CN113876964A - 一种肿瘤细胞膜载药体系及其构建方法和应用 - Google Patents

一种肿瘤细胞膜载药体系及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种肿瘤细胞膜载药体系及其构建方法和应用，所述载药体系包括肿瘤细胞膜和连接在所述肿瘤细胞膜表面的多肽药物。因肿瘤细胞膜具有良好生物相容性，能够延长多肽药物在体内的半衰期；肿瘤细胞膜表面能够表达的肿瘤相关性抗原，被巨噬细胞吞噬后能够起到肿瘤疫苗的作用；肿瘤细胞表面还能够表达同质黏附性抗原，使所述载药体系主动靶向到肿瘤部位，实现主动靶向药物递送。同时，将造影剂包裹于肿瘤细胞膜内，利用肿瘤细胞膜对肿瘤部位的主动靶向性，使造影剂在肿瘤部位聚集，浓度增高，从而使肿瘤部位的核磁成像效果增强。因此，所述肿瘤细胞膜载药体系对于实现肿瘤的诊疗一体化具有重要意义。

Description

一种肿瘤细胞膜载药体系及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种肿瘤细胞膜载药体系及其构建方法和应用，尤其涉及一种体内长循环多肽药物的肿瘤细胞膜载药体系及其构建方法和应用。
背景技术
癌症已成为越来越严重的健康问题，免疫治疗成为治疗癌症的有效手段。抗体药物特异性高、敏感度高、稳定性好在免疫治疗中发挥了重要作用，但是具有成本高、批次间差异大、免疫原性高的缺点。
随着生物技术与多肽合成技术的日臻成熟，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。与抗体药物相比，多肽类药物适应症广、成本低、批次间差异小、免疫原性低且疗效显著，目前已广泛应用于肿瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病等疾病的预防、诊断和治疗，具有广阔的开发前景。同时多肽药物分子结构小、易改造、易合成，其生产无需大流程装置，普通大型实验室即可达到生产条件，且生产过程中排放的废物少，属于绿色制药，因此多肽药物是21世纪最有发展前途的药物之一。
虽然多肽药物具有众多优点，且多肽药物分子量较小，在进入体内后会很快被机体代谢清除，很大程度限制了多肽药物的临床应用。目前，为了提高多肽药物的利用率，延长其半衰期，研究人员利用生物相容性可降解材料(例如高分子材料)包裹药物活性成分，制成微球制剂，通过可降解的生物高分子材料在体内逐步降解来控制药物释放，维持有效的血药浓度。
CN102688198A公开了一种多肽药物缓释微球制剂及其制备方法，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚乳酸和保护剂、多肽药物共同溶解在有机溶剂中，形成完全均一的混合溶液，混合溶液加入到油相形成乳液。除去有机溶剂，离心洗涤，冷冻干燥，即得多肽药物缓释微球。生物活性多肽药物通过微球表面孔隙和随着微球的聚合物材料在体内降解缓慢释放出来，释放时间可长达数周至数月，体外释放试验结果表明释放符合近似零级释放。虽然多肽药物被制成缓释微球制剂，但是其口服生物利用度依然很低，以致不能产生足够高的有效血药浓度。
然而，皮下注射多肽药物时，由于体内蛋白酶的存在，药物在体内的半衰期很短，需要频繁注，会增加了患者的痛苦，降低患者依从性。
因此，寻找一种合适的多肽药物体内运输体系对其应用具有重要意义。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种肿瘤细胞膜载药体系及其构建方法和应用，该体系能够延长多肽药物在体内的半衰期，靶向肿瘤部位，并在肿瘤微环境中智能控制药物释放。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种肿瘤细胞膜载药体系，所述载药体系包括肿瘤细胞膜和连接在所述肿瘤细胞膜表面的多肽药物。
选择肿瘤细胞膜作为多肽药物的载体，一方面因为肿瘤细胞膜具有良好生物相容性，能够延长多肽在体内的半衰期；同时，肿瘤细胞膜表面能够表达的肿瘤相关性抗原，被巨噬细胞吞噬后能够起到肿瘤疫苗的作用；肿瘤细胞表面还能够表达同质黏附性抗原，如TF抗体、E钙黏素和CD47，使肿瘤细胞膜载药体系在荷瘤小鼠体内不仅能够通过EPR效应被动扩散到肿瘤部位，更能够通过肿瘤细胞膜之间同质黏附性抗原的相互作用，主动靶向到肿瘤部位，实现主动靶向药物递送。
作为本发明优选的技术方案，所述载药体系还包括造影剂，所述造影剂包裹于肿瘤细胞膜内。
优选地，所述造影剂包括超顺磁四氧化三铁纳米粒子。
超顺磁四氧化三铁作为一种T2核磁造影剂，可以提高正常和患病部位的成像对比度，更好的对肿瘤进行成像。将超顺磁四氧化三铁纳米粒子包裹在细胞膜内，利用肿瘤细胞膜对肿瘤部位的主动靶向性，使四氧化三铁在荷瘤小鼠的肿瘤部位聚集，浓度增高，从而使肿瘤部位的核磁成像效果增强；同时，由于肿瘤细胞膜的高度生物相容性，可以降低超顺磁四氧化三铁可能对细胞产生的毒副作用，对细胞的增殖有促进作用，且因为细胞膜的包裹，在静脉注射时不会引起溶血效应，不会对小鼠产生伤害。
优选地，所述肿瘤细胞膜和超顺磁四氧化三铁纳米粒子的质量比为(10～1000):1，例如可以是1000:1、800:1、500:1、200:1、150:1、120:1、100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1或20:1等，优选为(20～100):1，进一步优选为20:1。
作为本发明优选的技术方案，所述多肽药物为磷脂化修饰的多肽药物。
优选地，所述多肽药物通过磷脂交换反应连接到肿瘤细胞膜表面。
优选地，所述磷脂化修饰的多肽药物由如下方法制备得到：将多肽药物与磷脂化修饰剂混合反应，透析后冻干得到磷脂化修饰的多肽药物。
优选地，所述磷脂化修饰剂包括DSPE-PEG2000-NHS。
优选地，所述多肽药物与磷脂化修饰剂的摩尔比为1:(1～5)，例如可以是1:1、1:1.2、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5等，优选为1:2。
优选地，所述混合反应的时间为36～60h，例如可以是36h、38h、40h、42h、45h、48h、50h、52h、54h、56h、58h或60h等，优选为48h。
作为本发明优选的技术方案，所述多肽药物包括PD-1/PD-L1通路抑制多肽、PD-1拮抗多肽或KLA杀伤性多肽中的任意一种或至少两种的组合。
该细胞膜载药体系负载的多肽不局限于PD-1/PD-L1通路抑制多肽，可以负载多种功能性多肽，如负载PD-1拮抗多肽，实现PD-1/PD-L1通路的双重阻断作用；负载KLA杀伤性多肽，能够直接杀伤肿瘤细胞；或者多种功能的多肽联合使用，以实现功能互补和强化的作用，使得该载药体系具有更加广阔的应用前景。
优选地，所述PD-1/PD-L1通路抑制多肽包括多肽序列SGQYASYHCWCWRDPGRSGGSK(记为TPP1)。
本发明中，使用TPP1多肽作为模型多肽研究载药体系的效果。TPP1多肽能够和PD-1竞争，特异性结合PD-L1，阻断PD-1/PD-L1通路从而重新，激活肿瘤微环境中的T细胞，达到杀伤肿瘤细胞的效果。
优选地，所述多肽药物还包括基质金属蛋白酶的底物。基质金属蛋白酶(matrixmetallo proteinases，MMPs)中MMP2、MMP9能够分解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原蛋白，两者的过度表达与恶性肿瘤的浸润、转移有关。过表达的MMP2在许多癌症的诊断与预测中被认为生物标志物，这也为肿瘤靶向药物递送体系提供了一条酶引发控释的策略。
本发明中，利用MMP2酶的底物多肽序列连接TPP1多肽和肿瘤细胞膜，再将超顺磁四氧化三铁纳米粒子包裹在肿瘤细胞膜内，构建诊疗一体化的肿瘤细胞膜负载多肽的载药体系。
优选地，所述基质金属蛋白酶的底物包括多肽序列PLGLLG。
利用PLGLLG能被肿瘤微环境中过表达的MMP2酶识别的特点，确保载药体系在体内的肿瘤靶点部位释放TPP1多肽，从而减少TPP1多肽在外周血中的消耗，提高TPP1多肽在肿瘤微环境中的浓度，更好的发挥多肽的抗肿瘤作用。
需要说明的是，上述实施方式中提及的肿瘤细胞、可被肿瘤微环境特异性裂解多肽是彼此对应的，例如对应本实施方式中可被肿瘤微环境识别的响应性多肽为MMP2响应肽PLGLLG，而在其他的实施例中，肿瘤细胞和靶向多肽以及响应性多肽可以替换为彼此特异性结合的任何组合。
优选地，所述多肽药物包括多肽序列SGQYASYHCWCWRDPGRSGGSPLGLLGGGGSK(记为MMP2-TPP1)。
其中，PLGLLG作为酶的底物序列，在肿瘤发生部位会被识别切断，帮助TPP1多肽释放，并不会影响TPP1序列的功能。
优选地，所述多肽药物采用固相合成法合成。本发明中，将TPP1多肽和MMP2底物多肽通过固相合成技术制备，然后用磷脂酰乙醇胺聚乙二醇对多肽进行了磷脂化修饰，利用细胞膜磷脂双分子层的流动性，将磷脂化的多肽通过磷脂交换反应连接到细胞膜载体上，这种方法对细胞膜的伤害最小，同时将多肽高效的连接到细胞膜表面。
作为本发明优选的技术方案，所述肿瘤细胞膜由如下方法制备得到：收集肿瘤细胞后用胰蛋白酶消化，再经过低渗处理和冰浴超声，而后破碎所述肿瘤细胞，得到肿瘤细胞膜。使用该制备方法能够保证制备出较纯的肿瘤细胞膜，在排除内容物的同时保留细胞膜蛋白。同时，通过超声破碎将细胞膜纳米化，可以借助EPR效应穿过肿瘤新生血管，将多肽运载到肿瘤部位。
优选地，所述低渗处理的温度为0～5℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃、4℃或5℃等，时间为0.5～5h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h或5h等。优选地，所述低渗处理的温度为4℃，时间为1h。
优选地，所述冰浴超声的时间为20～40min，例如可以是20min、22min、24min、26min、28min、30min、32min、34min、36min、38min或40min等。
优选地，所述破碎的方法为超声破碎。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的载药体系的构建方法，包括如下步骤：将肿瘤细胞膜与磷脂化修饰的多肽药物混合，振荡孵育，再经过超声破碎和超滤除去游离的多肽药物，得到所述载药体系。
作为本发明优选的技术方案，所述肿瘤细胞膜的质量浓度为1～5mg/mL，例如可以是1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL或5mg/mL等，优选为2mg/mL、
优选地，所述多肽药物的质量浓度为15～20μg/mL，例如可以是15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL或20μg/mL等，优选为16μg/mL。
优选地，所述振荡孵育的温度为35～38℃，例如可以是35℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃等，优选为37℃、
优选地，所述振荡孵育的时间为0.8～4h，例如可以是0.8h、1h、1.2h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h或4h等，优选为1h。
优选地，所述超声破碎的时间为2～5min，例如可以是2min、2.5min、3min、3.5min、4min、4.5min或5min等。
优选地，所述超滤时超滤管的孔径大小为200～400kDa，例如可以是200kDa、220kDa、250kDa、280kDa、300kDa、320kDa、350kDa、380kDa或400kDa等，优选为300kDa。
作为本发明优选的技术方案，所述制备方法还包括将连接多肽药物的肿瘤细胞膜与超顺磁四氧化三铁纳米粒子混合孵育的操作。
优选地，所述混合孵育的时间为20～40min，例如可以是20min、25min、28min、30min、32min、34min、35min或40min等。
优选地，所述混合孵育的温度为0～5℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃、4℃或5℃等，优选为4℃。
优选地，所述混合孵育后还包括冰浴超声、破碎和超滤的操作。
作为本发明优选的技术方案，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将肿瘤细胞膜与磷脂化修饰的多肽药物混合，所述肿瘤细胞膜的质量浓度为1～5mg/mL，所述多肽药物的质量浓度为15～20μg/mL，35～38℃下振荡孵育0.8～4h，再经过超声破碎2～5min和200～400kDa超滤管超滤，除去游离的多肽药物，得到连接多肽药物的肿瘤细胞膜；
其中，所述肿瘤细胞膜的制备方法为：收集肿瘤细胞后用胰蛋白酶消化，在0～5℃下经过低渗处理0.5～5h，而后冰浴超声20～40min，再超声破碎所述肿瘤细胞，得到肿瘤细胞膜；
所述磷脂化修饰的多肽药物的制备方法为：将多肽药物与磷脂化修饰剂混合反应，透析后冻干得到磷脂化修饰的多肽药物，所述多肽药物与磷脂化修饰剂的摩尔比为1:(1～5)；
(2)将步骤(1)得到的肿瘤细胞膜与超顺磁四氧化三铁纳米粒子在0～5℃下混合孵育20～40min，而后冰浴超声20～40min，再经过超声破碎2～5min和200～400kDa超滤管超滤，除去游离的超顺磁四氧化三铁纳米粒子，得到所述肿瘤细胞膜载药体系。
示例性的，所述肿瘤细胞膜载药体系可采用如下方法进行制备：
(1)制备肿瘤细胞膜；
将H460细胞培养于含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素与链霉素)RPMI-1640完全培养基中，在37℃5％CO2的细胞培养箱中培养至细胞密度达到80％-90％。
用PBS清洗，用含2mM的EDTA的PBS稀释4倍的胰蛋白酶消化，300g离心，用PBS清洗两遍，收集细胞重悬于含蛋白酶抑制剂的低渗缓冲液(缓冲液包括20mM pH为7.5的Tris-HCl缓冲液，10mM KCl，2mM MgCl2和100×蛋白酶抑制剂)中处理一段时间后，冰浴超声，再使用超声细胞破碎仪超声，使细胞破碎，离心弃去沉淀，上清再经高速离心，收获细胞膜沉淀；
其中，选择4℃低渗处理1h，冰浴超声30min，超声细胞破碎仪超声3min，20000g离心20min，弃去沉淀，上清100000g 4℃超速离心1h，收获得到的细胞膜较为纯净。
同时，可根据需要用适当体积的PBS溶液重悬细胞膜沉淀，经过细胞超声破碎仪超声5min，使细胞膜粒径纳米化以进行后续试验。
(2)制备磷脂化修饰的多肽药物
利用固相合成法合成目的多肽，为了将多肽通过磷脂交换连接到肿瘤细胞膜表面，利用亲核取代反应将DSPE-PEG2000-NHS偶联在多肽上，对多肽进行磷脂化修饰。
取FITC-TPP1荧光多肽溶于DMF中，再取DSPE-PEG2000-NHS溶于DMF中，将两者混合于棕色玻璃样品瓶中，加入TEA调节pH为8.0，室温避光条件下用磁力搅拌反应48h；
取反应液于截留分子量为3500Da的透析袋中，以去离子水作为透析外液，避光透析48h，去除游离的多肽和反应溶剂DMF，冻干得到磷脂化修饰的多肽药物FITC-TPP1-PEG2000-DSPE。
(3)磷脂交换连接多肽和细胞膜
细胞膜表面的磷脂双分子层处于流动状态，可以将亲脂性分子额外的加到细胞膜表面进行修饰。
在含有浓度为2mg/mL H460细胞膜的PBS悬液中加入磷脂化修饰的多肽药物FITC-TPP1-PEG2000-DSPE，37℃分别振荡孵育1h，细胞超声破碎仪破碎3min(3s/3s，on/off，30％功率)，300kDa超滤管超滤，除去游离的荧光多肽分子，重悬即得到表面连接多肽药物的肿瘤细胞膜。
(4)包裹超顺磁四氧化三铁Fe3O4纳米粒子
将连接有多肽药物的肿瘤细胞膜重悬于低渗缓冲液中，按细胞膜和Fe3O4为20:1的质量比混合，4℃80rpm旋转孵育30min，冰浴超声30min，超声细胞破碎仪破碎1min，300KD超滤管超滤，除去未包裹的Fe3O4，得到本发明所述的肿瘤细胞膜载药体系。
第三方面，如第一方面所述的肿瘤细胞膜载药体系在制备肿瘤药物或造影剂中的应用。
本发明所述的肿瘤细胞膜载药体系能够明显延长多肽药物循环半衰期，且利用其制备的肿瘤药物能够主动靶向肿瘤位点，提高治疗效果；利用其制备的造影剂能够在治疗的同时反应肿瘤部位的情况，方便对肿瘤药物进行筛选。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供一种肿瘤细胞膜载药体系，利用肿瘤细胞膜作为多肽的运载体系，该体系能够显著延长多肽半衰期，以TPP1为例，游离多肽在体内的半衰期只有不到10分钟的时间，而细胞膜负载的荧光多肽在体内的半衰期可以延长至近6个小时；同时，该载药体系负载的多肽不局限于TPP1多肽，可以负载多种功能性多肽或者负载多种不同功能的多肽，以实现功能互补和强化的作用，使得该载药体系具有更加广阔的应用前景；
(2)本发明采用肿瘤细胞膜作为载体，由于肿瘤细胞膜来源于生物体本身，具有良好的生物相容性，不引入其他有机或有害物质，作为体内载药体系能够保证其安全性；同时，能够对同种的肿瘤细胞具有主动靶向的作用，实现主动靶向的药物递送；
(3)本发明提供的肿瘤细胞膜载药体系还能够负载造影剂，将造影剂包裹在细胞膜内，利用肿瘤细胞膜对肿瘤部位的主动靶向性，使造影剂在肿瘤部位聚集，浓度增高，从而使肿瘤部位的核磁成像效果增强；同时，由于肿瘤细胞膜的高度生物相容性，可以降低造影剂可能对细胞产生的毒副作用，对细胞的增殖有促进作用，且因为细胞膜的包裹，在静脉注射时不会引起溶血效应，不会对人体产生伤害；同时，使用多肽药物、造影剂以及肿瘤细胞膜的载药体系将治疗与造影结合，实现了肿瘤的诊疗一体化，能够减少肿瘤患者在治疗时程序和不适，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的包裹超顺磁四氧化三铁的肿瘤细胞膜负载TPP1多肽药物的工作示意图；
其中，1为带荧光标记的多肽药物；2为肿瘤细胞膜；3为基质金属蛋白酶；4为超顺磁四氧化三铁纳米粒子；5为T细胞表面受体；6为抗体；7为PD-1；8为PD-L1。
图2(a)为实施例1中肿瘤细胞膜和细胞裂解液的SDS-PAGE检测图。
图2(b)为实施例1中肿瘤细胞膜和细胞裂解液在蛋白水平上的检测胶图。
图2(c)为实施例1中肿瘤细胞膜和细胞裂解液在核酸水平上的检测胶图。
图2(d)为实施例1中肿瘤细胞膜和细胞裂解液经SYBR染色后的DNA荧光强度图。
图3为实施例1中流式细胞仪检测荧光多肽连接到细胞膜表面时的荧光偏移率曲线。
图4(a)为肿瘤细胞膜和Fe3O4的质量比与载药体系的粒径变化图。
图4(b)为细胞膜载药体系在第0天和第7天时的粒径大小柱状图。
图5为实施例1中通过透射电子显微镜(TEM)检测肿瘤细胞膜包裹Fe3O4后的显微图(标尺100nm)。
图6(a)为实施例2中不同浓度的Fe3O4的在磁共振分析仪中的成像图。
图6(b)为实施例2中不同浓度的细胞膜载药体系的在磁共振分析仪中的成像图。
图6(c)为实施例2中Fe3O4和细胞膜载药体系的r2随浓度变化曲线图。
图7为实施例3中Fe3O4和细胞膜载药体系的浓度与细胞活力柱状图。
图8为实施例4中细胞膜载药体系的血液相容性检测图。
图9(a)为实施例5中各实验组的IFN-γ分泌量柱状图。
图9(b)为实施例5中各实验组的细胞活力柱状图。
图10(a)为实施例6中多肽药物TPP1的体内半衰期检测曲线图。
图10(b)为实施例6中细胞膜载药体系上TPP1的体内半衰期检测曲线图。
图11(a)为实施例7中皮下注射细胞膜载药体系后体内总荧光量柱状图。
图11(b)为实施例7中静脉注射细胞膜载药体系后体内总荧光量柱状图。
图11(c)为实施例7中经瘤旁注射各实验组小鼠的肿瘤体积大小变化曲线图。
图11(d)为实施例7中经尾静脉注射各实验组小鼠的肿瘤体积大小变化曲线图。
图11(e)为实施例7中经瘤旁注射各实验组小鼠的体重变化曲线图。
图11(f)为实施例7中经尾静脉注射各实验组小鼠的体重变化曲线图。
图12为实施例8中肿瘤细胞膜载药体系在体内的核磁成像图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
首先结合图1，介绍本发明中所述肿瘤细胞膜载药体系的工作原理：
制备好的肿瘤细胞膜载药体系包括带荧光标记的多肽药物1和肿瘤细胞膜2，多肽药物1连接在肿瘤细胞膜2表面，且肿瘤细胞膜2内部包含超顺磁四氧化三铁纳米粒子4，所述肿瘤细胞膜载药体系进入体内后，主动靶向至肿瘤部位，基质金属蛋白酶3作用于多肽药物1，使其从肿瘤细胞膜2表面脱落；假设多肽药物为TPP1，则游离的多肽药物能够特异性的阻断PD-1蛋白7及其配体PD-L1蛋白8之间的相互作用，却无法阻断T细胞表面受体5与肿瘤细胞表面抗体6的相互作用。
实施例1
本实施例提供一种肿瘤细胞膜载药体系，其制备方法包括如下步骤：
1、制备肿瘤细胞膜
将H460细胞培养于含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素与链霉素)RPMI-1640完全培养基中，在37℃5％CO2的细胞培养箱中培养至细胞密度达到80％。
用PBS清洗两遍，用含2mM的EDTA的PBS稀释4倍的胰蛋白酶消化，300g离心，用PBS清洗两遍，收集细胞重悬于含蛋白酶抑制剂的低渗缓冲液中，4℃80rpm转动1h，冰浴超声30min，超声细胞破碎仪超声3min使细胞破碎，20000g离心20min，弃去沉淀，上清4℃100000g离心1h，收获细胞膜沉淀。再使用PBS溶液重悬，经细胞超声破碎仪超声5min，使细胞膜粒径纳米化以进行后续试验。
通过SDS-PAGE电泳(如图2(a)所示)检测分离得到的肿瘤细胞膜和细胞裂解液(lysis)相比没有明显的蛋白缺失。
然后，分别从蛋白水平和核酸水平对细胞膜的纯度进行检测。
在蛋白水平上(如图2(b)所示)，细胞膜相比于细胞裂解液，基本不含肌动蛋白(actin)，而PD-L1水平相当；核酸水平上，细胞膜和细胞裂解液中均未检测到DNA条带(如图2(c)所示)，而使用酶标仪检测SYBR染色后的DNA荧光强度，由图2(d)所示，肿瘤细胞膜相比于细胞裂解液基本不含核酸。
结果表明通过上述步骤制备得到的肿瘤细胞膜在保留了膜蛋白的同时，去除了骨架蛋白和核酸，细胞膜较纯净。
2、多肽药物的磷脂化修饰
(1)多肽序列设计
多肽序列SGQYASYHCWCWRDPGRSGGSK能够阻断PD-1/PD-L1通路；
为了在肿瘤部位实现多肽序列对MMP2酶的响应性，在多肽的序列中引入MMP2酶底物片段PLGLLG；
最终构建得到的多肽序列为：
SGQYASYHCWCWRDPGRSGGSPLGLLGGGGSK(记为MMP2-TPP1)。
(2)多肽磷脂化修饰
取1mg FITC-TPP1荧光多肽溶于500μL DMF，按摩尔比1:2取相应量的DSPE-PEG2000-NHS溶于500μL DMF，将两者混合于5mL棕色玻璃样品瓶中，加入20μL TEA调节pH为8.0，室温避光条件下用磁力搅拌反应48h。
取反应液于截留分子量为3500Da的透析袋中，以去离子水作为透析外液，避光透析48h，去除游离的多肽和反应溶剂DMF，冻干得到多肽磷脂化修饰的产物DSPE-PEG-MMP2-TPP1。
3、磷脂交换连接多肽药物和肿瘤细胞膜
将500μL含有浓度为2mg/mL H460细胞膜的PBS悬液平均分为5组，其中一组为空白对照组，剩余四组各加入8μg DSPE-PEG-MMP2-TPP1，37℃分别振荡孵育1h、2h、3h、4h，细胞超声破碎仪破碎3min(3s/3s，on/off，30％功率)，300kDa超滤管超滤，除去游离的荧光多肽分子，重悬到500μL。
用流式细胞仪(Accuri C6)检测荧光多肽在细胞膜上的连接情况。
如图3所示，通过流式细胞仪结果表明，荧光多肽连接到细胞膜上，荧光偏移率达到了99％，且延长共孵育的时间对连接效率没有明显影响，故磷脂交换反应时间选用1h即可。
4、包裹超顺磁四氧化三铁Fe3O4纳米粒子
将连接有多肽药物的肿瘤细胞膜平均分为5组，分别重悬于1mL低渗缓冲液中，按细胞膜和Fe3O4不同质量比混合(细胞膜与Fe3O4的质量比为1000:1、500:1、100:1、50:1、20:1和10:1)，4℃80rpm旋转孵育30min，冰浴超声30min，超声细胞破碎仪破碎1min，300KD超滤管超滤，除去未包裹的Fe3O4，得到肿瘤细胞膜载药体系。
5、最佳质量比的确定及稳定性检测
将得到肿瘤细胞膜载药体系重悬于1mL的PBS溶液中，通过动态光散射仪测定样品的粒径值。4℃保存，7天后再次测量粒径，以观察其稳定性。
如图4(a)所示，随着细胞膜和Fe3O4纳米粒子的质量比的增加，粒径呈现先减小后增大的趋势，当达到最佳质量比时粒径最小，细胞膜或者Fe3O4在游离状态下不稳定，粒径会变大。
确定最佳质量比后，对20:1的体系在4℃保存7天后的粒径变化进行观察，结果如图4(b)所示，第0天时粒径为120nm，第7天粒径为156.78nm，此变化在可接受范围，稳定性尚可。
TEM直观展示出细胞膜对超顺磁Fe3O4的包裹情况，如图5所示，Fe3O4不同程度的团聚在细胞膜内部，外部浅色的细胞膜厚度约为10nm，与肿瘤细胞膜的理论厚度一致。
实施例2
本实施例用于研究细胞膜载药体系的核磁性质。
将实施例1中制备的细胞膜包裹Fe3O4的载药体系(mem/Fe3O4)按Fe3O4浓度配成系列不同浓度的水溶液，Fe3O4浓度分别为20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL和0.2μg/mL，用0.5T磁共振分析仪分别测试Fe3O4用细胞膜包裹前后的T2成像和弛豫时间T2，不同浓度的Fe3O4和mem/Fe3O4的磁共振分析图像如图6(a)和图6(b)所示，由图可知，相比于Fe3O4，mem/Fe3O4仍然具有较好的成像效果；
样品的弛豫率r2如图6(c)所示，细胞膜包裹的Fe3O4的弛豫率有一些下降，其原因可能是细胞膜的包覆在一定程度上遮盖了Fe3O4的成像效果。尽管如此，mem/Fe3O4仍然具有很高的弛豫率，细胞膜的包裹增强了Fe3O4的生物相容性同时可以增强其在荷瘤小鼠肿瘤部位的聚集，有利于体内核磁成像。
实施例3
本实施例检测研究细胞膜载药体系的细胞毒性。
裸露Fe3O4和细胞膜包裹的Fe3O4载药体系，根据Fe3O4的量用完全培养基稀释成不同浓度，和H460细胞置于37℃细胞培养箱中共培养24h后，各孔加入10％的CCK8(CellCounting Kit-8)试剂，于37℃继续培养1h后用酶标仪检测450nm处的吸光值。
所得结果如图7所示，裸露的Fe3O4没有细胞毒性，同时细胞膜包裹后的Fe3O4具有更强的生物相容性，能够更好地促进细胞增殖。
实施例4
本实施例用于评价细胞膜载药体系的血液相容性。
取1mL的小鼠血液于含EDTA的抗凝管中，2000rpm离心10min，沉淀用PBS清洗三遍，将细胞膜载药体系的加入到红细胞沉淀中，红细胞的体积比为1％，按照细胞膜的浓度确定载药体系不同浓度，细胞膜浓度分别为1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、以超纯水为阳性对照组、PBS溶液为阴性对照组，室温下旋转4h，然后用酶标仪测定上清在541nm处的吸收值。
所得结果如图8所示，超纯水使得红细胞破裂，OD541有较强吸收，载药体系和PBS组吸光值没有差别，说明载药体系不会产生溶血效应，较为安全，可以通过静脉注射给药，应用便捷。
实施例5
本实施例用于研究本发明提供的载药体系对T细胞的激活效果。
向96孔细胞培养板各孔分别加入100μL浓度为1μg/mL的CD3抗体，4℃过夜孵育。第二天吸去抗体溶液，用PBS清洗后向各孔分别加入100μL浓度为10μg/mL的PD-L1蛋白溶液，37℃孵育4h，用PBS清洗后分别加入游离TPP1多肽以及膜载药体系，并设置加MMP2蛋白酶和不加酶两组，加酶的剂量为1μg/孔，加入到相应的孔中，37℃孵育1h。
最后各孔分别加入5×104个CD4+T细胞，在37℃5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中共孵育3天。3天后收集细胞上清，用human IFN-γELISA kit测定上清中IFN-γ含量，并通过CCK8试剂检测细胞增殖情况。
如图9(a)所示，从左到右各实验组分别为：①空白对照，②仅含CD3抗体，③加入CD3抗体与PD-L1蛋白，④加入CD3抗体、PD-L1蛋白以及TPP1多肽，⑤加入CD3抗体、PD-L1蛋白、细胞膜载药体系以及MMP2酶，⑥加入CD3抗体、PD-L1蛋白以及细胞膜载药体系；
各组和CD3+PD-L1组相比，IFN-γ分泌量均能够有显著的差异，说明多肽能够有效地重新激活T细胞，TPP1多肽和细胞膜载药体系没有显著差异。
如图9(b)所示，T细胞激活的另一个表现是细胞增殖，通过CCK8试剂测定T细胞的增殖率，和IFN-γ的趋势相同，进一步印证了修饰后的多肽能够阻断PD-1/PD-L1通路，重新激活T细胞。
实施例6
本实施例用于检测多肽药物的半衰期。
通过尾静脉注射游离的荧光多肽和负载荧光多肽的细胞膜载药体系，注射剂量为4mg/kg。
分别于不同时间断尾取血，每次取血20μL，迅速加入肝素钠抗凝管中，用PBS稀释，加入黑色96孔板，用酶标仪测各孔的荧光强度。通过PK solver进行拟合，对比多肽修饰前后在小鼠体内的半衰期的变化。
利用药代动力学软件将数据进行拟合，两者均符合双室模型，如图10(a)和图10(b)所示，游离多肽在体内的半衰期只有不到10分钟的时间(0.933min)，而细胞膜负载的荧光多肽在体内的半衰期可以延长至近6个小时(5.782h)，半衰期延长近60倍；即细胞膜载药体系与裸露多肽组相比，细胞膜载药体系明显延长了在小鼠体内的循环半衰期。
实施例7
本实施例用于研究细胞膜载药体系的体内抗肿瘤效果。
小鼠种瘤第二天，在肿瘤注射部位可以观察到明显的小白点，按分组对不同组小鼠按照4mg/kg的剂量分别注射相应的药物，每两天给药一次，共计8次。每5天记录一次小鼠体重及肿瘤体积变化，每7天通过小动物活体成像记录肿瘤体积变化。
如图11(a)所示，瘤旁注射组肿瘤荧光强度随时间的增加逐步变强，且肿瘤细胞膜负载TPP1的荧光强度始终高于直接注射TPP1；同时，如图11(b)所示，尾静脉注射组肿瘤荧光强度在第28天时达到峰值，且肿瘤细胞膜负载TPP1的荧光强度始终低于直接注射TPP1；
荧光强度越高说明肿瘤的体积越大，在瘤旁注射时，肿瘤细胞膜负载TPP1的荧光强度始终高于直接注射TPP1，这种现象出现的原因可能是游离的TPP1多肽会直接发挥抑制肿瘤生长的功能，因此效果较载药体系更为显著；而尾静脉注射涉及到血液运输和体内代谢，载药体系显示出更好的长循环优势，因此抑瘤效果更加明显。
从肿瘤大小来看，如图11(c)和图11(d)所示，各实验组中除抗体组MEDI4736外，瘤旁注射(subcutaneous)TPP1浓度较高因而效果最佳，而尾静脉注射(vein)TPP1相对而言效果较差，但是，肿瘤细胞膜负载可以显著有效的延长TPP1多肽在体内的半衰期，所以尾静脉注射后依然有较好的抑制肿瘤生长的效果；同时，无论是采用瘤旁注射还是尾静脉注射，小鼠体重无明显变化(如图11(e)，和图11(f)所示)，说明载药体系对小鼠没有明显毒性。
实施例8
本实施例用于研究细胞膜载药体系的体内核磁成像效果。
待小鼠肿瘤大小约为100mm3时，取15只小鼠进行核磁成像。
用24％的乌拉坦溶液使小鼠处于麻醉状态，分别通过尾静脉按照5mg/kg的剂量注射PBS、裸露的Fe3O4粒子、H460-luc细胞膜包裹的Fe3O4粒子，分别于注射前、注射后3h和6h用1.5T小动物核磁成像仪扫描荷瘤小鼠的T2加权MR成像，采集数据。
如图12所示，相比于对照组，肿瘤细胞膜包裹Fe3O4的小鼠，肿瘤部位的核磁成像在注射药物后3h肿瘤(如图中圆圈内所示区域)有部分变暗，6h后肿瘤整体变暗，说明肿瘤细胞膜包裹后使得Fe3O4在体内对肿瘤的靶向性增强，在肿瘤部位的聚集增加，使得肿瘤部位的核磁成像更清晰。
综上所述，本发明以生物技术为基础，通过对不同功能性多肽之间的巧妙组合，和肿瘤细胞膜的同质靶向作用，实现对肿瘤细胞的特异性识别与肿瘤微环境中T细胞的再激活，从而能够更精确更高效的杀伤肿瘤细胞。相比于PEG修饰达到多肽长循环的方法，成本低廉，且生物相容度更高，不引入有机或有害物质，更加安全，便于载药体系的获得与使用，在多肽药物的体内运载有潜在的应用前景；相比于裸露的核磁造影剂Fe3O4，肿瘤细胞膜包裹Fe3O4在体内有聚集效果且不至于产生沉底反应，能够在肿瘤部位聚集，增强核磁成像清晰度，更好的对肿瘤部位进行成像和示踪，对诊疗一体化的发展有重要启发。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种肿瘤细胞膜载药体系，其特征在于，所述载药体系包括肿瘤细胞膜和连接在所述肿瘤细胞膜表面的多肽药物。
2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞膜载药体系，其特征在于，所述载药体系还包括造影剂，所述造影剂包裹于肿瘤细胞膜内；
优选地，所述造影剂包括超顺磁四氧化三铁纳米粒子；
优选地，所述肿瘤细胞膜和超顺磁四氧化三铁纳米粒子的质量比为(10～1000):1，优选为(20～100):1，进一步优选为20:1。
3.根据权利要求1或2所述的肿瘤细胞膜载药体系，其特征在于，所述多肽药物为磷脂化修饰的多肽药物；
优选地，所述多肽药物通过磷脂交换反应连接到肿瘤细胞膜表面；
优选地，所述磷脂化修饰的多肽药物由如下方法制备得到：将多肽药物与磷脂化修饰剂混合反应，透析后冻干得到磷脂化修饰的多肽药物；
优选地，所述磷脂化修饰剂包括DSPE-PEG2000-NHS；
优选地，所述多肽药物与磷脂化修饰剂的摩尔比为1:(1～5)，优选为1:2；
优选地，所述混合反应的时间为36～60h，优选为48h。
4.根据权利要求1～3任一项所述的肿瘤细胞膜载药体系，其特征在于，所述多肽药物包括PD-1/PD-L1通路抑制多肽、PD-1拮抗多肽或KLA杀伤性多肽中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述PD-1/PD-L1通路抑制多肽包括多肽序列SGQYASYHCWCWRDPGRSGGSK；
优选地，所述多肽药物还包括基质金属蛋白酶的底物；
优选地，所述基质金属蛋白酶的底物包括多肽序列PLGLLG；
优选地，所述多肽药物包括多肽序列SGQYASYHCWCWRDPGRSGGSPLGLLGGGGSK；
优选地，所述多肽药物采用固相合成法合成。
5.根据权利要求1～4任一项所述的肿瘤细胞膜载药体系，其特征在于，所述肿瘤细胞膜由如下方法制备得到：
收集肿瘤细胞后用胰蛋白酶消化，再经过低渗处理和冰浴超声，而后破碎所述肿瘤细胞，得到肿瘤细胞膜；
优选地，所述低渗处理的温度为0～5℃，时间为0.5～5h；
优选地，所述低渗处理的温度为4℃，时间为1h；
优选地，所述冰浴超声的时间为20～40min；
优选地，所述破碎的方法为超声破碎。
6.一种如权利要求1～5任一项所述的肿瘤细胞膜载药体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
将肿瘤细胞膜与磷脂化修饰的多肽药物混合，振荡孵育，再经过超声破碎和超滤除去游离的多肽药物，得到所述载药体系。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞膜的质量浓度为1～5mg/mL，优选为2mg/mL；
优选地，所述多肽药物的质量浓度为15～20μg/mL，优选为16μg/mL；
优选地，所述振荡孵育的温度为35～38℃，优选为37℃；
优选地，所述振荡孵育的时间为0.8～4h，优选为1h；
优选地，所述超声破碎的时间为2～5min；
优选地，所述超滤时超滤管的孔径大小为200～400kDa，优选为300kDa。
8.根据权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括将连接多肽药物的肿瘤细胞膜与超顺磁四氧化三铁纳米粒子混合孵育的操作；
优选地，所述混合孵育的时间为20～40min；
优选地，所述混合孵育的温度为0～5℃，优选为4℃；
优选地，所述混合孵育后还包括冰浴超声、破碎和超滤的操作。
9.根据权利要求6～8任一项所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
(1)将肿瘤细胞膜与磷脂化修饰的多肽药物混合，所述肿瘤细胞膜的质量浓度为1～5mg/mL，所述多肽药物的质量浓度为15～20μg/mL，35～38℃下振荡孵育0.8～4h，再经过超声破碎2～5min和200～400kDa超滤管超滤，除去游离的多肽药物，得到连接多肽药物的肿瘤细胞膜；
其中，所述肿瘤细胞膜的制备方法为：收集肿瘤细胞后用胰蛋白酶消化，在0～5℃下经过低渗处理0.5～5h，而后冰浴超声20～40min，再超声破碎所述肿瘤细胞，得到肿瘤细胞膜；
所述磷脂化修饰的多肽药物的制备方法为：将多肽药物与磷脂化修饰剂混合反应，透析后冻干得到磷脂化修饰的多肽药物，所述多肽药物与磷脂化修饰剂的摩尔比为1:(1～5)；
(2)将步骤(1)得到的肿瘤细胞膜与超顺磁四氧化三铁纳米粒子在0～5℃下混合孵育20～40min，而后冰浴超声20～40min，再经过超声破碎2～5min和200～400kDa超滤管超滤，除去游离的超顺磁四氧化三铁纳米粒子，得到所述肿瘤细胞膜载药体系。
10.如权利要求1～5任一项所述的肿瘤细胞膜载药体系在制备肿瘤药物或造影剂中的应用。
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