JP5554407B2 - ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子を含有するアジュバント組成物 - Google Patents
ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子を含有するアジュバント組成物 Download PDFInfo
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Description
本発明の他の目的は、前記ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子と抗原とを含有するワクチン用組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子と抗原とを含有するワクチンの製造方法を提供することにある。
また、本発明は、前記アジュバント組成物をヒトを除いた動物に抗原と共に投与して、抗原に対する抗体生成率を増加させる方法を提供する。
また、本発明は、ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子と抗原とを含むワクチン用組成物を提供する。
本発明の他の特徴及び具現例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からより一層明白になる。
本発明に係るポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子を含有するアジュバント組成物において、ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子は、ワクチン組成物乾燥重量100重量部に対し、乾燥重量0.001〜5重量部で含有することを特徴とし、好ましくは乾燥重量0.01〜3重量部で含有することができる。仮に、ワクチン組成物乾燥重量100重量部に対し、乾燥重量0.001重量部未満で含有させる場合、抗体生成機能を期待できず、乾燥重量5重量部を超えるときには作用には差がないが、粘性が過度に増加するという問題が生じる。
ポリγ−グルタミン酸産生用基本培地(3%のL−グルタミン酸が添加された培地、グルコース3%、(NH4)2SO4 1%、KH2PO4 0.27%、Na2HPO4.12H2O 0.17%、NaCl 0.1%、クエン酸ナトリウム0.5%、ソイペプトン0.02%、MgSO4.7H2O 0.7%、ビタミン水溶液10mL/L、pH6.8)を滅菌、準備して、5L ジャーファーメンター(working vol. 3L)にバチルスサブチルスチョンクッジャン菌株(Bacillus subtilis var chungkookjang、KCTC 0697BP)の種菌培養液(LB medium)を4%接種して、発酵させた。攪拌速度は、500rpm、空気注入速度は1.0vvmにして、37℃で48時間発酵させた後、小型フィルタープレス(硅藻土celite 1%)を利用して、菌体を取り除いてポリγ−グルタミン酸含有試料液として用いた。
実施例1で製造されたポリγ−グルタミン酸とキトサン(Amicogen Co.,Korea)を利用して、アジュバントとして用いるナノ粒子を製造した。
使用するポリγ−グルタミン酸及びキトサンは0.85%NaCl溶液に溶解して用いた。ポリγ−グルタミン酸とキトサンの混合比を1:1〜8:1の割合でキトサン溶液にポリγ−グルタミン酸溶液を混合して、表面電荷が陰電荷を持つポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子を製造した。製造されたナノ粒子は、DLS(Dynamyc Light Scattering)を利用して、粒度及び表面電荷を測定した。その結果、200〜300nm大きさのナノ粒子が製造されることを確認し、ナノ粒子の表面電荷が−20.8mVと測定された。また、製造されたナノ粒子の表面形態は電子顕微鏡を用いて観察した(図1)。
実施例2で確認されたポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子にタンパク質を導入させ、該当タンパク質に対する抗体生成率を増加させるためのアジュバントとして機能するか否かの検証のために、該当タンパク質のPI値を検討して、混合順によるナノ粒子を製造した。まずpI値が5.2であるOVA(SIGMA,USA)タンパク質に蛍光物質のFITCを結合させたOVA−FITCをポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子に結合させた。結合方法でポリγ−グルタミン酸とOVA−FITCをまず混合した後、キトサンを混合して製造した試料とキトサンとOVA−FITCをまず混合した後、ポリγ−グルタミン酸を混合して製造したナノ粒子二種類を製造して、蛍光顕微鏡によってOVAの結合の程度を確認した。
本実施例では本発明のポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子が、OVA抗原に対して特異的免疫増進効果を示すのか調べるために、抗体特異的な免疫反応中、特に抗体産生と関連があるB細胞による体液性免疫反応(humoral immuneresponse)に及ぼす影響を調べた。
ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子によるマウス脾臓内T細胞のOVAに対する細胞性免疫反応を調べた。実施例4で処理したマウスをグループ当り5匹ずつを選択して、それぞれのマウスから脾臓を摘出して、滅菌されたペトリディッシュに前記脾臓組織を移した。セルストライナー(cell strainer)を用いて、前記脾臓をこすりつけ、組織皮膜から細胞を分離した。前記ペトリディッシュ内の全ての内容物を15mLチューブに移して、RPMI培地で充填した後、1,500rpmで5分間遠心分離した後、上澄液を取り除いたペレットに赤血球溶血バッファー(red blood cell lysing buffer、sigma aldrich,Germany)を3mL入れて37℃水槽で10分間放置して、赤血球を溶血させた。チューブに含まれた細胞をPBSで洗浄した後、RPMI1640培地に浮遊させて、脾臓細胞(splenocyte)を分離した。分離した脾臓細胞を1x106cells/mLで24ウエルプレートに敷いて、golgi plug 2μLとMHCクラスI拘束OVAペプチドを1μg/mLの濃度で12時間処理した。その後、T細胞の表面分子であるCD8に対する特異的抗体(PE-conjugated anti-mouse CD8)を利用して、4℃で1時間染色した後、サイトフィックス/サイトパーム(Cytofix/Cytoperm)キット(BD Biosciences,USA)で細胞に穴を開けて、IFN−γに特異的な抗体(FITC conjugated anti-mouse IFN-γ)で細胞内部のIFN−γを染色した。
本実施例では、本発明のポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子が鳥インフルエンザウイルス(Avian influenza virus、AIV)特異抗原タンパク質であるHA(hemagglutinin)タンパク質に対し特異的免疫増進効果を示すか調べるために、抗体特異的な免疫反応中、特に抗体産生と関連があるB細胞による体液性免疫反応に及ぼす影響を調べた。
最初、皮下注射または鼻腔注射後、1週毎にマウス血清を採取して、血清中のHAタンパク質に対する抗体の力価をELISA法で測定した。
各グループ毎のマウス血清における抗体力価測定は、下記のHIテスト法で測定した。
全ての血清は、ビブリオコレラから抽出したRDE(receptor-destroying enzyme)を血清サンプル体積対比1:3で処理した後(例えば、血清10μLにRDE30μL添加)、37℃培養器で18〜20時間培養した。血清内の非特異的な受容体の活性を取り除いたサンプルを96ウエル丸底プレートで25μLずつ順に2進希釈した。次に、血清サンプルに同じ体積の4HAUウイルスを入れて、37℃培養器で30分間反応させて、最後に0.5%鶏赤血球が含まれたPBSを50μLずついれた後、室温で40分間反応させた。力価は希釈された50μL範囲で計算された値で、log10N=10NでN値で表記した。
本実施例では、ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子の鳥インフルエンザウイルスに対する免疫増強効果を調べるために、インフルエンザウイルスを感染させた実験動物の斃死を確認した。
病原体として使われたインフルエンザウイルスは忠北(チュンブク)大学医科大学微生物学実験室崔ヨンギ教授から分譲された、マウスにおいて高病原性を示すH1N1インフルエンザウイルス株(A/Puerto Rico/8/34(H1N1))をMadin−Darby canine kidney(MDCK) cellで増幅した後、実験に用いて、実験動物としては6周齢の雌Balb/Cマウスを用いた。
分譲されたウイルスの純粋分離は次のとおり実施した。
次に、6ウエル細胞培養プレートでペニシリンとストレプトマイシンと5%牛胎児血清(fetal bovine serum、FBS)が含まれたalpha−MEM(minimun essential medium、Gibco,USA)培地で育ったMDCK cellをPBSで3度洗浄をして、ペニシリンとストレプトマイシン(以下P/S)は含むがFBSが入っていない培地で希釈して、各ウエルにウイルスを希釈してから感染させた後、5%二酸化炭素が充填された37℃細胞培養器で1時間培養した。FBSが入っていない0.1%TPCK(N-alpha-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone)処理トリプシンEDTAとP/Sが含まれたalpha−MEM培地を各ウエルに入れ、細胞培養器で培養した。培養24時間後、細胞培養プレートをPBSで洗浄して、培地を含んでいる0.1%ノーブルアガーを用いて固定した。
まず、対照群としては、インフルエンザウイルスを単独で鼻腔内投与または皮下注射したマウスを用いて、実験群はポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子とAI抗原タンパク質を混合し皮下注射または鼻腔内投与した後、翌日インフルエンザウイルスを投与した。
ウイルスの感染は、実験動物にジエチルエーテルを用いて30秒間麻酔した後、ウイルス30μLを各マウスに鼻腔を通して、1.25×105EID50投与した。
その結果、図9に示したように、対照群はウイルス投与後8日目に全例死んだが、ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子とAIタンパク質混合投与群の場合、11日経過後の間、全て生存した。これは、ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子によってAIタンパク質に対する抗体生成を誘導して、ウイルス感染を抑制することによって、個体が生存するようになったものと判断される。
本実施例では、ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子のインフルエンザウイルスに対する免疫増強効果を調べるために、インフルエンザワクチンに対するポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子のアジュバント効果を確認した。
抗原として用いられたインフルエンザワクチンは、H1N1インフルエンザウイルス株(A/California/07/09(H1N1))ワクチン抗原を用いた。
(2)動物実験
対照群としてはPBSだけを筋肉注射したマウスを用い、実験群はインフルエンザワクチン(0.2μg)だけを筋肉注射したマウスとインフルエンザワクチン(0.2μg)とAlumアジュバントを混合して、筋肉注射したマウス、及びインフルエンザワクチン(0.2μg)とポリγグルタミン酸−キトサンナノ粒子(800μg)を混合して、筋肉注射したマウスを用いた。
各グループ毎のマウス血清における抗体力価測定は、下記HI(Hemagglutination Inhibition)テスト法で測定した。
各グループ毎の最後のワクチン注射後、14日目にインフルエンザウイルス(A/California/04/09(H1N1))を投与した。
ウイルス感染は、実験動物に麻酔をかけた後、各107.25 EID50のウイルス30μLずつ鼻腔を通して投与した。
Claims (11)
- ポリγ−グルタミン酸とキトサンとがイオン結合によって結合されているポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子を含有するアジュバント組成物。
- 前記ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子の表面電荷は陰電荷であることを特徴とする請求項1に記載のアジュバント組成物。
- 請求項1又は2に記載のアジュバント組成物をヒトを除いた動物に抗原と共に投与して、抗原に対する抗体生成率を増加させる方法。
- 前記投与は、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、鼻腔内投与、口腔投与、経皮投与及び経口投与からなる群より選択されるいずれか一つの方法で行われること特徴とする請求項3に記載の方法。
- 抗原を含むワクチン用組成物において、ポリγ−グルタミン酸とキトサンとがイオン結合によって結合されているポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子と、前記抗原とがイオン結合されていることを特徴とするワクチン用組成物。
- 前記抗原は、タンパク質、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド及びウイルスからなる群から選択されたことを特徴とする請求項5に記載のワクチン用組成物。
- 鳥インフルエンザウイルス、豚インフルエンザウイルス及び新種インフルエンザウイルスからなる群から選択されたいずれか一つ以上のウイルスによる疾病の予防用または治療用であることを特徴とする請求項5又は6に記載のワクチン用組成物。
- 次の工程を含むポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子と表面電荷が陰電荷の抗原を含むワクチンの製造方法:
(a)表面電荷が陰電荷の抗原とキトサンとをイオン結合させる工程、及び
(b)前記キトサンと結合した抗原にポリγ−グルタミン酸を添加して、キトサンとポリγ−グルタミン酸とをイオン結合させて、ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子と抗原が結合されているワクチンを製造する工程。 - 次の工程を含むポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子と表面電荷が陽電荷の抗原を含むワクチンの製造方法:
(a)表面電荷が陽電荷の抗原とポリγ−グルタミン酸をイオン結合させる工程、及び
(b)前記ポリγ−グルタミン酸と結合した抗原にキトサンを添加して、ポリγ−グルタミン酸とキトサンとをイオン結合させて、ポリγ−グルタミン酸−キトサンナノ粒子と抗原が結合されているワクチンを製造する工程。 - 請求項5〜7のいずれか一項に記載のワクチン用組成物をヒトを除いた動物に投与して、抗原に対する抗体生成率を増加させる方法。
- 前記投与は、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、鼻腔内投与、口腔投与、経皮投与及び経口投与からなる群より選択されるいずれか一つの方法で行われること特徴とする請求項10に記載の方法。
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