CN111658767B - 一种亲水性抗原和/或疏水性抗原疫苗递送系统及其制备方法 - Google Patents

一种亲水性抗原和/或疏水性抗原疫苗递送系统及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种亲水性抗原和/或疏水性抗原疫苗递送系统，并提供其制备方法。本发明采用两相法合成分散性良好，粒径、孔径可控的介孔二氧化硅，本发明所述的介孔二氧化硅通过介孔包载亲水性抗原，通过脂质膜包载疏水性抗原，是多价抗原递送系统。制备的疫苗能够传递到淋巴结，被抗原提呈细胞高效摄取，诱导抗原特异性的免疫反应，具有广阔的应用前景。

Description

一种亲水性抗原和/或疏水性抗原疫苗递送系统及其制备 方法
技术领域
本发明涉及一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和/或疏水性抗原的疫苗递送系统及其制备方法，属于医药领域。
背景技术
疫苗的发明与应用是现代医学最伟大的成就之一，其在控制和预防全球感染性疾病方面具有不可争辩的重要性。疫苗发展的三个重要方向包括：新的抗原的发现、新的佐剂技术及新的载体平台。
抗原作为疫苗最重要的组成部分，是决定疫苗保护效果的关键所在。对于一个病原体而言，一个疫苗应该尽可能多的囊括该病原体的相关抗原以诱导机体产生全面、强效的保护效果。然而来源于不同的病原体或者同一个病原体的不同抗原性质差异大。例如肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜，其中肿瘤细胞裂解液的抗原组成复杂，分子量、电性、极性等性质迥异，而肿瘤细胞膜不仅抗原成分复杂，且本身具有一定粒径，很难找到合适的载体包载。此外，肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜亲疏水性差异大，导致目前还没有合适的佐剂或载体可以将这两类抗原共载。一个能够同时包载多种抗原，尤其是能同时包载亲水性抗原和疏水性抗原的佐剂或载体，能够实现不同性质抗原的共递送，诱导比单一抗原及游离抗原更有效的免疫应答。
佐剂是指能够非特异性的增强或者改变机体对抗原免疫应答的物质，根据其作用方式可以被分为两类，一类可以刺激抗原提呈细胞，促进其活化和抗原处理；一类是作为递送系统增加抗原提呈细胞对抗原的摄取。
常见的疫苗载体如脂质体、聚合物纳米粒等，能够促进抗原提呈细胞吞噬抗原，促进抗原提呈细胞处理呈递抗原，然而这些载体通常只能包载单一成分的抗原，且通常需要联合佐剂使用才能诱导有效的免疫应答。
介孔二氧化硅因其良好的生物相容性，表面可修饰，粒径可调控，比表面积大，以及本身具有的佐剂性质，是很好的疫苗佐剂和载体。且介孔二氧化硅的介孔结构可以包载亲水性抗原，而疏水性抗原如肿瘤细胞膜、细菌细胞膜、支原体细胞膜、衣原体细胞壁、螺旋体、立克次体微荚膜、病毒包膜、外泌体，载有疏水性蛋白或多肽的脂质体可以吸附或包裹在介孔二氧化硅的表面，实现亲水性抗原和疏水性抗原共递送，诱导强效的免疫应答。
氧化硅材料能够促进细胞产生活性氧，从而使溶酶体膜失稳，促进溶酶体逃逸。基于这一优点，使用介孔二氧化硅递送抗原可以促进抗原的交叉呈递，从而诱导有效的细胞免疫应答，这对于肿瘤疫苗和病毒疫苗十分有益。
淋巴结是免疫应答的主要场所，拥有具有吞噬活性和交叉呈递能力的抗原提呈细胞，因此促进疫苗的淋巴结递送，能够提高疫苗诱导的免疫应答。载体的尺寸是影响淋巴结递送的关键因素，一般粒径在100 nm以内的粒子淋巴结靶向效果最好，而粒径大于100 nm的粒子的淋巴结靶向效率随着粒径的增加迅速降低。
发明内容
本发明针对现有疫苗载体通常只能包载、递送单一成分的抗原，导致不能诱导针对病原体抗原的全面免疫应答，常需要联合其他佐剂作用，及淋巴结靶向递送效果差等问题，设计了一种可单独或同时包载、递送多种抗原成分的疫苗递送系统，通过将抗原递送至淋巴结，促进淋巴结内的抗原提呈细胞摄取、呈递抗原，从而诱导强于只载有单一成分抗原的疫苗递送系统或游离的抗原的免疫应答。
本发明的目的之一提供一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和/或疏水性抗原的疫苗递送系统，本发明所述的介孔二氧化硅纳米粒通过两相法制备，分散性良好，介孔孔径、粒径可控。
本发明的目的之一提供一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和/或疏水性抗原的疫苗递送系统，其中所述的亲水性抗原可以是，但不局限于蛋白抗原、多肽抗原、肿瘤细胞裂解物、细菌裂解物中的一种或多种。
作为优选实验方案，本发明选择模型抗原OVA、肿瘤细胞裂解液、细菌裂解液三种亲水性抗原。
本发明提供了一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和/或疏水性抗原的疫苗递送系统，其中，基于重量份计，亲水性抗原：介孔二氧化硅为1:1~1:20，优选为1:1~1:10。
本发明的目的之一提供一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和/或疏水性抗原的疫苗递送系统，其中所述的疏水性抗原可以是，但不局限于：肿瘤细胞膜、细菌细胞膜、支原体细胞膜、衣原体细胞壁、螺旋体、立克次体微荚膜、病毒包膜、外泌体，载有疏水性蛋白或多肽的脂质体的中一种或多种。
作为优选实验方案，本发明选择疏水肽trp2、肿瘤细胞膜、细菌细胞膜三种疏水性抗原。
本发明提供了一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和/或疏水性抗原的疫苗递送系统，其中，基于重量份计，疏水性抗原：介孔二氧化硅为1:1~1:20，优选为1:1~1:10。
本发明提供了一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和/或疏水性抗原的疫苗递送系统，所述的介孔二氧化硅粒径在10-100 nm，孔径在5-15 nm，可以高效包载大分子抗原，并具有淋巴结靶向性。
本发明提供了一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和/或疏水性抗原的疫苗递送系统的制备方法，其特征在于，所述的介孔二氧化硅纳米粒通过两相法制备，再采用超声法将亲水性抗原和/或疏水性抗原载入介孔二氧化硅的介孔内和/或介孔二氧化硅表面。
本发明提供了一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和/或疏水性抗原的疫苗递送系统的制备方法，具体制备过程是：
（1）将十六烷基三甲基氯化铵、三乙醇胺溶于无菌水，50℃~80℃搅拌0.5~3 h，加入溶有正硅酸乙酯的有机溶剂，低速搅拌反应，产物在水相中生成；
（2）将步骤（1）中的水相采用乙醇稀释后离心，收集沉淀，沉淀采用无水乙醇洗涤两次，采用硝酸铵/乙醇溶液重悬，加热搅拌回流以除去模板剂十六烷基三甲基氯化铵，回流过的介孔二氧化硅经离心收集，冷冻干燥；
（3）将步骤（2）中的介孔二氧化硅采用无菌水溶解，超声分散；
（4）将超声分散的介孔二氧化硅与亲水性抗原或疏水性抗原按照一定比例混合，采用超声将亲水性抗包载在介孔内，或将疏水性抗原包载在介孔二氧化硅表面，得到载亲水性抗原的介孔二氧化硅或载疏水性抗原的介孔二氧化硅的疫苗递送系统；
（5）将载亲水性抗原的介孔二氧化硅与疏水性抗原按照一定比例混合，采用超声的方法将疏水性抗原载在介孔二氧化硅表面，得到基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和疏水性抗原共载的疫苗传递系统。
本发明的目的之一提供一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和/或疏水性抗原的疫苗递送系统的制备方法，所述介孔二氧化硅合成中十六烷基三甲基氯化铵的质量为6 g，三乙醇胺的质量为0.05 g~0.8 g，水的用量为60 ml，有机溶剂体积为20 ml，正硅酸乙酯的体积分数为5%~40%，低速反应时间为1 h~24，低速搅拌速度为100 rpm~300 rpm。硝酸铵/乙醇溶液的质量体积分数为0.6%。回流时间为6h~10 h，回流次数为2~3次。
本发明的目的之一提供了一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和/或疏水性抗原的疫苗递送系统的制备方法，其中，亲水性抗原包载方式为探头超声，超声功率为100 w~200 w，超声时间为1 min~10 min。
本发明的目的之一提供了一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和/或疏水性抗原的疫苗递送系统的制备方法，其中，疏水性抗原包载方式为探头超声或水浴超声，超声功率为50 w-200 w，超声时间为1 min~10 min。
本发明的目的之一，提供了一种多抗原共递送的疫苗递送系统制备方法。
本发明的目的之一，提供一种基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和疏水性抗原共载的疫苗递送系统，所述疫苗递送系统同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。
本发明所述亲水性抗原和疏水性抗原共载的疫苗递送系统，其制备方法简单、快速，可应用于多种病原体疫苗制备。
本发明选择B16F10肿瘤细胞裂解物和B16F10肿瘤细胞膜、铜绿假单包菌裂解物和铜绿假单包菌细胞膜、鸡卵清白蛋白和载有疏水肽trp2-脂质体作为模型抗原，通过体、内外实验证明，利用介孔二氧化硅可以实现亲水性抗原和疏水性抗原的共载和递送，并诱导机体产生强于单载亲水性抗原、单载疏水性抗原或游离抗原的免疫应答。
作为本发明的优选实施方案之一，介孔二氧化硅同时包载亲水性抗原和疏水性抗原，能同时促进亲水性抗原和疏水性抗原在DC细胞上的摄取。
作为本发明的优选实施方案之一，介孔二氧化硅同时包载亲水性抗原和疏水性抗原，能显著促进淋巴结内DC细胞成熟。
作为本发明的优选实施方案之一，介孔二氧化硅同时包载亲水性抗原和疏水性抗原，能同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。
有益效果
本发明的用作疫苗载体的介孔二氧化硅，同时具有佐剂作用和载体作用，粒径可控制在100 nm以内，且孔径可调，有利于包载大分子抗原并实现淋巴结递送。
本发明将亲水性抗原和疏水性抗原包载于同一载体内，实现不同性质的多种抗原的共递送，诱导机体产生针对病原体的全面、有效的免疫应答。
本发明使用介孔二氧化硅作为载体，可将肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜，细菌裂解液和细菌细胞膜直接包载，即保留了病原体的全部抗原，又避免了分离、制备单一抗原的繁琐工作。
本发明目的之一提供了一种不同性质抗原共递送系统，其制备方法简单、快速。
附图说明
以下，为本发明实施例的结果，其中：
图1 介孔二氧化硅氮气吸附-解吸附（a）和孔径分布图（b）；
图2 介孔二氧化硅（a），载有B16F10细胞裂解液的介孔二氧化硅（b），载有B16F10细胞细胞膜的介孔二氧化硅（c）及共载B16F10细胞裂解液和B16F10细胞膜的介孔二氧化硅（d）的电镜图；
图3共载铜绿假单胞菌裂解液和铜绿假单胞菌细胞膜的介孔二氧化硅的电镜图；
图4 载有OVA和trp2-脂质体的介孔二氧化硅电镜图；
图5 载有B16F10细胞裂解液的介孔二氧化硅（BL@MSNs）、载有B16F10细胞膜的介孔二氧化硅（BM@MSNs）、共载B16F10细胞裂解液和B16F10细胞膜的介孔二氧化硅（BM+BL@MSNs）、游离的B16F10细胞裂解液和B16F10细胞膜(BM+BL-free)在DC细胞上摄取结果。图a为摄取了肿瘤细胞裂解液的细胞百分比，图b为摄取了肿瘤细胞膜的细胞百分比，图c为同时摄取肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜的细胞百分比；
图6 载有B16F10细胞裂解液的介孔二氧化硅（BL@MSNs）、载有B16F10细胞膜的介孔二氧化硅（BM@MSNs）、共载B16F10细胞裂解液和B16F10细胞膜的介孔二氧化硅（BM+BL@MSNs）、游离的B16F10细胞裂解液和B16F10细胞膜(BM+BL-free)体内DC成熟诱导结果；
图7载有B16F10细胞裂解液的介孔二氧化硅（BL@MSNs）、载有B16F10细胞膜的介孔二氧化硅（BM@MSNs）、共载B16F10细胞裂解液和B16F10细胞膜的介孔二氧化硅（BM+BL@MSNs）、游离的B16F10细胞裂解液和B16F10细胞膜(BM+BL-free)免疫后的动物血清抗体情况。图a为IgG抗体，图b为IgG1抗体，图c为IgG2a抗体；
图8载有B16F10细胞裂解液的介孔二氧化硅（BL@MSNs）、载有B16F10细胞膜的介孔二氧化硅（BM@MSNs）、共载B16F10细胞裂解液和B16F10细胞膜的介孔二氧化硅（BM+BL@MSNs）、游离的B16F10细胞裂解液和B16F10细胞膜(BM+BL-free)免疫动物后细胞因子的分泌情况。图a为IFN-γ+/CD4+T细胞比例，图b为TNF-α+/CD8+T细胞比例，图c为IFN-γ+/CD8+T细胞比例；
图9载有B16F10细胞裂解液的介孔二氧化硅（BL@MSNs）、载有B16F10细胞膜的介孔二氧化硅（BM@MSNs）、共载B16F10细胞裂解液和B16F10细胞膜的介孔二氧化硅（BM+BL@MSNs）、游离的B16F10细胞裂解液和B16F10细胞膜(BM+BL-free)免疫动物后的抗肿瘤效果。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
实施例1
将6 g十六烷基三甲基氯化铵、0.18 g三乙醇胺溶于无菌水加热搅拌1 h，加入20ml正硅酸乙酯/环己烷溶液（v/v， 5%），将搅拌速度调整为180rpm，反应24 h，产物在水相中生成，水相采用乙醇稀释，离心，收集沉淀，沉淀采用无水乙醇洗涤两次，用40 ml硝酸铵/乙醇溶液重悬（w/v， 0.6%），加热搅拌回流6 h，除去模板剂十六烷基三甲基氯化铵；回流过的介孔二氧化硅经离心收集，冷冻干燥即得。
实施例2
将6 g十六烷基三甲基氯化铵、0.8 g三乙醇胺溶于无菌水加热搅拌1 h，加入20ml正硅酸乙酯/奈烷溶液（v/v， 20%），将搅拌速度调整为300rpm，反应12 h，产物在水相中生成，水相采用乙醇稀释，离心，收集沉淀，沉淀采用无水乙醇洗涤两次，用40 ml硝酸铵/乙醇溶液重悬（w/v， 0.6%），加热搅拌回流6 h，除去模板剂十六烷基三甲基氯化铵；回流过的介孔二氧化硅经离心收集，冷冻干燥即得。
实施例3
将6 g十六烷基三甲基氯化铵、0.05 g三乙醇胺溶于无菌水加热搅拌1 h，加入20ml正硅酸乙酯/奈烷溶液（v/v， 40%），将搅拌速度调整为100 rpm，反应1 h，产物在水相中生成，水相采用乙醇稀释，离心，收集沉淀，沉淀采用无水乙醇洗涤两次，用40 ml硝酸铵/乙醇溶液重悬（w/v， 0.6%），加热搅拌回流6 h，除去模板剂十六烷基三甲基氯化铵；回流过的介孔二氧化硅经离心收集，冷冻干燥即得。
实施例4
B16F10肿瘤细胞裂解液的制备: B16F10细胞用含有1 mM PMSF的PBS缓冲液（0.001M，pH7.4）重悬，调整细胞浓度为1x107个/ml，将细胞分装至保种管（1ml/管），将保种管装入液氮冻存盒里，置于液氮5 min，取出在37℃快速化冻，重复冻融过程5次，将裂解后的细胞转入10 ml EP管合并，10000 g离心20 min，上清使用0.22 μm的滤头过滤，滤液采用截留分子量为10K的超滤管浓缩，使用BCA测定蛋白浓度，4℃保存备用。
实施例5
B16F10肿瘤细胞膜的制备:收集的B16F10用含有蛋白酶抑制剂的TDS缓冲液（0.182 g Tris-HCl、2.049 g D-甘露糖、1.283 g 蔗糖，溶于40.0 ml 无菌注射用水，调节pH到7.4，用无菌注射用水定容至50 ml）重悬，调整细胞浓度为1x107个/ml，在冰水浴条件下使用探头超声将细胞破碎（150 W，4 s开，6s关，重复18次），10000 g离心25 min，收集上清150000 g 离心40 min，细胞膜沉淀采用0.2 mM的EDTA水溶液洗涤2次，最后用无菌水重悬，使用BCA测定蛋白浓度，4℃保存备用。
实施例6
铜绿假单胞菌裂解液的制备:离心收集处于对数生长期的铜绿假单胞菌，用1 mM的PBS缓冲液（pH7.4）重悬，采用探头超声破碎细菌（150 W，4 s开，6 s关，重复18次），6000 g离心30 min，收集上清100000 g离心30 min，收集上清，使用BCA测定蛋白浓度，4℃保存备用。
实施例7
铜绿假单胞菌细胞膜的制备: 离心收集处于对数生长期的铜绿假单胞菌，用1 mM的PBS缓冲液（pH7.4）重悬，采用探头超声破碎细菌（150 W，4 s开，6 s关，重复18次），6000g离心30 min，收集上清100000 g离心30 min，收集沉淀才用无菌水重悬，使用BCA测定蛋白浓度，4℃保存备用。
实施例8
载有OVA的介孔二氧化硅制备: 取0.5ml实施例1制备的介孔二氧化硅（4 mg/ml）经超声分散，与1 mg/ml的OVA溶液等体积混合，探头超声(150 W,5 min)即得。
实施例9
载有B16F10肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅制备：取0.5ml实施例1制备的介孔二氧化硅（8 mg/ml）经超声分散，与实施例4制备的肿瘤细胞裂解液（1 mg/ml）等体积混合，探头超声(150 W,5 min)即得。
实施例10
载有B16F10肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅制备：取0.5ml实施例1制备的介孔二氧化硅（8 mg/ml）经超声分散，与实施例4制备的肿瘤细胞裂解液（8 mg/ml）等体积混合，探头超声(150 W,5 min)即得。
实施例11
载有B16F10肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅制备：取0.5ml实施例1制备的介孔二氧化硅（8 mg/ml）经超声分散，与实施例4制备的肿瘤细胞裂解液（0.4 mg/ml）等体积混合，探头超声(150 W,5 min)即得。
实施例12
载有B16F10肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅制备：取0.5ml实施例1制备的介孔二氧化硅（8 mg/ml）经超声分散，与实施例5制备的肿瘤细胞膜（1 mg/ml）等体积混合，水浴超声(70 W,4 min)即得。
实施例13
载有B16F10肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅制备：取0.5ml实施例1制备的介孔二氧化硅（8 mg/ml）经超声分散，与实施例5制备的肿瘤细胞膜（8 mg/ml）等体积混合，水浴超声(70 W,4 min)即得。
实施例14
载有B16F10肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅制备：取0.5ml实施例1制备的介孔二氧化硅（8 mg/ml）经超声分散，与实施例5制备的肿瘤细胞膜（0.4 mg/ml）等体积混合，水浴超声(70 W,4 min)即得。
实施例15
载有B16F10肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅制备：按实施例9制备的载有肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅1 ml，与0.5 ml实施例5制备的肿瘤细胞膜（1 mg/ml）混合，水浴超声(70 W,4 min)即得。
实施例16
载有B16F10肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅制备：按实施例10制备的载有肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅1 ml，与0.5 ml实施例5制备的肿瘤细胞膜（8 mg/ml）混合，水浴超声(70 W,4 min)即得。
实施例17
载有B16F10肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅制备：按实施例11制备的载有肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅1 ml，与0.5 ml实施例5制备的肿瘤细胞膜（0.4mg/ml）混合，水浴超声(70 W,4 min)即得。
实施例18
载有细菌裂解液和细菌细胞膜的介孔二氧化硅制备：取0.5ml实施例1制备的介孔二氧化硅（8 mg/ml）经超声分散，与实施例6制备的细菌裂解液（1 mg/ml）等体积混合，探头超声(150 W,5 min)，再加入0.5 ml实施例7制备的细菌细胞膜（4 mg/ml），水浴超声(70 W,4 min)即得。
实施例19
载有OVA和trp2-脂质体的介孔二氧化硅制备：胆固醇2.4 mg、E80 9.6 mg、trp2肽1.2 mg 溶于3 ml 氯仿，悬干，加入1 ml 按照实施例8制备的载有OVA的介孔二氧化硅，水化后探头超声（150 W，5 min）即得。
实施例20
FITC标记B16F10肿瘤细胞裂解液：按照实施例4制备肿瘤细胞裂解液，5 mg ml-1的肿瘤细胞裂解液取1 ml，加入100 μl 0.5 M的碳酸盐缓冲液（pH 9.2），加入300 μg FITC（10 mg ml-1DMSO溶液），室温搅拌3h，使用截留分子量为2000的透析袋透析除去游离的FITC，纯化后的肿瘤细胞裂解液-FITC 4℃避光保存，尽快使用。
实施例21
DiD标记B16F10肿瘤细胞膜：按照实施例5制备肿瘤细胞膜，细胞膜采用5 μg ml-1的DiD染色15 min，离心去除多余的DiD染料，肿瘤细胞膜-DiD用水重悬，4℃避光保存，尽快使用。
实施列22
游离的肿瘤细胞裂解液与肿瘤细胞膜：0.5 ml实施例4制备的肿瘤细胞裂解液（1mg/ml）与0.5 ml无菌水混合，探头超声(150 W,5 min)，再加入0.5 ml实施例5制备的肿瘤细胞膜（1 mg/ml）（实施例5），水浴超声(70 W,4 min)即得。
实施例23
纳米粒粒径、电位测定：使用Zetasizer Nano ZS900激光粒度仪测定纳米粒的粒径和电位。取1ml纳米粒溶液加入粒径皿，选择介质为水，设定测定温度为25℃进行粒径测定。另取800 μl纳米粒与200μl的HEPES缓冲液（100mM，pH7.4）混合，加入电位皿进行电位测定。结果如表1-4所示。
表1 介孔二氧化硅粒径结果
Figure 880104DEST_PATH_IMAGE001
表2 载有肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅粒径结果
Figure 52633DEST_PATH_IMAGE002
表3载有肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅粒径结果
Figure 364405DEST_PATH_IMAGE003
表4 载有肿瘤细胞裂解液的和肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅粒径结果
Figure 897061DEST_PATH_IMAGE004
实施例24
细胞摄取实验：DC2.4细胞按照5 x 105/孔接种于12孔板，待细胞长至80%融合时，去除培养基，PBS洗涤2遍，加入1ml无血无抗培养基，向其中加入按照实施例9制备的载有FITC标记的肿瘤细胞裂解液（实施例20）的介孔二氧化硅、按照实施例12制备的载有DiD标记的肿瘤细胞膜（实施列21）的介孔二氧化硅、按照实施例15制备的载有FITC标记的肿瘤细胞裂解液（实施列20）和DiD标记的肿瘤细胞膜（实施列21）的介孔二氧化硅或按照实施例22制备的游离的FITC标记的肿瘤细胞裂解液（实施列20）和DiD标记的肿瘤细胞膜（实施列21），每孔含细胞裂解液10 μg，细包膜10 μg，介孔二氧化硅80 μg，每组三个复孔，37℃孵育1h，孵育结束PBS洗涤三遍，流式检测。实验结果见图5所示，与游离的肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜相比，肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜经介孔二氧化硅包载后在DC2.4细胞上的摄取显著增加，具有显著性差异（**p<0.01,***p<0.001），且肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜两者之间互不影响。图中BL@MSNs表示载有肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅，BM@MSNs表示载有肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅，BM+BL@MSNs表示载有肿瘤细胞膜和肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅，BM+BL-free标记游离和肿瘤细胞膜和肿瘤细胞裂解液。
实施例25
成熟诱导实验：C57/BL小鼠脚掌注射25 μl实施例9制备的载有肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅、实施例12制备的载有肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅，实施例15制备的载有肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅或实施例22制备的游离的肿瘤细胞裂解液与肿瘤细胞膜，其中包含细胞裂解液10 μg，细包膜10 μg，介孔二氧化硅80 μg。注射后第三天剖取腘湾淋巴结，制备成单细胞悬液，与抗小鼠CD11c/CD80/CD86抗体孵育，流式检测。结果如图6所示，相比游离的肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜，以及单载肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅或单载肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅，共载肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅能显著增加淋巴结内DC细胞表达协同共刺激分子（CD80、CD86），促进DC细胞成熟，有利于促进免疫应答，**p<0.01,***p<0.001。图中BL@MSNs表示载有肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅，BM@MSNs表示载有肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅，BM+BL@MSNs表示载有肿瘤细胞膜和肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅，BM+BL-free标记游离和肿瘤细胞膜和肿瘤细胞裂解液。
实施例26
动物免疫：C57/BL小鼠在第0天脚掌注射25 μl实施例9制备的载有肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅、实施例12制备的载有肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅，实施例15制备的载有肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅或实施例22制备的游离的肿瘤细胞裂解液与肿瘤细胞膜，其中包含细胞裂解液10 μg，细包膜10 μg，介孔二氧化硅80 μg。在第14天和第28天按照第0天的给药剂量进行加强免疫，第35天进行检测。
实施例27
动物免疫抗体检测: C57/BL小鼠按照实施例26进行免疫，第35天从小鼠眼眶静脉取血，血清经250倍稀释后，加入到采用肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜包被的ELISA板，检测血清中肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜抗原特异性抗体。结果如图7所示，相比游离的肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜，介孔二氧化硅包载的肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜能显著增加血清中肿瘤细胞抗原特异性抗体产生，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。图中BL@MSNs表示载有肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅，BM@MSNs表示载有肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅，BM+BL@MSNs表示载有肿瘤细胞膜和肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅，BM+BL-free标记游离和肿瘤细胞膜和肿瘤细胞裂解液。
实施例28
动物免疫细胞内因子检测：C57/BL小鼠按照实施例26进行免疫，第35天取脾，制备成单细胞悬液，采用肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜刺激24h，采用抗小鼠CD4/CD8/IFN-γ/TNF-α抗体染色，检测分泌IFN-γ的CD4+T细胞，分泌IFN-γ的CD8+T细胞及分泌TNF-α的CD8+T细胞比例。结果如图8所示，相比游离的肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜，以及单载肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅或单载肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅，共载肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅能显著增加分泌IFN-γ的CD4+T细胞，分泌TNF-α的CD8+T细胞及分泌IFN-γ的CD8+T细胞比例,**p<0.01,***p<0.001。图中BL@MSNs表示载有肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅，BM@MSNs表示载有肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅，BM+BL@MSNs表示载有肿瘤细胞膜和肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅，BM+BL-free标记游离和肿瘤细胞膜和肿瘤细胞裂解液。
实施例29
抑瘤实验：C57/BL小鼠按照实施例26进行免疫后，在第35天皮下接种1 x 105个B16F10细胞，每隔两天记录肿瘤生长情况。结果如图9所示，相比游离的肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜，以及单载肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅或单载肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅，共载肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅能显著抑制肿瘤的生长。同时，相比未治疗组，单载肿瘤细胞膜，以及单载肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅也能显著抑制肿瘤生长，**p<0.01,***p<0.001。图中BL@MSNs表示载有肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅，BM@MSNs表示载有肿瘤细胞膜的介孔二氧化硅，BM+BL@MSNs表示载有肿瘤细胞膜和肿瘤细胞裂解液的介孔二氧化硅，BM+BL-free标记游离和肿瘤细胞膜和肿瘤细胞裂解液。
通过以上实施例，本发明基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和疏水性抗原共载的疫苗递送系统对肿瘤细胞裂解液和肿瘤细胞膜、细菌裂解液和细菌细胞膜、亲水性抗原OVA和疏水性肽trp2三类不同组成的抗原分别实现共载，说明本发明能将亲水性抗原和疏水性抗原进行共载。进一步以基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和疏水性抗原疫苗递送系统的体内外研究系列结果表明，本发明中基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和疏水性抗原疫苗递送系统能同时促进抗原提呈细胞对亲水性抗原和疏水性抗原的摄取，促进抗原提呈细胞成熟，有效诱导体液免疫应答和细胞免疫应答，接受该疫苗递送系统免疫治疗的小鼠，显示出了优异的抗肿瘤效果。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种基于介孔二氧化硅的疫苗递送系统，其特征在于介孔二氧化硅作为载体材料，包载亲水性抗原和/或疏水性抗原，其中所述亲水性抗原为肿瘤细胞裂解物、细菌裂解物中的一种或多种，所述疏水性抗原选自肿瘤细胞膜、细菌细胞膜、支原体细胞膜、衣原体细胞壁、螺旋体、立克次体微荚膜、病毒包膜、外泌体或多肽的脂质体中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的疫苗递送系统，其特征在于，所述亲水性抗原与介孔二氧化硅的质量比为1:1～1:20。
3.如权利要求1或2所述的疫苗递送系统，其特征在于，所述疏水性抗原与介孔二氧化硅的质量比为1:1～1:20。
4.如权利要求1或2所述的疫苗递送系统，其特征在于，所述介孔二氧化硅的粒径在10-100nm，孔径在5-20nm。
5.如权利要求1或2所述疫苗递送系统，其特征在于，所述疫苗递送系统可以同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。
6.如权利要求1-5任一所述的疫苗递送系统的制备方法，其特征在于所述的介孔二氧化硅纳米粒通过两相法制备，再采用探头超声法将亲水性抗原包载于介孔二氧化硅的介孔内，和/或使用水浴超声方法将疏水性抗原载入介孔二氧化硅表面。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)将十六烷基三甲基氯化铵、三乙醇胺溶于无菌水，50℃～80℃搅拌0.5～3h，加入溶有正硅酸乙酯的有机溶剂，低速搅拌反应，产物在水相中生成；步骤(2)将步骤(1)中的水相采用乙醇稀释后离心，收集沉淀，沉淀采用无水乙醇洗涤两次，采用硝酸铵/乙醇溶液重悬，加热搅拌回流以除去模板剂十六烷基三甲基氯化铵，回流过的介孔二氧化硅经离心收集，冷冻干燥；步骤(3)将步骤(2)中的介孔二氧化硅采用无菌水溶解，超声分散；步骤(4)将超声分散的介孔二氧化硅与亲水性抗原或疏水性抗原按照一定比例混合，采用超声将亲水性抗原包载在介孔内，或将疏水性抗原包载在介孔二氧化硅表面，得到载亲水性抗原的介孔二氧化硅或载疏水性抗原的介孔二氧化硅的疫苗递送系统；步骤(5)将载亲水性抗原的介孔二氧化硅与疏水性抗原按照一定比例混合，采用超声的方法将疏水性抗原载在介孔二氧化硅表面，得到基于介孔二氧化硅的亲水性抗原和疏水性抗原共载的疫苗传递系统。
8.如权利要求1-5任一所述的疫苗递送系统在制备预防性和/或治疗性免疫药物中的应用。
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