CN114224838B - 一种肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统及其制备方法及应用 - Google Patents

一种肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统及其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是一种肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统及其制备方法及应用。本发明的融合膜表面含有癌细胞膜表面的蛋白和脂质体表面的肿瘤微环境激活的基团，赋予仿生纳米递送系统同源靶向黏附识别功能和快速穿透进入肿瘤的功能。本发明的仿生纳米递送系统的纳米内核表面含有肿瘤酸性微环境可触发电荷逆转的负电涂层，能实现仿生纳米系统肿瘤微环境敏感释药。本发明的融合膜修饰的仿生纳米递送系统可以递送化疗药、基因药物以及共载化疗药和基因药物，具有靶向性好，免疫原性低，生物相容性好的特点，为肿瘤治疗中的药物精准递送提供一种有效的手段。

Description

一种肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统及其 制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统及其制备方法及应用。
背景技术
目前，纳米技术已经在各个领域广泛应用，在肿瘤治疗的领域尤为突出。许多传统药物由于药代动力学差、渗透性低、容易被机体清除以及靶向性差、明显的细胞毒性等特点，导致这些药物很难达到预期的治疗效果，而纳米材料由于其粒径小、靶向性高以及循环时间长等特点，作为药物载体后，可以将药物递送至靶器官部位，然后实现缓释作用，进而实现精准靶向治疗的效果。但是，纳米医学发展至今，也存在着诸多问题，例如许多纳米粒进入体内后不稳定，组织相容性差，会出现一系列的毒性作用和排斥反应，目前仅有很少的纳米材料被批准用于临床医疗。可见，纳米材料的进一步优化是一项极具挑战性的课题。
目前已开发的药物递送载体材料通常为人工合成的高分子化合物，根据使用目的的不同对载体进行修饰，但是这些修饰有的很难在体内发挥识别体内复杂的内源性物质的作用，而且有时候还会被机体视为外源性毒物排出体外，无法按照预先设计可以到达肿瘤部位。基于此现状，出现了一些细胞、内源性蛋白、病原体等仿生型药物递送系统。仿生纳米药物载体是利用机体不同种类胞膜包裹纳米粒，实现纳米粒子的“伪装”，并赋予纳米粒不同的功能，可有效的避免了纳米粒在体内的免疫清除，其中肿瘤细胞包裹的纳米递送系统可以通过同源靶向的特性实现药物靶向递送至肿瘤部位。细胞膜仿生纳米递送体系具有以下优点：(1)与人体可具有生物同源性，使用自源性细胞膜时不会引起的有害免疫反应；(2)仿生纳米载体在血流中的稳定性好；(3)组织穿透力强，向组织转运药物的效率高；(4)仿生纳米递送系统可很好的利用肿瘤组织的增强滞留(EPR)效应，富集于肿瘤部位。目前已有癌细胞[Yang R,et al.ACS Nano.2018；12(6):5121-5129；Fang RH,et al.Nano Lett.2014；14(4):2181-2188]、红细胞膜[Gao M,et al.Adv Mater.2017；29(35)]、血小板膜[Jing L,et al.Theranostics.2018；8(10):2683-2695]、巨噬细胞膜[Cao H,et al.ACSNano.2016；10(8):7738-7748]等细胞膜包裹的纳米粒用于抗肿瘤治疗药物的递送研究。
在新型药物传递载体的研究过程中，人们进一步尝试用对仿生材料进行改造和修饰，包裹使用不同来源的细胞膜的融合膜构建仿生纳米递送体系，或者将特殊功能的脂质体与细胞膜进行融合，进一步赋予仿生纳米递送系统更多的功能。肿瘤微环境响应的脂质体与癌细胞膜融合后，会进一步赋予仿生纳米粒肿瘤微环境响应的特性，进而实现肿瘤微环境靶向。肿瘤细胞利用肿瘤微环境中过表达的基质金属蛋白酶(MMPs)破坏细胞外基质，是肿瘤细胞侵袭和转移过程的关键生理学步骤，基质金属蛋白酶是降解细胞外基质的主要酶类之一，具有不同的底物特异性，肿瘤利用MMPs破坏转移过程中遇到的正常组织屏障。多数MMPs是由肿瘤微环境中基质细胞合成的，而不是肿瘤细胞，其中MMP-2、MMP-9在肿瘤侵袭和转移过程中发挥重要作用。尽管，肿瘤微环境中过表达的MMPs为肿瘤细胞的生长，侵袭和转移提供了帮助，由于其较高的表达水平，也成为了肿瘤组织区别于正常组织的特征之一。利用这一特点，可以开发基于MMPs响应的纳米递药系统。
目前尚无一种将癌细胞膜与酶响应脂质体膜两种膜的融合膜修饰的仿生纳米给药系统，并且能够实现肿瘤治疗药物的靶向递送。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向性强，免疫原性低、肿瘤微环境响应、可递送疏水性治疗药物、基因药物的仿生纳米递送系统，通过将疏水性治疗药物包载在纳米内核的疏水空腔中(例如PLGA、多肽胶束等)，或基因药物包载在纳米内核表面，然后将上述纳米内核表面PC负电涂层包裹，最后用癌细胞膜与功能化脂质体膜的融合膜进行包裹，PC负电涂层和功能化脂质体膜都可以赋予仿生纳米粒肿瘤微环境响应的特性，可以多层次实现肿瘤微环境敏感释药。本发明的第二个目的是提供该仿生纳米递送系统的制备方法。本发明的第三个目的是提供该仿生纳米递送体系在靶向递送疏水性治疗药物、基因药物至肿瘤部位的应用。
本发明中选用了癌细胞膜包裹的纳米载体作为递送系统利用癌细胞膜的同源靶向可以有希望减少除了纳米递送系统非靶向部位的分布，实现特定肿瘤的治疗药物靶向递送。
DSPE-PEG-MAP(DSPE-PEG2000-RRRRRRRRR-PVGLIG-EGGEGGEGG)中的MAP多肽(RRRRRRRRR-PVGLIG-EGGEGGEGG)是一种肿瘤微环境基质金属蛋白酶激活的细胞穿膜肽(Chen L,et al.ACS Nano.2020；14(6):6636-6648)，可以使得在富含MMP-9基质金属蛋白酶的肿瘤微环境条件下，细胞穿膜肽经MMP-9基质金属蛋白酶激活后才具有穿膜效应，可以增加细胞摄取，原理为PVGLIG为MMP-9基质金属蛋白酶可以剪切的片段，其断裂后，掩盖RRRRRRRRR多肽正电荷的负电荷多肽序列EGGEGGEGG脱落，使得RRRRRRRRR多肽中精氨酸的正电荷暴露，进而实现高效的摄取。MAP修饰的脂质体膜与癌细胞膜融合后，其融合膜也具有肿瘤微环境基质金属蛋白酶MMP9响应的特点。该融合膜包裹的仿生纳米递送系统进入细胞后，如何实现药物的快速释放，这也需要在纳米内核表面增加一种肿瘤微环境敏感的涂层，进一步实现纳米内核药物的释放。
PC(PLL-CA)是一种可以在酸性条件下实现电荷翻转的基团(Pranantyo D,etal.Biomater Sci.2021；9(5):1627-1638)，可以应用在仿生纳米粒的纳米内核表面，使得纳米粒在PC的负电涂层的包裹下，维持纳米内核为负电荷，有利益融合膜的进一步包裹。
本发明所要解决的主要技术问题是：如何通过将癌细胞和功能化脂质体膜进行融合得到融合膜，然后包裹在修饰有可以电荷逆转的负电涂层的的纳米内核表面，制备具有靶向性、肿瘤微环境激活等特点的仿生纳米递送体系，实现肿瘤治疗药物的靶向递送和精准释放。
本发明设计了一种由癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜和可电荷逆转的负电涂层修饰的纳米内核共组合构建的仿生纳米递送体系。癌细胞膜可以实现同源肿瘤的精准靶向，功能化脂质体膜可以实现对肿瘤微环境响应，实现肿瘤细胞的高效摄取，另外可以电荷逆转的负电涂层可以进一步促进仿生纳米粒在进入细胞后，其载药纳米内核的药物的进一步释放，本发明构建的融合膜仿生递送体系有希望实现肿瘤治疗药物的精准靶向和胞内释放。
本发明通过分离提取癌细胞膜和功能化脂质体两种脂质膜，并将两种膜进行融合，癌细胞膜可以赋予纳米递送系统具有同源靶向的特点，进而可以靶向识别同类肿瘤细胞的功能。功能化脂质体膜可以赋予纳米递送系统在肿瘤微环境条件下可以实现快速穿透肿瘤细胞。另一个特征在于，本发明的仿生纳米递送系统的纳米内核表面包裹有在肿瘤微酸性环境下可以实现电荷翻转的负电涂层，可以进一步促进所递送药物的靶向释放。
本发明的第一方面，提供一种肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统，是将纳米递送体系进行可电荷逆转的负电涂层PC修饰，再通过癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜对其进行包裹。
进一步的，所述纳米递送体系由多肽胶束或高分子聚合物制成。具体可选LC多肽胶束(多肽单体LA-CL溶于甲醇中，加入10％半胱氨酸盐酸盐进行交联，在室温下聚合12h，N2吹干甲醇，得到LA-CLss，简写LC，中国专利文献CN107129522A，一种硫辛酸修饰的固有无序蛋白纳米载体及其制备方法和应用，申请号：201710202680.9)、聚酰胺-胺(PAMAM)树状大分子、硬酯酰化多肽纳米粒等。
本发明的第二方面，提供一种如上所述的肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统的制备方法，是将制备好的癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜与负电涂层修饰后的纳米递送体系混合在一起以质量比1:1的比例水浴超声2min，即得。
进一步的，所述的癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜是将癌细胞膜与功能化脂质体膜在一定温度条件(37℃)下通过薄膜水化法以质量比1:2进行融合。
进一步的，所述的负电涂层修饰，是配置1mg/mL的PC溶液，按照纳米递送体系与PC按照比例(纳米递送体系的氨基与PC羧基摩尔比为1:3)室温孵育半小时即得到。
更进一步的，所述的癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜的制备方法包括以下步骤：
(A)将培养瓶中处于对数生长期的肿瘤细胞，用PBS润洗2遍，用细胞刮子刮下细胞，然后600g，5min离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。
(B)将1ml临用前添加了PMSF的膜蛋白抽提试剂A加入至2-5×107细胞中，轻轻并充分悬浮细胞，冰浴放置10-15min。
(C)采用液氮冻融法将细胞放在液氮和室温依次反复冻融三次来破碎细胞。
(E)于4℃，700g离心10min，弃掉沉淀(细胞核和未破碎的细胞)，收集上清液至一新的离心管中。
(F)最后在4℃，14000g条件下离心30min，弃去上清即得到细胞膜碎片备用。
(G)功能化脂质体制备：1.3mg二棕榈酰磷脂酰胆碱,0.3mg胆固醇,2.4mg DSPE-PEG-MAP，溶于5ml二氯甲烷中，然后溶剂通过旋转蒸发器在圆形烧瓶中蒸发，水浴温度50℃，形成薄膜。
(H)进一步的将4mg上述得到的薄膜用2ml的蔗糖溶液(10％)水化，水化0.5h，然后在冰水中超声3min，然后分别用0.2-μm和0.1-μm聚碳酸酯膜来回挤压3次，得到脂质体膜。
(I)水化时加入若加入1.85ml 10％蔗糖+0.15ml癌细胞细胞悬液(2mg细胞膜蛋白，与脂质体体膜质量比1:2)，则得到癌细胞膜(Cm)与功能化脂质体膜(Lipm)融合在一起的癌细胞膜与功能化脂质体膜的融合膜(CLip)。
进一步的，所述的融合膜的鉴定方法：通过检测荧光供体C6-NBD的在发射波长534nm的荧光来看膜的融合程度。
进一步的，所述的可电荷翻转的负电涂层为聚赖氨酸(Poly-L-lysine，PLL)与2-甲基马来酸酐(citraconic anhydride，CA)合成所得，命名为PC。其制备方法为：将PLL(50mg，0.01mmol)溶解在2ml PBS中，缓慢加入CA(87.4mg，0.77mmol)，用氢氧化钠(5M)调pH，直到pH为中性，然后搅拌过夜，室温，透析48h，然后冻干可得PC。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统在制备药物递送系统中的应用。
所述的肿瘤微环境激活：仿生纳米递送系统表面的融合膜中的脂质体膜表面含有可以在肿瘤基质金属蛋白酶MMP9的微环境下可以断裂的负电荷基团，进而暴露正电荷，可以实现仿生纳米粒的肿瘤细胞的快速摄取，另外仿生纳米粒进入细胞后，其内部的负电涂层PC可以在酸性条件下实现电荷翻转，由较为稳定的负电荷变为正电荷，进一步可以穿透仿生膜，实现纳米内核所递送药物的成功释放。
本发明的第四方面，提供一种如上所述的肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统在制备靶向递送抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述的靶向递送抗肿瘤药物是通过纳米递送载体包载疏水性化疗药物和/或基因药物，然后修饰负电涂层PC，再通过癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜对其进行包裹。
进一步的，所述的抗肿瘤药物靶向的肿瘤指的是与融合膜中癌细胞膜为同一个种类的肿瘤。更进一步的，所述的肿瘤可以为肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等。
进一步的，所述的疏水性药物，为疏水性化疗药(阿霉素、多西他赛)，也可以是疏水性小分子药物(例如IDO抑制剂(NLG919)、PD-L1抑制剂BMS-202等)。
进一步的，所述的基因药物，包括siRNA、DNA等基因治疗药物。
进一步的，所述的应用具体为：将所述的疏水性治疗药物和基因药物通过纳米递送载体包裹，然后修饰负电涂层PC，通过融合膜对其进行包裹，制得靶向递送抗肿瘤药物。
本发明提供的肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统适用于递送抗肿瘤疏水性小分子药物、基因药物或二者共递送。
本发明所述的仿生纳米递送系统能够实现纳米递送体系的仿生“伪装”，可以躲避机体的免疫清除系统，进而实现肿瘤部位的靶向，靶向至肿瘤部位后，在肿瘤基质金属蛋白酶MMP-9的触发下，融合膜表面的正电荷细胞穿膜肽可以实现高效的肿瘤细胞摄取，进入细胞后，纳米内核的负电涂层可以进一步实现负电向正电荷转变，实现仿生膜的破裂，可以进一步触发纳米内核上所包载药物的释放。
所述的仿生纳米递送系统，可以实现肿瘤部位的精准靶向和肿瘤细胞内的释放。所述精准靶向是指融合膜中癌细胞膜介导的靶向，癌细胞膜可以实现同种肿瘤细胞的同源靶向。
本发明可以适用于多种类肿瘤的治疗。本发明的肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统具有的靶向功能，主要是因为其中肿瘤细胞膜的功能，组成融合膜中癌细胞膜具有同源靶向的功能，不同种类的肿瘤细胞具有靶向其同源肿瘤的功能，可以实现多种肿瘤的靶向。
本发明的第五方面，提供一种乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统，其制备方法为：
(1)将1.3mg二棕榈酰磷脂酰胆碱，0.3mg胆固醇，2.4mg DSPE-PEG-MAP，溶于5ml二氯甲烷中，然后溶剂通过旋转蒸发器在圆形烧瓶中蒸发，水浴温度50摄氏度，形成薄膜；水化：加入2ml 10％蔗糖溶液，水化0.5h，然后在冰水中超声3min，然后分别用0.2-μm和0.1-μm聚碳酸酯膜来回挤压3次，得到脂质体膜；水化时加入若加入1.85ml 10％蔗糖+0.15ml乳腺癌细胞细胞悬液(2mg细胞膜蛋白，与脂质体体膜质量比1:2)，得到乳腺癌细胞膜(4T1m)与功能化脂质体膜(Lipm)融合在一起的融合膜(4T1-Lipm)；
(2)称适量PLL-CA(PC)配置成1mg/mL的溶液，按照LC氨基与PC羧基摩尔比为1:3室温孵育半小时即制备得到PC@CO-LC NPs；将所得的融合膜4T1-Lipm与制得的PC@CO-LC NPs纳米胶束按照质量比1:1超声2min，制备得到融合膜包裹的仿生纳米递送体系(4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs)。
本发明的第六方面，提供一种乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统在制备靶向递送乳腺癌治疗药物中的应用。
进一步的，所述的靶向递送乳腺癌治疗药物是通过纳米递送载体包载疏水性化疗药物和/或基因药物，然后修饰负电涂层PC，再通过癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜对其进行包裹；所述的疏水性药物，为疏水性化疗药(阿霉素、多西他赛)，也可以是疏水性小分子药物(例如IDO抑制剂(NLG919)、PD-L1抑制剂BMS-202等)；所述的基因药物，包括siRNA、DNA等基因治疗药物。
进一步的，所述的应用具体为：将所述的疏水性治疗药物和基因药物通过纳米递送载体包裹，然后修饰负电涂层PC，通过融合膜对其进行包裹，制得靶向递送抗肿瘤药物。
本发明的融合细胞膜采用癌细胞膜和功能化的脂质体在适宜浓度条件下融合所得，融合得到的融合膜表面含有癌细胞膜表面的蛋白和脂质体表面的肿瘤微环境激活的基团，癌细胞膜赋予仿生纳米递送系统具有同源靶向黏附识别功能，功能化的脂质体膜赋予仿生纳米递送系统具有肿瘤微环境激活的特点，可以赋予所修饰的仿生纳米载药体系可以在肿瘤富含MMP9基质金属蛋白酶的微环境下实现快速穿透进入肿瘤的功能。本发明的融合膜包裹的仿生纳米递送系统实现肿瘤微环境激活的另外一个特点是其纳米内核表面含有肿瘤酸性微环境可触发电荷逆转的负电涂层，实现仿生纳米系统肿瘤微环境敏感释药。本发明还涉及上述融合膜的制备方法和鉴定方法。本发明的融合膜修饰的仿生纳米递送系统可以递送化疗药、基因药物以及共载化疗药和基因药物，具有靶向性好，免疫原性低，生物相容性好的特点，为肿瘤治疗中的药物精准递送提供一种有效的手段。
本发明优点在于：
1、本发明所得到的可在肿瘤微环境激活的融合膜仿生递送系统具有可以实现靶向肿瘤细胞，以及可以实现肿瘤微环境激活，一方面可以在肿瘤基质金属蛋白酶MMP9的微环境中仿生纳米粒表面的功能化脂质体膜表面的细胞穿膜肽经MMP-9基质金属蛋白酶激活后具有穿膜效应，增加肿瘤细胞摄取，另一方面，在仿生纳米粒进入肿瘤细胞中后，其纳米内核表面的负电涂层PC可以在肿瘤微酸性环境下发生由负电荷像正电荷的转变，可以实现仿生膜破裂，可以进一步促进纳米内核所递送药物的释放，有希望成为肿瘤多模式综合靶向治疗的优势递送系统。
2、本发明所构建的仿生纳米递送系统具有免疫原性低、安全性好、肿瘤微环境激活、靶向性强等优势，可以实现递送的药物可以顺利到达肿瘤细胞。本发明构建的递送系统可以用于递送疏水性治疗药物或者基因药物，可以用于化疗、基因治疗、免疫小分子治疗、或者化疗与基因联合治疗等体内外的抗肿瘤治疗研究，为肿瘤的临床治疗提供依据。
3、本发明的制备方法操作简单，反应条件容易达到，较为温和，无污染、用于构建融合膜的材料(癌细胞、脂质体)制备和收集简单，所得到的肿瘤微环境激活的仿生纳米载体安全性好、免疫原性低、靶向性强、可用于递送抗肿瘤治疗药物，有利于大规模推广于研究和应用领域。
附图说明
图1为所述的荧光共振能量转移法考察癌细胞膜与脂质体膜融合荧光强度图；
图2为癌细胞膜与脂质体膜融合后的红外吸收光谱图；
图3为负电涂层材料的核磁结果图；
图4为融合膜仿生纳米递送系统的透射电镜图；
图5为融合膜仿生纳米递送系统粒径图；
图6为融合膜仿生纳米递送系统电位图；
图7为融合膜的激光共聚焦共定位结果图；DiO(绿色荧光)标记巨噬细胞膜RAW、DiD(红色荧光)标记癌细胞膜4T1；
图8为融合膜仿生纳米递送系统的聚丙烯酰胺电泳图；
图9为融合膜仿生纳米递送系统的Western Blot蛋白鉴定图；
图10为融合膜仿生纳米递送系统在肺癌细胞中介导尼罗红的流式细胞摄取结果图；
图11为融合膜仿生纳米递送系统在肺癌细胞中介导FAM-siRNA的流式细胞摄取结果图；
图12为融合膜仿生纳米递送系统的体内靶向实验；
图13为乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜生纳米递送系统粒径图；
图14为乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统电位图；
图15为乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统的透射电镜图；
图16为乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统的聚丙烯酰胺电泳图；
图17为乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统的体外细胞靶向性实验图；
图18为乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统在乳腺癌细胞中介导尼罗红的流式细胞摄取结果图；
图19为乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统在乳腺癌细胞中介导FAM-siRNA的流式细胞摄取结果图；
图20为乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统在乳腺癌细胞的抗增殖研究结果图；
图21为乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统在乳腺癌细胞的促凋亡分析结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：融合膜仿生纳米递送系统的制备及融合膜比例考察
收集约2-5×107细胞，用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。用适量冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞4℃，600g离心5min沉淀细胞。弃上清，随后4℃，600g离心1min，以沉淀离心管管壁上的残留液体并进一步沉淀细胞，尽最大努力吸尽残留液体。然后把1ml临用前添加了PMSF的膜蛋白抽提试剂A加入至2000-5000万细胞中，轻轻并充分悬浮细胞，冰浴放置10-15min，然后采用冻融法将细胞放在液氮和室温依次反复冻融三次来破碎细胞，然后通过4℃，700g离心10min，小心收集上清液至一新的离心管中以去除细胞核和未破碎的细胞。最后通过4℃，14000g离心30min，以得到细胞膜碎片。1×108个A549肿瘤细胞可提取细胞膜0.6482±0.1184mg。
将1.3mg二棕榈酰磷脂酰胆碱，0.3mg胆固醇，2.4mg DSPE-PEG-MAP，溶于5ml二氯甲烷中，然后溶剂通过旋转蒸发器在圆形烧瓶中蒸发，水浴温度50摄氏度，形成薄膜。水化：加入2ml 10％蔗糖溶液，水化0.5h，然后在冰水中超声3min，然后分别用0.2-μm和0.1-μm聚碳酸酯膜来回挤压3次，得到脂质体膜。水化时加入若加入1.85ml 10％蔗糖+0.15ml癌细胞细胞悬液(2mg细胞膜蛋白，与脂质体体膜质量比1:2)，则得到癌细胞膜(Cm)与功能化脂质体膜(Lipm)融合在一起的融合膜(CLip)。
利用膜融合实验采用荧光共振能量转移法。DOPE-RhB/C-6NBD两种染料都溶解在二氯甲烷中，旋转蒸发成一层薄膜，然后加进去A549癌细胞膜(Cm)，二者与A549细胞膜蛋白的质量百分比分别为0.17和1.74wt％，37℃搅拌50min，然后，残余的染料通过21 000×g离心15min，洗涤四次。脂质体再加入到掺杂A549癌细胞膜的DOPE-RhB/C-6NBD混合溶液中，以下列蛋白比例添DOPE-RhB加：5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、0:1。37℃条件下超声10min，加速膜融合。每个样品的荧光色谱图通过470nm的波长激发，接收波长为500到650nm。通过检测荧光供体C6-NBD的在发射波长534nm的荧光来看膜的融合程度。
结果见图1，当脂质体以不同比例后续加入，能量转移效率降低，由图可以看出当两种膜质量比为1:1时，能量转移效率最高，534nm的荧光强度并未恢复，预示着两种膜融合最佳。
实施例2：癌细胞膜与脂质体膜融合后的红外吸收光谱图
为了考察癌细胞膜与脂质体的融合，我们对实施例1中制备所得的Cm、Lipm、CLip三个样品进行傅里叶变换红外光谱分析。结果见图2，由傅里叶变换红外光谱所示，与Lip组相比，Cm组与CLip组显示出相似的典型的蛋白吸收峰，说明A549癌细胞膜被融合到了脂质体膜中。如图，Cm组与CLip组在1700-1600cm-1的吸收条带与C＝O的拉伸振动有关，1600-1500cm-1的吸收条带与NH的弯曲振动及C-N的拉伸振动有关。综上所述，这些结果有力地证明了癌细胞膜和脂质膜的成功融合以及癌细胞膜成分在融合膜CLip中的保留。
实施例3：负电涂层PC的制备和核磁鉴定
称量PLL(50mg，0.01mmol)溶解在2ml PBS中，缓慢加入CA(87.4mg，0.77mmol)，用配制好的浓度为5M的氢氧化钠调pH，直到pH为中性，然后室温搅拌过夜，将反应溶液加入到500MW截留分子量的透析袋中，透析纯化72h，然后于冷冻干燥机中冻干。取2mg PLL-CA冻干粉末，用0.5ml D2O溶解，在600MHz条件下通过1H-NMR对所得到的产物进行分析。
结果见图3，图3为PLL-CA的核磁共振图谱，1H-NMR分析结果显示，图谱中各峰归属如下：1.06-1.16ppm(峰e，f，g)归属于聚赖氨酸的亚甲基质子峰，4.06ppm峰b为聚赖氨酸中的次甲基质子峰。3.02 ppm峰c为PLL-CA临近酰胺键的聚赖氨酸上亚甲基质子峰。5.72ppm峰a和1.94ppm峰d分别归属于CA上的亚甲基质子峰和甲基质子峰。结果显示PC合成成功。
实施例4：融合膜仿生纳米递送系统的构建及形态考察
超声乳化的方法制备多肽载药胶束。称取DTX 1mg，加入二氯甲烷1mL。称取5mg LC(多肽单体LA-CL溶于甲醇中，加入10％半胱氨酸盐酸盐进行交联，在室温下聚合12h，N2吹干甲醇，得到LA-CLss，简写LC)，用双蒸水涡旋震荡溶解制成浓度为1mg/mL的溶液。然后将溶解DTX的二氯甲烷溶液慢慢加到LCss的溶液中，在冰浴的条件下，进行超声，时间30s，功率为200W。然后立即将超声处理后的LCss和DTX的溶液立即转移至事先放置在磁力搅拌器上盛有8mL双蒸水并放有磁力搅拌子的烧杯中，在通风橱下搅拌条件挥发二氯甲烷2h后，使用0.45μm的微孔滤膜过滤载药溶液，除去未包封的DTX，得到含有DTX的LC多肽胶束(LC/DTX)。取适量siRNA加入DEPC水制成一定浓度的siRNA溶液，按照N/P＝40加入上述LC/DTX中，然后涡旋10s，室温孵育30min后制得既包封DTX又包裹基因药物siRNA的载药多肽胶束(CO-LC)。只含有siRNA的多肽胶束(LC-siRNA)的制备方法与制备Co-LC相同，即将空白胶束溶液(Blank-LC)和基因siRNA按照N/P＝40来配制，涡旋然后室温孵育半小时即可。
称适量PLL-CA配置成1mg/mL的溶液，按照LC氨基与PLL-CA羧基摩尔比为1:3室温孵育半小时即得到制备PC@CO-LC NPs，将试剂盒提取的细胞膜用水重悬，通过BCA蛋白法测定蛋白浓度。将所得的融合膜CLip稀释测定粒径，并超声改善其分散性，与制得的PC@CO-LCNPs纳米胶束按照质量比1:1超声2min，制备得到融合膜包裹的仿生纳米递送体系CLip-PC@CO-LC NPs。将制备所得到的CO-LC NPs、Clip、CLip-PC@CO-LC NPs、MMP-9作用两小时后CLip-PC@CO-LC NPs滴在200目铜网上，室温晾干，然后于磷钨酸染液中染色30s，至完全干燥，于透射电镜(TECNAI G2S-TWIN，美国)上观察并拍照。
如图4可见，CLip-PC@CO-LC NPs形态完整，在酸性pH条件下，CLip-PC@CO-LC NPs形态有所变形，可以看出负电涂层PC的电荷逆转使得仿生膜发生了破裂，进一步验证了仿生纳米递送系统可以响应肿瘤酸性微环境。
实施例5：融合膜仿生纳米递送系统的粒径考察
取实施例4中制备所得的CO-LC NPs、PC@CO-LC NPs、Clip-PC@CO-LC NPs各组纳米复合物溶液，取适量对其粒径进行分析。
结果如图5所示，融合膜仿生纳米复合物CLip-PC@CO-LC NPs的粒径在190nm左右。
实施例6：融合膜仿生纳米递送系统的电位考察
取实施例4中制备所得的CO-LC NPs、PC@CO-LC NPs、Clip-PC@CO-LC NPs各组纳米复合物溶液，取适量对其电位进行分析。
结果如图6所示，纳米复合物CO-LC NPs、PC@CO-LC NPs、Clip-PC@CO-LC NPs的电位分别为35.4±1.18mV、-41.2±0.70mV、-33.5±1.18mV。
实施例7：融合膜激光共聚焦共定位观察
癌细胞膜用DiD标记(红色荧光，激发/发射波长＝644nm/665nm)，脂质体膜用DiO标记(绿色荧光，激发/发射波长＝484nm/501nm)，多余的染料通过离心去除，用染色后的癌细胞膜、脂质体膜、癌细胞膜脂质体融合膜包裹纳米粒，制得C-PC@CO-LC NPs，Lip-PC@CO-LC NPs，CLip-PC@CO-LC NPs，然后在共聚焦显微镜下观察共定位情况，并拍照。
结果见图7，黄色荧光代表的是绿色荧光与红色荧光相重叠，是两种细胞膜共定位后的荧光，说明融合膜制备较成功。
实施例8：融合膜仿生纳米复合物的聚丙烯酰胺电泳结果
为了考察细胞膜融合后蛋白成分的变化情况，我们通过十二烷基硫酸钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)实验对蛋白成分进行分析。步骤如下：1)样品制备：分别制备癌细胞膜Cs、癌细胞膜脂质体融合膜CLips、癌细胞膜脂质体融合膜包裹的纳米粒CLip-PC@CO-LC NPs。分别加入细胞裂解液(含PMSF，100:1)冰上裂解半小时，然后12000rpm离心5min。将得到的样品分批处理，一部分加入PBS、BCA工作液(A试剂：B试剂＝50:1)，37℃摇床混匀半小时，在酶标仪上测定在563nm处的吸光度，计算蛋白浓度。另一部分样品快速加入蛋白上样缓冲液，置于金属浴中(95℃，5min)使得蛋白充分变性，放置负80℃保存备用。2)制胶：胶板清洗、检查、漏后，快速从一侧注入分离胶，小心在胶的表面加入异丙醇封胶，然后倒掉异丙醇，加入浓缩胶，插入电泳梳。3)上样：根据蛋白浓度计算对应样品的上样体积。4)电泳：恒压浓缩一段时间后加压进行分离，当溴酚蓝溶液移动至距离底部1cm处即完成电泳。5)电泳完毕后，将凝胶放在考马斯亮蓝溶液中染色15min，然后转移至脱色液中放置摇床脱色，并多次更换脱色液，直至背景清晰。6)拍照：对蛋白凝胶进行拍照分析。
结果见图8，融合膜仿生纳米粒CLip-PC@CO-LC NPs与CLip以及癌细胞膜Cm蛋白种类相同，结果显示癌细胞膜表面的蛋白成功保留在融合膜仿生纳米粒CLip-PC@CO-LC NPs表面。
实施例9：融合膜仿生纳米复合物的Western Blot蛋白鉴定试验
将制备得到的A549细胞(Cell)裂解液、A549细胞膜(Cm)、A549细胞膜与脂质体膜的融合膜(CLip)、以及融合膜包裹的纳米粒(CLipm-PC@CO-LC NPs)样品，通过BCA法定量测蛋白浓度使得各个样品总蛋白含量调整一致，用SDS-PAGE电泳将蛋白分离，然后将蛋白转移至PVDF膜上，100V条件下转膜2h，然后用TBST缓冲液(Tris-buffered Saline withTween 20)洗涤5min，再去除TBST，再在TBS/吐温-20溶液中用5％脱脂牛奶室温封闭1h，加入一抗，4℃条件下孵育过夜后，将样本于恒温摇床上放置1h，然后收集一抗，并用TBST进行洗涤3次，每次洗涤时间达15min；用同样的方法制备二抗(Pan-cadherin、Histone H3、COXIV)的稀释液，和膜在室温的条件下孵育达30min，再弃掉二抗，在0.1％TBST的脱色摇床上继续洗涤3次，洗涤每次时间达15min，再将膜放在保鲜膜上，将ECL(Millipore,Bedford,MA,USA)化学发光液滴在膜上，曝光拍照。
结果见图9：Na+/K+-ATPase为内参。Pan-cadherin是钙黏着蛋白(跨膜蛋白)，在A549细胞(Cell)、A549细胞膜(Cm)、A549细胞膜与脂质体膜融合膜(CLipm)、融合膜包裹的纳米粒(CLipm-PC@CO-LC NPs)都存在。Histone H3细胞核标志性蛋白和COX IV线粒体标志性蛋白仅仅在A549细胞(Cell)样品中表达，综上可得，提取所得的Cm很好的保留了细胞膜上的Pan-cadherin跨膜蛋白，而COX IV线粒体蛋白和Histone H3细胞核蛋白却比较少，且制备所得的融合膜包裹的纳米粒(CLipm-PC@CO-LC NPs)表面也保留了Pan-cadherin跨膜蛋白，含有COX IV线粒体蛋白和Histone H3细胞核蛋白较少，结果从蛋白的角度对所分离制备的融合膜CLip的表面蛋白进行了鉴定。
实施例10：载尼罗红的融合膜仿生纳米复合物的细胞摄取实验
CLip-PC@CO-LC NPs载药仿生纳米粒介导尼罗红的摄取考察
1)尼罗红标准曲线(生物发光仪)尼罗红溶解在DMSO中，配制不同浓度的溶液(0.0025μg/ml，0.025μg/ml，0.05μg/ml，0.1μg/ml，0.25μg/ml)，然后再生物发光仪中测定吸光度值，绘制标准曲线。
2)CLip-PC@LC-Nile Red NPs制备
制备过程中用尼罗红(1mg)代替DTX通过超声乳化法制备载尼罗红的LC-Nile Red纳米胶束，其他同制备CLip-PC@CO-LC NPs，制备载尼罗红的仿生纳米递送体系，通过尼罗红标准曲线测定尼罗红浓度浓度。
3)铺板给药摄取考察：
A549细胞在CO2孵箱中培养至显微镜下观察融合达70-80％，然后用PBS洗涤一遍后，加入胰酶浸润细胞表面，然后倾倒胰酶后继续放入孵箱中37℃下继续放置2min，然后加入含有血清的培养基吹打至单细胞悬液，用移液枪吸取20μL于计数板上计数，以细胞密度为3×105个细胞/孔铺于12孔板,培养板每孔中补充不含血清的1640培养基使得体积达1mL，然后将培养板放置在CO2孵箱中继续培养24h后，吸去旧的培养基，加入新制的NileRed,LC-Nile Red,CLip-PC@LC-Nile Red(50nM MMP-9预处理或不预处理)胶束溶液，补充新鲜培养基(不含FBS)，放入孵箱中继续培养4h后，将培养板取出，弃去培养基，PBS洗涤1次，然后用胰酶消化，1300rpm离心5min收集细胞后，用PBS重悬洗涤1次后，再加入300μLPBS重悬，以培养板中未作处理的细胞作阴性对照，利用流式细胞仪检测A549细胞对尼罗红的摄取情况。
结果见图10，结果显示尼罗红在CLip-PC@LC-Nile Red仿生纳米递送体系的介导下的摄取显著高于多肽载体LC介导，且在MMP-9处理后的CLip-PC@LC-Nile Red仿生纳米递送体系的摄取显著多于MMP-9未处理组CLip-PC@LC-Nile Red(p＜0.01)。
实施例11：载FAM标记的siRNA的融合膜仿生纳米复合物的细胞摄取实验
FAM-siRNA核苷酸序列：
sense(5'-3')：5’–UUCUCCGAACGUGUCACGU–3’(SEQ ID NO.1)；
antisense(5'-3')5’–ACGUGACACGUUCGGAGAA–3’(SEQ ID NO.2)；
其中siRNA使用时在3’端加上TT以增加siRNA的稳定性。
A549细胞在CO2孵箱中培养至显微镜下观察融合达70-80％，然后用PBS洗涤一遍后，加入胰酶浸润细胞表面，然后倾倒胰酶后继续放入孵箱中37℃下继续放置2min，然后加入含有血清的培养基吹打至单细胞悬液，用移液枪吸取20μL于计数板上计数，以细胞密度为3×105个细胞/孔铺于12孔板,培养板每孔中补充不含血清的1640培养基使得体积达1mL，然后将培养板放置在CO2孵箱中继续培养24h后，吸去旧的培养基，加入新制的FAM-siRNA，LC-FAM-siRNA，CLip-PC@LC-FAM-siRNA(50nM MMP-9预处理或不预处理)胶束溶液，补充新鲜培养基(不含FBS)，放入孵箱中继续培养4h后，将培养板取出，弃去培养基，PBS洗涤1次，然后用胰酶消化，1300rpm离心5min收集细胞后，用PBS重悬洗涤1次后，再加入300μLPBS重悬，以培养板中未作处理的细胞作阴性对照，利用流式细胞仪检测A549细胞对FAM-siRNA的摄取情况。
结果见图11，FAM-siRNA在CLip-PC@LC-FAM-siRNA纳米仿生递送体系的介导下，摄取进入A549细胞的FAM-siRNA显著多于LC-FAM-siRNA给药组，且MMP-9预处理后的CLip-PC@LC-FAM-siRNA纳米仿生递送体系的摄取的平均荧光密度显著高于MMP-9未处理组(p＜0.01)。
实施例12：融合膜仿生纳米递送体系的体内靶向性考察
选择处于对数生长期的A549细胞，胰酶消化，离心，计数，加入4℃解冻的基质胶与预冷的培养基按1：1体积混合，调整细胞密度为1×107个/ml，将每只裸鼠北部右上肢的皮肤用酒精消毒后，用1ml注射器吸取100μL细胞悬液皮下进行接种，接种后的裸鼠继续饲养2周后，然后从其中挑选出裸鼠移植瘤体积50mm3以上的用于接下来的实验。为了考察化疗药或者基因药物siPGAM1在纳米仿生载体介导下的体内分布，我们用染料DiR模拟化疗药，考察其体内分布，将肿瘤体积大于80mm3的裸鼠随机分成2组，每组5只，分别经尾静脉注射单纯DiR、CLip-PC@LC-DiR NPs仿生纳米胶束，注射后于1h，3h，6h，12h，24h时间点于活体成像仪下观察裸鼠体内荧光物质分布情况，并于24h后对老鼠体内心肝脾肺肾肿瘤组织进行离体拍照考察荧光分布，拍照记录。
结果见图12，由图可知，单纯的DiR染料裸鼠在1h后以及24h时荧光主要分布在肝脏部位，而注射CLip-PC@LC-DiR NPs给药组的裸鼠体内荧光在1h后逐渐富集于肿瘤部位，24h后肿瘤部位的荧光仍然较强，离体组织荧光也显示CLip-PC@LC-DiR NPs给药组的荧光主要富集在肿瘤部位(p＜0.01)，肝脏部位的荧光显著低于单纯的DiR组(p＜0.01)。
综合以上各项实施例，可见融合膜能有效地包载纳米粒靶向递送至靶细胞，说明融合膜适合作为纳米粒外层靶向包衣递送疏水性化疗药和基因药物，并可以有效地介导疏水性化疗药和基因药物进入肿瘤细胞，并在体内具有良好的靶向性。
实施例13：乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜生纳米递送系统粒径图
超声乳化的方法制备多肽载药胶束。称取DTX 1mg，加入二氯甲烷1mL。称取5mg LC(多肽单体LA-CL溶于甲醇中，加入10％半胱氨酸盐酸盐进行交联，在室温下聚合12h，N2吹干甲醇，得到LA-CLss，简写LCss)，用双蒸水涡旋震荡溶解制成浓度为1mg/mL的溶液。然后将溶解DTX的二氯甲烷溶液慢慢加到LCss的溶液中，在冰浴的条件下，进行超声，时间30s，功率为200W。然后立即将超声处理后的LCss和DTX的溶液立即转移至事先放置在磁力搅拌器上盛有8mL双蒸水并放有磁力搅拌子的烧杯中，在通风橱下搅拌条件挥发二氯甲烷2h后，使用0.45μm的微孔滤膜过滤载药溶液，除去未包封的DTX，得到含有DTX的LC多肽胶束(LC/DTX)。取适量siRNA加入DEPC水制成一定浓度的siRNA溶液，按照N/P＝40加入上述LC/DTX中，然后涡旋10s，室温孵育30min后制得既包封DTX又包裹基因药物siRNA的载药多肽胶束(CO-LC)。只含有siRNA的多肽胶束(LC-siRNA)的制备方法与制备CO-LC相同，即将空白胶束溶液(Blank-LC)和基因siRNA按照N/P＝40来配制，涡旋然后室温孵育半小时即可。
收集约2-5×107乳腺癌细胞，用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。用适量冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞4℃，600g离心5min沉淀细胞。弃上清，随后4℃，600g离心1min，以沉淀离心管管壁上的残留液体并进一步沉淀细胞，尽最大努力吸尽残留液体。然后把1ml临用前添加了PMSF的膜蛋白抽提试剂A加入至2000-5000万细胞中，轻轻并充分悬浮细胞，冰浴放置10-15min，然后采用冻融法将细胞放在液氮和室温依次反复冻融三次来破碎细胞，然后通过4℃，700g离心10min，小心收集上清液至一新的离心管中以去除细胞核和未破碎的细胞。最后通过4℃，14000g离心30min，以得到乳腺癌细胞膜碎片。1×108个4T1乳腺癌细胞可提取细胞膜0.8138±0.2091mg。
将1.3mg二棕榈酰磷脂酰胆碱，0.3mg胆固醇，2.4mg DSPE-PEG-MAP，溶于5ml二氯甲烷中，然后溶剂通过旋转蒸发器在圆形烧瓶中蒸发，水浴温度50摄氏度，形成薄膜。水化：加入2ml 10％蔗糖溶液，水化0.5h，然后在冰水中超声3min，然后分别用0.2-μm和0.1-μm聚碳酸酯膜来回挤压3次，得到脂质体膜。水化时加入若加入1.85ml 10％蔗糖+0.15ml乳腺癌细胞细胞悬液(2mg细胞膜蛋白，与脂质体体膜质量比1:2)，则得到乳腺癌细胞膜(4T1m)与功能化脂质体膜(Lipm)融合在一起的融合膜(4T1-Lipm)。
称适量PLL-CA(Citraconic anhydride-grafted poly-l-lysine,PC)配置成1mg/mL的溶液，按照LC氨基与PC羧基摩尔比为1:3室温孵育半小时即制备得到PC@CO-LC NPs，将试剂盒提取的细胞膜用水重悬，通过BCA蛋白法测定蛋白浓度。将所得的融合膜4T1-Lipm稀释测定粒径，并超声改善其分散性，与制得的PC@CO-LC NPs纳米胶束按照质量比1:1超声2min，制备得到融合膜包裹的仿生纳米递送体系4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs。将制备所得的CO-LC NPs、PC@CO-LC NPs、4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs各组纳米复合物溶液，取适量对其粒径进行分析。
结果如图13所示，融合膜仿生纳米复合物4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs的粒径在180nm左右。
实施例14：乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统电位图
将实施例13中制备所得的CO-LC NPs、PC@CO-LC NPs、4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs各组纳米复合物溶液，取适量对其电位进行分析。
结果如图14所示，纳米复合物CO-LC NPs、PC@CO-LC NPs、4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs的电位分别为33.5±2.13mV、-40.4±0.43mV、-27.9±2.12mV。
实施例15：乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统的透射电镜图
将制备所得到的CO-LC NPs、4T1-Lipm、4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs，MMP-9作用两小时后4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs滴在200目铜网上，室温晾干，然后于磷钨酸染液中染色30s，至完全干燥，于透射电镜(TECNAI G2S-TWIN，美国)上观察并拍照。
如图15可见，4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs形态完整，在酸性pH条件下，4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs形态有所变形，可以看出负电涂层PC的电荷逆转使得仿生膜发生了破裂，进一步验证了仿生纳米递送系统可以响应肿瘤酸性微环境。
实施例16：乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统的聚丙烯酰胺电泳图
为了考察细胞膜融合后蛋白成分的变化情况，我们通过十二烷基硫酸钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)实验对蛋白成分进行分析。步骤如下：1)样品制备：分别制备乳腺癌细胞膜4T1m、癌细胞膜脂质体融合膜4T1-Lipm、癌细胞膜脂质体融合膜包裹的纳米粒4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs。分别加入细胞裂解液(含PMSF，100:1)冰上裂解半小时，然后12000rpm离心5min。将得到的样品分批处理，一部分加入PBS、BCA工作液(A试剂：B试剂＝50:1)，37℃摇床混匀半小时，在酶标仪上测定在563nm处的吸光度，计算蛋白浓度。另一部分样品快速加入蛋白上样缓冲液，置于金属浴中(95℃，5min)使得蛋白充分变性，放置负80℃保存备用。2)制胶：胶板清洗、检查、漏后，快速从一侧注入分离胶，小心在胶的表面加入异丙醇封胶，然后倒掉异丙醇，加入浓缩胶，插入电泳梳。3)上样：根据蛋白浓度计算对应样品的上样体积。4)电泳：恒压浓缩一段时间后加压进行分离，当溴酚蓝溶液移动至距离底部1cm处即完成电泳。5)电泳完毕后，将凝胶放在考马斯亮蓝溶液中染色15min，然后转移至脱色液中放置摇床脱色，并多次更换脱色液，直至背景清晰。6)拍照：对蛋白凝胶进行拍照分析。
结果见图16，融合膜仿生纳米粒4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs与4T1-Lipm以及乳腺癌细胞膜4T1m蛋白种类相同，结果显示乳腺癌细胞膜表面的蛋白成功保留在融合膜仿生纳米粒4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs表面。
实施例17：乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统的体外细胞靶向性实验图
选择鼠源神经胶质瘤细胞G422、鼠源前列腺癌细胞RM-1、鼠源乳腺癌细胞4T1考察仿生给药体系4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs的体外靶向性。将呈对数生长期神经胶质瘤细胞G422、前列腺癌细胞RM-1、乳腺癌细胞4T1消化计数并以30万/孔的密度铺于12孔板，上述细胞培养24小时，使细胞汇合度达到50％，更换培养基为无血清的培养基。将用膜性染料DiL标记4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs，加入到12孔板的细胞孔中，在孵箱中培养4小时后吸取培养基，消化收集细胞，通过流式细胞术仪检测各组肿瘤细胞对DiL标记的4T1-Lipm-PC@CO-LCNPs的摄取情况。图17结果显示4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs在4T1乳腺癌细胞中的摄取显著高于其他两种肿瘤细胞，可以验证融合膜中4T1细胞膜介导的同源靶向特性可以介导使得4T1细胞对4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs的摄取增多。
实施例18：乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统在乳腺癌细胞中介导香豆素6(Ce6)的流式细胞摄取结果
4T1-Lipm-PC@CO-LC NPs载药仿生纳米粒介导香豆素6的摄取考察
1)Ce6标准曲线(生物发光仪)Ce6溶解在DMSO中，配制不同浓度的溶液(0.001μg/ml，0.01μg/ml，0.05μg/ml，0.1μg/ml，0.2μg/ml)，然后在生物发光仪中测定吸光度值，绘制标准曲线。
2)4T1-Lipm-PC@LC-Ce6 NPs制备
制备过程中用(1mg)代替DTX通过超声乳化法制备载香豆素6的LC-Ce6纳米胶束，其他同制备4T1-Lipm-PC@LC-Ce6 NPs，制备载香豆素6的仿生纳米递送体系，通过香豆素6标准曲线测定香豆素6浓度浓度。
3)铺板给药摄取考察：
4T1细胞在CO2孵箱中培养至显微镜下观察融合达70-80％，然后用PBS洗涤一遍后，加入胰酶浸润细胞表面，然后倾倒胰酶后继续放入孵箱中37℃下继续放置2min，然后加入含有血清的培养基吹打至单细胞悬液，用移液枪吸取20μL于计数板上计数，以细胞密度为3×105个细胞/孔铺于12孔板,培养板每孔中补充不含血清的1640培养基使得体积达1mL，然后将培养板放置在CO2孵箱中继续培养24h后，吸去旧的培养基，加入新制的Ce6,LC-Ce6,4T1-Lipm-PC@LC-Ce6(50nM MMP-9预处理或不预处理)胶束溶液，补充新鲜培养基(不含FBS)，放入孵箱中继续培养4h后，将培养板取出，弃去培养基，PBS洗涤1次，然后用胰酶消化，1300rpm离心5min收集细胞后，用PBS重悬洗涤1次后，再加入300μL PBS重悬，以培养板中未作处理的细胞作阴性对照，利用流式细胞仪检测4T1细胞对香豆素6的摄取情况。
结果见图18，结果显示Ce6在4T1-Lipm-PC@LC-Ce6仿生纳米递送体系的介导下的摄取显著高于多肽载体LC介导，且在MMP-9处理后的4T1-Lipm-PC@LC-Ce6仿生纳米递送体系的摄取显著多于MMP-9未处理组4T1-Lipm-PC@LC-Ce6(p＜0.01)。
实施例19：乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统在乳腺癌细胞中介导FAM-siRNA的流式细胞摄取结果
FAM-siRNA核苷酸序列：
sense(5'-3')：5’–UUCUCCGAACGUGUCACGU–3’(SEQ ID NO.1)；
antisense(5'-3')5’–ACGUGACACGUUCGGAGAA–3’(SEQ ID NO.2)；
其中siRNA使用时在3’端加上TT以增加siRNA的稳定性。
4T1细胞在CO2孵箱中培养至显微镜下观察融合达70-80％，然后用PBS洗涤一遍后，加入胰酶浸润细胞表面，然后倾倒胰酶后继续放入孵箱中37℃下继续放置2min，然后加入含有血清的培养基吹打至单细胞悬液，用移液枪吸取20μL于计数板上计数，以细胞密度为3×105个细胞/孔铺于12孔板,培养板每孔中补充不含血清的1640培养基使得体积达1mL，然后将培养板放置在CO2孵箱中继续培养24h后，吸去旧的培养基，加入新制的FAM-siRNA，LC-FAM-siRNA，4T1-Lipm-PC@LC-FAM-siRNA(50nM MMP-9预处理或不预处理)胶束溶液，补充新鲜培养基(不含FBS)，放入孵箱中继续培养4h后，将培养板取出，弃去培养基，PBS洗涤1次，然后用胰酶消化，1300rpm离心5min收集细胞后，用PBS重悬洗涤1次后，再加入300μLPBS重悬，以培养板中未作处理的细胞作阴性对照，利用流式细胞仪检测4T1细胞对FAM-siRNA的摄取情况。
结果见图19，FAM-siRNA在4T1-Lipm-PC@LC-FAM-siRNA纳米仿生递送体系的介导下，摄取进入4T1细胞的FAM-siRNA显著多于LC-FAM-siRNA给药组，且MMP-9预处理后的4T1-Lipm-PC@LC-FAM-siRNA纳米仿生递送体系的摄取的平均荧光密度显著高于MMP-9未处理组(p＜0.01)。
实施例20：4T1-Lipm-PC@LC-DTX NPs的体外抗增殖研究
将实验分为5组：DTX组、LC-DTX NPs组、4T1-Lipm-PC@LC-DTX NPs组、4T1-Lipm-PC@LC-DTX NPs(MMP-9)组。将4T1按照8×103/孔接种于96孔板中，培养24h，使细胞汇合度达到50％。吸去培养基，每孔加入100μl含不同药物浓度的培养基，继续培养48h，CCK-8法检测细胞毒性，统计细胞存活率。
结果如图20所示，对于4T1细胞而言，空白载体组对细胞存活率几乎无影响，与单纯的DTX组合LC-DTX组比较4T1-Lipm-PC@LC-DTX组可以显著抑制细胞活力，且与4T1-Lipm-PC@LC-DTX组相比，MMP-9处理组，细胞活力更低。因此，将DTX包载在融合膜介导的仿生纳米递送体系中增强了对4T1细胞的药效，且在MMP-9条件下，仿生纳米递送体系表面阳离子电荷暴露，会加速肿瘤细胞对它的摄取，可以更高效的抑制细胞活力。
实施例21：乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜仿生纳米递送系统在乳腺癌细胞中促凋亡分析
将实验分为6组：对照组、DTX组、LC-DTX组、4T1-Lipm-PC@LC-DTX组、4T1-Lipm-PC@LC-DTX NPs(MMP-9)组。将4T1细胞按照4×105/孔接种于12孔板中，培养24h，使细胞汇合度达到80-90％。吸去培养基，每孔加入1ml含一定药物浓度的培养基(DTX：1μg/ml)，继续培养24h，流式细胞仪测定细胞凋亡。
结果如图21所示，对照组早期凋亡加晚期凋亡的总和即凋亡细胞总比例为1.2％、DTX组为11.3％，LC-DTX组为15.1％、4T1-Lipm-PC@LC-DTX组为32.2％、4T1-Lipm-PC@LC-DTX组为41.2％。由此可见，药物DTX经载体包裹后可以显著促进了细胞凋亡，且在MMP-9存在的条件下，细胞凋亡更显著。
综合以上实施例，可见乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜能有效地包载纳米粒靶向递送至乳腺癌细胞，说明乳腺癌细胞膜-功能化脂质体膜融合膜适合作为纳米粒外层靶向包衣递送疏水性化疗药和基因药物，并可以有效地介导疏水性化疗药和基因药物进入乳腺癌细胞，并发挥显著的促凋亡作用，并在体内具有良好的靶向性。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 上海市肺科医院
<120> 一种肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统及其制备方法及应用
<130> /
<140> 202111244826.9
<141> 2021-10-26
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
acgugacacg uucggagaa 19

Claims (7)

1.一种肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统，其特征在于，是将纳米递送体系进行可电荷逆转的负电涂层PC修饰，再通过癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜对其进行包裹；所述纳米递送体系是多肽胶束LA-CLss，所述PC修饰是PLL-CA修饰，所述癌细胞膜是肺癌或乳腺癌细胞膜，所述脂质体膜材包括二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-PEG-MAP；所述的肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统的制备方法是将制备好的癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜与负电涂层修饰后的纳米递送体系混合在一起以质量比1:1的比例水浴超声2min，即得；所述的癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜是将癌细胞膜与功能化脂质体膜通过薄膜水化法以质量比1:2进行融合；所述的负电涂层修饰，是配置1mg/mL的PC溶液，将纳米递送体系与PC室温孵育半小时即得。
2.一种肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，所述的肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统是将纳米递送体系进行可电荷逆转的负电涂层PC修饰，再通过癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜对其进行包裹；所述纳米递送体系是多肽胶束LA-CLss，所述PC修饰是PLL-CA修饰，所述癌细胞膜是肺癌或乳腺癌细胞膜，所述脂质体膜材包括二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-PEG-MAP；所述的制备方法是将制备好的癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜与负电涂层修饰后的纳米递送体系混合在一起以质量比1:1的比例水浴超声2min，即得；所述的癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜是将癌细胞膜与功能化脂质体膜通过薄膜水化法以质量比1:2进行融合；所述的负电涂层修饰，是配置1mg/mL的PC溶液，将纳米递送体系与PC室温孵育半小时即得。
3.一种如权利要求1所述的肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统在制备药物递送系统中的应用。
4.一种如权利要求1所述的肿瘤微环境激活的融合膜包裹的仿生纳米递送系统在制备靶向递送抗肿瘤药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的靶向递送抗肿瘤药物是通过纳米递送载体包载疏水性化疗药物和/或基因药物，然后修饰负电涂层PC，再通过癌细胞膜和功能化脂质体膜的融合膜对其进行包裹。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物靶向的肿瘤指的是与融合膜中癌细胞膜为同一个种类的肿瘤。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的疏水性药物，为疏水性化疗药或疏水性小分子药物；所述的基因药物，为siRNA或DNA基因治疗药物。
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