CN101390826A

CN101390826A - 一种磁性肿瘤靶向聚合物纳米囊泡及其制备方法

Info

Publication number: CN101390826A
Application number: CNA2008102186334A
Authority: CN
Inventors: 帅心涛; 李皓; 杨小强
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2008-10-24
Filing date: 2008-10-24
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2028-10-24
Also published as: CN101390826B

Abstract

本发明公开了一种磁性肿瘤靶向聚合物纳米囊泡，由以下重量份数的组分制成：5～20份叶酸封端的聚乙二醇和聚乳酸的两亲性共聚物，1份超顺磁性纳米粒子，以及1份亲水性抗癌药物。本发明还公开了上述纳米囊泡的制备方法，是以叶酸封端的聚乙二醇和聚乳酸的两亲性共聚物为原料，采用超声双乳化法包负超顺磁性四氧化三铁纳米粒子和亲水性抗癌药物制得纳米囊泡。该囊泡能够进一步提高药物的释放效率和局部浓度、降低药物的使用剂量和毒副作用等，并具备优异的磁共振显像特性，在癌症的治疗和早期诊断领域有着重大的研究价值和应用前景。

Description

一种磁性肿瘤靶向聚合物纳米囊泡及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型药物载体——磁性肿瘤靶向聚合物纳米囊泡及其制备方法，属高分子化学和生物医学工程领域。

背景技术

癌症是危害人类健康的最主要疾病之一，在中国59种癌症发病率在1981至2000的20年间升高了约45％，发病率达到245人/10万人，在2006年癌症已成为我国城乡居民的第一位死因。发展更加有效的癌症治疗手段对促进国人健康具有重大意义。

抗癌药物化疗是除手术以外最重要的癌症治疗手段，然而直接施药在肿瘤化疗上存在着难以克服的缺点：体内循环的半衰期过短；对肌体的健康组织及细胞具有很强的毒副作用；容易产生肌体内免疫排斥反应而使药物降低甚至失去疗效。目前来看，采用高效药物载体负载、通过实现抗癌药物的靶向控释来大幅度提高疗效减少副作用是最佳的解决方法之一。

在高效药物载体中，脂质体囊泡作为一种生物膜载药模型，历来是重点的研究方向之一并已部分地应用于临床，但其具有靶向性差和无法实现可控释放的致命缺陷。因此，由两亲性嵌段共聚物发展出来的新型纳米囊泡正在逐步兴起并开始取代脂质体成为研究和应用的焦点模型。不过，当前以药物靶向传输为目的设计的囊泡结构聚合物纳米粒子，其相关报道还是少之又少。

双亲分子由于其特殊的溶解性质在溶液中会自发集成为分子有序结构，其中一种表现为双层构型。当这些双层弯曲并封闭起来时就形成了一种新的构型。如果这些双亲分子是天然表面活性剂卵磷脂，形成的结构就称为脂质体；若是合成表面活性剂组，则称之为囊泡。其所用原料与胶束基本相同。

该结构类似于细胞，包括水相内核和疏水性外壳两部分，可以用来进行细胞膜的生物模拟、药物的封装及输送等等。相对于胶束，囊泡同样易功能化，其疏水性外壳亦可包负疏水性物质(包括药物)，但是其独具的水相内核却能够使其再包负亲水性药物，对于负载缩氨酸、蛋白质、低聚核苷酸和DNA等亲水性生物大分子进入细胞内部尤其有利，而且药物的内部包裹还可避免类似胶束表面的初期释放。此外，纳米级的聚合物微粒通过提高渗透性和持久性也可被动地在实体瘤中实现富集。

尽管如此，要实现良好的肿瘤靶向性仍然需要在材料和结构上进行改进。众所周知，实现活性肿瘤靶向的方法之一是用能够识别癌细胞膜上特定分子信号的特殊配体来修饰载体外层。目前，这类配体主要包括叶酸、缩氨酸(如环状五肽cRGD)、铁传递蛋白和某些抗体。该方法尽管能够显著提高细胞粘附力和细胞对胶束的吸收，但无法引导纳米微粒主动向肿瘤部位聚集。可以设想，如果在进入静脉后附加某些外力(如一定的外部磁场)作用，载体微粒就可以被有效地控制并导向肿瘤组织，从而大大提高药物传输的效果。

应用磁性纳米粒子进行肿瘤靶向化学疗法自上世纪七十年代起已整整持续繁荣了三十多年，个别研究甚至已经发展到了临床试验阶段。然而，在用作磁共振显像(可简写为MRI)造影剂时，粒子磁性偏弱、药物负载率低、释放效果差和粒径不易精确控制等主要问题尚待解决。因而需要更多地采用新技术和新方法来发展更为先进的功能化磁性载体。如前所述，聚合物纳米胶束和囊泡正是两种最为适宜的药物传输载体。不过迄今为止，强磁靶向囊泡的相关研究尚未开展。本发明中磁性肿瘤靶向聚合物纳米囊泡的研究得到了国家自然科学基金委海外青年学者合作研究基金(原杰出青年基金B，20728403)的支持。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有载药体系的不足，提供一种磁性肿瘤靶向聚合物纳米囊泡。

本发明的另一目的是提供上述纳米囊泡的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种磁性肿瘤靶向聚合物纳米囊泡，由以下组分制成：5～20份叶酸封端的聚乙二醇和聚乳酸的两亲性共聚物，1份超顺磁性纳米粒子，1份亲水性抗癌药物。

所述的叶酸封端的聚乙二醇和聚乳酸的两亲性共聚物的结构中，聚乙二醇段的数均分子量为1.0～1.35KD，聚乳酸段的数均分子量分别为10～16.5KD。

所述超顺磁性纳米粒子是超顺磁性四氧化三铁纳米粒子。

所述超顺磁性四氧化三铁纳米粒子是亲水性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子或疏水性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子。

所述亲水性抗癌药物为盐酸阿霉素或吉西他滨。

本发明所设计的纳米囊泡由聚乙二醇(Polyethyeneglycol，可简写为PEG)与聚乳酸(poly(D，L-lactic acid)，可简写为PDLLA)的两亲性共聚物制成，末梢接有靶向配体分子——叶酸(folate，该共聚物即可简写为folate-PEG-PLA)。其中疏水的PDLLA段具有良好的链柔顺性、生物相容性和生物可降解性；亲水的PEG段能够延长整个药物载体的血液循环时间，以避免被网状内皮组织系统排泄出去。在自组装过程中，PDLLA段自发地形成囊泡的疏水性外壳，PEG段位于该壳的内外表面，其内部封闭的水相则含有亲水性抗癌药物(如质子化阿霉素，即盐酸阿霉素，hydrochloric doxorubicin，可简写为DOX，或吉西他滨等)和超顺磁性四氧化三铁纳米粒子(Super-paramagnetic Ironic Oxide，可简写为SPIO)，因此通过外磁场的磁导向和囊泡表面叶酸配体分子的化学识别实现了胶束的肿瘤靶向功能。

本发明纳米囊泡的制备方法是：以叶酸封端的聚乙二醇和聚乳酸的两亲性共聚物为原料，通过两次超声乳化来包负SPIO和亲水性抗癌药物，从而制得纳米载药囊泡。

所述以叶酸封端的聚乙二醇和聚乳酸的两亲性共聚物制备方法如下：采用活性阴离子聚合、以丙烯醇化钾为引发剂合成烯丙基封端的PEG，并由此在辛酸亚锡的催化下引发单体丙交酯的开环聚合制成烯丙基封端的PEG-PDLLA(可简写为allyl-PEG-PDLLA)，再通过还原反应将聚合物末端的烯丙基转化为氨基，然后在氨基处接上肿瘤靶向配体——叶酸，制得最终产物叶酸封端的聚乙二醇和聚乳酸的两亲性共聚物folate-PEG-PDLLA。

制备包负疏水性SPIO和亲水性抗癌药物的聚合物纳米囊泡的具体方法如下：将5～10份共聚物与1份疏水性SPIO纳米粒子共溶于10体积的氯仿中，在超声作用下于冰浴中滴加1体积含1份亲水性抗癌药物的水溶液，然后将该乳化液在超声作用下分散至200体积0.5％聚乙烯醇水溶液中，静置后旋转蒸发除去溶剂氯仿，再经透析除去未包裹的抗癌药物及多余的聚乙烯醇，即得。

制备包负亲水性SPIO纳米粒子和亲水性抗癌药物的聚合物纳米囊泡的具体方法如下：将5～10份共聚物溶于10体积的氯仿中，在超声作用下于冰浴中滴加1体积含1份亲水性抗癌药物和1份亲水性SPIO纳米粒子的水溶液，然后将该乳化液在超声作用下分散至200体积0.5％聚乙烯醇水溶液中，静置后旋转蒸发除去溶剂氯仿，再经透析除去未包裹的抗癌药物及多余的聚乙烯醇，即得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)该囊泡由聚乙二醇与聚乳酸的两亲性共聚物制成，PEG作为亲水段能够延长载药囊泡的血液循环时间，而聚乳酸作为疏水段则具有合适的链柔顺度和优良的生物活性；(2)该囊泡的平均粒径仅为240至275nm，有利于囊泡在人体内的细胞吸收和被动聚集；(3)该囊泡能够同时在水相内腔和疏水性外膜中包负相应的亲疏水性物质；(4)该纳米囊泡能够在PEG末端靶向配体的引导下实现药物的肿瘤靶向效果、提高药物的释放效率和局部浓度，并降低药物的使用剂量和毒副作用等；(5)亲疏水性SPIO被包负进该纳米囊泡后能够显著提高磁共振显像特性，其中包负疏水性SPIO纳米粒子囊泡的磁共振响应性是未被包裹的亲水性SPIO纳米粒子的5倍，包负亲水性SPIO纳米粒子囊泡的磁共振响应性是未被包裹的亲水性SPIO纳米粒子的近7倍，均大大优于临床上用作T₂显像试剂的

附图说明

图1和图2分别是是实施例2中6nm疏水性SPIO粒子和6nm亲水性SPIO粒子的透射电子显微镜图片。其中，SPIO纳米粒均为球形，大小均匀且分布很窄，但由于粒子表面带有四甲基胺11-氨基癸酸表面活性剂分子，相同粒径下的亲水性SPIO比疏水性SPIO略大。

图3、图4和图5分别是实施例3中空白聚合物囊泡、疏水性囊泡(疏水性SPIO负载于囊泡外膜中，可简写为M-vesicle)与亲水性囊泡(亲水性SPIO负载于囊泡水相内腔中，可简写为C-vesicle)的透射电子显微镜图片。图6、图7与图8则分别为图3、图4和图5中对应囊泡的动态光散射柱状图。其中，从透射电子显微镜图片可以明显地看出两亲性聚合物在水溶液中自组装成具有中心膜壁的“空心球”，囊泡的膜壁大约有20nm，在亲疏水作用下疏水性和亲水性SPIO分别包负于囊泡的外膜和内腔且亲水性SPIO发生了聚集；从动态光散射柱状图可以得出，空白聚合物纳米囊泡的粒径为240～260nm，但由于疏水性SPIO的负载增大了囊泡外膜的厚度，M-vesicle的粒径为255～275nm，而C-vesicle的平均粒径为245～255nm。

图9、图10、图11和图12分别是实施例3中空白聚合物囊泡、空白聚合物囊泡局部放大、M-vesicle与C-vesicle的扫描电子显微镜图片。其中，绝大部分聚合物囊泡为大小均匀的光滑球体，一部分囊泡被破坏表现出中空的球体结构。

图13、图14、图15和图16分别是实施例3中在300K和10K下测量的M-vesicle、C-vesicle、6nm疏水性SPIO和6nm亲水性SPIO的磁滞回线。

图17是实施例4中负载DOX的纳米囊泡的荧光图片。其中，质子化DOX因具有荧光性而显像，密集的荧光点也显示质子化DOX被成功地包负于聚合物囊泡的水相内腔中。

图18是实施例4中M-vesicle和C-vesicle的X-射线衍射图。其中，所有的晶面信息都符合文献中报道的有关Fe₃O₄的结晶结构，即SPIO的性质在包负前后未发生任何改变。

图19、图20、图21和图22分别是实施例5中不同环境中培养的KB细胞在经普鲁士蓝染色后的荧光显微图片：叶酸修饰(图19)和非叶酸修饰(图20)的M-vesicle及叶酸修饰(图21)和非叶酸修饰(图22)的C-vesicle。其中，KB细胞的吸收完全受叶酸靶向分子控制。

图23、图24、图25和图26是实施例5中不同环境中培养的KB细胞的DOX荧光显微图片：叶酸修饰(图23)和非叶酸修饰(图24)的M-vesicle及叶酸修饰(图25)和非叶酸修饰(图26)的C-vesicle。其中，KB细胞的吸收完全受叶酸靶向分子控制。

图27是实施例6中6nm SPIO与分别包负疏水性和亲水性SPIO的聚合物纳米囊泡的T2驰豫率-铁离子浓度函数关系图。以T2为权重的显像通过下列参数获得：TR/TE，5,000/100ms；FOV，150mm；matrix，256×256；slice thickness，1.5mm。其中，未包裹的亲水性SPIO的r₂值为43.8mM^-1s^-1；当其被包裹在囊泡内腔时，随着SPIO的聚集团簇，r₂值增加了近7倍达到280.2mM^-1s^-1；当疏水性SPIO负载在囊泡外膜上时，测得的r₂值增加了5倍达到204.2mM^-1s^-1，远大于临床上用作T2显像试剂的

(82Fe mM^-1s^-1)。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

本发明基于叶酸修饰的两亲性共聚物folate-PEG-PDLLA的磁性肿瘤靶向纳米囊泡被用于负载SPIO和传输亲水性抗癌药物，所得囊泡的大小、形态和磁性强弱等基本性能分别采用动态光散射、透射电子显微镜和磁强计来测定，其对SPIO和亲水性抗癌药物包负能力的大小则采用紫外可见分光光度计、荧光显微镜和偏振塞曼原子吸收光谱来进行验证，并通过体外吸收试验来检测该纳米载药囊泡体系的靶向治疗效果。

此外，该囊泡还通过细胞实验来评价这一潜在的、可定向传输抗癌药物到肿瘤细胞的双靶向体系，即采用人类口腔的鳞状癌细胞株(human squamouscarcinoma cell line，可简写为KB cells)来进行体外的细胞毒性实验，以分别测定叶酸配体和磁场作用下叶酸功能化并负载SPIO与抗癌药物的囊泡(如包附SPIO和DOX可简写为SPIO-DOX-vesicles)的细胞毒性。

实施例1

叶酸修饰的聚合物纳米囊泡载体材料folate-PEG-PDLLA的制备

1.1 烯丙基封端的PEG均聚物的制备：

该聚合物以醇化钾为引发剂，通过环氧乙烷的连续相阴离子开环聚合反应得到。首先，将4ml萘基钾的四氢呋喃溶液与1.5～2.5ml丙烯醇混合均匀后在干燥的反应瓶中搅拌15分钟。然后在氩气保护下加入20ml无水四氢呋喃和18-冠醚-6的四氢呋喃溶液(含1.5g18-冠醚-6和5ml无水四氢呋喃)，搅拌15分钟后将混合物置于冰盐浴中冷却，并缓慢通入一定量的干燥环氧乙烷，维持低温24小时以使聚合反应持续进行。最后在室温下放置至少3天，以利于环氧乙烷的完全转化。

1.2 烯丙基封端的allyl-PEG-PDLLA两亲性嵌段共聚物的制备：

氩气保护下将0.2g烯丙基PEG(分子量在1.0～1.5Kg/mol)在45℃左右真空干燥数小时后冷却至室温，然后注入1.6～2.4g干燥的ε-己内酯或丙交酯和少量辛酸亚锡。室温下真空干燥一小时后加入无水甲苯20ml，在120℃回流10小时聚合。反应结束后，在无水乙醚中进行重沉淀，过滤后再用二氯甲烷溶解，于无水乙醚中进行二次重沉淀，经过滤和真空干燥得到纯样品。

1.3 将allyl-PEG-PDLLA末端的烯丙基转化为氨基：

该方法通过2-氨基乙硫醇盐酸盐的基团加成反应来使allyl-PEG-PDLLA末端的烯丙基转化为氨基。称取200mg allyl-PEG-PDLLA溶解于2ml四氢呋喃中，待溶解后在超声作用下加入到40ml蒸馏水中，过夜挥发四氢呋喃，然后通氮气鼓泡除去溶液中的氧气，并在氮气流下加入200mg氨基硫醇和5mg过二硫酸钾，在50℃下反应5小时。待反应完成后，透析除去未反应的硫醇及过二硫酸钾，最后冷冻干燥。

1.4 叶酸修饰的PEG-PDLLA两亲性嵌段共聚物的制备：

叶酸首先用N-羟基琥珀酰亚胺活化。具体地，将0.2～0.5g叶酸与0.5～0.9gN-羟基琥珀酰亚胺(可简写为NHS)和0.2～0.5g二环己基碳二亚胺(可简写为DCC)(叶酸、NHS与DCC的最佳摩尔比为1:1:2)溶于20ml无水二甲基亚砜(可简写为DMSO)，在氩气保护下室温反应一夜，再过滤除去副产物1，3-二环己基脲。另将0.1～0.4g端氨基PEG-PDLLA溶于5～10ml无水DMSO，然后先用三乙胺调节PH值至9.5，再滴加活化的叶酸溶液3～5ml，室温避光过夜反应。反应完成后将反应液转入透析袋中除去溶剂DMSO、三乙胺及叶酸等。冷冻干燥后溶于氯仿，经过滤、沉淀、干燥将样品进行纯化。

实施例2

磁性肿瘤靶向聚合物纳米载药囊泡的制备

2.1 超顺磁性四氧化三铁SPIO纳米粒子的制备

首先，将0.7g乙酰丙酮铁、2.9g 1，2-十六烷二醇、2ml油酸、2ml油胺和20ml二苄醚在氮气保护下混合均匀后于200℃加热两小时，然后升温至300℃回流一小时。待所得黑色产物冷却到室温再在乙醇中进行重沉淀，离心除去多余溶剂后溶解在正己烷中密封保存，得到疏水性SPIO样品溶液。

将上述制得的疏水性SPIO的正已烷溶液与三到五倍的四甲基胺11-氨基癸酸的二氯甲烷溶液混合并在室温下振荡24小时，然后用磁铁从溶液中分离出沉淀物，再用二氯甲烷洗涤两次并用磁铁分离。最后，经氮气流下干燥分散在去离子水中制得亲水性SPIO。

所得SPIO纳米粒子通过透射电子显微镜进行了观察、测定，测试结果见图1和图2，其中，SPIO纳米粒均为球形，大小均匀且分布很窄，但由于粒子表面带有四甲基胺11-氨基癸酸表面活性剂分子，相同粒径下的亲水性SPIO比疏水性SPIO略大。

2.2 磁性肿瘤靶向聚合物纳米载药囊泡的制备

疏水性或亲水性SPIO和亲水性抗癌药物是采用超声双乳化法包负在囊泡中的。

将10mg共聚物(allyl-PEG-PDLLA或folate-PEG-PDLLA)与2mg疏水性SPIO共溶于2ml氯仿中，在超声作用下于冰浴中滴加0.2ml DOX水溶液(含DOX 2mg)，然后所得初次乳化液在超声作用下分散于40ml 0.5％聚乙烯醇水溶液中。稍静置后旋转蒸发除去溶剂氯仿，再经透析除去未包裹的DOX及多余的聚乙烯醇，最后所得溶液用0.22μm微孔膜过滤。

包负亲水性SPIO囊泡样品的制备与包负疏水性SPIO囊泡样品的制备类似。具体地，将10mg共聚物(allyl-PEG-PDLLA或folate-PEG-PDLLA)溶于2ml氯仿中，在超声作用下于冰浴中滴加0.2ml混合水溶液(含DOX 2mg和亲水性SPIO 10mg)，得到初次乳化液。其余操作与与制备包负疏水性SPIO囊泡的操作相同。

实施例3

磁性肿瘤靶向聚合物纳米载药囊泡基本性能的测试

3.1 磁性肿瘤靶向聚合物纳米载药囊泡大小及形态的测试

所得囊泡的粒径大小采用动态光散射系统进行测量，其形态则通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜来观察确定，测试结果见图3至12。图6、图7和图8则分别为对应囊泡的动态光散射柱状图，其中，从透射电子显微镜图片可以明显地看出两亲性聚合物在水溶液中自组装成具有中心膜壁的“空心球”，囊泡的膜壁大约有20nm，在亲疏水作用下疏水性和亲水性SPIO分别包负于囊泡的外膜和内腔且亲水性SPIO发生了聚集；从动态光散射柱状图可以得出，空白聚合物纳米囊泡的粒径为240～260nm，但由于疏水性SPIO的负载增大了囊泡外膜的厚度，M-vesicle的粒径为255～275nm，而C-vesicle的平均粒径为245～255nm。图9至12中看出绝大部分聚合物囊泡为大小均匀的光滑球体，一部分囊泡被破坏表现出中空的球体结构。

3.2 磁性肿瘤靶向聚合物纳米载药囊泡磁学性质的测试

所得囊泡的变温磁化率通过磁强计来测量，SPIO和囊泡溶液的磁响应性则通过将一磁铁放置于容器附近来体现，测试结果见图13至16。

实施例4

磁性肿瘤靶向聚合物纳米载药囊泡包负量的测定

4.1 磁性肿瘤靶向聚合物纳米载药囊泡载药量的测定

将一定量冻干样品悬浮于10ml 10％ HCl溶液中，在37℃恒温摇床中摇振以使聚合物囊泡完全破坏并释放出DOX。在用磁铁分离出SPIO粒子后，采用紫外可见分光光度计在最大吸收波长(如DOX为480nm)处测量相应的吸光度，根据吸收强度与浓度的标准曲线可计算出药物的负载量。具体包负情况可通过荧光显微镜来观察，测试结果见图17，图中质子化DOX因具有荧光性而显像，密集的荧光点也显示质子化DOX被成功地包负于聚合物囊泡的水相内腔中。包负前后SPIO结晶结构的对比通过广角X-射线衍射仪进行测定，测试结果见图18，图中，所有的晶面信息都符合文献中报道的有关Fe₃O₄的结晶结构，即SPIO的性质在包负前后未发生任何改变。

4.2 磁性肿瘤靶向聚合物纳米载药囊泡SPIO包负量的测定

将一定量冻干样品悬浮于1M HCl溶液中，在37℃恒温摇床中摇振以使聚合物囊泡完全降解并使SPIO完全溶解，采用偏振塞曼原子吸收光谱(ZeemanAtomic Absorption Spectrophtotometer)检测在248.3nm处铁特征吸收峰相应的吸收强度，根据吸收标准曲线可计算出囊泡中铁的含量。

实施例5

磁性肿瘤靶向聚合物纳米载药囊泡体外吸收试验

将人类口腔的鳞状癌细胞株(可简写为KB cells)以5×10⁵的单位细胞密度植于60mm细胞培养皿内4ml的RPMI-1640培养基上，并补充10％非热敏性牛胎血清，在含5％ CO₂的37℃孵箱中培养24小时。培养皿-1作为对照组仅加入磷酸盐缓冲溶液(可简写为PBS)并定容2ml以供对照。培养皿-2中加入叶酸修饰的SPIO-DOX-vesicle(囊泡内腔包负有亲水性SPIO与DOX)，SPIO终浓度为5ug/ml并定容2ml。培养皿-3中加入非叶酸修饰的SPIO-DOX-vesicle(囊泡内腔包负有亲水性SPIO与DOX)，SPIO终浓度为5ug/ml并定容2ml。培养皿-4中加入叶酸修饰的SPIO-DOX-vesicle(囊泡外膜负载有疏水性SPIO，水相内腔则包负DOX)，SPIO终浓度为5ug/ml并定容2ml。培养皿-5中加入非叶酸修饰的SPIO-DOX-vesicle(囊泡外膜负载有疏水性SPIO，水相内腔则包负DOX)，SPIO终浓度为5ug/ml并定容2ml。

将所有培养皿一起置入含5％ CO2的37℃孵箱中培养1小时后取出并吸弃培养基，用PBS冲洗两次。然后，先加2ml 4％多聚甲醛PBS溶液避光静置30分钟，再加2ml亚铁氰化钾溶液避光静置20分钟，接着用PBS冲洗两次，最后加入5ml 4％多聚甲醛PBS溶液固定并采用倒置荧光显微镜进行检测、观察。测试结果见图19至22和图8。图19至22显示了不同环境中培养的KB细胞在经普鲁士蓝染色后的荧光显微图片：叶酸修饰(图19)和非叶酸修饰(图20)的M-vesicle及叶酸修饰(图21)和非叶酸修饰(图22)的C-vesicle，其中，KB细胞的吸收完全受叶酸靶向分子控制。图23至26显示了不同环境中培养的KB细胞的DOX荧光显微图片：叶酸修饰(图23)和非叶酸修饰(图24)的M-vesicle及叶酸修饰(图25)和非叶酸修饰(图26)的C-vesicle，其中，KB细胞的吸收完全受叶酸靶向分子控制。

实施例6

磁性肿瘤靶向聚合物纳米载药囊泡的磁共振显像检测

密度为1×10⁶数量级的KB细胞，分别与亲水性SPIO、疏水性SPIO、C-vesicle和M-vesicle在Fe离子浓度为3.125，6.25，12.5，25μg/ml RPMI 1640培养基中培养1小时后，经洗涤和胰蛋白化后加入2％琼酯糖溶液，在1.5T MRI扫描仪上进行检测，以得到囊泡样品的T₂驰豫率(r₂)，测试结果见图27，图中看出，以T₂为权重的显像通过下列参数获得：TR/TE，5,000/100ms；FOV，150mm；matrix，256×256；slice thickness，1.5mm。其中，未包裹的亲水性SPIO的r₂值为43.8mM^-1s^-1；当其被包裹在囊泡内腔时，随着SPIO的聚集团簇，r₂值增加了近7倍达到280.2mM^-1s^-1；当疏水性SPIO负载在囊泡外膜上时，测得的r₂值增加了5倍达到204.2mM^-1s^-1，远大于临床上用作T₂显像试剂的

(82Fe mM^-1s^-1)。

以上测试结果表明，所得囊泡的粒径为240～275nm，为中空球体形态，能够成功地包负SPIO和DOX并不改变其性质：疏水性囊泡的SPIO负载率为32～38％(wt％)，DOX的负载率为1.5～21.％(wt％)；亲水性囊泡的SPIO负载率为15～18％(wt％)，DOX的负载率为3.2～4.2.％(wt％)。磁性分析表明，负载SPIO的聚合物纳米囊泡具有迅疾的磁响应性和超顺磁性。体外吸收实验表明，该聚合物纳米载药囊泡具有明显的肿瘤靶向功能，可以提高阿霉素对肿瘤的治疗效果。磁共振显像实验表明，该磁性肿瘤靶向聚合物纳米囊泡的显像特性大大优于目前常用的临床T₂显像试剂

因此，该新型聚合物纳米囊泡具有显著的肿瘤靶向效果和优异的磁共振显像特性，在癌症治疗和早期诊断领域有着重大的研究价值和应用前景。

Claims

1.一种磁性肿瘤靶向聚合物纳米囊泡，其特征在于由以下重量份数的组分制成：5～20份叶酸封端的聚乙二醇和聚乳酸的两亲性共聚物，1份超顺磁性纳米粒子，1份亲水性抗癌药物。

2.如权利要求1所述的纳米囊泡，其特征在于所述叶酸封端的聚乙二醇和聚乳酸的两亲性共聚物的结构中聚乙二醇段的数均分子量为1.0～1.35KD，聚乳酸段的数均分子量分别为10～16.5KD。

3.如权利要求1所述的纳米囊泡，其特征在于所述超顺磁性纳米粒子是超顺磁性四氧化三铁纳米粒子。

4.如权利要求3所述的纳米囊泡，其特征在于所述超顺磁性纳米粒子是亲水性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子或疏水性超顺磁性四氧化三铁纳米粒子。

5.如权利要求1所述的纳米囊泡，其特征在于所述亲水性抗癌药物为盐酸阿霉素或吉西他滨。

6.权利要求1所述的纳米囊泡的制备方法，其特征是以叶酸封端的聚乙二醇和聚乳酸的两亲性共聚物为原料，采用超声双乳化法包负超顺磁性纳米粒子和亲水性抗癌药物来制得纳米载药囊泡。