CN103405386A - 一种脂质体的制备方法及制作脂质体佐剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脂质体的制备方法及其作为疫苗免疫佐剂的应用，提供的一种脂质体制备方法，包括如下步骤：1)称取氢化大豆磷脂HSPC、胆固醇CHOL、1，2-二油酰氧基三甲基氯化铵DOTAP-Cl或者1，2-二硬酯酰磷脂酰甘油钠盐DSPG-Na、维生素VE，按质量分数70～90∶0～30∶10～20∶0.5的比例制成混合物；2)将步骤1所述混合物溶解于氯仿/甲醇溶剂中得到溶液，所述氯仿/甲醇溶剂由体积比为24∶72∶4-5.1的氯仿、甲醇和超纯水组成；3)称取固体支持物，再加入上述类脂的有机溶液，搅拌均匀，旋转蒸去有机溶剂。该制备方法工艺简单，成本低，适于大量培养脂质体并应用于疫苗免疫佐剂。

Description

一种脂质体的制备方法及制作脂质体佐剂的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种脂质体的制备方法及其作为疫苗免疫佐剂的应用。

背景技术

疫苗接种防治疾病是一种非常有效的方法，但某些传统疫苗能引起不同程度的副作用。近年来，随着免疫学研究的不断深入及基因工程技术的迅速发展，活载体疫苗、DNA疫苗和蛋白质疫苗等新型疫苗的研究取得了可喜的进步。这些新型疫苗纯度高、特异性强，但免疫原性弱，诱导机体产生的免疫应答不够强，因此，运用既安全又有效的佐剂来增强疫苗效果已成为当前急待解决的问题。

目前唯一被正式批准用于人类疫苗的佐剂是铝佐剂(主要成分为氢氧化铝或磷酸铝)。尽管多年来的实践证明铝佐剂基本上是安全有效的，但它也有很大局限性，而且这种单一类型的佐剂无法满足多种疫苗对多种类型佐剂的不同需要。为满足疫苗产业的发展，运用一些新的手段和方法开发新型佐剂势在必行。在国外新型佐剂的研发已成为热点，而国内虽研究较多，但尚处于起步阶段。

1965年由英国的Bangham首先发现磷脂在水中可以自发形成脂质体(liposomes)以来，对其试验研究日渐广泛。脂质体的这种结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两性的物质，它们被包入脂质体内部水相，或插入类脂双分子层，或吸附、联接在脂质体的表面。作为模拟细胞膜和药物载体，脂质体的研究和应用正日渐深入与广泛。起初曾设想，将药物包裹在脂质体内部，能逃避或减轻宿主对药物产生免疫应答，但是1974年Allison和Gregoriadis发现，脂质体对掺在其中的白喉类毒素具有明显的免疫佐剂作用，从此揭开了脂质体作为免疫增强剂研究的序幕。随着人用脂质体疫苗资料的进一步积累，脂质体可望在不久的将来成为继铝佐剂之后又一种被批准用于人类疫苗的新型佐剂。

脂质体作为佐剂具有许多独特的优点：(1)抗原与脂质体单纯混合就可增强抗原的免疫原性，若包裹或固定在脂质体上则更强；(2)具有天然靶向性，可将抗原靶向网状内皮系统，从而优先被抗原递呈细胞(APC)所摄取；(3)副作用小、程度轻，无全身毒性反应，可生物降解，本身无毒性和免疫原性，尚未发现脂质体疫苗诱导变态反应和自身抗体的现象；(4)仓库效应，脂质体对包裹的抗原有缓释作用，使机体长时间保持高滴度抗体，减少抗原的剂量及接种次数；(5)可改变免疫应答的类型和方式，可同时诱导体液和细胞免疫，明显优于细胞免疫诱导力差的铝佐剂，增强体液免疫表现在抗体的亚型转换、滴度升高、持续时间长，还可产生免疫记忆；(6)脂质体中可包入单磷脂酰脂质A(MPL)、γ干扰素、白细胞介素2和细胞因子等，发挥协同作用，刺激和促进APC对抗原的加工、递呈及免疫细胞间相互作用；进一步增强体液和细胞免疫，同时减少了常规佐剂的用量、毒性以及抗原的用量；(7)脂质体具有抗原递呈作用，在无APC及主要组织相容性复合体分子时，脂质体内高浓度抗原亦可激活某些T细胞。

尽管随着DNA重组疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗不断涌现，免疫佐剂研究越来越受人们的关注。但是由于佐剂加强免疫反应是一个非常复杂的过程，每一种抗原的合适的佐剂配方需要重新筛选，如何开发适用HPV病毒疫苗蛋白的免疫佐剂系统目前研究较少，也没有见到关于脂质体作为HPV病毒疫苗免疫佐剂的报道。本疫苗研发部决定运用纳米技术开发新型脂质体佐剂产品，不仅能用于后续疫苗产品，为具体的疫苗品种上市作出贡献，更在于为我国该领域做出了突破，学术意义和前景市场均较大。

脂质体作为一种先进的药物传递系统，其优势已经被越来越多的人所承认。目前致力于开发脂质体药物的公司所采用的国内外技术平台和开发的产品的研发重点重要集中在3个方面：A包裹抗肿瘤的化疗药物，尤其是阿霉素类、长春新碱类和喜树碱类药物。B用作核酸类药物的载体。C用做蛋白质-多肽疫苗以及DNA疫苗的载体。

脂质体是一种有效免疫佐剂，作为疫苗的载体进行免疫治疗是一个很好的方向，可以降低铝佐剂或病毒类载体等佐剂的不良反应。提高药物的治疗指数，增强机体的免疫反应。但是，各开发人用脂质体疫苗类药物的公司大多尚处于研发阶段，取得实质性进展的只有BernaBiotech公司及Biomira公司。BernaBiotech公司采用Virosomes的技术平台，用于传送抗原、DNA-RNA、或治疗性药物。但是目前主要用作疫苗的载体。采用Virosomes技术，BernaBiotech已经开发了2个产品，一个是流感疫苗(Inflexal.V)，一个是甲肝疫苗(Epaxal.)。Biomira公司制备的脂质体药物，是将此人工抗原和佐剂掺入进去，得到脂质体疫苗。该公司正在开发的产品是BLP25脂质体疫苗目前处于临床实验阶段，该疫苗可以使机体对肿瘤相关抗原mucinMUC1产生特异性的细胞免疫反应。而在国内将脂质体用于疫苗的领域尚未见报道。

发明内容

本提供一种脂质体制备方法，该方法操作简单、易于大批量制备、避免有机溶剂对生物活性物质活性影响。所制得的脂质佐剂在制备和存储过程中较为稳定，将其应用于公司研发的预防及治疗HPV病毒相关的疾病疫苗上可得到较好的蛋白包载能力和免疫应答水平。

本发明提供的脂质体制备方法包括如下步骤：1)称取氢化大豆磷脂HSPC、胆固醇CHOL、1，2-二油酰氧基三甲基氯化铵DOTAP-Cl、维生素VE，按质量分数70～90∶0～30∶10～20∶0.5的比例制成混合物，2)将步骤1所述混合物溶解于氯仿/甲醇溶剂中得到类脂的有机溶液备用，所述氯仿/甲醇溶剂由体积比为24∶72∶4-5.1的氯仿、甲醇和超纯水组成；3)称取水溶性粉末状固体支持物置于250ml的圆底烧瓶中，再加入上述类脂的有机溶液，搅拌均匀，置于旋转蒸发仪上冰/水浴恒温的条件下旋转蒸去有机溶剂，其中所述固体支持物的质量是所述混合物质量的5倍，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、氯化钠的一种或几种；4)取下圆底烧瓶，取出固体样品，置于-18℃下密封保存。

本发明另外提供一种脂质体制备方法，包括如下步骤：1)称取氢化大豆磷脂HSPC、胆固醇CHOL、1，2-二硬酯酰磷脂酰甘油钠盐DSPG-Na、维生素VE，按质量分数70～90∶0～30∶10～20∶0.5的比例制成混合物；2)将步骤1所述混合物溶解于氯仿/甲醇溶剂中得到类脂的有机溶液备用，所述氯仿/甲醇溶剂由体积比为24∶72∶4-5.1的氯仿、甲醇和超纯水组成；3)称取水溶性粉末状固体支持物置于250ml的圆底烧瓶中，再加入上述类脂的有机溶液，搅拌均匀，置于旋转蒸发仪上冰/水浴恒温的条件下旋转蒸去有机溶剂，其中所述固体支持物的质量是所述混合物质量的5倍，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、氯化钠的一种或几种；4)取下圆底烧瓶，取出固体样品，置于-18℃下密封保存。

本发明另外提供一种使用上述脂质体制备脂质体佐剂的方法，称取按照上述方法制得的前体脂质体加入到锥形瓶中，加入适量的超纯水或缓冲液中，轻轻振荡使之分散，得到空白脂质体粗悬液；将空白脂质体粗悬液加入到高压均质机中进行高速剪切处理及高压均质处理，经0bar压力下均质3-5次，继续升高压力到300bar均质3-5次，即得到脂质体样品，将制备的脂质体样品进行115℃、30min条件下的湿热灭菌得到最终的脂质体佐剂；然后4℃条件下保存。

附图说明

图1示出的是不同胆固醇含量的脂质体溶液；

图2示出的是胆固醇含量为0％的脂质体溶液的颗粒状态；

图3示出的是胆固醇含量为10％的脂质体溶液的颗粒状态；

图4示出的是胆固醇含量为20％的脂质体溶液的颗粒状态；

图5示出的是胆固醇含量为30％的脂质体溶液的颗粒状态；

图6示出的是不同胆固醇含量的脂质体溶液中脂质体的粒径分布；

图7示出的是脂质体对HPV 16L1蛋白的吸附前后Z-Average粒径的变化情况；

图8示出的是脂质体对HPV 16L1蛋白的吸附前后Zeta电位的变化情况；

图9示出的是脂质体对VR111蛋白的吸附前后Z-Average粒径的变化情况；

图10示出的是不同胆固醇含量的脂质体溶液对小鼠成瘤率的影响；

图11示出的是不同胆固醇含量的脂质体溶液对小鼠平均肿瘤体积的影响；

图12示出的是不同胆固醇含量的脂质体溶液对小鼠体内抑瘤率的影响；

图13示出的是不同胆固醇含量的脂质体溶液对小鼠存活率的影响。

具体实施方式

称取氢化大豆磷脂HSPC、胆固醇CHOL、1，2-二油酰氧基三甲基氯化铵DOTAP-Cl、维生素VE，按质量分数70～90∶0～30∶10～20∶0.5的比例制成混合物，2)将步骤1所述混合物溶解于氯仿/甲醇溶剂中得到类脂的有机溶液备用，所述氯仿/甲醇溶剂由体积比为24∶72∶4-5.1的氯仿、甲醇和超纯水组成；；3)称取水溶性粉末状固体支持物置于250ml的圆底烧瓶中，再加入上述类脂的有机溶液，搅拌均匀，置于旋转蒸发仪上冰/水浴恒温的条件下旋转蒸去有机溶剂，其中所述固体支持物的质量是所述混合物质量的5倍，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、氯化钠的一种或几种；4)取下圆底烧瓶，取出固体样品，即得前体脂质体，置于-18℃下密封保存。

称取按照上述方法制得的前体脂质体加入到锥形瓶中，加入适量的超纯水或缓冲液中，轻轻振荡使之分散，得到空白脂质体粗悬液；将空白脂质体粗悬液加入到高压均质机中进行高速剪切处理及高压均质处理，0bar压力下均质3-5次，继续升高压力到300bar均质3-5次，即得到脂质体样品，将制备的脂质体样品在115℃条件下湿热灭菌30分钟；然后4℃条件下保存。

下面通过实验对脂质体佐剂的各方面性能给出结论。

(一)根据实验考察脂质体佐剂所含成分在各比例下制备的脂质体的外观、平均粒径及其分布、透射电镜下形态等指标，以此作为选择最佳佐剂配方的依据。

1、外观性状

将胆固醇含量不同的脂质体佐剂使用超纯水或其它蛋白质溶液缓冲液为溶剂配置成浓度为2.0mg/ml溶液封存于西林瓶，观察脂质体佐剂溶液的外观性状。结果见附图1。

图1中，左一瓶中的脂质体佐剂溶液中胆固醇含量为0％，左二瓶中的脂质体佐剂溶液中胆固醇含量为10％，左三瓶中的脂质体佐剂溶液中胆固醇含量为20％，左四瓶中的脂质体佐剂溶液中胆固醇在原料混合物中胆固醇含量为30％。由图1可知脂质体佐剂溶液均为具有白色乳光的溶液，经长时间放置无固体样品析出，溶液颜色随胆固醇含量的增加而加深。其中胆固醇含量在10％以下时，澄清度较好。

2、颗粒形态

将上述四瓶胆固醇含量不同的脂质体佐剂溶液样品经稀释到2mg/ml后，滴加入磷钨酸染色，室温挥干，于透射电镜测定样品的粒子形态。结果见附图2～附图5。

对比电镜结果，可发现在胆固醇含量不同的脂质体佐剂溶液中，脂质体颗粒大多呈球形或椭球形的结构，分散性较好。脂质体颗粒的大小随脂质体中胆固醇比例的增加而增大。其中胆固醇含量在10％以下时，颗粒大小较均一。

3、平均粒径及分布

将上述四瓶胆固醇含量不同的脂质体佐剂溶液样品稀释到2mg/ml后，采用Marven公司的Zetasizer Nano ZS测定样品的粒子直径和多分散性系数(PDI)。结果见附图6及附表1。

脂质体名称	平均粒径(Z-Average)	多分散性系数(PDI)
			CHOL含量0％脂质体	95.30nm	0.252
CHOL含量10％脂质体	109.90nm	0.235
			CHOL含量20％脂质体	118.00nm	0.237
CHOL含量30％脂质体	201.50nm	0.178

表1脂质体的Z-Average粒径及其多分散性系数

由脂质体的Z-Average粒径及粒径分布结果可知，脂质体的Z-Average粒径一般在200nm以下，分散均匀PDI约0.25以下，具有明显的纳米结构，颗粒较均匀，脂质体颗粒的大小随脂质体中胆固醇比例的增加而增大。该实验结果与电镜检测结果相一致综合上述各项结果，脂质体中时胆固醇含量在10％时为较优配方。

4、离子型脂质体的Zeta电位(表面电位)

缓冲溶液I终浓度：0.486mol/L氯化钠、0.01mol/L组氨酸、0.01％吐温80，pH6.2；

缓冲溶液II终浓度：0.154mol/L氯化钠、0.01mol/L组氨酸、0.01％吐温80，pH6.2；

缓冲溶液III终浓度：0.041mol/L磷酸二氢钠、0.009mol/L磷酸氢二钠，pH 6.2；

带电磷脂组分对脂质体Zeta电位的影响：采用Marven公司的ZetasizerNanoZS测定以乳糖为固体支持物和含有与总脂质体质量比为0.5％的维生素VE的阳离子脂质体(HSPC80/DOTAP10/CHOL10/VE0.5、HSPC70/DOTAP20/CHOL10/VE0.5)及阴离子脂质体(HSPC80/DSPG10/CHOL10/VE0.5、HSPC70/DSPG20/CHOL10/VE0.5)的Zeta电位，以上脂质体佐剂溶液的溶液体系均为缓冲溶液I。结果见附表2。

表2脂质体的Z-Average粒径及其多分散性系数

溶液体系对脂质体Zeta电位的影响：HSPC70/DSPG20/CHOL10/VE0.5为例，采用Marven公司的Zetasizer Nano ZS测定分别以乳糖(或氯化钠)为固体支持物的脂质体，在超纯水、缓冲溶液I、缓冲溶液II、缓冲溶液III、8％的乳糖或8％的氯化钠中的Zeta电位。结果见附表3。

表3脂质体在不同溶液中的Zeta电位

实验结果表明，磷脂种类，固体支持物种类，缓冲液种类，离子强度等等均有关系。根据项目需要，选择不同类型的带电荷的脂质体载体，通过脂质体和带相反电荷蛋白分子间的静电引力来吸附蛋白。通过筛选脂质体的固体支持物、缓冲液种类、离子强度等调节脂质体的Zeta电位的高低，来影响脂质体在溶液中的稳定性的高低及脂质体佐剂对蛋白吸附能力的强弱。

5、加速稳定性

以HSPC70/DSPG20/CHOL10/VE0.5为例，脂质体水溶液分别放置于37+2℃及4±2℃的稳定条件下，分别于0天、7天、14天、21天取样采用Marven公司的ZetasizerNanoZS测定脂质体的Z-Average粒径及Zeta电位的变化。结果见附表4及附表5。

表4温度、保存时间对脂质体Z-Average粒径的影响

表5温度、保存时间对脂质体Zeta电位的影响

该脂质体的水溶液在4℃及37℃保存温度下，为澄清的具有白色乳光的溶液，实验过程中所取样品无明显固体沉淀析出。脂质体的Z-Average粒径没有明显增加，其zeta电位也较为稳定，具有明显的负电性，脂质体稳定性较好。

6、脂质体与蛋白疫苗的结合能力

以HSPC70/DSPG20/CHOL10/VE0.5为例，测定脂质体对HPV 16L1蛋白的结合能力。各浓度脂质体分别与HPV 16L1蛋白按体积比1∶1混合，吸附2小时。测定吸附蛋白前后脂质体的Z-Average粒径及zeta电位，并根据两者的变化趋势估测出脂质体对疫苗的包载能力。其中脂质体佐剂与HPV16L1蛋白的比例分别为100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1、3.13∶1、1.56∶1、0.78∶1。结果见附表6、附图7及附图8。

表6脂质体对HPV 16L1蛋白吸附前后的Z-Average粒径和Zeta电位

以HSPC70/DSPG20/CHOL10/VE0.5为例，测定脂质体对VR111蛋白的结合能力。各浓度脂质体分别与浓度为0.02mg/ml的VR111蛋白按体积比1∶1混合，吸附2小时。测定吸附蛋白前后脂质体的Z-Average粒径，并根据两者的变化趋势估测出脂质体对疫苗的包载能力。其中脂质体佐剂与HPV 16L1蛋白的比例分别为200∶1、100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1、3.13∶1、1.56∶1。结果见附表7、附图9。

表7脂质体对VR111蛋白的吸附

实验表明，加入带电荷的脂质体有利于带相反电荷的蛋白的吸附，当带负电荷的HSPC70/DSPG20/CHOL10/VE0.5脂质体佐剂与带正电的HPV16L1蛋白的比例大于3倍时即有较好的吸附结果。而HSPC70/DSPG20/CHOL10/VE0.5脂质体佐剂与同样带负电的VR111蛋白的比例需要大于10倍时才有较好的吸附结果。

(二)脂质体对疫苗的体液免疫增强能力

实验目的：考察自制的脂质体佐剂、脂质体/磷酸铝联合佐剂对示例蛋白重组人乳头瘤病毒18型蛋白疫苗(HPV 18L1)的体液免疫增强作用的效果。

实验动物：Bal/C小鼠，6-8周，雌性，20.0±2.0g。

免疫样品：用脂质体佐剂、脂质体/磷酸铝联合佐剂、磷酸铝佐剂吸附HPV 18L1蛋白原液制备免疫样品，其组成如表8，溶液缓冲体系为0.01M L-His，0.01％Tween-80，pH 6.2：

表8各佐剂型HPV 18L1疫苗的组成

免疫方法：上述样品给予Bal/C小鼠免疫一次，免疫途径为腹部皮下5点注射，每只接种0.5ml。小鼠免疫28天后，采用摘眼球取血，分离血清进行阳转率的检测。实验结果见表9。

分组	血清抗体OD平均值	抗体滴度
			A组	1.164	117376.5(592000)
B组	1.529	256000(288000)
			C组	0.431	\
D组	0.194	\
			E组	0.809	82997.73(118000)
F组	0.008	\

表9动物试验检测结果

如表中血清抗体OD值及抗体滴度的结果显示，单独使用脂质体佐剂可得到较好的免疫增强效果，可减少抗原蛋白的脊梁或接种次数；且脂质体与铝佐剂有很好的协同作用，共同使用这些佐剂对HPV 18L1疫苗蛋白所诱导体液免疫应答的增强作用优于商品化磷酸铝佐剂Adju-phos。

(三)脂质体对疫苗的细胞免疫增强能力

实验目的：考察自制的脂质体佐剂、脂质体/氢氧化铝联合佐剂对示例蛋白治疗用重组人乳头瘤病毒16型E7融合蛋白疫苗(VR111)的细胞免疫增强作用的效果。

实验材料及实验动物：Human TNF-a ELISA KIT：mabtech cat：3510-1H-6；PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)SIGMA P8139-1MG，用DMSO溶解，分装；C57BL/6小鼠，6-8周，雌性，20.0±2.0g；以TC-1细胞接种C57BL/6小鼠，建立E7肿瘤体内模型。

免疫样品：用脂质体佐剂、脂质体/氢氧化铝联合佐剂、氢氧化铝佐剂吸附VR111蛋白原液制备免疫样品，其组成如表10，溶液缓冲体系为0.008mol/L磷酸二氢钠、0.042mol/L磷酸氢二钠，pH7.5。

表10各佐剂型VR111疫苗的组成

将制备好的免疫样品进行体外细胞免疫刺激活性效价、小鼠体内细胞免疫增强性及在动物模型中肿瘤抑制效果，考察脂质体对VR111蛋白疫苗的药效增强能力。

免疫方法：

方法一：体外细胞免疫

用加入含PMA(佛波脂)的培养基稀释。样品做8个2倍系列稀释。加入不同浓度的样品C和样品E，同时设阴性对照及PMA对照50μl/孔。收集THP-1细胞，适当细胞种于96孔板内。37度培养2-3天。取细胞上清，检测TNF-α含量。检测结果见表11。

免疫样品	工作参考品	样品组别C	样品组别E
				体外相对效力	\	1.075	0.927

表11蛋白疫苗原液体外相对效力

实验结果表明，加入脂质体后VR111蛋白样品体外细胞免疫刺激活性高于未加脂质体的样品活性。

方法二、小鼠体内细胞免疫

免疫样品A和样品B做系列稀释。起始浓度为60μg/ml，做6个3倍稀释。小鼠腹腔注射0.5ml，于0天、14天免疫，28天取脾脏淋巴细胞，用Elispot方法检测细胞分泌IFN-r的斑点数。阳性判断标准：斑点数大于20个，且大于4倍的未加刺激物的本底的斑点数。检测结果见表12。

蛋白剂量(μg)	工作参考品	样品组别A	样品组别B
				30	100％	100％	100％
10	87.5％	87.5％	87.5％
				3.3333	75.00％	62.50％	50.00％
1.1111	0.00％	12.50％	25.00％
				0.3704	0％	0％	0％
0.1235	0％	0％	0％
				ED50值(μg)	3.070	2.960	2.916
ED50值工作参考品/样品	\	1.037	1.053

表12VR111疫苗体内细胞免疫活性

实验结果表明脂质体/氢氧化铝佐剂型VR111疫苗成品样品小鼠体内细胞免疫增强性不低于氢氧化铝佐剂型VR111疫苗成品的样品活性。

方法三、在动物模型中肿瘤抑制效果

注射免疫样品A～D，给予小鼠颈背部皮下注射。接种TC-1细胞后48h第一次免疫给药，16天加强给药。注射剂量每只0.5ml每天观察动物肿瘤生长情况，记录接种后不同时间出现肿瘤的动物数，计算成瘤率，即出现肿瘤动物数与每组实际动物数之比；肿瘤可触及后，每周2次用游标卡尺测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积，即肿瘤体积＝(长径×短径2)/2；记录动物带瘤生存时间。实验结果见附图10～附图13。

对比小鼠体内成瘤率、肿瘤体积、抑瘤效果、存活率的实验结果可知，脂质体单一佐剂及脂质体/氢氧化铝联合佐剂对于VR111疫苗成品样品小鼠体内肿瘤抑制均不低于氢氧化铝佐剂型VR111疫苗成品的样品活性。

综合上述三个实验结果可知，脂质体单一佐剂、脂质体/氢氧化铝联合佐剂可提高VR111的细胞免疫效果，可减少抗原蛋白的脊梁或接种次数；脂质体单一佐剂及脂质体/氢氧化铝联合佐剂的免疫增强效果均不低于氢氧化铝佐剂的效果，可作为铝佐剂的替代佐剂。

本发明制备的脂质体佐剂可用于制备预防性及治疗型HPV疫苗，为后续疫苗产品提供技术支持。脂质体本身具有较好的免疫增强效果，且脂质体与铝佐剂有很好的协同作用，共同使用这些佐剂，可以提高免疫效应。脂质体作为铝佐剂的替代佐剂或与铝佐剂共同使用，为新型疫苗的开发及应用提供了新的思路。本发明提供的制备方法具有操作简单、易于大批量制备、避免有机溶剂对生物活性物质活性影响等优点。脂质体的稳定性较好，可根据需要课题需要进行优化，如适当加入与疫苗带有相反电荷的类脂成分，提高疫苗的吸附率。脂质体本身具有较好的免疫增强效果，且脂质体与铝佐剂有很好的协同作用，共同使用这些佐剂，可以提高免疫效应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (8)

1.一种脂质体制备方法，包括如下步骤：

1)称取氢化大豆磷脂HSPC、胆固醇CHOL、1，2-二油酰氧基三甲基氯化铵DOTAP-Cl、维生素VE，按质量分数70～90∶0～30∶10～20∶0.5的比例制成混合物；

2)将步骤1所述混合物溶解于氯仿/甲醇溶剂中得到类脂的有机溶液备用，所述氯仿/甲醇溶剂由体积比为24∶72∶4-5.1的氯仿、甲醇和超纯水组成；

3)称取水溶性粉末状固体支持物置于250ml的圆底烧瓶中，再加入上述类脂的有机溶液，搅拌均匀，置于旋转蒸发仪上冰/水浴恒温的条件下旋转蒸去有机溶剂，其中所述固体支持物的质量是所述混合物质量的5倍，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、氯化钠的一种或几种；

4)取下圆底烧瓶，取出固体样品，置于-18℃下密封保存。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物中胆固醇的质量百分含量为0％、10％、20％或30％。

3.一种脂质体制备方法，包括如下步骤：

1)称取氢化大豆磷脂HSPC、胆固醇CHOL、1，2-二硬酯酰磷脂酰甘油钠盐DSPG-Na、维生素VE，按质量分数70～90∶0～30∶10～20∶0.5的比例制成混合物；

2)将步骤1所述混合物溶解于氯仿/甲醇溶剂中得到类脂的有机溶液备用，所述氯仿/甲醇溶剂由体积比为24∶72∶4-5.1的氯仿、甲醇和超纯水组成；

3)称取水溶性粉末状固体支持物置于250ml的圆底烧瓶中，再加入上述类脂的有机溶液，搅拌均匀，置于旋转蒸发仪上冰/水浴恒温的条件下旋转蒸去有机溶剂，其中所述固体支持物的质量是所述混合物质量的5倍，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、氯化钠的一种或几种；

4)取下圆底烧瓶，取出固体样品，置于-18℃下密封保存。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述混合物中胆固醇的质量百 分含量为0％、10％、20％或30％。

5.一种使用权利要求1-4中的方法制备的脂质体来制备脂质体佐剂的方法，包括如下步骤：

1)称取按照上述方法制得的前体脂质体加入到锥形瓶中，加入适量的超纯水或缓冲液中，轻轻振荡使之分散，得到空白脂质体粗悬液；

2)将空白脂质体粗悬液加入到高压均质机中进行高速剪切处理及高压均质处理，经0bar压力下均质3-5次，继续升高压力到300bar均质3-5次，即得到脂质体样品；

3)将制备的脂质体样品进行115℃、30min条件下的湿热灭菌得到最终的脂质体佐剂。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述缓冲液终浓度为0.486mol/L氯化钠、0.01mol/L组氨酸、0.01％吐温80，pH6.2。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述缓冲液终浓度为0.154mol/L氯化钠、0.01mol/L组氨酸、0.01％吐温80，pH6.2。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述缓冲液终浓度为0.041mol/L磷酸二氢钠、0.009mol/L磷酸氢二钠，pH 6.2。 

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