CN104623646A - 一种双功能配体靶向树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗及其制备方法，该方法包括以下步骤：S1、制备甘露糖修饰的纳米脂质体；S2、将CpG-ODN连接至纳米脂质体上得到双功能配体修饰的纳米脂质体；S3、通过反复融冻法从肿瘤细胞中提取出肿瘤抗原肽；S4、通过冻干-再水化法将肿瘤抗原肽包裹进所述功能配体修饰的纳米脂质体内。本发明采用双功能配体修饰的纳米脂质体作为载体，脂质体表面的甘露糖分子能特异性靶向至树突状细胞，CpG-ODN则结合于树突状细胞内的Toll样受体9，促进树突状细胞成熟，成熟的树突状细胞能高效递呈纳米脂质体内部释放出的肿瘤抗原肽，激活T淋巴细胞，产生特异性抗肿瘤作用。

Description

一种双功能配体靶向树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物材料的医学基础应用领域，更具体地说，涉及一种双功能配体靶向树突状细胞（DC）肿瘤疫苗及其制备方法。

背景技术

肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一。虽然传统方法如手术切除、局部或全身化疗和放疗等方法取得了一定的进展，但是仍然需要探索新的抗肿瘤方法。

树突状细胞（DC）是目前研究已知的体内能力最强的专职抗原提呈细胞（APC），也是唯一能诱导初次免疫应答和激活未致敏T细胞的APC。DC作为抗原特异性免疫应答的始动者，在机体的抗肿瘤免疫反应中发挥着核心的作用。肿瘤浸润组织中DC诱导免疫效应细胞的能力较低，这是因为在肿瘤的发生发展过程中，DC的成熟不仅受到肿瘤细胞死亡方式的影响，而且坏死的肿瘤细胞核晚期凋亡的肿瘤细胞仅给DC输送了部分成熟信号，肿瘤细胞产生的可溶性因子也会对DC的成熟和功能起到抑制作用。探索新的方法靶向有效激活体内的抗原提呈细胞产生抗肿瘤效应有重要的科学意义和潜在的应用前景。

肿瘤的免疫治疗是近年来兴起的最有前景的治疗方法，其最大的优点处在于激发、增强机体的特异性免疫反应，加强免疫系统的自我调节能力，从而达到延缓和降低肿瘤复发转移的目的。肿瘤主动性免疫治疗是指利用肿瘤细胞或肿瘤特异性抗原物质或者免疫佐剂等诱导机体产生特异性免疫，进而主动杀伤肿瘤细胞。但是输注进体内的肿瘤抗原肽或者佐剂缺乏靶向性和免疫原性弱等问题，无法强有效地刺激机体产生特异性的抗肿瘤作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有肿瘤主动免疫治疗中肿瘤抗原肽疫苗靶向性弱、抗原刺激性低下的问题，提供一种双功能配体靶向DC的肿瘤疫苗及其制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：

S1、将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、双十二烷基二甲基溴化铵、软脂酸-甘露糖酯、α-生育酚按照摩尔比为49.8：40：5：3：2：0.2的比例混合后，通过真空旋转蒸发后干燥，再重悬过滤得甘露糖修饰的纳米脂质体；

S2、使用磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺制备胶束液，将CpG-寡聚脱氧核苷酸溶液加入所述胶束液中，在氮气氛围中反应30-60分钟，加入与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺等摩尔的β-半胱胺，孵育30-60分钟；随后将孵育液加入步骤S1制得的甘露糖修饰的纳米脂质体的溶液中，反应30-45分钟，得到双功能配体修饰的纳米脂质体；

S3、通过反复融冻法从肿瘤细胞中提取肿瘤抗原肽；

S4、通过冻干-再水化法将肿瘤抗原肽包裹进所述功能配体修饰的纳米脂质体内得双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗。

在根据本发明所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法中，所述步骤S1中真空旋转蒸发的转速为200rpm/min，时间为10-20分钟，水浴温度为40度，所述干燥的时间为2-4小时，所述重悬采用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液水浴超声5-10分钟，所述过滤中采用孔径为200nm、100nm和50nm的聚碳酸酯膜。

在根据本发明所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法中，所述步骤S2中将孵育液与步骤S1制得的甘露糖修饰的纳米脂质体的溶液在55度水浴反应30-45分钟。

在根据本发明所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法中，所述步骤S3中，将型号为H22或4T1的肿瘤细胞的重悬液用封口膜密封，在液氮中反应10-20分钟，再在37℃水浴反应10-20分钟，如此反复冻融，最后在600rpm转速下离心10分钟收集上清得到所述肿瘤混合抗原肽。

在根据本发明所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法中，所述步骤S3中反复冻融5次。

在根据本发明所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法中，所述步骤S4具体包括：在步骤S2制得的双功能配体修饰的纳米脂质体中加入所述肿瘤抗原肽以及与所述双功能配体修饰的纳米脂质体等摩尔的蔗糖，通过冻干-再水化法制备双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗。

本发明还提供了一种双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗，其采用如上所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法制得。

实施本发明的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗及其制备方法，具有以下优势与效果：本发明采用双功能配体修饰的纳米脂质体作为载体，具有良好的生物相容性和高效的载荷量，将相应的肿瘤抗原肽包裹至载体内，制备得到双功能配体靶向DC的肿瘤疫苗；本发明通过适当的制备条件获得的双功能配体脂质体纳米粒子粒径适中，通过皮下注射，能高效靶向并刺激皮下的树突状细胞，由于材料的体积优势及表面修饰的聚乙二醇（PEG），在体内可以降低粒子被网状上皮系统清除速率，延长粒子在体内的停留时间。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1所示为根据本发明的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗的制备方法流程图；

图2所示为根据本发明的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗的粒径分布图；

图3A为链接有CpG-ODN纳米粒子的甘露糖修饰的纳米脂质体的扫描电镜图，图3B为甘露糖修饰的纳米脂质体包裹H22抗原肽纳米粒子的扫描电镜图，3C为链接有CpG-ODN纳米粒子的甘露糖修饰的纳米脂质体包裹4T1抗原肽纳米粒子的扫描电镜图，3D为链接有CpG-ODN纳米粒子的甘露糖修饰的纳米脂质体包裹H22抗原肽纳米粒子的扫描电镜图；

图4所示为根据本发明的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗刺激树突状细胞成熟流式结果统计图；

图5所示为根据本发明的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗血清稳定结果图；

图6所示为根据本发明的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗治疗荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线图；

图7所示为根据本发明的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗治疗荷瘤小鼠的生存曲线；

图8所示为根据本发明的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗治疗荷瘤小鼠的肿瘤照片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

请参阅图1，为根据本发明的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗的制备方法流程图。如图1所示，本发明的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗的制备方法包括以下步骤：

首先，在步骤S1中，先制备出甘露糖修饰的纳米脂质体。步骤S1具体包括：

S1-1、将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱（POPC）、胆固醇（cholesterol）、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG₂₀₀₀-DSPE）、双十二烷基二甲基溴化铵（DDAB）、软脂酸-甘露糖酯、α-生育酚（α-tocopherol）按照摩尔比为49.8：40：5：3：2：0.2的比例混合后通过真空旋转蒸发；具体地，本实施例中以制备一份双配体靶向肿瘤疫苗为例，可以称取以下质量的原料：POPC7.56mg、胆固醇3.2mg、DSPE-PEG₂₀₀₀2.8mg、DDAB0.38mg、软脂酸-甘露糖酯0.17mg和α-生育酚0.017mg，加入到5ml的圆底烧瓶中，将烧瓶接到旋转蒸发仪上，旋转蒸发仪以转速为200rpm/min旋转并打开真空泵抽真空。待看到圆底烧瓶表面产生一层水汽后，将瓶身降至水浴锅中，水浴锅的温度为40度，旋转10-20min后即可关闭真空并停止旋转，形成A；

S1-2、将A置于真空干燥箱中干燥2-4h去除残余的有机溶剂，加入1ml的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）缓冲液（pH6.5，10mmol/l），在水浴超声5-10min，形成溶液B；

S1-3、将溶液B装入便携式脂质体挤推器的特定玻璃注射器中，反复通过聚碳酸酯膜200nm、100nm、50nm若干次，得到溶液C，即甘露糖修饰的纳米脂质体的溶液。

随后，在步骤S2中，采用后插入法（post-insertion），将CpG-ODN₁₈₂₆链接至甘露糖修饰的纳米脂质体表面，得到双功能配体修饰的纳米脂质体。优选CpG-ODN₁₈₂₆，其中1826代表一个特定序列的CPG-ODN，已有大量文献报道该序列能引起强烈的免疫反应，应用比较成熟。步骤S2具体包括：

S2-1、取一定体积的磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺（MAL-PEG₂₀₀₀-DSPE）储存液于离心管中，在室温下自然吹干形成脂膜，用一定体积的hepes缓冲液（pH6.5，10mmol/l）重悬后吹打均匀，在65℃下水浴5-10min，形成溶液D，即胶束液；优选地，在制备一份双配体靶向肿瘤疫苗时，可以选用浓度为10mg/ml的MAL-PEG₂₀₀₀-DSPE储存液，使用体积为13.2μl，在重悬时使用的hepes缓冲液体积为20μl。

S2-2、将CpG-ODN₁₈₂₆溶液加入到溶液D中，吹打均匀后通入一定体积的氮气，封口膜封好，放入50ml离心管中，再通入氮气，封口膜封好，室温下反应30-60min得到溶液E；

S2-3、在溶液E中加入与MAL-PEG₂₀₀₀-DSPE等摩尔的β-半胱胺，室温下孵育30-60min，封闭未反应的马来酰亚胺，得到溶液F；

S2-4、将溶液F加入溶液C中，55℃水浴反应30-45min，得到溶液G，即双功能配体修饰的纳米脂质体的溶液。

随后，在步骤S3中，通过反复融冻法从肿瘤细胞中提取肿瘤抗原肽。步骤S3具体包括：

S3-1、收集培养的型号为H22或4T1的肿瘤细胞于冻存管中，用1mlPBS重悬，并用封口膜封好；

S3-2、按照液氮中反应10-20分钟，以及37℃水浴中反应10-20min的循环重复若干次；优选地，可以反复冻融5次。

S3-3、最后600rpm转速下离心10min收集上清得到溶液H，即肿瘤混合抗原肽。

随后，在步骤S4中，通过冻干-再水化法将肿瘤抗原肽包裹进双功能配体修饰的纳米脂质体内，制得双配体靶向DC肿瘤疫苗。步骤S4具体包括：

S4-1、在溶液G中加入相应的溶液H，以及与溶液G中双功能配体修饰的纳米脂质体等摩尔的蔗糖，混匀后迅速置于液氮中快速冷冻，干燥过夜形成粉末I；优选地，在制备一份双配体靶向肿瘤疫苗时，可以加入肿瘤混合抗原肽溶液中肽量为100μg。

S4-2、用0.1ml的PBS重悬粉末I并在涡轮振荡器上以最大的速率震荡，当粉末I充分溶解后，置于37℃水浴中30-60min，再次加入0.1ml的PBS并在涡轮振荡器涡旋，置于37℃水浴中30-60min，最后加入0.8ml的PBS混匀后置于37℃水浴中30-60min，制得双功能配体靶向DC肿瘤疫苗，也就是双功能配体靶向的包裹多肽纳米脂质体。其中所有用于重悬的PBS溶液均需要37℃预热。

本发明还提供了采用上述制备方法制得的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗。

自20世纪70年代后期甘露糖受体(mannose receptor，MR)被首次报道以来。人们对其结构和功能的研究不断深入。甘露糖受体为甘露糖受体家族的成员，属于C型凝集素受体。甘露糖受体广泛分布于体内的各种组织，以非成熟的树突状细胞和巨噬细胞亚群多见。以甘露糖受体为点的靶向药物与分子疫苗已经显示出良好的应用前景。近年研究表明甘露糖受体作为一种免疫黏附分子，可能通过对不同表达量肿瘤相关抗原的识别参与机体的肿瘤免疫、肿瘤转移以及肿瘤微环境中肿瘤的免疫逃避等过程。

脂质体（liposome）是一种具有靶向给药功能的新型药物制剂。通过在脂质体膜中掺入一些靶向物质或在脂质体分子上联接一种识别分子，可以使脂质体在生物因素的引导下向特定部位靶向集中，实现脂质体的主动靶向性。这种受体介导的脂质体增加了药物的特异性，减少对非靶组织器管损伤，提高了疗效。脂质体制备工艺相对简单，可以同时包裹脂溶性药物和水溶性药物，而且由于药物包封在脂质体中，受到脂质体双分子层膜的保护，可以显著提高其稳定性。同时在进入体内之后，由于脂质体膜的保护，药物可以免受机体酶系统和免疫系统的降解。制备脂质体所用到的脂类与人体细胞膜结构和成分相似，毒性小，生物相溶性好，没有免疫反应。

CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）为人工合成的含胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸，是一种功能强大的免疫激动剂。研究证实，CpG-ODN能与Toll样受体9（TLR9）结合而激活体内DC等多种免疫细胞并分泌多种细胞因子，使机体产生快速的细胞免疫及体液免疫。大量的研究发现，CpG-ODN能作为危险信号促使DC成熟，上调MHCⅡ（主要组织相容性复合体Ⅱ类分子）和共刺激分子(如CD40、CD80、CD86等)，同时诱导DC分泌大量IL-12（白细胞介素-12）、IL-6（白细胞介素-6）、TNF-α（肿瘤坏死因子-α）。在IL-12存在的条件下，DC促使T细胞分泌IL-2（白细胞介素-2）和IFN-γ（γ干扰素），从而使免疫应答倾向于Th1型。因此CpG ODN成为一种有效增强机体抗肿瘤免疫效应的佐剂。

通过本发明的方法制备的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗的生物传递系统具有以下独特的优势：（1）甘露糖修饰的纳米脂质体能通过甘露糖受体介导的内吞途径靶向至树突状细胞，使得双功能配体靶向DC肿瘤疫苗集中于树突状细胞；（2）脂质体被DC内吞后可通过表面链接的免疫激动剂CpG-ODN₁₈₂₆与内体上的Toll-9受体结合从而激活树突状细胞并使之活化、成熟；（3）甘露糖和CpG-ODN₁₈₂₆作用于树突状细胞的甘露糖受体和Toll-9受体相互促进相互交流促进免疫应答趋势。

本发明将这种双功能配体靶向肿瘤疫苗对BALB/c荷瘤小鼠进行皮下注射，通过受体介导的内吞途径靶向到皮下的树突状细胞，双功能配体靶向肿瘤疫苗上链接的CpG-ODN₁₈₂₆则结合于DC内体上的Toll样受体9，主动激活DC并使之变成熟。双配体靶向肝癌肿瘤疫苗在进入抗原提呈细胞后可以释放出内部的肿瘤抗原肽，成熟的DC能高效递呈这些肿瘤相关抗原，激活T淋巴细胞，产生特异性抗肿瘤作用。由于纳米粒子材料的体积优势，在体内可以降低粒子被网状上皮系统清除速率，延长粒子在血液循环系统中的停留时间。

请参阅图2，为根据本发明的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗的粒径分布图。其中A组为链接有CpG-ODN纳米粒子的甘露糖修饰的纳米脂质体（M/CpG-ODN-Lipo）；B组为甘露糖修饰的纳米脂质体包裹H22抗原肽纳米粒子（M-H22-Lipo，未链接CpG-ODN），C组为链接有CpG-ODN纳米粒子的甘露糖修饰的纳米脂质体包裹4T1抗原肽纳米粒子（M/CpG-ODN-4T1-Lipo），D组为链接有CpG-ODN纳米粒子的甘露糖修饰的纳米脂质体包裹H22抗原肽纳米粒子（M/CpG-ODN-H22-Lipo）。可以看到，每种纳米粒子的粒径分布均呈现正态分布，平均粒径均在200纳米以内。

请参阅图3A-3D分别为前述图2中A-D组的扫描电镜图。其中，图3A为链接有CpG-ODN纳米粒子的甘露糖修饰的纳米脂质体的扫描电镜图，图3B为甘露糖修饰的纳米脂质体包裹H22抗原肽纳米粒子的扫描电镜图，3C为链接有CpG-ODN纳米粒子的甘露糖修饰的纳米脂质体包裹4T1抗原肽纳米粒子的扫描电镜图，3D为链接有CpG-ODN纳米粒子的甘露糖修饰的纳米脂质体包裹H22抗原肽纳米粒子的扫描电镜图。可以看到，每种纳米粒子均有层状结构，大小在200纳米以内。

本发明还进行了DC2.4细胞吞噬不同组别未修饰甘露糖与修饰了甘露糖的脂质体的对比实验。将各个实验组别的物质分别与DC2.4细胞37℃孵育60min后荧光显微镜下放大200倍。脂质体或甘露糖修饰的脂质体采用DiI（细胞膜红色荧光探针）标记，为红色荧光；细胞核采用DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色，为蓝色荧光。其中实验组别A-D分别为DC2.4吞噬了脂质体、CpG-ODN链接的脂质体、包裹H22抗原肽的脂质体、链接CpG-ODN包裹H22抗原肽的脂质体后的荧光结果图，实验组别E-H分别为DC2.4吞噬了修饰甘露糖的脂质体、修饰甘露糖链接CpG-ODN的脂质体、修饰甘露糖包裹H22抗原肽的脂质体、修饰甘露糖链接CpG-ODN包裹H22抗原肽的脂质体后的荧光结果。实验结果表明由于DC2.4细胞本身具有吞噬异物的特性，即使实验组别A-D中未修饰甘露糖的脂质体也会被DC2.4细胞吞噬，但荧光强度较弱；DC2.4细胞对实验组别E-H中修饰了甘露糖的脂质体的吞噬则很强，可见所有细胞的胞质内的均有红色荧光，说明甘露糖修饰的脂质体能通过甘露糖受体介导的内吞途径靶向至树突状细胞表面。

此外，本发明还进行了DC2.4细胞吞噬不同组别未链接CpG-ODN与链接了CpG-ODN的脂质体的对比实验。将各个实验组别的物质分别与DC2.4细胞37℃孵育60min后荧光显微镜下放大200倍。甘露糖修饰的脂质体采用DiI标记，为红色荧光；CpG-ODN采用FITC（异硫氰酸荧光素）标记，为绿色荧光；细胞核采用DAPI染色，为蓝色荧光。其中，实验组别A-B分别为DC2.4细胞吞噬甘露糖修饰的脂质体和甘露糖修饰的脂质体包裹H22抗原肽纳米粒子；实验组别C-D分别为DC2.4吞噬了CpG-ODN链接的甘露糖修饰的脂质体和CpG-ODN链接甘露糖修饰的脂质体包裹H22抗原肽纳米粒子。实验结果表明只有吞噬了链接CpG-ODN的脂质体的DC2.4细胞胞质内才有绿色荧光，而吞噬了没有链接CpG-ODN的脂质体的DC2.4细胞则只有红色与蓝色荧光，没有绿色荧光。

请参阅图4，为本发明的双功能配体靶向肿瘤疫苗刺激树突状细胞成熟流式统计图结果。具体为分别用脂质体、CpG-ODN链接的脂质体、CpG-ODN链接甘露糖修饰的脂质体、CpG-ODN链接甘露糖修饰的脂质体包裹H22抗原肽刺激DC2.4细胞48小时候分别检测细胞表面分子MHCI、MHCII、CD80、CD86的表达量来判断细胞是否变成熟，采用未刺激和加入TNF-α组作为阴性对照与阳性对照。由结果可以看出本发明的双功能配体靶向肿瘤疫苗能很好的刺激树突状细胞DC2.4变成熟，与阴性对照相比结果具有统计学意义。

请参阅图5，为双功能配体靶向肿瘤疫苗血清稳定结果。具体为将本发明的双功能配体靶向肿瘤疫苗与50%人血清分别在37℃预先孵育10天、7天、5天、3天、2天和1天后再刺激DC2.4细胞48小时后检测细胞表面共刺激分子CD80和CD86。由结果可以看出随着与50%人血清孵育时间的延长双功能配体靶向肿瘤疫苗对DC2.4细胞的刺激强度也随之减弱，但结果相对于阴性对照仍具有统计学意义。

请参阅图6，为本发明双功能配体靶向肿瘤疫苗治疗荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线图及肿瘤照片，实验组别包括PBS组、M/CpG-ODN-Lipo组、M-H22-Lipo组、M/CpG-ODN-4T1-Lipo组、M/CpG-ODN-H22-Lipo组。收集处于对数生长期的小鼠肝癌系H22细胞，给予4-6周龄的雌性BALB/c小鼠皮下种瘤，2X106/只老鼠，待各组小鼠成瘤后分别在第7、14、21、28、35天给与皮下注射疫苗治疗。每五天测量老鼠肿瘤体积连续测量5次。由结果可以看到，CpG-H22-ML处理组与各对照组相比肿瘤生长速度较慢，结果具有统计学意义，表明M/CpG-ODN-H22-Lipo可显著减慢肿瘤生长速度。

请参阅图7，为本发明双功能配体靶向肿瘤疫苗治疗荷瘤小鼠的生存曲线，实验组别包括PBS组、M/CpG-ODN-Lipo组、M-H22-Lipo组、M/CpG-ODN-4T1-Lipo组、CpG-H22-ML组。可以看到，M/CpG-ODN-H22-Lipo处理组与对照组生存曲线有统计学差异，小鼠生存率得到显著提高。

请参阅图8分别为PBS组、M/CpG-ODN-Lipo组、M-H22-Lipo组、M/CpG-ODN-4T1-Lipo组、M/CpG-ODN-H22-Lipo组小鼠肿瘤体积照片。待各组小鼠成瘤后分别在第5、10、15天给与皮下注射疫苗治疗。在第20天取出肿瘤，可观察到链接CpG-ODN包裹H22抗原肽甘露糖修饰的脂质体治疗组肿瘤体积最小，本图从直观上说明双功能配体靶向肿瘤疫苗较对照组有明显抑制肿瘤生长的作用。

本发明是根据特定实施例进行描述的，但本领域的技术人员应明白在不脱离本发明范围时，可进行各种变化和等同替换。此外，为适应本发明技术的特定场合或材料，可对本发明进行诸多修改而不脱离其保护范围。因此，本发明并不限于在此公开的特定实施例，而包括所有落入到权利要求保护范围的实施例。

Claims (7)

1.一种双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、双十二烷基二甲基溴化铵、软脂酸-甘露糖酯、α-生育酚按照摩尔比为49.8：40：5：3：2：0.2的比例混合后，通过真空旋转蒸发后干燥，再重悬过滤得甘露糖修饰的纳米脂质体；

S2、使用磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺制备胶束液，将CpG-寡聚脱氧核苷酸溶液加入所述胶束液中，在氮气氛围中反应30-60分钟，加入与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺等摩尔的β-半胱胺，孵育30-60分钟；随后将孵育液加入步骤S1制得的甘露糖修饰的纳米脂质体的溶液中，反应30-45分钟，得到双功能配体修饰的纳米脂质体；

S3、通过反复融冻法从肿瘤细胞中提取肿瘤抗原肽；

S4、通过冻干-再水化法将肿瘤抗原肽包裹进所述功能配体修饰的纳米脂质体内得双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗。

2.根据权利要求1所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中真空旋转蒸发的转速为200rpm/min，时间为10-20分钟，水浴温度为40度，所述干燥的时间为2-4小时，所述重悬采用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液水浴超声5-10分钟，所述过滤中采用孔径为200nm、100nm和50nm的聚碳酸酯膜。

3.根据权利要求1所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中将孵育液与步骤S1制得的甘露糖修饰的纳米脂质体的溶液在55度水浴反应30-45分钟。

4.根据权利要求1所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，将型号为H22或4T1的肿瘤细胞的重悬液用封口膜密封，在液氮中反应10-20分钟，再在37℃水浴反应10-20分钟，如此反复冻融，最后在600rpm转速下离心10分钟收集上清得到所述肿瘤混合抗原肽。

5.根据权利要求1所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中反复冻融5次。

6.根据权利要求1所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括：在步骤S2制得的双功能配体修饰的纳米脂质体中加入所述肿瘤抗原肽以及与所述双功能配体修饰的纳米脂质体等摩尔的蔗糖，通过冻干-再水化法制备双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗。

7.一种双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗，其特征在于，采用权利要求1-6中任意一项所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法制得。