CN114288408B

CN114288408B - 双佐剂自载体原位纳米疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN114288408B
Application number: CN202111562762.7A
Authority: CN
Inventors: 刘兰霞; 冷希岗; 马兵
Original assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2041-12-20
Also published as: CN114288408A

Abstract

本发明涉及一种双佐剂自载体原位纳米疫苗及其制备方法，双佐剂自载体原位纳米疫苗具有通过两亲性单体分子自组而成的球状结构，两亲性单体分子包含依次连接的疏水性佐剂分子、亲水性佐剂分子、微环境响应性连接分子和亲水性化疗药物分子，疏水性佐剂分子在球状结构的内侧，亲水性化疗药物分子在球状结构的外侧。本发明的双佐剂自载体原位纳米疫苗，不需要其它高分子材料的介入。而且，该原位纳米疫苗的内核是由双佐剂形成的球形核苷酸纳米颗粒，可高效刺激机体免疫反应的产生。采用该新的连接策略制备的双佐剂自载体原位纳米疫苗，粒径控制在200‑300nm，更易于在肿瘤部位蓄积，有利于原位纳米疫苗产生更强的抗肿瘤效果。

Description

双佐剂自载体原位纳米疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制备技术领域，特别涉及一种双佐剂自载体原位纳米疫苗及其制备方法。

背景技术

随着肿瘤免疫学的发展，肿瘤疫苗逐渐成为一种新型有效的抗肿瘤治疗策略。然而，肿瘤疫苗面临的主要问题是缺乏高特异性肿瘤抗原以及诱导产生的免疫保护性反应强度较弱。部分化疗药物在杀伤肿瘤细胞时，会引起肿瘤细胞的免疫原性死亡，释放肿瘤特异性抗原和佐剂形成原位疫苗，进而产生肿瘤抗原特异性免疫反应进一步杀伤肿瘤细胞，但是该免疫反应强度常常较弱。

某些化疗药可诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，产生肿瘤特异性抗原，并由此产生特异性抗肿瘤免疫反应(也称为原位疫苗)。传统的原位疫苗需要借助高分子材料，存在安全性隐患。

发明内容

基于以上技术问题，本发明的主要目的是提供一种双佐剂自载体原位纳米疫苗及其制备方法，该双佐剂自载体原位纳米疫苗具有佐剂和化疗药物分子自组建的球状结构，可精确定量各药物组分，且其制备无需借助其他的高分子材料。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种双佐剂自载体原位纳米疫苗，所述双佐剂自载体原位纳米疫苗具有通过两亲性单体分子自组而成的球状结构，所述两亲性单体分子包含依次连接的疏水性佐剂分子、亲水性佐剂分子、微环境响应性连接分子和亲水性化疗药物分子，所述疏水性佐剂分子在所述球状结构的内侧，所述亲水性化疗药物分子在所述球状结构的外侧。

在其中一些实施例中，所述亲水性佐剂分子包含CpG ODN、QS21、IL-1、IL-2和IFN-γ中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述亲水性化疗药物分子包含阿霉素、柔红霉素、米托蒽醌、博来霉素和环磷酰胺中的一种或者多种。

在其中一些实施例中，所述微环境响应性连接分子包含基质金属蛋白酶响应性多肽、分子谷胱甘肽响应性分子、酶解α-乳白蛋白多肽分子和H₂O₂响应性分子中的一种或者多种。

在其中一些实施例中，所述疏水性佐剂分子包含单磷脂酰A、R848和咪喹莫特中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述亲水性佐剂分子和所述微环境响应性连接分子之间的连接键为酰胺键或者二硫键。

一种双佐剂自载体原位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括制备所述两亲性单体分子以及所述两亲性单体分子自组装成所述双佐剂原位纳米疫苗的步骤。

在其中一些实施例中，所述两亲性单体分子包含依次连接的疏水性佐剂分子、亲水性佐剂分子、微环境响应性连接分子和亲水性化疗药物分子；

制备所述两亲性单体分子的步骤包括：

将所述亲水性化疗药物分子连接在所述微环境响应性连接分子上，制备连接产物Ⅰ；

在所述连接产物Ⅰ上连接所述亲水性佐剂分子，制备连接产物Ⅱ；

将所述疏水性佐剂分子连接在所述连接产物Ⅱ上，制备所述两亲性单体分子。

在其中一些实施例中，将所述亲水性化疗药物分子连接在所述微环境响应性连接分子上的步骤包括：

所述微环境响应性连接分子和活化剂a反应，制备活化产物a，

所述活化产物a和所述亲水性化疗药物分子反应，制备所述连接产物Ⅰ。

在其中一些实施例中，所述活化剂a包含质量比为(0.9-1.3):(0.2-0.4)的1,2-二氯乙烷和N-羟基丁二酰亚胺。

在其中一些实施例中，制备所述活化产物a的步骤中，反应的条件包括：温度为22℃-28℃，时长为1.5h-2.5h。

在其中一些实施例中，将所述疏水性佐剂分子连接在所述连接产物Ⅱ上的步骤包括：

所述疏水性佐剂分子和活化剂b反应，制备活化产物b；

所述化产物b和所述第连接产物Ⅱ反应，制备所述两亲性单体分子。

在其中一些实施例中，所述活化剂b包含N,N'-羰基二咪唑。

在其中一些实施例中，在所述连接产物Ⅰ上连接所述亲水性佐剂分子的步骤包括：

所述连接产物Ⅰ和交联剂反应，制备连接产物Ⅱ’；

所述第连接产物Ⅱ’和经巯基修饰的所述亲水性佐剂分子反应，制备连接产物Ⅱ。

在其中一些实施例中，所述连接产物Ⅱ’的制备步骤中，所述交联剂包含琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯。

在其中一些实施例中，所述连接产物Ⅱ’的制备步骤中，所述连接产物Ⅰ和所述琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯的质量比为1:(1-2)。

在其中一些实施例中，所述连接产物Ⅱ’的制备步骤中，反应的条件包括：温度为22℃-28℃，时长为5h-7h。

在其中一些实施例中，所述连接产物Ⅱ’的制备步骤中，所述连接产物Ⅱ’和经巯基修饰的所述亲水性佐剂分子的质量比＞10。

与传统技术相比，本发明具备如下有益效果：

发明人在研究中发现，传统工艺制备的原位纳米疫苗需要借助其它的高分子材料才能构建成纳米原位疫苗。发明人创新性地提出一种全新的完全由双佐剂和化疗药物分子构建而成的原位纳米疫苗，不需要其它高分子材料的介入。而且，该纳米疫苗的内核是由双佐剂形成的球形核苷酸纳米颗粒，可高效刺激机体免疫反应的产生。同时，发明人在对原位纳米疫苗的传统制备工艺进行了大量的研究的基础上，提出一种新的双佐剂原位纳米疫苗的制备工艺，该制备工艺在制备自组装的两亲性单体的过程中采用新的连接策略，即：先将亲水性化疗药物分子连接到微环境响应性连接分子上，然后再将亲水性佐剂分子连接到微环境响应性连接分子，最后将亲水性佐剂上连接疏水性佐剂。采用该新的连接策略制备的双佐剂自载体原位纳米疫苗，粒径控制在200nm-300nm，该尺寸的原位纳米疫苗更易于在肿瘤部位蓄积，有利于原位纳米疫苗产生更强的抗肿瘤效果。

本发明制备方法制备的双佐剂原位纳米疫苗，是内核为双佐剂纳米颗粒、外层为亲水性化疗药物分子的“球包球”肿瘤微环境响应性纳米体系。该原位纳米疫苗到达肿瘤局部后，首先释放化疗药物，杀伤肿瘤细胞并产生具有高度抗原特异性的肿瘤细胞碎片，经树突状细胞加工提呈给T细胞，触发抗原特异性免疫反应。同时，双佐剂纳米颗粒作为新型高效的纳米佐剂可高效作用于DC细胞，同时激活多条免疫通路，产生协同刺激效应，增强机体产生高效协同的具有个体化特性的肿瘤特异性免疫反应，进一步特异杀伤肿瘤细胞。并且，本发明制备的原位纳米疫苗，是由化疗药物和佐剂构建而成的可控释放的纳米疫苗，属自载体纳米体系，减少了以高分子材料为药物/佐剂载体带来的潜在的安全性隐患，还可以保证药物的负载量。

进一步地，本发明提供的制备工艺，在连接亲水性佐剂分子的过程中，采用酰胺键或者二硫键连接微环境响应性连接分子和亲水性佐剂分子。当原位纳米疫苗进入机体细胞后，酰胺键或者二硫键断裂，释放出双佐剂纳米颗粒，可去除微环境响应性连接分子(例如MMP-9残余氨基酸)对双佐剂纳米颗粒的影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例制备的原位纳米疫苗结构示意图；

图2为本发明一个实施例制备的原位纳米疫苗的动态光散射粒径检测结果；

图3为本发明一个实施例制备的双佐剂原位纳米疫苗的透射电子显微镜图；

图4为本发明一个实施例制备的双佐剂原位纳米疫苗作用于HUVEC后的细胞活力检测；

图5为本发明一个实施例制备的双佐剂原位纳米疫苗对BMDC细胞的促成熟情况；

图6为BMDC细胞与本发明一个实施例制备的双佐剂原位纳米疫苗共孵育后细胞因子的分泌情况；

图7为本发明一个实施例各组处理对应的荷瘤小鼠肿瘤体积变化曲线；

图8为本发明一个实施例各组处理对应的荷瘤小鼠生存期统计图；

图9为本发明一个实施例各组处理对应的荷瘤小鼠肿瘤质量统计图；

图10为实施例1和对比例1的双佐剂自载体原位疫苗在小鼠体内肿瘤部位蓄积情况对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。

出于说明本发明各种实施方式的目的给出如下实施例，并非意图以任何方式限制本发明。本领域技术人员将理解，如权利要求的范围所限定的，其中的变化和其它用途包括在本发明精神范围内。下列实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中，“第一方面”、“第二方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。

本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。

本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。

前期，发明人通过合成不同长短的分别含有佐剂和化疗药物的分子(CN113521031A)，并通过自组装形成杂化的球包球状纳米颗粒作为原位纳米疫苗，取得了良好的抗肿瘤效果。但是由该方法构建的纳米原位疫苗不能精确的控制各纳米颗粒中的成分，而且肿瘤局部聚集量较低，药物的利用率有待提高。在此基础之上，发明人通过单分子一体成型的方式构建了集不同佐剂与化疗药物于一体的双佐剂载体原位纳米疫苗。

第一方面，本发明提供一种双佐剂自载体原位纳米疫苗，所述双佐剂自载体原位纳米疫苗具有通过两亲性单体分子自组而成的球状结构，所述两亲性单体分子包含依次连接的疏水性佐剂分子、亲水性佐剂分子、微环境响应性连接分子和亲水性化疗药物分子，所述疏水性佐剂分子在所述球状结构的内侧，所述亲水性化疗药物分子在所述球状结构的外侧。

在其中一个示例中，所述亲水性佐剂分子包含CpG ODN、QS21、IL-1、IL-2和IFN-γ中的一种或多种。

在其中一个示例中，所述亲水性化疗药物分子包含阿霉素、柔红霉素、米托蒽醌、博来霉素和环磷酰胺中的一种或者多种。

在其中一个示例中，所述微环境响应性连接分子包含基质金属蛋白酶响应性多肽、分子谷胱甘肽响应性分子、酶解α-乳白蛋白多肽分子和H₂O₂响应性分子中的一种或者多种。

在其中一个示例中，所述疏水性佐剂分子包含单磷脂酰A、R848和咪喹莫特中的一种或多种。

在其中一个示例中，所述亲水性佐剂分子和所述微环境响应性连接分子之间的连接键为酰胺键或者二硫键。

第二方面，本发明提供一种双佐剂自载体原位纳米疫苗的制备方法，所述制备方法包括制备两亲性单体分子以及所述两亲性单体分子自组装成所述双佐剂自载体原位纳米疫苗的步骤。在其中一个示例中，制备所述两亲性单体分子的步骤包括：

本发明制备的双佐剂原位纳米疫苗是一种内核为双佐剂自载体纳米颗粒、外层为化疗药物分子的“球包球”肿瘤微环境响应性自载体纳米体系。该原位纳米疫苗到达肿瘤局部后，首先释放化疗药物，杀伤肿瘤细胞并产生具有高度抗原特异性的肿瘤细胞碎片，经树突状细胞加工提呈给T细胞，触发抗原特异性免疫反应。同时，双佐剂自载体球形纳米内核可高效作用于DC细胞，同时激活多条免疫通路，产生协同刺激效应，增强机体产生高效协同的具有个体化特性的肿瘤特异性免疫反应，进一步特异杀伤肿瘤细胞，为肿瘤患者提供了一种安全高效的“即时化疗直接杀伤肿瘤细胞+长效抗原特异性免疫反应杀伤肿瘤细胞”的新型治疗手段。

在其中一个示例中，所述双佐剂自载体原位纳米疫苗的粒径为200nm-300nm，具体可以为200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm。

在其中一个示例中，所述连接产物Ⅱ中，所述连接产物Ⅰ上和所述亲水性佐剂分子通过酰胺键或者二硫键连接。

在其中一个示例中，在所述连接产物Ⅰ上连接所述亲水性佐剂分子的步骤包括：

所述连接产物Ⅰ和交联剂反应，制备连接产物Ⅱ’；

在其中一个示例中，所述交联剂包含琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯，所述第一连接产物和所述琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯的质量比为1:(1-2)。例如1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8、1:2。

在其中一个示例中，所述连接产物Ⅱ’的制备步骤中，反应的条件包括：温度为22℃-28℃，时长为5h-7h。例如：22℃下7h、23℃下6.5h、24℃下6h、25℃下5.5h、26℃下5h、27℃下7h、28℃下6.5h。

在其中一个示例中，所述连接产物Ⅱ’和经巯基修饰的所述亲水性佐剂分子的质量之比＞10。

在其中一些实施例中，所述连接产物Ⅱ的制备步骤中，反应的条件包括：温度为22℃-28℃，时长为22h-26h。例如：22℃下26h、23℃下25.5h、24℃下24h、25℃下23.5h、26℃下23h、27℃下22.5h、28℃下22h。

在其中一个示例中，将所述亲水性化疗药物分子连接在所述微环境响应性连接分子上的步骤包括：

在其中一个示例中，所述活化剂a包含质量比为(0.9-1.3):(0.2-0.4)的1,2-二氯乙烷和N-羟基丁二酰亚胺。例如：0.9:0.2、0.9:0.3、0.9:0.4、1.3:0.2、1.3:0.3、1.3:0.4。

在其中一个示例中，制备所述活化产物a的步骤中，反应的条件包括：温度为22℃-28℃，时长为1.5h-2.5h。例如：22℃下1.5h、23℃下1.6h、24℃下1.7h、25℃下1.8h、26℃下2h、27℃下2.3h、28℃下2.5h。

在其中一个示例中，将所述疏水性佐剂分子连接在所述连接产物Ⅱ上的步骤包括：

所述疏水性佐剂分子和活化剂b反应，制备活化产物b；

在其中一个示例中，所述活化剂b包含N,N'-羰基二咪唑。

在其中一个示例中，制备所述活化产物b的步骤中，反应的条件包括：温度为22℃-28℃，时长为1.5h-2.5h。例如：22℃下1.5h、23℃下1.6h、24℃下1.7h、25℃下1.8h、26℃下2h、27℃下2.3h、28℃下2.5h。

在其中一个示例中，所述疏水性佐剂分子为单磷脂酰A，所述亲水性佐剂为CpGODN，所述微环境响应性连接分子为氨基酸序列为GPQGIAGQR的多肽分子，所述亲水性化疗药物分子为盐酸阿霉素。

实施例1

本实施例提供一种双佐剂原位纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)将MMP-9底物多肽分子(GPQGIAGQR)与1,2-二氯乙烷和N-羟基丁二酰亚胺按照质量比1:1.1:0.3混合，室温条件下，搅拌反应2h。

(2)向步骤(1)加入盐酸阿霉素，其与多肽分子的质量之比为0.3：1，接下来继续室温搅拌24h，用1000Da的透析袋透析，收集大分子量物质MMP-9—DOX。

(3)再将SPDP(琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯，交联剂)与上步得到的MMP-9—DOX按照质量比1.5：1混合，室温反应6h后透析得到(SPDP)-MMP-9—DOX，再将12倍量的(SPDP)-MMP-9—DOX与经巯基修饰的CpG ODN(亲水性佐剂分子)室温下反应24h后的到CpG—MMP-9—DOX；

(4)取将单磷脂酰A与N,N'-羰基二咪唑按质量比1:1混合反应，室温活化2h后加入上述得到的CpG—MMP-9—DOX，共同反应12h，经透析袋透析后收集分子量较大的物质，即得到MPLA—CpG—MMP-9—DOX纳米颗粒，亦可简称为“MCMD纳米疫苗”，可用“MCMD NPs”表示。

图1为原位纳米疫苗结构示意图，图2为原位纳米疫苗的动态光散射粒径检测结果，图3为原位纳米疫苗的透射电子显微镜图。如图2、图3所示，MCMD NPs(MPLA—CpG—MMP-9—DOX纳米颗粒)的粒径为223.3±7.3nm，在MMP-9酶的作用下，纳米颗粒发生裂解，其内部是仍具有纳米颗粒形态的双佐剂球形核酸。

对原位纳米疫苗的性能进行如下检测：

(1)细胞活力实验：

将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于96孔板中，置于5％CO₂的37℃培养箱孵育过夜，每孔分别加入含有DOX浓度为0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5ug/ml的原位纳米疫苗或游离DOX，继续培养24小时，每孔加入10ul的CCK-8检测液，培养箱中继续培养1～4小时，利用多功能全波长酶标仪(Thermo Varioskan Flash3001)于450nm处测定吸光度。

图4为MCMD纳米疫苗和游离DOX作用于HUVEC后的细胞活力检测结果。结果表明，与游离DOX组相比，MCMD NPs显著降低了DOX对静脉内皮细胞的毒性作用，因此在静脉给药时具有良好的安全性。

(2)纳米疫苗对BMDCs成熟的影响

①应用流式细胞术检测纳米疫苗对于BMDCs细胞促成熟情况：BMDC与MPLA-CpG纳米疫苗共孵育24小时，同时为模拟体内化疗免疫联合应用的情况，另设置一组BMDC与MPLA-CpG纳米疫苗同化疗药处理过的肿瘤细胞碎片共孵育24小时(两组均按照MPLA的浓度5μg/ml计算给药量)，收集细胞，标记CD11C、CD40及CD86等流式抗体，用流式细胞仪进行检测。用PBS、同浓度的游离MPLA和CpG作对照。

图5为纳米疫苗对BMDC细胞的促成熟情况，结果表明，在提供了肿瘤特异性抗原后，MPLA-CpG纳米疫苗能够较好地促进BMDCs的成熟。(其中Free MPLA和CpG用Free M+C表示，MPLA-CpG NPs用M-C表示，添加了肿瘤细胞碎片的MPLA-CpG NPs组用M-C+表示)。

②ELISA法测定纳米疫苗对BMDCs细胞因子分泌的影响：收集BMDCs，接种于96孔板中。BMDC与MPLA-CpG纳米疫苗和BMDC与MPLA-CpG纳米疫苗同化疗药处理过的肿瘤细胞碎片共孵育24小时(按照MPLA的浓度5μg/ml计算给药量)后，离心后取上清培养基，按照ELISA试剂盒说明书方法对BMDCs上清液进行细胞因子IFN-α(Interferon-alpha，干扰素-α)的含量测定。使用酶标仪测定450nm处的吸光度OD值，根据标准品吸光度与浓度绘制标准曲线，计算样品浓度。用PBS、同浓度的游离MPLA和CpG作对照。

图6为BMDC细胞与纳米疫苗共孵育后细胞因子的分泌情况，结果表明，MPLA-PSMA纳米疫苗与特异性肿瘤抗原能有效促进BMDCs分泌IFN-α。

MCMD NPs在发挥作用时，并非其本身直接作用于BMDCs，而是发生裂解后其内核MPLA-CpG作用于BMDCs，因此设计的M-C+组即模拟了MCMD NPs在体内的作用，先释放DOX杀灭肿瘤细胞生成特异性抗原，再与内核MPLA-CpG共同作用于BMDCs，因此，M-C+组对应MCMDNPs组。

(3)抑瘤效果

制备6-8周龄的C57BL/6 E.G7荷瘤小鼠模型，在肿瘤体积达到80mm³左右时，将荷瘤小鼠随机分为四组，每组6只，对四组小鼠分别给予PBS、FREE DOX、M-C NPs、和MCMD NPs进行治疗(按照MPLA 20ug/只，DOX 100ug/只计算给药量)，每5天给药一次，共给药3次。从给药当日起，每两天测量肿瘤体积和小鼠体重，记录数据并绘制小鼠肿瘤体积及小鼠生存期变化曲线，当肿瘤体积达到2000mm³时则判定小鼠死亡。随后，处死小鼠，取出肿瘤并称量肿瘤质量。

图7为荷瘤小鼠肿瘤体积变化曲线，图8为荷瘤小鼠生存期，图9为荷瘤小鼠肿瘤质量。结果表明，MCMD NPs能够有效地抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠的生存期。

对比例1

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别之处在于制备两性单体分子的过程中，各分子连接顺序不同，具体地，本对比例的制备方法包括：

(1)将经二硫键连接的CpG ODN-MMP-9底物多肽分子(GPQGIAGQ R)与1,2-二氯乙烷和N-羟基丁二酰亚胺按照1:1.1:0.3的比例混合，室温搅拌反应2h。

(2)向步骤(1)反应产物加入盐酸阿霉素，其与多肽分子的质量比为0.3:1，室温搅拌反应24h，采用透析袋进行透析，收集分子量较大的物质，冻干，得到CpG ODN-MMP-9-DOX。

(3)将单磷脂酰A与N,N'-羰基二咪唑按照质量比1:1混合，室温搅拌反应2h，再加入单磷脂酰A5倍质量的CpG ODN-MMP-9-DOX，混合后，室温搅拌反应12h，采用透析袋进行透析，收集分子量较大的物质，得到MPLA—CpG—MMP-9—DOX纳米颗粒，粒径为135nm-140nm。

比较实施例1制备的MPLA—CpG—MMP-9—DOX纳米颗粒和对比例1制备的MPLA—CpG—MMP-9—DOX纳米颗粒在肿瘤组织蓄积的情况，见图10，根据图示结果可知，实施例1制备的MPLA—CpG—MMP-9—DOX纳米颗粒在肿瘤组织的蓄积情况明显好于对比例1制备的MPLA—CpG—MMP-9—DOX纳米颗粒。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.一种双佐剂自载体原位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述双佐剂自载体原位纳米疫苗具有通过两亲性单体分子自组而成的球状结构，所述两亲性单体分子包含依次连接的疏水性佐剂分子、亲水性佐剂分子、微环境响应性连接分子和亲水性化疗药物分子，所述疏水性佐剂分子在所述球状结构的内侧，所述亲水性化疗药物分子在所述球状结构的外侧；

所述制备方法包括制备所述两亲性单体分子以及所述两亲性单体分子自组装成所述双佐剂自载体原位纳米疫苗的步骤；

制备所述两亲性单体分子的步骤包括：

将所述疏水性佐剂分子连接在所述连接产物Ⅱ上，制备所述两亲性单体分子；

所述疏水性佐剂分子为单磷脂酰A；所述亲水性佐剂分子为CpG ODN；所述微环境响应性连接分子为氨基酸序列为GPQGIAGQR的多肽分子；所述亲水性化疗药物分子为盐酸阿霉素。

2.根据权利要求1所述的双佐剂自载体原位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述亲水性佐剂分子和所述微环境响应性连接分子之间的连接键为酰胺键或者二硫键。

3.根据权利要求1所述的双佐剂自载体原位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，将所述亲水性化疗药物分子连接在所述微环境响应性连接分子上的步骤包括：

4.根据权利要求3所述的双佐剂自载体原位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，制备所述活化产物a的步骤中，所述活化剂a包含质量比为0.9-1.3:0.2-0.4的1,2-二氯乙烷和N-羟基丁二酰亚胺，反应的条件包括：温度为22℃-28℃，时长为1.5h-2.5h。

5.根据权利要求1或4所述的双佐剂自载体原位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，将所述疏水性佐剂分子连接在所述连接产物Ⅱ上的步骤包括：

所述疏水性佐剂分子和活化剂b反应，制备活化产物b；

所述活化产物b和所述连接产物Ⅱ反应，制备所述两亲性单体分子。

6.根据权利要求5所述的双佐剂自载体原位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，制备所述活化产物b的步骤中，所述活化剂b包含N,N'-羰基二咪唑；反应的条件包括：温度为22℃-28℃，时长为1.5h-2.5h。

7.根据权利要求1、4或6任一项所述的双佐剂自载体原位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，在所述连接产物Ⅰ上连接所述亲水性佐剂分子的步骤包括：

所述连接产物Ⅰ和交联剂反应，制备连接产物Ⅱ’；

所述连接产物Ⅱ’和经巯基修饰的所述亲水性佐剂分子反应，制备连接产物Ⅱ。

8.根据权利要求7所述的双佐剂自载体原位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述连接产物Ⅱ’的制备步骤中，所述交联剂包含琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯，所述连接产物Ⅰ和所述琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯的质量比为1:1-2；反应的条件包括：温度为22℃-28℃，时长为5h-7h；所述连接产物Ⅱ’和经巯基修饰的所述亲水性佐剂分子的质量比＞10。

9.根据权利要求1、4、6或8任一项所述的双佐剂自载体原位纳米疫苗的制备方法，其特征在于，所述双佐剂自载体原位纳米疫苗的粒径为200nm-300nm。