs。
(3)AuNRs-PEG-c(RGDfK)的制备
按照实施例2中步骤(3)方法制备AuNRs-PEG-c(RGDfK)，不同之处在于将AuNPs-PEG-COOH替换为AuNRs-PEG-COOH。
金纳米颗粒及其修饰物的表征
图5为金纳米颗粒及其修饰物的射电子显微镜图，图中A为AuNPs，B为AuNPs-PEG-COOH，C为AuNPs-PEG-c(RGDfK)，D为AuNRs，E为AuNRs-PEG-COOH，F为AuNRs-PEG-c(RGDfK)。由图5可知，所述AuNPs的粒径约为30nm，经过HS-PEG-COOH和c(RGDfK)修饰没有对AuNPs的形态造成改变；所述AuNRs的长约为50nm，宽约为12nm，长径比约为4，经过HS-PEG-COOH和c(RGDfK)修饰没有对AuNRs的形态造成改变。
图6为AuNPs及其修饰物的UV谱图，由图6可知，经过HS-PEG-COOH修饰后，AuNPs有略微的红移：527～531nm；经过c(RGDfK)修饰后，AuNPs-PEG-COOH有略微的红移：531～534nm，并且出现了c(RGDfK)258nm的吸收峰，可以初步认为修饰成功。
图7为AuNRs及其修饰物的UV谱图，由图7可知，经过HS-PEG-COOH修饰后，AuNRs的横向等离子共振吸收(TSPR)没有明显变化，纵向等离子共振吸收(LSPR)有略微的红移：758～764nm；经过c(RGDfK)修饰后，AuNRs-PEG-COOH有略微的红移：764～769nm，并且出现了c(RGDfK)258nm的吸收峰，可以初步认为修饰成功。
图8中的A为AuNPs及其修饰物的Zeta电位测定值统计图，由图可知，修饰前的AuNPs由于表面存在的柠檬酸钠而带负电荷，Zeta电位为-25.2±0.6mV；在HS-PEG-COOH修饰后，由于HS-PEG-COOH带的负电不如柠檬酸钠多，AuNPs-PEG-COOH表面所带负电荷减少，电位降为-21.2±0.9mV；在c(RGDfK)修饰后，由于c(RGDfK)带正电荷，进一步使AuNPs-PEG-c(RGDfK)表面所带负电荷减少，电位降为-13.8±0.3mV，可以认为HS-PEG-COOH成功替换了AuNPs表面的柠檬酸钠，并且成功与c(RGDfK)结合。
图8中的B为AuNRs及其修饰物的Zeta电位测定值统计图，由图可知，修饰前的AuNRs由于表面存在的CTAB而带正电荷，Zeta电位为20.2±4mV；在HS-PEG-COOH修饰后，由于HS-PEG-COOH带负电，AuNRs-PEG-COOH表面所带电荷由正转负，电位变为-19.2±0.1mV；在c(RGDfK)修饰后，由于c(RGDfK)带正电荷，使表面所带负电荷减少，电位变为-14.1±1.5mV，可以认为HS-PEG-COOH成功替换了AuNRs表面的CTAB，并且成功与c(RGDfK)结合。
实施例4
纳米载体分散液的制备：以去离子水为溶剂，将实施例1制备的PD-RGDS配制成浓度为0.25mg/mL的PD-RGDS分散液，分别将实施例2和3制备的金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)配制成金浓度为50μg/mL的金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)分散液。
YW3-56溶液的制备：将YW3-56(按照专利US20120108562的方法制备得到)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，将所得溶液与去离子水混合，得到YW3-56溶液；所述YW3-56溶液中YW3-56浓度为500μmol/L，DMSO和去离子水的体积比为0.5:99.5。
纳米载药体系的制备：将纳米载体分散液与YW3-56溶液以体积比为1:1的比例混合，室温(25℃)条件下搅拌2h，分别得到金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)-YW3-56纳米载药体系溶液(其中，金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)-YW3-56纳米载药体系中金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)与YW3-56的质量比为2:1)以及PD-RGDS-YW3-56纳米载药体系溶液(其中，PD-RGDS-YW3-56纳米载药体系中PD-RGDS与YW3-56的质量比为4:1)。
金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)-YW3-56纳米载药体系的表征
图9为不同比例条件下AuNPs-PEG-c(RGDfK)与YW3-56结合的UV图，其中，右侧为左侧的局部放大图，由图9可知，随着YW3-56浓度(单位为mg/mL)的增加，AuNPs-PEG-c(RGDfK)发生减色与红移现象，说明AuNPs-PEG-c(RGDfK)与YW3-56能够产生结合作用。
图10为不同比例条件下AuNRs-PEG-c(RGDfK)与YW3-56结合的UV图，其中，右侧为左侧的局部放大图，由图10可知，随着YW3-56浓度(单位为mg/mL)的增加，AuNRs-PEG-c(RGDfK)发生减色与红移现象，说明AuNRs-PEG-c(RGDfK)与YW3-56能够产生结合作用。
图11为金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)与YW3-56结合的TEM图，图中A为AuNPs-PEG-c(RGDfK)，B为AuNPs-PEG-c(RGDfK)+YW3-56，C为AuNRs-PEG-c(RGDfK)，D为AuNRs-PEG-c(RGDfK)+YW3-56。由图11可知，金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)与YW3-56产生结合作用后没有对其形态结构产生影响。
测试例1评价纳米载药体系体外抗细胞增殖活性(MTT法)
1.1实验材料
1.1.1制备样品
受试纳米载体-药物结合物：将金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)(即AuNPs-PEG-c(RGDfK)、AuNRs-PEG-c(RGDfK)，分别记为P、R)分散液浓缩后用原体积1/10的DMSO溶解，加入PBS缓冲液稀释至金浓度50μg/mL。将PD-RGDS用PBS缓冲液配成浓度为0.25mg/mL的溶液。化合物YW3-56用含有0.5％DMSO的PBS缓冲液配成浓度为500μM(加入96孔板中终浓度为100μM)的YW3-56溶液。将所得纳米载体溶液与YW3-56溶液以体积比1:1的比例混合，室温(25℃)条件下搅拌2h，制备得到高浓度纳米载体-药物结合物。分别将纳米载体-药物结合物以及YW3-56溶液稀释调整至合适浓度，如20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.63μM、0.31μM，用于确定受试纳米载体-药物结合物与化合物YW3-56的IC50，其中，纳米载体为AuNPs-PEG-c(RGDfK)、AuNRs-PEG-c(RGDfK)以及PD-RGDS时，纳米载体-药物结合物分别记为P-3-56、R-3-56以及PD-3-56。
阳性对照：阿霉素(DOX)，用含有0.5％DMSO的PBS缓冲液配制成确定浓度(2.5μM、1.25μM、0.63μM、0.31μM、0.16μM和0.08μM)。
空白对照：含0.5％DMSO的PBS缓冲液。
1.1.2实验试剂
青霉素(Penicillin G Sodium salt)：P8420，Solarbio，中国；链霉素(Streptomycin Sulfate)：S8290，Solarbio，中国；胎牛血清(Fetal Bovine SerumAustralia Source)：35-076-CV，Corning，美国；PBS缓冲液：称取8.00g NaCl，0.20g KCl，1.56g Na2HPO4·12H2O以及0.20g KH2PO4，于500mL烧杯中用三蒸水溶解，调节其pH值至7.4，转移至1000mL容量瓶中定容，蒸汽高压灭菌锅灭菌，保存于4℃冰箱中备用；
RPMI-1640培养基：RPMI-1640干粉培养基一袋(31800-022，Gibco，美国)，与青霉素60mg、链霉素100mg于500mL烧杯中用三蒸水溶解后，转移至1000mL容量瓶中定容，经0.22μm滤膜过滤，转移450mL至培养基瓶中，经0.22μm滤膜过滤，加入50mL胎牛血清(FBS)，使其体积比为10％，Para膜密封，保存于4℃冰箱中备用；
DMEM培养基：DMEM干粉培养基一袋(12100-046，Gibco，美国)，与青霉素60mg、链霉素100mg于500mL烧杯中用三蒸水溶解后，转移至1000mL容量瓶中定容，经0.22μm滤膜过滤，转移450mL至培养基瓶中，经0.22μm滤膜过滤，加入50mL胎牛血清(FBS)，使其体积比为10％，Para膜密封，保存于4℃冰箱中备用；
McCoy’s 5A培养基：含双抗500mL不完全McCoy’s 5A培养基一瓶(KGM4892-500，江苏凯基生物技术股份有限公司，中国)，倒出50mL培养基，经0.22μm滤膜过滤，加入50mL胎牛血清(FBS)，使其体积比为10％，Para膜密封，保存于4℃冰箱中备用；
胰蛋白酶-EDTA消化液：KGY0012，江苏凯基生物技术股份有限公司，中国；
MTT：噻唑蓝染料(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)(CAS号：298-93-1，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国)，称取250mg MTT加入50mLEP管中，避光条件下加入50mLPBS缓冲液，超声震荡使其溶解，浓度为5mg/mL，避光保存于4℃冰箱中备用；
DMSO：CAS号：57-68-5，Hyclone，美国；
阿霉素(DOX)：CAS号：23214-92-8，北京华丰联合技术有限公司，中国。
1.1.3所用细胞株
人高转移肺癌细胞95D，购自江苏凯基生物技术股份有限公司；
人乳腺癌细胞MCF-7，购自江苏凯基生物技术股份有限公司；
人结肠癌细胞HCT-116，购自江苏凯基生物技术股份有限公司；
小鼠纤维肉瘤细胞S180，购自北京大学医学部动物实验中心。
1.2实验方法
1.2.1培养基的选择
S180细胞株采用DMEM培养基进行培养；HCT-116细胞株采用McCoy’s5A培养基进行培养；95D、MCF-7细胞株采用1640培养基进行培养。
1.2.2贴壁细胞株培养方法(HCT-116、95D、MCF-7)
HCT-116、95D、MCF-7均属于贴壁依赖型细胞株，需要采取单层细胞培养的方法。在显微镜下观察细胞形态，生长状态良好的细胞形态饱满，透明度大，折光性良好，均贴壁且培养液上清透明无漂浮物。当细胞汇合率达到80％时，细胞处于对数生长期，此状态下的细胞满足实验要求。
将细胞所需相应培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶-EDTA消化液以及各受试药物置于37℃水浴下预热30min。取对数生长期细胞，弃去瓶中原有的细胞培养基，加入2mLPBS缓冲液清洗残留培养基2次后，加入1mL胰蛋白酶-EDTA消化液，放入37℃的孵箱中进行消化，显微镜下观察细胞形态，大部分细胞变为圆形并能从瓶壁上脱落时，加入1mL培养基终止消化，沿瓶壁用滴管反复吹打细胞使其从瓶壁脱落并分散，将液体转移至经过灭菌的15mL离心管中，用离心机3000rpm离心3min，弃去上清，加入5mL培养基，用滴管反复吹打细胞使其分散均匀，利用红细胞计数板在显微镜下进行计数，加入相应培养基稀释，使稀释后的细胞浓度为5×104个/mL。取平底96孔板，外围一周各孔加入100μLPBS缓冲液进行液封，将细胞悬液均匀接种于剩下的孔洞中，每孔接种100μL细胞悬液。置于37℃、5％CO2孵箱中培养12h后进行给药，每个受试药物设置3个副孔，每孔加入25μL受试化合物溶液，每板均设置阳性对照与阴性对照孔。给药完成后，轻拍96孔板四壁并轻轻摇晃，使之均匀分散，再次置于孵箱中培养48h后，每孔加入25μL配制好的MTT溶液，置于孵箱中培养4h，取出后弃去板内残余液体，每孔加入150μL的DMSO，于平板振荡器上振摇15min，使甲臜(活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以使外源性MTT还原为水不溶解的蓝紫色结晶甲臜)完全溶解，完全溶解后尽快用酶标仪在λ＝490nm处测定其OD值，OD值应介于参考值(0～1.4)之间。其中，抑制率＝[(阴性对照组OD值均数-受试化合物组OD值均数)/阴性对照组OD值均数]×100％。
1.2.3悬浮及半悬浮细胞株培养方法(S180)
S180属于悬浮细胞株，需要采取悬浮细胞培养的方法。在显微镜下观察细胞形态，生长状态良好的细胞形态饱满，透明度大，折光性良好，均贴壁且培养液上清透明无漂浮物。当细胞汇合率达到80％时，细胞处于对数生长期，此状态下的细胞满足实验要求。将细胞所需相应培养基、PBS缓冲液以及各受试药物置于37℃水浴下预热30min。取对数生长期细胞，用滴管反复吹打细胞使其分散均匀，将液体转移至经过灭菌的15mL离心管中，用离心机3000rpm离心3min，弃去上清，加入5mL培养基，用滴管反复吹打细胞使其分散均匀，利用红细胞计数板在显微镜下进行计数，加入相应培养基稀释，使稀释后的细胞浓度为5×104个/mL。取圆底96孔板，外围一周各孔加入100μLPBS缓冲液进行液封，将细胞悬液均匀接种于剩下的孔洞中，每孔接种100μL细胞悬液。接种完细胞悬液后立刻进行给药，每个受试药物设置3个副孔，每孔加入25μL受试化合物溶液，每板均设置阳性对照与阴性对照孔。给药完成后，轻拍96孔板四壁并轻轻摇晃，使之均匀分散，再次置于孵箱中培养48h后，每孔加入25μL配制好的MTT溶液，置于孵箱中培养4h，取出后用离心机3000rpm离心10min，移液枪吸除板内上清废液，每孔加入150μL DMSO，于平板振荡器上振摇15min，使甲臜完全溶解，完全溶解后尽快用酶标仪在λ＝490nm处测定其OD值应介于参考值(0～1.4)之间。其中，抑制率＝[(阴性对照组OD值均数-受试化合物组OD值均数)/阴性对照组OD值均数]×100％。
1.3实验结果及分析
本实验评价了纳米载药体系对HCT-116、95D、MCF-7以及S1804株细胞的体外抗细胞增殖活性，以抑制率对所测受试化合物的浓度进行统计分析，使用SPSS中回归分析-概率统计的方法，计算出阳性药及纳米载药体系的IC50值，结果见表1。
表1受试药物体外抗细胞增殖活性的IC50值
Figure BDA0002547940150000151
表1中，n＝9，经过t检验；a：与YW3-56组相比，P<0.01；b：与YW3-56组相比，P<0.05，c：与P-3-56组相比，P<0.05。
图12为受试药物体抗HCT-116细胞增殖活性的细胞活力统计图，图13为受试药物体抗95D细胞增殖活性的细胞活力统计图，图14为受试药物体抗MCF-7细胞增殖活性的细胞活力统计图，图15为受试药物体抗S180细胞增殖活性的细胞活力统计图。
由表1和图12～14可知，高浓度下的纳米载体没有明显的细胞毒性，添加纳米载体的YW3-56与未添加纳米载体的YW3-56相比，在低浓度下有着更好的细胞增殖抑制效果。添加金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)(即P或R)组的4株细胞的IC50均有明显的下降，平均约下降1倍，添加PD-RGDS组除了S180细胞之外对YW3-56抑制细胞生长能力提升不明显。添加P或R的YW3-56组与未添加P或R的YW3-56组相比活性得到了提升。添加不同形状的金纳米颗粒的组别相比，虽然大部分组别没有显著性差异，但是金纳米棒具有活性略优于金纳米球的现象。
添加纳米载体使YW3-56的活性得到提升，可能是纳米载体表面修饰的RGD序列肽增强了对细胞表面整合素受体的靶向性，使纳米载体-药物结合物更容易被细胞识别而摄取，抗细胞增殖活性增强。
测试例2细胞免疫荧光实验
本实验观测在647nm激发波长下的红色荧光强度与403nm激发波长下的蓝色荧光强度。瓜氨酸是PAD4酶促反应的产物。本实验中一抗与瓜氨酸结合，二抗将与瓜氨酸结合的一抗染上红色荧光，如果生成的瓜氨酸越多，则红色荧光强度越高。403nm为YW3-56的激发波长。
2.1实验材料
2.1.1制备样品
受试纳米载体-药物结合物：将金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)(AuNPs-PEG-c(RGDfK)、AuNRs-PEG-c(RGDfK)，下文分别简称为P与R)分散液浓缩后用原体积1/10的DMSO溶解，加入PBS缓冲液稀释至金浓度50μg/mL。将PD-RGDS用PBS缓冲液配成浓度为0.25mg/mL的溶液。化合物YW3-56用含有0.5％DMSO的PBS缓冲液配成浓度为500μM(加入96孔板中终浓度为100μM)的溶液。将所得纳米载体溶液与YW3-56溶液以体积比1:1的比例结合后再稀释10倍，得到YW3-56浓度为25μM的纳米载体-药物结合物溶液(加入共聚焦小皿中终浓度为5μM)。
空白对照：含0.5％的DMSO的PBS缓冲液。
2.1.2实验试剂
青霉素(Penicillin G Sodium salt)：P8420，Solarbio，中国；链霉素(Streptomycin Sulfate)：S8290，Solarbio，中国；胎牛血清(Fetal Bovine SerumAustralia Source)：35-076-CV，Corning，美国；PBS缓冲液：称取8.00g NaCl，0.20g KCl，1.56g Na2HPO4·12H2O以及0.20g KH2PO4，于500mL烧杯中用三蒸水溶解，调节其pH值至7.4，转移至1000mL容量瓶中定容，蒸汽高压灭菌锅灭菌，保存于4℃冰箱中备用；
RPMI-1640培养基：RPMI-1640干粉培养基一袋(31800-022，Gibco，美国)，与青霉素60mg、链霉素100mg于500mL烧杯中用三蒸水溶解后，转移至1000mL容量瓶中定容，经0.22μm滤膜过滤，转移450mL至培养基瓶中，经0.22μm滤膜过滤，加入50mL胎牛血清(FBS)，使其体积比为10％，Para膜密封，保存于4℃冰箱中备用；
胰蛋白酶-EDTA消化液：KGY0012，江苏凯基生物技术股份有限公司，中国；
DMSO：CAS号：57-68-5，Hyclone，美国；
4％多聚甲醛固定液：KGIHC016-CS，江苏凯基生物技术股份有限公司，中国；
Anti-Histone H3(citrulline R2+R8+R17)抗体-ChIP Grade：ab5103，Abcam，英国；
山羊抗兔IgG H&L(Alexa
Figure BDA0002547940150000171
647)：ab150079，Abcam，英国；封闭山羊血清(原液)：SL038，Solarbio，中国；
TritonX-100：CAS号：9002-93-1，上海麦克林生化科技有限公司，中国。
2.1.3肿瘤细胞株
人乳腺癌细胞MCF-7，购自江苏凯基生物技术股份有限公司。
2.2实验方法
MCF-7属于贴壁依赖型细胞株，需要采用单层细胞培养的方法。在镜下观察细胞形态，生长状态良好的细胞形态饱满，透明度大，折光性良好，均贴壁且培养液上清透明无漂浮物。当细胞汇合率达到80％时，细胞处于对数生长期，此状态下的细胞满足实验要求。
将RPMI-1640培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶-EDTA消化液以及各受试药物置于37℃水浴下预热30min。取对数生长期细胞，弃去瓶中原有的细胞培养基，加入2mL PBS缓冲液清洗残留培养基2次后，加入1mL胰蛋白酶-EDTA消化液，放入37℃的孵箱中进行消化，显微镜下观察细胞形态，大部分细胞变为圆形并能从瓶壁上脱落时，加入1mL培养基终止消化，沿瓶壁用滴管反复吹打细胞使其从瓶壁脱落并分散，将液体转移至经过灭菌的15mL离心管中，用离心机3000rpm离心3min，弃去上清，加入5mL培养基，用滴管反复吹打细胞使其分散均匀，利用红细胞计数板在显微镜下进行计数，加入RPMI-1640培养基稀释，使稀释后的细胞浓度为2×105个/mL。向共聚焦小皿中加入1mL细胞悬液，置于37℃、5％CO2的细胞孵箱内培养12h。将小皿从孵箱内取出，将培养基吸出弃去，PBS缓冲液洗涤2次，加入1mL新鲜培养基，再加入250μL药液或PBS缓冲液，置于37℃、5％CO2的细胞孵箱内培养8h。将小皿从孵箱内取出，将培养基吸出弃去，PBS缓冲液洗涤3次，加入4％多聚甲醛中室温固定20min，用移液枪吸除废液，PBS缓冲液洗涤3次，加入0.1％TritonX100溶液作用3min，用移液枪吸除废液，PBS缓冲液洗涤3次，加入5％山羊血清室温封闭2h，用移液枪吸除废液，PBS缓冲液洗涤3次，加入用PBS缓冲液稀释250倍的一抗溶液1mL，4℃作用14h，用移液枪吸除废液，PBS缓冲液洗涤3次，加入用PBS缓冲液稀释500倍的二抗溶液1mL，室温于避光湿盒内作用1h，用移液枪吸除废液，PBS缓冲液洗涤3次，加入1mLPBS缓冲液，1h之内用激光共聚焦显微镜观测。
2.3实验结果及分析
图16为细胞免疫荧光实验成像图；图17为细胞免疫荧光实验灰度分析统计图-红色荧光，其中，n＝10，经过t检验；a：与对照组相比，P<0.01；b：与对照组相比，P<0.01；c：与YW3-56相比，P<0.01；图18为细胞免疫荧光实验灰度分析统计图-蓝色荧光，其中，n＝10，经过t检验；a：与YW3-56组相比，P<0.01。
由图16～18可知，空白对照组红色荧光更亮，给YW3-56的组别红色荧光更暗，说明空白对照组产生的瓜氨酸更多，给YW3-56的组别生成的瓜氨酸受到抑制而减少，进而说明对PAD4起到了抑制作用。与YW3-56组相比，加入纳米载体的组别红色荧光更暗，说明加入纳米载体之后能够提升YW3-56对PAD4的抑制能力。蓝色荧光为YW3-56发出的荧光，实验结果表明，与YW3-56组相比，加入纳米载体的组别蓝色荧光更亮，说明进入细胞的YW3-56量增加，这也解释了纳米载体能够增强YW3-56对PAD4抑制能力的原因。
测试例3评价纳米载药体系体内抗肿瘤增殖活性(移植性小鼠S180肉瘤模型)
3.1实验动物
雄性SPF级ICR品系小鼠，体重20±2g，购自北京维通利华实验动物有限公司，在首都医科大学实验动物部动物屏障内饲养。
3.2实验分组与给药方案
阴性对照组：生理盐水(NS)，每组10只，给药途径为尾静脉注射；
阳性对照组：阿霉素(DOX)，每组10只，剂量为2.0μmol/kg，给药途径为腹腔注射；
受试组：P、R、YW3-56、P-3-56、R-3-56，共5组，每组10只，YW3-56的剂量为10.0μmol/kg，P-3-56、R-3-56组YW3-56的剂量为1.0μmol/kg，含有金纳米颗粒的组别中金元素的剂量为0.2mg/kg，给药途径为尾静脉注射。
3.3实验步骤
移植性小鼠S180肉瘤模型所用的瘤源为S180小鼠纤维肉瘤细胞，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。
将S180小鼠纤维肉瘤细胞接种于SPF级雄性ICR小鼠腹腔内，自行传代，将传代一周后的荷S180腹水瘤的小鼠，用适量乙醚麻醉后，脱颈处死，将小鼠置于75％的酒精中浸泡消毒1min，然后剖开小鼠腹腔，收集腹水S180瘤液，将瘤液以1000rpm离心10min，弃去上清，用生理盐水洗涤去除非细胞碎片、组织以及浮血，将其充分混合，得到S180细胞悬液，稀释至一定倍数后与新鲜配制的0.2％台盼蓝以9:1的体积比混匀染色。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。用红细胞计数板计数，按以下公式计算细胞浓度和细胞存活率：
细胞浓度(细胞数/mL)＝4个大方格内活细胞数/4×104×稀释倍数，
细胞存活率(％)＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％。
用生理盐水将存活率大于90％的细胞悬液稀释至2×107个/mL，此时应当尽快完成实验的接种，接种时，左手抓取小鼠进行固定，右手持注射器刺入小鼠右侧腋下至皮下约2mm深，使用针头钝性分离出一个小空腔，注射0.2mL制备好的细胞悬液，每次注射前应将细胞悬液混合均匀。至此动物模型建立完成。模型建立后每日观察小鼠，待大部分小鼠腋下可见黄豆粒大小的实体瘤后进行分组，本实验在接种后第5天进行随机分组，使每组小鼠肿瘤大小平均分布，当天开始给药，每天1次，至第11天进行第7次给药。最后一次给药24h后取出小鼠，各组小鼠进行称重，乙醚麻醉后摘除眼球进行取血，之后脱颈处死，左手用镊子固定小鼠腋下实体瘤生长部位，右手用剪刀剪开皮肤，充分暴露肿瘤组织，沿皮肤、上肢进行钝性分离，取出肿瘤组织，进行称重。再依次解剖取出小鼠的心、肝、脾、肾、脑等脏器组织进行称重。
3.4实验结果与分析
原位肿瘤组织质量以均值±SD g表示，经t检验进行组间统计学比较。抑制率＝[(阴性对照组瘤重平均值-受试化合物瘤重平均值)/(阴性对照组瘤重平均值)]×100％。移植性小鼠S180肉瘤模型评价受试药物体内抑制肿瘤增殖活性的结果如表2所示：
表2受试药物体内抑制肿瘤增殖活性评价
Figure BDA0002547940150000191
表中n＝10，经t检验，a：与NS相比，P<0.01；b：与YW3-56相比，P>0.05。
图19为体内抗肿瘤增殖活性实验瘤重统计图。
由表2和图19可知，阴性对照组的平均瘤重为1.96±0.65g，阳性对照组的平均瘤重为0.74±0.14g，抑制率为62.2％，与阴性对照组相比，瘤重具有显著性差异，可以判断模型建立成功。
含有YW3-56的给药组，平均瘤重与阴性对照组相比均存在显著性差异，说明YW3-56对肿瘤生长有抑制作用。1.0μmol/kg的YW3-56加入金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)后，与10.0μmol/kg的YW3-56相比没有显著性差异，说明加入金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)使YW3-56的活性得到了提升。可能是与金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)结合的YW3-56进入体内后，增强了YW3-56的生物相容性，使其更加稳定，同时金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)表面修饰的RGD序列肽增强了对细胞表面整合素受体的靶向性，使金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)-药物混合物更容易被肿瘤部位识别而摄取，增强YW3-56抑制肿瘤增殖活性。
测试例4体内荧光免疫实验
4.1实验材料
4.1.1实验样品
移植性小鼠S180肉瘤模型中解剖得到的肿瘤组织。
4.1.2实验试剂
4％多聚甲醛固定液：KGIHC016-CS，江苏凯基生物技术股份有限公司，中国；pH6.0枸橼酸盐缓冲液：62706-10，EM Science，美国；Anti-Histone H3(citrulline R2+R8+R17)抗体-ChIP Grade：ab5103，Abcam，英国；山羊抗兔IgG H&L(Alexa
Figure BDA0002547940150000201
ab150079，Abcam，英国；封闭山羊血清(原液)：SL038，Solarbio，中国。
4.2实验分组
阴性对照组：生理盐水(NS)，每组2个肿瘤样本；
受试组：YW3-56(10.0μmol/kg)、P-3-56(1.0μmol/kg)、R-3-56(1.0μmol/kg)，每组两个肿瘤样本。
4.3实验步骤
解剖剥离出不同组别的肿瘤组织，用4％的多聚甲醛4℃固定24h，将其置于脱水盒。进行常规酒精梯度脱水、透明、石蜡包埋：75％酒精4h，85％酒精2h，90％酒精22h，95％酒精1h，无水乙醇(I)30min，无水乙醇(II)30min，二甲苯(I)10min，二甲苯(II)10min，蜡(I)1h，蜡(II)1h，蜡(III)1h。最后应用切片机将标本切割，得到厚度为5～6mm切片。
将切片用二甲苯(I)脱蜡30min，二甲苯(II)脱蜡10min。之后进行酒精梯度水化：100％酒精3min，100％酒精3min，95％酒精3min，85％酒精3min，75％酒精3min，50％酒精3min，蒸馏水3min，蒸馏水3min，PBS缓冲液5min。继续进行抗原修复：将切片置于含有0.1mol/L且pH＝6.0的枸橼酸盐缓冲液的抗原修复液玻片盒，置于抗原修复锅内，启动仪器，高温高压处理15min，自然冷却过夜。用组化笔在组织周围画圈，将玻片置于含有PBS缓冲液的避光湿盒，置于脱色摇床，晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加5％山羊血清室温封闭1h。轻甩除去封闭液，在切片上滴加用PBS缓冲液稀释250倍的一抗溶液，切片置于避光湿盒内4℃作用14h。将玻片置于含有PBS缓冲液的湿盒，置于脱色摇床，晃动洗涤3次，每次5min，用滤纸擦去样本之外的废液，加入用PBS缓冲液稀释500倍的二抗溶液，室温于避光湿盒内作用1h。将玻片置于含有PBS缓冲液的湿盒，置于脱色摇床，晃动洗涤3次，每次5min，用滤纸擦去样本之外的废液，用抗荧光淬灭封片剂封片。切片置于荧光显微镜下观测。
4.4实验结果与分析
图20为体内免疫荧光实验成像图(放大倍数200x)；图21为体内免疫荧光实验灰度分析统计图-红色荧光，其中，n＝10，经过t检验；a：与NS组相比，P<0.01；b：与YW3-56组相比，P>0.05；图22为体内免疫荧光实验灰度分析统计图-蓝色荧光，其中，n＝10，经过t检验；a：与YW3-56组相比，P>0.05。
由图20～22可知，空白对照组与给YW3-56的组别相比，红色荧光更亮，说明空白对照组产生的瓜氨酸更多。给YW3-56组红色荧光更暗，说明瓜氨酸的生成受到抑制而减少，进而说明对PAD4起到了抑制作用。与细胞免疫荧光实验得到的结果一致。加入金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)的YW3-56组与未加入的更高剂量YW3-56组相比，红色荧光与蓝色荧光强度没有显著性差异，说明组别间有着相似的抑制效果，与移植性小鼠S180肉瘤模型实验得到的结果一致，说明金纳米颗粒-PEG-c(RGDfK)的加入增强了YW3-56的抗肿瘤增殖活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种载药体系，包括纳米载体和负载在所述纳米载体上的PAD4抑制剂，所述PAD4抑制剂为N-(1-(苄基氨基)-5-(2-氯乙二酰亚胺基)-1-氧戊烷-2-基)-6-(二甲基氨基)-2-萘酰胺，所述纳米载体由修饰剂对载体材料进行修饰得到，所述修饰剂中含RGD序列肽，所述载体材料为金纳米颗粒-聚乙二醇羧基或聚天冬氨酸；所述金纳米颗粒-聚乙二醇羧基中的金纳米颗粒包括金纳米球和/或金纳米棒；所述金纳米球的粒径为20~40nm；所述金纳米棒的长为40~60nm，宽为10~15nm，长径比为4.0~4.2；以聚天冬氨酸作为载体材料时，所述聚天冬氨酸被所述修饰剂修饰后，在水中自组装形成纳米球，所述纳米球的粒径为60~110nm。
2.根据权利要求1所述的载药体系，其特征在于，所述纳米载体的制备方法，
（i）当所述载体材料为金纳米颗粒-聚乙二醇羧基时，包括以下步骤：
将金纳米颗粒、巯基聚乙二醇羧基和水混合进行配位反应，得到金纳米颗粒-聚乙二醇羧基；
将所述金纳米颗粒-聚乙二醇羧基活化后与c(RGDfK)和PBS缓冲液混合进行第一缩合反应，得到纳米载体；
（ii）当所述载体材料为聚天冬氨酸时，包括以下步骤：
将含有聚天冬氨酸与HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl的反应液进行第二缩合反应，得到聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl；
将所述聚天冬酰-Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl、三氟乙酸和三氟甲磺酸混合进行保护基脱除反应，得到纳米载体。
3.根据权利要求2所述的载药体系，其特征在于，所述金纳米颗粒与c(RGDfK)的用量比为0.9~1.1 mg：4.99×10-3 mmol；
所述聚天冬氨酸与HCl·Arg(Tos)GlyAsp(OBzl)Ser(Bzl)OBzl的摩尔比为0.0055：(0.8~1.2)。
4.根据权利要求1所述的载药体系，其特征在于，所述载药体系的载药量为10~50 wt%。
5.权利要求1~4任一项所述载药体系的制备方法，包括以下步骤：
将纳米载体、PAD4抑制剂与溶剂混合，所述PAD4抑制剂与所述纳米载体经自组装，得到载药体系。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述纳米载体、PAD4抑制剂与溶剂混合所得反应液中，纳米载体的浓度为25~125 µg/mL，PAD4抑制剂的浓度为240~260 µg/mL。
7.权利要求1~4任一项所述载药体系或权利要求5~6任一项所述制备方法制备得到的载药体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括结肠癌、肺癌、乳腺癌或纤维肉瘤。
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CN113462640B (zh) * 2021-06-16 2024-03-22 成都微沃科技有限公司 一种用于调控细胞铺展速率的笼闭配体的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102389573A (zh) * 2011-11-15 2012-03-28 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种治疗恶性胶质瘤的药物及其制备方法
CN103341186A (zh) * 2013-07-24 2013-10-09 上海交通大学 一种肿瘤靶向的放射性纳米颗粒及其制备方法
CN109395105A (zh) * 2018-11-05 2019-03-01 中山大学 一种聚氨基酸声敏剂及其制备方法与应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103189063B (zh) * 2010-11-01 2016-10-19 宾夕法尼亚州研究基金会 治疗组合物和方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102389573A (zh) * 2011-11-15 2012-03-28 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种治疗恶性胶质瘤的药物及其制备方法
CN103341186A (zh) * 2013-07-24 2013-10-09 上海交通大学 一种肿瘤靶向的放射性纳米颗粒及其制备方法
CN109395105A (zh) * 2018-11-05 2019-03-01 中山大学 一种聚氨基酸声敏剂及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development and activity evaluation of Arg-Gly-Asp-containing antithrombotic conjugate;Shuangling Chen，et al.;《Journal of Molecular Structure》;20190716;第1198卷;1-9 *
Shuangling Chen，et al..Development and activity evaluation of Arg-Gly-Asp-containing antithrombotic conjugate.《Journal of Molecular Structure》.2019,第1198卷第1-9页. *
Synthesis and Bioevaluation of Iodine-131 Directly Labeled Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanorods for Tumor-Targeted Imaging;Yingying Zhang，et al.;《Contrast Media & Molecular Imaging》;20171224;第2017卷;1-10 *
Yingying Zhang，et al..Synthesis and Bioevaluation of Iodine-131 Directly Labeled Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanorods for Tumor-Targeted Imaging.《Contrast Media & Molecular Imaging》.2017,第2017卷第1-10页. *

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