CN107456574B

CN107456574B - 一种无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN107456574B
Application number: CN201710693401.3A
Authority: CN
Inventors: 张建; 王海刚; 韩秋菊; 徐东青; 赵华俊
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2017-08-14
Filing date: 2017-08-14
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2037-08-14
Also published as: CN107456574A

Abstract

本发明公开了一种无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗及其制备方法，该无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗的制备步骤如下：在恒温搅拌条件下，逐步混合CS、HBsAg、γ‑PGA溶液，即可制备正电荷或者负电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗。正电荷HBsAg纳米凝胶疫苗只需要单剂量注射即可获得有效的抗体表达，增强细胞免疫，能够更好提高接种者顺从性，保证HBV预防的普遍实施。该疫苗能够诱导免疫记忆的形成，对接种者进行长久免疫保护。负电荷HBsAg纳米凝胶疫苗单剂量注射虽然没有明显的抗体产生，但是与正电荷HBsAg纳米凝胶疫苗联合应用，能够获得更强的细胞免疫，能够具有更好的对HBV的长效免疫保护。

Description

一种无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种新型的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗及其制备方法。

背景技术

据最近的统计，全世界大约有20亿人曾经感染过乙肝病毒(HBV)。其中，超过3.5亿转变为慢性乙肝病毒(CHB)携带者，他们将会有转化为肝硬化和肝癌的风险。每年因HBV感染造成患者死亡约200万人左右。中国是慢性HBV感染的重灾区，HBV携带者的比例高达9.3％。因此，HBV引起的持续性病毒感染仍严重危害我国人民健康，影响我国人口素质的提高。

预防性免疫是当前控制HBV感染最好的方法。自1982年起，安全有效的HBV预防性疫苗已上市销售。这种疫苗是从慢性乙肝患者的血浆中收集乙肝表面抗原(HBsAg)制作，存在一定的安全性问题，而且由于来源困难，难以满足普遍接种的需要。之后，重组DNA技术的发展使大量生产HBsAg疫苗变为现实。该类疫苗是采用基因工程的重组技术，首先把HBsAg的基因片段插入酵母细胞或哺乳动物细胞基因中，在体外培养增殖过程中组装或分泌HBsAg，将其收集、提纯，辅以磷酸铝或氢氧化铝为佐剂制成的乙肝疫苗。现在重组疫苗己在大部分国家广泛应用。1999年之后，美国批准HBV疫苗可以在婴儿和儿童使用。我国卫生部近10多年来不断加大HBV防控工作力度，采取预防为主的综合防控措施，取得了显著成就，目前接种率均在90％以上。在新生儿计划免疫实施20多年后，我国儿童乙肝发病率、HBV携带率有了明显的下降。

但是，铝佐剂乙肝疫苗在应用中，越来越多不完善的地方暴露出来。目前，国内外大多使用乙肝免疫流程为WHO推荐使用的0、1、6月进行三次免疫接种，需要耗时六个月。这无论从经济上还是使用便利上都限制了现行HBV疫苗在发展中国家的广泛应用。有研究显示，该方法的免疫接种完成率仅为50％左右，部分接种者无法按该流程进行全程接种，从而导致无(弱)免疫应答，成为乙肝易感人群。而且，尽管铝化合物作为佐剂通常认为是比较安全的，但是越来越多的潜在副作用被报道。例如，无菌性脓肿、嗜酸性粒细胞增多、肌筋膜炎、肉芽肿形成和阿尔茨海默氏病等。尽管，现有乙肝疫苗可使大约95％的接种人群产生乙肝抗体，但由于铝佐剂疫苗只能诱导体液免疫，不能激发细胞免疫而降低了乙肝疫苗的免疫效果，仍有少部分人对乙肝疫苗无应答或低应答，不能产生足够抗体预防HBV感染。更重要的是，继新生儿乙肝疫苗计划免疫策略实施20多年来，小年龄组人群乙肝的发病率得到有效的控制，但是成人作为乙肝发病的高危人群并没有改变。有研究报道，20-49岁的乙肝报告发病率超过100/10万。成人乙肝发病率较高的原因是，尽管新生儿期接种过乙肝疫苗，但随着时间的推移，乙肝获得性免疫减弱，重新成为乙肝易感的高危人群。

综上，目前制约现有乙肝疫苗应用的主要原因包括：一是铝佐剂疫苗免疫接种次数多，耗费时间长，限制疫苗接种全面开展；二是铝佐剂疫苗的免疫记忆时间短，随着时间推移，乙肝获得性免疫会减弱；三是铝佐剂疫苗只能诱导体液免疫，少部分人不能产生足够抗体预防HBV感染；四是铝化合物作为佐剂可能导致多种不良反应，影响接种人群用药安全。因此，开发新型的乙肝疫苗对于乙型肝炎的防治具有十分重要的意义。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗及其制备方法。本发明的疫苗单次免疫即可获得良好的免疫效果，而且免疫记忆时间长，延长了疫苗的作用时间。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种表面带正电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗的制备方法，步骤如下：

在搅拌条件下向壳聚糖(Chitosan，CS)溶液中滴入HBsAg溶液，搅拌稳定后，再滴入聚γ谷氨酸(Polyglutamic Acid，γ-PGA)溶液，恒温搅拌，即制备得到表面带正电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗；

所述壳聚糖溶液的浓度为2mg/ml，pH＝6；所述HBsAg溶液的浓度为25μg/ml；所述γ-PGA溶液的浓度为0.5mg/ml。

优选的，壳聚糖溶液、HBsAg溶液和γ-PGA溶液加入体积比1:1:1。

优选的，恒温搅拌的温度为40℃，恒温搅拌的时间为20min。

进一步的，用于制备本发明的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗的壳聚糖，其分子量优选为100kDa-1000kDa。若壳聚糖的分子量过小，则难以制备纳米颗粒；若分子量过大，则会影响其溶解性，经试验优化，发现壳聚糖的分子量以100kDa-1000kDa为宜。

进一步的，用于制备本发明的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗的γ-PGA，其分子量优选为100kDa-1000kDa。若γ-PGA的分子量过小，则其免疫增强作用会降低；若γ-PGA的分子量过大，则会产生与其增加的粘度相关的问题。经试验优化，发现γ-PGA的分子量以100kDa-1000kDa为宜。

本发明的第二方面，提供一种表面带负电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗的制备方法，步骤如下：

在搅拌条件下向γ-PGA溶液中滴入HBsAg溶液，搅拌稳定后，再滴入壳聚糖溶液，恒温搅拌，即制备得到表面带负电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗；

所述γ-PGA溶液的浓度为2mg/ml；所述HBsAg溶液的浓度为25μg/ml；所述壳聚糖溶液的浓度为0.5mg/ml，pH＝6。

优选的，壳聚糖溶液、HBsAg溶液和γ-PGA溶液加入体积比1:1:1。

优选的，恒温搅拌的温度为40℃，恒温搅拌的时间为20min。

进一步的，用于制备本发明的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗的壳聚糖，其分子量优选为100kDa-1000kDa。进一步的，用于制备本发明的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗的γ-PGA，其分子量优选为100kDa-1000kDa。

本发明的第三方面，提供由上述制备方法制备得到的表面带正电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗和表面带负电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗。

本发明通过调节壳聚糖和聚γ谷氨酸的加入量，以及加入的顺序，可以得到表面带不同电荷的HBsAg纳米凝胶疫苗。

在本发明的一种制备方案中(壳聚糖溶液的浓度为2mg/ml，pH＝6；γ-PGA溶液的浓度为0.5mg/ml)，制备得到的是一种表面带正电荷的HBsAg纳米凝胶疫苗(HBsAg Ng(+))。该疫苗的Zeta电位+38.7±1.07mV，平均粒径265.3±7.28nm。Ng(+)对HBsAg包封率接近100％。

在本发明的另一种制备方案中(壳聚糖溶液的浓度为0.5mg/ml，pH＝6；γ-PGA溶液的浓度为2mg/ml)，制备得到的是一种表面带负电荷的HBsAg纳米凝胶疫苗(HBsAg Ng(-))。该疫苗的Zeta电位-13.80±0.56mV，平均粒径213.6±8.60nm。Ng(-)对HBsAg包封率约90％。

本发明在试验过程中发现，与表面电荷为负电荷的HBsAg Ng(-)及市售铝佐剂HBsAg疫苗相比，正电荷HBsAg Ng(+)能够更迅速产生更强效的抗体，单次免疫即可获得对HBV感染的长久免疫防御。

本发明进一步的试验发现，负电荷HBsAg Ng(-)免疫虽然抗体诱导作用很弱，但是与HBsAg Ng(+)联合能够诱导更强的针对HBV-challenge的细胞免疫应答，有利于减少不应答人群，获得对HBV的长效免疫防御。

本发明的有益效果：

(1)本发明制备的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗，采用的敷料CS、γ-PGA均为天然来源，安全、无毒、生物可降解，无免疫原性，已广泛用作药剂敷料。CS为正电荷多糖化合物，γ-PGA为负电荷多聚氨基酸。CS与γ-PGA通过静电作用即可制备高蛋白载量纳米凝胶(Nanogel，Ng)。调整CS与γ-PGA比例可分别获得正、负电荷Ng。所得制剂安全、经济、制备方便，有利于免疫接种的全面实施。该制剂不需要铝佐剂的加入，能够避免铝佐剂相关不良反应的发生。

(2)小鼠体内免疫证实，本发明制备的无佐剂单剂量正电荷HBsAg纳米凝胶疫苗能够比铝佐剂HBsAg疫苗更快地产生抗体，抗体水平更高。单次肌肉注射免疫后，该制剂能够显著诱导抗体产生，而负电荷HBsAg纳米凝胶疫苗与市售铝佐剂HBsAg疫苗不能产生抗体。进行pAAV HBV1.2质粒高压尾静脉注射诱导HBV感染后一周观察，正电荷HBsAg纳米凝胶能够迅速清除HBV，恢复小鼠抗体水平。负电荷HBsAg纳米凝胶能够显著清除HBV，但是没有观察到抗体。因此，正电荷HBsAg纳米凝胶单次免疫即可获得良好的免疫效果，可以减少给药次数，简化免疫过程。

(3)小鼠单次免疫后，可以发现正电荷HBsAg纳米凝胶与负电荷HBsAg纳米凝胶免疫小鼠HBV-challenge后脾脏DC细胞比例显著增加，DC细胞CD80、CD86表达显著上升。正电荷HBsAg纳米凝胶免疫小鼠的腹股沟淋巴结淋巴细胞中滤泡辅助性T细胞(Tfh)和生发中心B细胞(GC B)比例显著上升。Ng(+)、Ng(-)均能够更好促进DC成熟，增强抗原有效递呈。正电荷HBsAg纳米凝胶可促进淋巴滤泡中Tfh细胞、GC B细胞的增加，增强免疫后体液免疫应答。

(4)免疫后小鼠在接受HBV-challenge时，对小鼠CD8⁺T活化水平检测可以发现，正电荷HBsAg纳米凝胶免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ⁺CD8⁺T细胞比例显著上升。负电荷HBsAg纳米凝胶免疫小鼠脾淋巴细胞，IFN-γ⁺CD8⁺T与TNF-α⁺CD8⁺T比例均有显著上升。因此，本发明制备的无佐剂单剂量正、负电荷纳米凝胶均可作为HBsAg载体促进诱导细胞免疫应答，有助于HBV-challenge后的病毒清除，有利于减少不应答人群。

(5)与市售铝佐剂疫苗相比，本发明制备的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗单次免疫后能够显著诱导记忆性T细胞增殖。Ng(+)组具有较高的效应型记忆T细胞(T_EM)水平，Ng(-)组具有较高的T_EM和中枢记忆T细胞(T_CM)水平。而且，本实验中进行三个月的长期观察可以证实，Ng(+)组在进行HBV-challenge后能够迅速清除HBV，恢复抗体水平。Ng(+)/Ng(-)组免疫后虽然抗体水平较Ng(+)组低，但是HBV-challenge后能够同样能够迅速清除HBV。而且，Ng(+)/Ng(-)组HBV-challenge后具有更高的IFN-γ⁺CD8⁺T与TNF-α⁺CD8⁺T比例。因此，HBsAg Ng(+)与HBsAg Ng(-)的联合使用有利于减少不应答人群，获得长期免疫记忆。

综上，本发明制备的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗能够增强疫苗诱导的免疫记忆，延长疫苗作用时间。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：HBsAg纳米凝胶透射电镜图；

图2：无佐剂HBsAg纳米凝胶疫苗体液免疫诱导能力评估结果；

图3：无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗免疫清除HBV能力评估结果；

图4：无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗免疫对细胞免疫的促进作用评估结果；

图5：无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗免疫对小鼠免疫记忆影响评估结果；

图6：无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗免疫对小鼠HBV感染的长久免疫保护评估结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：表面带正电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗的制备

具体制备方法如下：

CS溶液(2mg/ml，pH＝6)，在搅拌下滴入HBsAg溶液(25μg/ml)，搅拌稳定后，滴入γ-PGA溶液(0.5mg/ml)，40℃恒温搅拌20分钟，即制备得到无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗(HBsAg Ng(+))。

实施例2：表面带负电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗的制备

具体制备方法如下：

γ-PGA溶液(2mg/ml)，在搅拌下滴入HBsAg溶液(25μg/ml)，搅拌稳定后，滴入CS溶液(0.5mg/ml，pH＝6)，40℃恒温搅拌20分钟，即制备得到无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗(HBsAg Ng(-))。

对实施例1和实施例2制备的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗进行理化性质考察：

粒径、Zeta电位通过英国马尔文仪器公司生产的纳米粒度仪(Zetasizer NanoZS90)测定。形态通过JEM-100CXII透射电镜(日本Jeol公司)。HBsAg包封率通过离心机(40000×g，20min)，测定上清游离HBsAg间接测定。透射电镜观察结果(图1)显示，实施例1制备的HBsAg纳米凝胶疫苗(图1中A)表面带正电荷，为均匀球状结构。Zetasizer纳米粒度仪结果显示，HBsAg Ng(+)Zeta电位+38.7±1.07mV，平均粒径265.3±7.28nm。Ng(+)对HBsAg具有很高的荷载效率，包封率接近100％。

实施例2制备的HBsAg纳米凝胶疫苗(图1中B)表面带负电荷，为均匀球状结构。Zetasizer纳米粒度仪结果显示，HBsAg Ng(-)Zeta电位-13.80±0.56mV，平均粒径213.6±8.60nm。Ng(-)对HBsAg包封率约90％。

试验例1：无佐剂HBsAg纳米凝胶疫苗体液免疫诱导能力评估

1.试验方法：

以同等剂量市售铝佐剂HBsAg疫苗、生理盐水(NS)作为对照，评估实施例1(HBsAgNg(+))和实施例2制备的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗(HBsAg Ng(-))抗体诱导能力。

C57BL/6小鼠分别注射生理盐水(NS)、市售铝佐剂HBsAg疫苗(HBsAg(Al))、HBsAgNg(-)、HBsAg Ng(+)(含HBsAg 1μg)，给药间隔2周，分别免疫1次、2次或3次。免疫后定时从尾静脉采集血样，分离血清，测定anti-HBs抗体表达。

2.试验结果：

在免疫2次或者3次时，HBsAg Ng(+)可以获得比HBsAg(Al)更快的抗体表达，抗体水平更高(如图2中A和B所示，其中A表示免疫3次，B表示免疫2次)。免疫1次时只有HBsAg Ng(+)可以获得有效的抗体(如图2中C所示)。结果表明：HBsAg Ng(+)免疫具有比HBsAg(Al)更快、更有效的抗体表达。

试验例2：无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗免疫清除HBV能力评估：

以HBsAg(Al)、生理盐水(NS)作为对照，评估壳聚糖-聚γ谷氨酸纳米凝胶免疫后小鼠接受pAAV HBV1.2质粒高压尾静脉注射后的HBV清除能力。

单次免疫后，对抗原的清除能力如图3中A所示；对抗体的恢复能力如图3中B所示。

结果可以发现，单次免疫后HBV challenge，只有HBsAg Ng(+)免疫能够迅速清除HBV，恢复抗体表达。HBsAg Ng(-)免疫具有较明显的HBV清除，但是没有明显的抗体产生。HBsAg(Al)免疫后进行HBV-challenge后，抗原、抗体水平与未免疫小鼠无差异。因此，HBsAgNg(+)单次免疫即可迅速清除感染病毒，恢复机体抗体水平。

试验例3：无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗免疫对细胞免疫的促进作用评估：

以生理盐水(NS)、HBsAg(Al)作为对照，评估壳聚糖-聚γ谷氨酸纳米凝胶单次免疫后对小鼠细胞免疫应答的影响。

具体实验方法为：生理盐水(NS)、HBsAg(Al)、HBsAg Ng(-)、HBsAg Ng(+)单次免疫后一月进行HBV-challenge，观察一周后处死，取脾淋巴细胞，PMA、Ion共孵育1h，加BFA继续孵育3h。取脾淋巴细胞进行流式观察，结果如图4所示。

由图4可以看出，单次免疫后进行HBV-challenge，HBsAg Ng(+)免疫小鼠具有更高的IFN-γ⁺CD8⁺T细胞水平，细胞免疫应答显著增强。而且，HBsAg Ng(-)免疫小鼠IFN-γ⁺CD8⁺T细胞和TNF-α⁺CD8⁺T细胞比例显著增加，细胞免疫应答显著增强。而NS、HBsAg(Al)免疫对细胞免疫没有促进作用。

结果表明：HBsAg Ng(+)、HBsAg Ng(-)单次免疫均有利于促进小鼠细胞免疫应答。

试验例4：无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗免疫对小鼠免疫记忆影响评估：

以生理盐水(NS)、HBsAg(Al)作为对照，评估壳聚糖-聚γ谷氨酸纳米凝胶单次免疫后对小鼠免疫记忆的影响。单次免疫后进行HBV-challenge，第7天处死小鼠，收集脾淋巴细胞，流式测定CD44^hiCD62L^low(T_EM)和CD44^hiCD62L^hi(T_CM)，结果分别如图5中A和B所示。

由图5可以看出，HBsAg Ng(+)单次免疫即可显著增强效应型记忆T细胞(T_EM)。HBsAg Ng(-)单次免疫即可显著增强中枢记忆T细胞(T_CM)和T_EM。

试验例5：无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗免疫对小鼠HBV感染的长久免疫保护

以生理盐水(NS)作为对照，评估壳聚糖-聚γ谷氨酸纳米凝胶单次免疫后对小鼠HBV感染的长期免疫保护作用。HBsAg Ng(+)、HBsAg Ng(+)/Ng(-)单次免疫后三个月测定抗体水平，进行HBV-challenge，测定HBsAg清除和抗体恢复水平，第7天处死小鼠，收集脾淋巴细胞，流式测定PMA、Ion刺激后CD8⁺T细胞IFN-γ、TNF-α表达，结果如图6所示。

免疫后三个月后HBsAg Ng(+)免疫具有最高的抗体水平，HBsAg Ng(+)/Ng(-)免疫抗体水平较低(如图6中A所示)。免疫三个月后对小鼠进行HBV-challenge，HBsAg Ng(+)、HBsAg Ng(+)/Ng(-)免疫均能够迅速清除HBV(如图6中B所示)，恢复小鼠抗体水平(如图6中C所示)。结果表明：HBsAg Ng(+)、HBsAg Ng(+)/Ng(-)单次免疫能够诱导对小鼠HBV感染的长久保护。另外，HBsAg Ng(+)/Ng(-)免疫虽然诱导抗体水平较低，但是具有更高的CD8⁺T细胞IFN-γ、TNF-α表达(如图6中D、E、F所示)。因此，联合HBsAg Ng(+)、HBsAg Ng(-)单次免疫能够获得更强的细胞免疫，有利于减少不应答人群，具有更好的对HBV的长效免疫保护。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种表面带正电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗，其特征在于，

其制备方法步骤如下：

在搅拌条件下向壳聚糖溶液中滴入HBsAg溶液，搅拌稳定后，再滴入γ-PGA溶液，恒温搅拌，即制备得到表面带正电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗；

所述壳聚糖溶液的浓度为2mg/ml，pH＝6；所述HBsAg溶液的浓度为25μg/ml；所述γ-PGA溶液的浓度为0.5mg/ml；

其中，壳聚糖溶液、HBsAg溶液和γ-PGA溶液加入体积比1:1:1；

壳聚糖的分子量为100kDa-1000kDa；γ-PGA的分子量为100kDa-1000kDa；

恒温搅拌的温度为40℃，恒温搅拌的时间为20min。

2.一种如权利要求1所述的疫苗与表面带负电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗联用在制备乙肝疫苗中的应用，其特征在于，该乙肝疫苗具有如下作用：

1)单次免疫有利于诱导对HBV感染的长效免疫防御，长期观察中HBV-challenge后迅速清除HBV，恢复抗体水平；

2)单次免疫更有利于诱导细胞免疫应答，长期观察中HBV-challenge后具有更高的IFN-γ⁺CD8⁺T细胞与TNF-α⁺CD8⁺T细胞比例;

其中，表面带负电荷的无佐剂单剂量HBsAg纳米凝胶疫苗的制备方法步骤如下：

所述γ-PGA溶液的浓度为2mg/ml；所述HBsAg溶液的浓度为25μg/ml；所述壳聚糖溶液的浓度为0.5mg/ml，pH＝6；

壳聚糖溶液、HBsAg溶液和γ-PGA溶液加入体积比1:1:1；

恒温搅拌的温度为40℃，恒温搅拌的时间为20min；

壳聚糖的分子量为100kDa-1000kDa；γ-PGA的分子量为100kDa-1000kDa。