JP5050144B2 - アジュバントとしてのポリアミノ酸 - Google Patents
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Description
(1)アジュバントとしてのポリアミノ酸の使用、
(2)ポリアミノ酸が、ポリ(γ−グルタミン酸)、ポリ(α−アスパラギン酸)、ポリ(ε−リジン)、ポリ(α−グルタミン酸)、ポリ(α−リジン)、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物からなる群より選択されるものである、(1)記載の使用、
(3)ポリアミノ酸がポリ(γ−グルタミン酸)である(2)記載の使用、
(4)ポリアミノ酸が両親媒化されている、(1)記載の使用、
(5)ポリアミノ酸がナノ粒子化されている、(1)から(4)いずれか記載の使用、
(6)ワクチンを製造するためのアジュバントとしてのポリアミノ酸の使用方法、
(7)ポリアミノ酸が、ポリ(γ−グルタミン酸)、ポリ(α−アスパラギン酸)、ポリ(ε−リジン)、ポリ(α−グルタミン酸)、ポリ(α−リジン)、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物からなる群より選択されるものである、(6)記載の使用方法、
(8)ポリアミノ酸がポリ(γ−グルタミン酸)である(7)記載の使用方法、
(9)ポリアミノ酸が両親媒化されている、(6)記載の使用方法、
(10)ポリアミノ酸がナノ粒子化されている、(6)から(9)いずれか記載の使用方法、
(11)アジュバントとしてポリアミノ酸を含むワクチン、
(12)ポリアミノ酸が、ポリ(γ−グルタミン酸)、ポリ(α−アスパラギン酸)、ポリ(ε−リジン)、ポリ(α−グルタミン酸)、ポリ(α−リジン)、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物からなる群より選択されるものである、(11)記載のワクチン、
(13)ポリアミノ酸がポリ(γ−グルタミン酸)である(12)記載のワクチン、
(14)ポリアミノ酸が両親媒化されている、(11)記載のワクチン、
(15)ポリアミノ酸がナノ粒子化されている、(11)から(14)いずれか記載のワクチン、
(16)ウイルス抗原を固定化した生分解性ナノ粒子、
(17)ウイルス抗原がレトロウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、フラビウイルス抗原、下痢症ウイルス抗原、およびコロナウイルス抗原からなる群から選択されるものである、(16)記載の生分解性ナノ粒子、
(18)ウイルス抗原がレトロウイルス抗原である、(17)記載の生分解性ナノ粒子、
(19)レトロウイルス抗原がHIV抗原である、(18)記載の生分解性ナノ粒子、
(20)ポリアミノ酸を骨格とする、(16)から(19)のいずれか記載の生分解性ナノ粒子、
(21)ポリアミノ酸が、ポリ(γ−グルタミン酸)、ポリ(α−アスパラギン酸)、ポリ(ε−リジン)、ポリ(α−グルタミン酸)、ポリ(α−リジン)、ポリアスパラギンまたはそれらの修飾体もしくは誘導体、またはそれらの混合物からなる群より選択されるものである、(20)記載の生分解性ナノ粒子、
(22)ポリアミノ酸がポリ(γ−グルタミン酸)である、(21)記載の生分解性ナノ粒子、
(23)ポリアミノ酸が両親媒化されている、(20)記載の生分解性ナノ粒子、
(24)抗原がナノ粒子に内包されている、(16)から(23)のいずれか記載の生分解性ナノ粒子、
(25)抗原がナノ粒子表面に存在する、(16)から(23)のいずれか記載の生分解性ナノ粒子、
(26)(16)から(25)のいずれか記載の生分解性ナノ粒子を含むワクチン、
(27)抗HIVワクチンである、(26)記載のワクチン、
(28)(26)記載のワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象の免疫方法、
(29)(26)記載のワクチンを対象に投与することを特徴とする、対象における疾病の治療および/または予防方法、
(30)疾病がHIVである、(29)記載の方法、
(31)疾病の治療および/または予防のためのワクチンを製造するための、(16)から(25)記載の生分解性ナノ粒子の使用、
(32)疾病がHIVである、(31)記載の使用、
を提供するものである。
マウスの下肢より単離した骨髄細胞をGM−CSF存在下で培養し、未熟樹状細胞(iDC)を得た。次に、iDCを100μg/ml γ−PGA、100μg/ml γ−PGAナノ粒子(サイズ;177nm)を含む培地で2日間培養した後、得られた細胞を同種異系マウス由来Tリンパ球と3日間共培養した。その後、Tリンパ球を3H−チミジンと16時間インキュベーションし、取り込み量を測定することにより、γ−PGAおよびγ−PGAナノ粒子がiDCを成熟樹状細胞(mDC)へと分化誘導し、さらにこのmDCがTリンパ球を活性化するかを調べた。ネガティブコントロールとして、γ−PGAを含まない培地で培養したiDCを用いた。結果を、ネガティブコントロールの3H−チミジン取り込み量を100(%)としたときの値として表す(図1)。γ−PGAが、Tリンパ球の3H−チミジンの取り込み量を増大させること、すなわちiDCをmDCへと分化成熟させ、このmDCがTリンパ球を活性化すること、さらにγ−PGAをナノ粒子化することにより、この作用、すなわちアジュバント作用が増強されることが分かった。
A.γ−PGAナノ粒子によるDC表面分子の発現の増加
実施例1記載の方法に従い得られたiDCを、75、150、300μg/ml γ−PGAナノ粒子をそれぞれ含む培地で2日間培養した後、DCの分化成熟に伴い発現が増加する細胞表面分子(CD40、CD80、CD86、MHCクラスI、およびMHCクラスII)をフローサイトメーターにより測定した。ネガティブコントロールとして、γ−PGAナノ粒子を含まない培地で培養したiDCを、そしてポジティブコントロールとして、DCの分化誘導物質として知られているLPS(リポ多糖)を含む培地で培養して得られたmDCを用いた。γ−PGAナノ粒子は、濃度依存的にCD40、CD86、MHCクラスIの発現を増加させること、すなわちiDCをmDCへと分化誘導し、活性化させることができることが分かった(図2参照)。
実施例1記載の方法に従い得られたiDCを、γ−PGAナノ粒子(75、150または300μg/ml)と共にインキュベーションした。2、6、24、48時間後の培養上清を回収し、DCより産生、分泌されたサイトカイン(IL−1β、IL−6、IL−12、およびTNF−α)をELISA法にて定量した。ネガティブコントロールとして、γ−PGAナノ粒子を含まない培地にて同じ時間インキュベーションしたiDC、そしてポジティブコントロールとして、LPSと共に同じ時間インキュベーションして得られたmDCを用いた。γ−PGAナノ粒子は、IL−1β、IL−12およびTNF−αの産生量を増大させることが分かった(図3参照)。さらに、IL−12およびTNF−αの産生量の増大は、γ−PGAナノ粒子の濃度に依存して増強されることが分かった。これらのサイトカインは、DCの分化成熟に伴い産生量が増加するため、γ−PGAナノ粒子はiDCをmDCへと分化誘導し、活性化することをさらに確認することができた。
実施例1記載の方法に従い、iDCをγ−PGAナノ粒子(75、150または300μg/ml)を含む培地で2日間培養して分化誘導した。次に、得られた細胞を同種異系マウス由来Tリンパ球と4日間共培養した。その後、Tリンパ球を3H−チミジンと16時間インキュベーションし、取り込み量を測定することにより、分化誘導されたiDCのTリンパ球活性化作用を調べた。ネガティブコントロールとして、γ−PGAナノ粒子を含まない培地にて培養したiDCを、そしてポジティブコントロールとして、LPSにより分化成熟させて得られたmDCを用いた。Tリンパ球の3H−チミジン取り込み量はiDCを分化誘導する際のγ−PGAナノ粒子の濃度に依存して増加すること、すなわち、γ−PGAナノ粒子のTリンパ球活性化作用は濃度に依存して増強されることが確認できた(図4参照)。
6から8週齢の雌BALB/c(H−2d)マウスを、p24抗原を内包するγ−PGA(p24−NP)を用いて7日間隔で3回免疫した。コントロールとして、PBS(ネガティブコントロール)、γ−PGAナノ粒子(NP)またはp24抗原(p24)単独、p24抗原とγ−PGAナノ粒子の混合物(p24+NP)を用いた。用いたγ−PGAナノ粒子およびp24抗原の量は、1回の免疫当たりそれぞれ1mg、25μgであった。最終免疫の10日後、脾臓から細胞を回収し、10mg/ml p24ペプチド(AMQMLKETI(配列番号:1))または10mg/ml 組換えp24タンパク質と共に24時間インキュベーションした。p24特異的IFN−γ産生細胞数を、ELISPOTアッセイ(BD Bioscience)にて決定した。全データを1×106細胞当たりの平均スポット形成数(SFU)±SEを用いて表す。統計的有意性をt検定を用いて検定した。結果を図5に示す。p24単独免疫群およびp24+NP免疫群と比べて、p24−NP免疫群においてIFN−γ産生細胞が多く誘導されることが分かった。
6から8週齢の雌BALB/c(H−2d)マウスを、p24抗原を内包するγ−PGAナノ粒子(p24−NP)を用いて2週間間隔で2回免疫した(n=4)。コントロールとして、PBS(ネガティブコントロール)、γ−PGAナノ粒子(NP)またはp24抗原(p24)単独、およびp24抗原とフロイントの完全アジュバントの混合物(p24+CFA)を用いた。用いたγ−PGAナノ粒子およびp24抗原の量は、それぞれ1回の免疫当たり1mg、25μgであった。最終免疫の10日後、血液を採取し、その血清中に含まれる抗原特異的抗体レベルを測定した。最終抗体価を、免疫していないマウスより2SD(約0.1)大きい吸光度(450nm)となる、最終希釈度の逆数として表す。統計的有意性をt検定を用いて検定した。結果を図6に示す。p24単独免疫群と比べて、p24−NP免疫群の血清における抗体価が非常に高いことが分かった。さらにこれは、既知のアジュバントであるCFAを用いて免疫した群(p24+CFA)に匹敵する値であった。
A.材料
C57/BL6マウス(雌性、6週齢)は日本SLCより、フロイントの完全アジュバントは、和光純薬工業より購入した。OVA発現細胞であるEG7細胞はAmerican Type Culture Collectionより購入し、培養には、400μg/ml G418(和光純薬工業)を含有する完全RPMI1640培地(SIGMA社)を用いた。
γ−PGA(分子量300,000)607mg(4.7unit mmol)を54mM NaHCO3水溶液(pH8.5)100mlに溶解した。次に、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(WSC)901mg(4.7mmol)およびL−フェニルアラニンエチルエステル(L−PAE)1080mg(4.7mmol)を添加し、攪拌しながら室温で一晩反応させた。反応後、生じた溶液を透析膜(分子量分画50,000)を用いて水で3日間透析を行い、次に、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物をエタノール100mlに添加し、一晩攪拌した。生じた溶液を遠心分離(1,500×g、20分間)し、沈殿物を減圧乾燥し、γ−PGA−g−L−PAEを得た。γ−PGA−g−L−PAE 100mgをDMSO 10mlに溶解して10mg/mlとし、次に10mg/ml γ−PGA−g−L−PAEと2mg/ml OVA(SIGMA)溶液とを1mlずつ当量混合し、反応させた。反応後、14,000×gにて15分間遠心した。上清を除去し、PBSにて再分散を行った。この操作を繰り返し、未反応のOVAを除去した。最終的に、10mg/ml OVA内包γ−PGAナノ粒子を製造した。このように両親媒化γ−PGAは、蛋白質溶液に分散させるだけで目的蛋白質を簡便かつ効率よく、均一に内包し得ることが分かった。
(腫瘍体積:mm3)=(腫瘍の長径:mm)×(腫瘍の短径:mm)2×0.5236
図7に示すように、PBSで免疫した群と比較して、OVA内包γ−PGAナノ粒子で免疫した群(γ−PGA/OVAナノ粒子(100)または(10))では、顕著な腫瘍増殖遅延を確認した。OVAを含まないγ−PGAナノ粒子およびOVAにより免疫した群(empty γ−PGAナノ粒子/OVA(100)または(10))において、若干の腫瘍生着遅延が見られたが、これはγ−PGAナノ粒子表面に吸着したOVAが抗原提示細胞内に取り込まれたことによるものだと考えられる。これらの結果より、γ−PGAナノ粒子が抗原提示細胞に取り込まれやすい性質を有していることが示される。さらに、本実施例で得られたOVA内包γ−PGAナノ粒子は、現在動物実験レベルで最も強いCTL誘導能を保持していることが知られているフロイント完全アジュバント免疫群(CFA/OVA(100))よりも、強力な抗腫瘍効果を示した。また、本実施例で得られたOVA内包γ−PGAナノ粒子は凍結乾燥により保存が可能であり、細胞毒性も認められないことが確認され、ワクチン担体およびアジュバントとしての条件を十分に兼ね備えていることがわかった。
A.材料
OVA発現EL4細胞は東北大学加齢研究所・癌細胞保存施設より供与いただき、培養には、5×10−5M 2−メルカプトエタノール(Invitrogen)、100U/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン(和光純薬工業)、および10% 牛胎児血清(FBS)を含む、完全RPMI1640倍地(SIGMA社)を用いた。マイトマイシンCは和光純薬工業、組換えマウスIL−2はPeprotech社、そしてNa2 51CrO4はAmersham Bioscience社より購入した。C57/BL6マウス、フロイントの完全アジュバント、EG7細胞については、実施例6に記載の通りである。
OVA内包γ−PGAナノ粒子を実施例6に記載のように製造した。マウスへの免疫は、OVA 100μg、25μgを含むサンプル 100μlを皮下注射することにより行った。免疫の10日後、脾臓細胞をナイロンメッシュに通し単一細胞とし、単核球を回収した。それぞれの免疫マウスより回収した単核球(4×106細胞/ml)を、30μg/ml マイトマイシンCで30分間処理したEG7(4×105細胞/ml)と、10U/ml マウスIL−2を含む完全RPMI1640培地中で5日間共培養(37℃、5% CO2)し、エフェクター細胞とした。標的細胞には、Na2 51CrO4で標識(0.56 MBq/106細胞、37℃、1時間)したEL4細胞およびEG7細胞を用いた。標的細胞を104細胞/ウェルの濃度で96ウェルプレートに入れ、次に、エフェクター細胞を12.5、25、50、100×104細胞/ウェルの濃度で加え、37℃にて4時間インキュベーションし、上清中の51Cr活性を測定した。CTL活性を以下に示す式に従い算出した。
溶解(%)=100×{(エフェクター細胞による51Cr遊離量)−(自然51Cr遊離量)}/{(最大51Cr遊離量)−(自然51Cr遊離量)}
γ−PGAナノ粒子を用いて免疫したマウスの脾臓において、OVA特異的CTLの誘導が認められた(図8(a)および(b))。これは、CFA/OVA免疫群(図8(d))よりも強力な抗腫瘍作用を示した。OVA単独免疫群ではCTL活性は全く認められなかった(図8(e))。empty γ−PGAナノ粒子/OVA群(図8(c))において、若干のCTL活性が見られたが、これはγ−PGAナノ粒子表面に吸着したOVAが抗原提示細胞内に取り込まれたことによるものであると考えられる。これらの結果から、生分解性であるγ−PGAナノ粒子が抗原提示細胞に取り込まれやすい性質を有していること、ならびにCTL誘導抗原キャリアーおよびアジュバントとして極めて優れた性能を有していることが示された。
A.材料
C3H/HeJマウス(雌性、6週齢)は日本SLCより購入した。マウス繊維芽細胞(L929)はATCCより購入し、培養には、100U/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン(和光純薬工業)、および10% 牛胎児血清(FBS)を含む、完全MEM培地(SIGMA社)を用いた。Tax38−46ペプチドはSIGMA Genosys社より購入した。フロイントの完全アジュバント、Na2 51CrO4に関しては、上記の通りである。
ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV−1)のマウスH−2KK拘束性エピトープである、Tax38−46ペプチド内包γ−PGAナノ粒子を実施例6の記載のように製造した。マウスへの免疫は、Tax38−46ペプチド 100pmol、10pmolを含むサンプル 100μlずつ、1週間おきに計3回皮下注射するこで行った。最終免疫の10日後、実施例7に記載のように単核球を回収した。単核球(1×107細胞/ml)を、30μg/ml マイトマイシンCで30分間処理し、1μM Tax38−46ペプチドを作用させたL929細胞(2.5×106細胞/ml)と4:1の割合で混合し、10U/ml マウスIL−2を含む完全RPMI1640培地中で5日間共培養(37℃、5% CO2)し、エフェクター細胞とした。標的細胞には、1μM Tax38−46ペプチドを作用させたL929細胞をNa2 51CrO4で標識(0.56 MBq/106細胞、37℃、1時間)したものを用いた。標的細胞を104細胞/ウェルの濃度で96ウェルプレートに入れ、次に、エフェクター細胞を12.5、25、50、100×104細胞/ウェルの濃度で加え、37℃にて4時間インキュベーションし、上清中の51Cr活性を測定した。CTL活性を以下に示す式に従い算出した。
溶解(%)=100×{(エフェクター細胞による51Cr遊離量)−(自然51Cr遊離量)}/{(最大51Cr遊離量)−(自然51Cr遊離量)}
図9(a)に示すように、γ−PGAナノ粒子を用いて免疫したマウスの脾臓において、PBS免疫群(図9(d))と比較して、Tax38−46特異的CTLの誘導が認められた。これは、CFA/Tax38−46免疫群(図9(b))よりも強力な抗腫瘍作用であった。また、Tax38−46単独免疫群ではCTL活性は全く認められなかった(図9(c))。この実施例で得られたTax38−46固定化ナノ粒子もまた、実施例6および7で得られたものと同様の性質・特徴を有していた。
A.材料
B16メラノーマ細胞にハイグロマイシンB耐性遺伝子と共にOVA cDNAを導入したB16−OVA細胞は熊本大学大学院医学薬学研究部免疫識別学分野 西村泰治先生より供与いただき、培養には10% FBS、50μM 2−MEおよび200μg/ml ハイグロマイシンBを含むDMEMを用いた。C57/BL6マウス(H−2b;7〜10週齢、雌性)は日本SLCより購入した。その他の材料は上述の通りである。
C57BL/6マウスの尾静脈内にB16−OVA細胞(1×106細胞)を投与した。接種後0、3、7日目に、上述の通り製造したOVA内包γ−PGAナノ粒子(γ−PGAナノ粒子/OVA)、CFAによりエマルジョン化したOVA(CFA/OVA)またはOVA溶液(OVA単独)を背部皮下に投与することで免疫した(n=9)。用いたOVAは100μgであった。ネガティブコントロールとしてPBSを投与した。25日目に肺を摘出してブアン溶液(ピクリン酸飽和溶液:ホルムアルデヒド:氷酢酸=15:3:1)にて固定し、肺表面の転移コロニー数を実体顕微鏡下で計測した。統計的有意性をマン・ホィットニー検定を用いて検定した。結果を、PBS投与群における転移コロニー数に対する割合(%)として表す(図10)。
γ−PGAナノ粒子/OVA免疫群(p<0.01)は、高い肺転移能を有するB16−OVA細胞の肺への生着を妨げる肺転移抑制効果を有することが確認できた。さらにその効果はCFA/OVA(p<0.01)よりも強力なものであった。また、γ−PGAナノ粒子/OVAが治療においても有用であることが確認できた。
A.方法
10mg/ml γ−PGAナノ粒子、等量のPBSでエマルション化したCFAおよびIFA、またはPBS(20μl/マウス)をマウス足蹠皮下に投与した。投与後7日目に足蹠を切断し、10% 中性緩衝ホルマリンによる固定処理を行った後、パラフィンブロックに包埋した。5μmの組織切片を作製し、ヘマトキシリン−エオシン染色した標本の病理組織学的観察を行った。
B.結果
CFAおよびIFAを投与したマウスの皮下組織において炎症反応が誘導されているのに対して、γ−PGAナノ粒子は投与局所に若干の障害を与えるのみであり、観察された炎症性細胞の浸潤も僅かななものであった(データは示していない)。γ−PGAナノ粒子が高い安全性を有することが確認できた。
Claims (14)
- ポリ(γ−グルタミン酸)とL−フェニルアラニンエチルエステルとをカップリングして得られる両親媒性ポリアミノ酸を含むアジュバント。
- 両親媒性ポリアミノ酸がナノ粒子化されている、請求項1記載のアジュバント。
- ナノ粒子のサイズが100nm〜500nmである、請求項2記載のアジュバント。
- 請求項1から3のいずれか一項記載のアジュバントを含む、ワクチン。
- ポリ(γ−グルタミン酸)とL−フェニルアラニンエチルエステルとをカップリングして得られる両親媒性ポリアミノ酸を含むアジュバントに、ウイルス抗原を固定化した、生分解性ナノ粒子。
- ウイルス抗原がレトロウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、フラビウイルス抗原、下痢症ウイルス抗原、およびコロナウイルス抗原からなる群から選択されるものである、請求項5記載の生分解性ナノ粒子。
- ウイルス抗原がレトロウイルス抗原である、請求項6記載の生分解性ナノ粒子。
- ウイルス抗原がHIV抗原である、請求項7記載の生分解性ナノ粒子。
- サイズが100nm〜500nmである、請求項5から8のいずれか一項記載の生分解性ナノ粒子。
- 抗原がナノ粒子に内包されている、請求項5から9のいずれか一項記載の生分解性ナノ粒子。
- 抗原がナノ粒子表面に存在する、請求項5から9のいずれか一項記載の生分解性ナノ粒子。
- 抗原がナノ粒子に吸着されている、請求項5から9のいずれか一項記載の生分解性ナノ粒子。
- 請求項5から12のいずれか一項記載の生分解性ナノ粒子を含むワクチン。
- 抗HIVワクチンである、請求項13記載のワクチン。
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