CN112826928A - 一种cd40靶向树突状细胞纳米疫苗及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本申请属于基因工程疫苗制备技术领域，具体涉及一种CD40靶向树突状细胞纳米疫苗及其构建方法专利申请事宜。该疫苗命名为：MSN‑CD40/抗原/Toll激动剂，具体制备步骤包括：CD40抗体修饰MSN制备MSN‑CD40、负载抗原、负载激动剂等步骤。初步实验结果表明，本申请所制备纳米复合物MSN‑CD40/OVA/CpG可以被脾脏DC亚群和骨髓来源BMDC有效地吞噬并诱导BMDC成熟和细胞因子释放。同时，该纳米载体可以实现有效的抗原交叉递呈，促进DC成熟并实现交叉递呈抗原给T细胞，促进CD8+T细胞的增值和IFN‑γ的分泌以产生免疫杀伤功能。

Description

一种CD40靶向树突状细胞纳米疫苗及其构建方法
技术领域
本申请属于基因工程疫苗制备技术领域，具体涉及一种CD40靶向树突状细胞纳米疫苗及其构建方法专利申请事宜。
背景技术
基于免疫原理的癌症免疫疗法，因其安全性、对于肿瘤类型的普适性，近年来得到了较多重视，并进行了大量研究。目前研究中，主要的免疫检查点分子有：
（1）细胞毒性T淋巴细胞抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4），该分子在活化的T细胞上表达，CTLA-4与T细胞上的共刺激受体CD28共享其配体：B7-1（CD80）和B7-2（CD86）；当活化的树突状细胞（DC）向T细胞呈现主要组织相容性复合物（MHC）-肽复合物时，B7-1和B7-2高表达；
（2）细胞程序性死亡蛋白-1（programmed cell death protein -1，PD-1），PD-1是一种免疫检查点抑制剂，属于免疫球蛋白超家族，在T细胞和pro-B细胞表面表达；PD-1及其配体PD-L1在癌细胞逃避免疫系统的能力中发挥核心作用；
（3）淋巴细胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3 ，LAG-3），被称为具有四个Ig样结构域的CD4同源分子，可以与MHC II类分子结合，LAG-3在微量免疫反应期间对T细胞的扩增发挥作用，对于增强Treg细胞的功能也至关重要，并且负调控CD8+T细胞的功能；
（4）T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（T-cell immunoglobulin mucin-3，TIM-3），是一种糖蛋白免疫检查点分子，具有细胞外免疫球蛋白和粘蛋白结构域； TIM-3在与其配体galectin-9结合后，诱导Th1细胞死亡并阻碍TIM-3依赖性途径中的Th1免疫应答。
疫苗（vaccine）是一种非常有应用前景的癌症防治方法。其主要作用原理为：抗原提呈细胞（Antigen Presenting cell，APC）可以递呈一个或者多个肿瘤抗原来激活免疫反应，从而发挥抗肿瘤效用。治疗性疫苗的活性主要依赖于抗原特异性CD8+T细胞诱导分化产生杀伤癌症或感染细胞的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。理想情况下，治疗性疫苗可以激活幼稚T细胞并调节现有的记忆T细胞（Scheme 2）。而恶性肿瘤具有通过表达免疫抑制分子或分泌免疫抑制细胞因子来抑制DC和效应T细胞的功能来逃避循环抗肿瘤免疫反应。由于树突状细胞（Dendritic cell，DC）是最强大的抗原呈递细胞（Antigen-presenting cell，APC），在产生强烈的免疫应答方面非常有效，被认为是免疫系统的中心，是连接先天性和适应性免疫反应之间联系的重要媒介。因此树突状细胞（Dendritic cell，DC）在癌症免疫治疗策略中对于激活免疫系统具有十分重要的地位。而如何实现有效递送抗原给DC并刺激其成熟，以及随后强烈引发DC表面肿瘤相关抗原的交叉递呈是DC免疫疗法的关键。
基于纳米材料的纳米粒径这一基本特性，利用纳米材料构建的各类药物递送系统在各类疾病的诊断、治疗、甚至疫苗开发中得到了较多关注。而在各类纳米材料中，介孔二氧化硅纳米粒子（MSNs），由于其良好的胶体稳定性、可调的孔径、广泛的载药能力和易于改性的表面而得到了深入研究。因此，如能基于现有纳米材料开发一种针对性的DC疫苗，对于解决相关肿瘤防控具有十分重要的科研价值和技术应用意义。
发明内容
本申请目的在于，结合现有纳米材料药物递送系统，提供一种基于CD40靶向的树突状细胞纳米疫苗及其制备方法，从而为相关肿瘤的防控和治疗奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种CD40靶向树突状细胞纳米疫苗，将其命名为：MSN-CD40/抗原/Toll激动剂，具体通过如下步骤制备：
（一）CD40抗体修饰MSN制备MSN-CD40
采用碳二亚胺法，将CD40抗体与氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒进行偶联，制备化学偶联的MSN-CD40（即，完成CD40抗体对介孔二氧化硅的标记修饰）；具体操作而言：
将CD40抗体与MES缓冲液配制的2mM NHS、5mM EDC共孵育15min后，再与清洗干净的介孔二氧化硅纳米颗粒共孵育2h，孵育结束后，清洗干净后所得即为CD40抗体标记修饰后介孔二氧化硅MSN-CD40；
所述介孔二氧化硅为电位为正电荷的氨基化的介孔二氧化硅MSN-NH2；
（二）负载抗原
将抗原制备成溶液，利用步骤（一）中的CD40抗体标记修饰后介孔二氧化硅MSN-CD40对抗原进行吸附负载，分离获得负载抗原的复合物MSN-CD40/抗原；
所述抗原，具体例如为OVA蛋白，由此，复合物为MSN-CD40/OVA；
（三）负载激动剂
取步骤（二）中所制备复合物MSN-CD40/抗原，在溶液状态下，负载吸附Toll激动剂，最后，分离获得同时负载抗原和Toll激动剂的纳米复合物：MSN-CD40/抗原/Toll激动剂；
所述Toll激动剂，具体例如为：CpG ODN1826、2’,3’cGAMP、R848、Poly:IC等，以CpGODN1826所制备纳米复合物，可命名为：MSN-CD40/OVA/CpG。
所述CD40靶向树突状细胞纳米疫苗在制备肿瘤药剂中的应用，所述肿瘤，具体例如为黑色素瘤。
已有研究认为，CD8+T免疫细胞的激活需要的条件有：（1）抗原提呈细胞对抗原的递呈，（2）产生辅助CD8+T细胞增值和分化的细胞因子。基于DC的免疫疗法是肿瘤免疫治疗中的一个重要研究方向，在通过DC疫苗启动特异性免疫应答时，抗原刺激成熟后的DC必须进一步与T细胞相互作用才能发挥免疫效力。为此，如何刺激和促进DC成熟、以及促进抗原交叉递呈是DC疫苗设计中必不可少的关键步骤。
作为抗原递呈的DC细胞，未成熟DC在转化为成熟DC之前，具有很强的吞噬能力，并且特异性表达胞内外病原体识别受体，如Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）。因此，配合相关激动剂应用，是促进树突状细胞（Dendritic cell，DC）成活、并激活相关免疫活性T细胞通路的关键之一。
另一方面，细胞表面分子CD40是DC上高度表达的肿瘤坏死因子受体家族的细胞表面受体，也是先天和适应性免疫系统的有力激活剂，因此CD40也是癌症免疫疗法中的治疗靶标之一。在生物机体中，CD40主要由抗原呈递细胞（包括树突细胞、单核细胞和B细胞等）表达，而CD40的配体（即CD154）则在多种细胞类型上表达，包括活化的CD4+T细胞、活化的B细胞、记忆性CD8+T细胞等。而现有研究表明，CD40与CD40配体的相互作用是DC有效递呈抗原和激活抗原特异性CD8+T细胞的能力的关键，具体而言：DC上CD40的配合连接，增强了共刺激分子（例如CD80和CD86）和主要组织相容性（MHC）分子的表达，进而诱导免疫细胞因子的释放和抗原递呈途径的激活。
虽然基于上述机理可以进行初步DC疫苗设计，但生物免疫类疫苗实际应用中，如果仅仅通过常规皮下注射方式进行应用，其实际应用效果往往较差，其主要原因在于：皮下注射后疫苗中，仅有小部分抗原可以被递送给DC并进而激活免疫系统，而大部分注射疫苗则会被身体正常代谢或者其他基体免疫细胞作为正常清除。因此，良好的疫苗载体系统设计是生物免疫类疫苗设计的关键技术之一。现有技术中，基于介孔二氧化硅纳米载体（Mesoporous Silica Nanoparticle，MSN）的良好的生物相容性、较好卸载能力等特性，是研究和应用的较为广泛的纳米药物递送系统之一。
在过去几年中，作为用于治疗各种疾病的药物载体的介孔二氧化硅纳米载体（Mesoporous Silica Nanoparticle，MSN）的研究迅速增加，表明其在药物递送中的潜在益处。利用此纳米材料，本申请中，发明人利用CD40抗体对其进行了修饰，同时利用该纳米材料负载了模式蛋白OVA作为模拟抗原，同时负载了CpG ODNs来作为激动剂以促进免疫细胞的激活，以此制备获得了CD40靶向的DC疫苗用纳米复合物MSN-CD40/OVA/CpG。
初步实验结果表明，纳米复合物MSN-CD40/OVA/CpG可以被脾脏DC亚群和骨髓来源BMDC有效地吞噬并诱导BMDC成熟和细胞因子释放。进一步地交叉递呈实验结果表明，该纳米载体可以实现有效的抗原交叉递呈，促进DC成熟并实现交叉递呈抗原给T细胞，促进CD8+T细胞的增值和IFN-γ的分泌以产生免疫杀伤功能。基于这些结果，可为相关DC疫苗的设计、开发奠定良好的技术基础，也为新的疫苗设计提供了新的思路和借鉴参考。
附图说明
图1 为不同Toll样激动剂对诱导第六天的BMDC的成熟作用评价过程中的CD80、CD86流式检测结果，其中：A为BMDC表面CD80的Mean值，B为BMDC表面CD86的Mean值；
图2为相关纳米复合物的表征结果，其中：A为MSN-NH2的TEM图，B为MSN/OVA/CpG的TEM图，C为MSN-CD40/OVA/CpG的TEM图；D为MSNs、MSN-IgG、MSN-CD40的红外光谱分析图；
E为各材料的Zeta电位测定结果；F为MSN-CD40/OVA/CpG纳米复合物的DLS 图；
图3为 MSN-CD40/OVA /CpG 纳米复合物对C57BL /6小鼠脾细胞不同亚群的内化实验结果（需要解释的是，制图时，图中制备材料名称中只是漏写CpG，并非实质性错误），实验时，脾细胞（400000细胞/孔）与各材料（折算后，OVA-FITC浓度为12.5μg/mL）混匀后，37℃温育4小时，流式检测分析，FITC的Mean值表示每个细胞内化的颗粒的相对量；其中：A为CD45+ CD11c+ NP + DC群实验结果；B为CD45 + B220 + CD19b + NP + B细胞群实验结果；C为CD45 + F4/80 + CD11b + NP +巨噬细胞群实验结果；图中结果统计结果为平均值，*表示p <0.05，**表示 p <0.01，***表示p <0.001（各图结果统计方式相同，不再一一说明）；
图4为MSN-CD40/OVA/CpG 纳米复合物对BMDC影响，结果证明，MSN-CD40/OVA/CpG纳米复合物可以通过多途径进入BMDC内；其中：A为BMDC（200000细胞/孔）与各材料的流式检测结果；B为BMDC（200000细胞/孔）与各材料、以及抑制剂孵育后的流式检测结果；C为BMDC与各材料孵育后的具体数据统计结果；D为BMDC与各材料、以及抑制剂孵育后的具体统计结果；
图5为不同材料与BMDC共孵育后的共聚焦成像及MTT活性检测结果；其中：
A为各实验组（BMDC，200000个细胞/孔）的共聚焦成像图（比例尺，7.5μm）；
B为MTT活性实验统计结果（BMDC，50000个细胞/孔）；
图6为各实验组对骨髓树突状细胞成熟影响结果图；其中：
A为BMDC上CD80表达的流式结果；
B为BMDC上CD86表达的流式结果；
C为BMDC上CD80表达的具体统计结果；
D为BMDC上CD86表达的具体统计结果；
E为通过ELISA法对上清液中IFN-γ的分泌情况的定量检测结果；
图7为MSN-CD40/OVA/CpG纳米颗粒体外对BMDC的MHC-I抗原呈递影响实验结果；实验时，将来自C57BL/6小鼠的BMDC与不同材料孵育后，收集BMDC进行流式检测，另一方面，对从OT-1小鼠淋巴结分离的CD8+T细胞进行CFSE标记后，与不同材料进行孵育；其中：
A为不同实验组处理BMDC后，对CD8+T细胞增殖刺激情况；
B为ELISA法对上清液中IFN-γ的分泌定量检测结果；
图8为MSN-CD40/OVA/ CpG纳米复合物对C57BL/6小鼠体内免疫活性实验结果；其中：
A为小鼠免疫流程示意图，其中OVA257-264在体外刺激脾脏细胞6h或者5天；
B为对脾脏细胞中毒性CD8 + T细胞释放IFN-γ比例的流式分析结果（左侧5副图），最右侧图为IFN-γ+ CD8 + T细胞数量具体统计图；
C为ELISA法对细胞上清中IFN-γ分泌量检测结果；
D为ELISA法对树突细胞成熟标志物MHC-II的检测结果；
E为ELISA法对CD80CD86检测结果；
图9为 MSN-CD40/OVA/CpG纳米复合物的活体抗肿瘤实验结果；其中：
A为荷瘤小鼠免疫给药流程示意图，小鼠荷瘤和免疫时，2×105个 B16-OVA细胞小鼠皮下荷瘤，皮下给药免疫小鼠，荷瘤第3天开始给药，每隔7天免疫一次，免疫3次，最后一次免疫结束第5天处死小鼠；
B为给药期间各实验组小鼠体重记录；
C为给药期间各组小鼠瘤体积记录；
D为各实验组荷瘤小鼠处死后肿瘤实际图；
E为各实验组小鼠肿瘤细胞中CD45+CD3+CD8+T细胞浸润检测流式图（左侧5副图），最右侧为具体统计结果；
F为各实验组小鼠肿瘤细胞中CD45+CD3+CD4+T细胞浸润检测流式图（左侧5副图），最右侧为具体统计结果；
G为各实验组小鼠脾脏细胞中CD8+IFN-γ+T细胞分泌比例的流式图（左侧5副图），最右侧为具体统计结果；
H为各实验组淋巴结细胞中CD8+IFN-γ+T细胞分泌比例的流式图（左侧5副图），最右侧为具体统计结果；
I为各实验组小鼠肝、肾、心脏的HE染色图（视野：200 x）。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
SPF级6~8周龄C57BL/6小鼠，购自北京维通利华公司；
原代OT-I小鼠由上海交通大学的杨选民教授惠赠，实验过程中所用为OT-I雄性小鼠与野生型6~8周龄C57BL/6小鼠交配繁殖后所生二代小鼠（经流式鉴定确定之后再进行相关实验）；
主要试剂：
FBS（胎牛血清）、RPMI 1640 培养基等，BI公司产品；
Murine GM-CSF（小鼠粒细胞巨噬细集落刺激因子）、Murine IL-4（小鼠白介素4）等，PeproTech公司产品；
Anti-mouse CD40 （Clone: FGK4.5）、Anti-mouse IgG（Clone: N418）等，BioCell公司产品；
Anti-mouse CD11c-APC（Clone: N418）、Anti-mouse CD80-eflour710 （Clone:N418）、Anti-mouse CD86-FITC（Clone: GL-1）、anti-mCD8α-APC（53-6.7）、anti-mCD3-PerCP-Flour 710（17A2）、anti-mCD86-FITC（GL1）、anti-mCD40-FITC（HM40-3）、anti-mCD45-FITC（30-F11）、anti-mCD8α-APC（53-6.7）、anti-mCD3-PerCP-eflour 710（17A2）、anti-mIFN-γ-APC（XMG1.2）、anti-mPerforin-APC（eBioOMAK-D）、anti-mGrz B-APC（NGZB）、anti-mCD8α-PE（53-6.7）等，均为eBioscience公司产品；
Ovalbumin（OVA，鸡卵白蛋白）、EDC、MES、Sulfo-NHS、FITC-NHS、荧光染料CFSE、MTT等，Sigma-Aldrich公司产品；
CpG ODN1826，金唯智生物科技有限公司产品；
MSN-NH2（氨基化修饰），上海羧菲生物科技公司产品；
EasySepTM Mouse CD8+T Cells Isolated，Stemcel公司产品l；
Hoechst 33342，索莱宝公司产品；
LysoTracker Red DND-99，Invitrogen公司产品；
Protein Transport Inhabitor（Containing Brefeldin A），BD公司产品；
实验过程中所用2 mol/L HCl、0.1 mol/L HCl、0.85 mol/L NH3·H2O溶液、100mM PBS溶液、2 mg/mL Sulfo-NHS溶液、2 mg/mL EDC溶液、0.5 M EDTA溶液、硼酸缓冲液、0.25% 胰蛋白酶溶液、5.6% NaHCO3溶液、10 mg/mL L-Gln溶液、RPMI-1640培养基、5 mg/mLMTT溶液、红细胞裂解液、0.5mol/L 碳酸盐溶液（pH=9.0）、PBST溶液、BSA封闭液等，参考现有技术常规配制即可；
主要仪器：
透射电镜（Tecnai G2 F20-S-TWIN），FEI公司；
红外光谱仪（FT/IR），ThermoScientific公司；
粒径电位分析仪（Nano-S90），Malvern公司；
酶标仪，BioRad公司；
流式细胞仪FACS Calibur，BD公司；
LightCycler 480荧光定量PCR仪，Roche罗氏公司。
实施例1
基于DC的免疫疗法，其应用效果主要依赖于有效刺激DC活化以进一步诱发强烈的CTL反应，而这一过程不仅需要模式抗原的有效递送，免疫佐剂的选择同样可以有效促进DC抗原提呈能力，同时增加MHC分子的表达和细胞因子的分泌。基于此技术原则，本实施例中，发明人以介孔二氧化硅（Mesoporous silica nanoparticle，MSN为纳米载体，通过利用CD40抗体修饰氨基化介孔二氧化硅表面来实现对DC的主动靶向，同时以靶向TLR9的激动剂CpG ODN1826作为免疫佐剂，以OVA蛋白作为模式抗原，构建了主动靶向DC的纳米复合物MSN-CD40/OVA/CpG。下面就相关实验过程简述如下。
（一）CD40抗体修饰MSN
选择电位为正电荷的氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒，碳二亚胺法，将其与CD40抗体进行偶联，以完成CD40抗体对介孔二氧化硅的标记修饰；具体操作参考如下。
首先，移取酒精储存的电位为正电荷的氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒（平均粒径200nm）于1.5mL Ep管内，4℃、12000rpm离心30min，弃上清（去除储存中的酒精）；随后200μL无菌水超声重悬，再补加体积至1mL后，4℃、12000rpm离心30min，重复两次，以确保清洗干净；
CD40抗体对介孔二氧化硅进行标记修饰（饱和修饰）时：
用0.1M的MES缓冲液（pH 6.0）分别溶解NHS（N-羟基丁二酰亚胺）和EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）；
将CD40抗体与2mM NHS、5mM EDC共孵育15min；
随后，将上述共孵育后混合物再与氨基化介孔二氧化硅共孵育2h；
孵育结束后，4℃、12000rpm离心30min，弃上清；用200μL PBS7.2超声重悬，补加体积至1mL后，4℃、12000rpm离心30min，重复两次后，最后所得即为CD40抗体标记修饰后介孔二氧化硅MSN-CD40。
（二）负载抗原OVA蛋白
首先，制备OVA蛋白溶液，具体而言：取10mg OVA蛋白，PBS7.2溶解后（1mg OVA加1ml PBS溶解），0.22μM滤头过滤备用；
随后，取上述浓度OVA蛋白溶液1.2ml，与步骤（一）中修饰后介孔二氧化硅MSN-CD40混合均匀后，4℃、避光、搅拌过夜，以确保介孔二氧化硅充分负载OVA蛋白；
以质量比计，具体比例参考为，MSN：OVA = 5:1；
最后，负载结束后，将上述混合物转移至Ep管，4℃、12000rpm离心30min（对于上清液，采用BCA蛋白定量法测定上清中蛋白的含量，从而计算负载率），所得沉淀即为负载抗原OVA蛋白的MSN-CD40/OVA纳米复合物。
（三）负载激动剂
取步骤（二）中所制备MSN-CD40/OVA纳米复合物，PBS7.2重悬后，在重悬液中缓慢加入Toll激动剂CpG ODN1826 300μg，4℃、避光、搅拌过夜以充分吸附；
以质量比计，具体比例参考为：MSN: CpG = 2:1；
负载结束后，将上述混合物转移至Ep管，4℃、12000rpm离心30min，所得沉淀即为负载抗原OVA蛋白的MSN-CD40/OVA/CpG纳米复合物（纳米载体）。
作为对照，参考上述操作，发明人同时制备了其他类型纳米复合物（MSN-CD40/OVA/CpG、MSN-IgG/OVA/CpG、MSN/OVA/CpG），以便进行相关实验验证。
另一方面，需要解释的是，上述MSN-CD40/OVA/CpG纳米复合物制备前，发明人对于Toll激动剂进行了初步筛选，基于相关筛选结果，发明人才初步确定选择CpG ODN1826作为最终纳米载体应用中的免疫佐剂。因此，下面就相关筛选实验简介如下。
（1）制备鼠源髓系BMDC（Bone-marrow derived dendritic cell，髓系来源树突状细胞）并进行诱导
首先，选取6-8周龄C57BL/6雌性小鼠，脱颈处死后，浸泡于75%酒精中5min进行消毒，随后解剖剥取大腿骨（去腿附肉），置于无菌PBS7.2中备用；
随后，在无血清1640培养基中，用培养基冲出大腿骨中骨髓，再用筛网过滤后，将滤液转移至离心管中，4℃、3000rpm离心5min，弃上清；
随后，用5mL红细胞裂解液室温裂解10min，再4℃、3000rpm离心5min，弃上清；
再后，用含10% FBS的1640培养基重悬后，加入20ng/mL GM-CSF和10ng/mL IL-4细胞因子，置于37℃恒温培养箱培养，记为第0天；
第3天，开始半量换液（即，抽取10mL培养基弃掉，再补加新的培养基10mL，同时再补加新的细胞因子以保持浓度恒定）；每天半量换液，直至第6天，即为不成熟BMDC。
（2）Toll激动剂对BMDC的刺激成熟作用
取步骤（1）中诱导第六天的不成熟BMDC，调整细胞浓度为4×106个/mL，铺24孔板，随后加入不同类型和不同浓度激动剂：
2’,3’cGAMP（1μg/mL和2μg/mL）、R848 （10μg/mL）、Poly:IC （20μg/mL）、CpG（ODN1826，30μg/mL）；
将激动剂与BMDC在37℃恒温培养箱共孵育，随后分别在孵育24h和48 h时进行检测评估。
具体检测评估时：
收集孵育后细胞于Ep管，4℃、3000rpm离心5min，弃上清；
随后，分别加入各流式抗体0.3μL（anti-mouse CD11c-APC、anti-mouseCD80-eflour710、anti-mouseCD86-FITC），4℃、避光孵育30min；
孵育结束后，转移至Ep管，4℃、3000rpm离心5min，弃上清，PBS7.2重悬过滤，流式检测DC表面CD80/CD86的变化。
不同类型、不同浓度Toll激动剂与BMDC共孵育24h后，细胞表面CD80和CD86的流式检测结果如图1所示。对结果分析可以看出：
CpG对DC表面CD80和CD86的表达刺激增强效果更显著。机理分析表明，作为TLR9激动剂的CpG，它最终定位于内溶酶体区室，因此可通过内吞途径进入免疫细胞。作为一种较为理想的应用方式，这也为后续纳米颗粒疫苗的设计和应用奠定了理论基础。
对最终所制备不同类型纳米复合物（MSN-NH2、MSN-CD40/OVA/CpG、MSN/OVA/CpG）的TEM图如图2（图2A、图2B、图2C）所示。分析可以看出：
MSN-NH2、MSN/OVA/CpG和MSN-CD40/OVA/CpG的粒径分布均匀，形貌特征良好，形态接近圆形，平均粒径在120nm，也即，本申请在对原始纳米材料进行修饰或负载抗原后，对于纳米材料大小并没有较多影响，从而可为后续基于纳米材料的小粒径特性的稳定应用奠定材料特性基础；
进一步，对偶联CD40抗体或者同型IgG的MSN-NH2（MSN-IgG、MSN-CD40）红外光谱扫描结果如图2D所示，从图中可以看出，与MSN-NH2对比，抗体修饰的MSN在1689cm-1和1580cm-1处出现酰胺键的吸收峰，表明CD40抗体或者同型IgG均与MSN-NH2化学偶联成功；
利用马尔文粒度电位仪对不同物质Zeta电位的测定结果如图2E所示，可以看出，MSN的Zeta电位为正，而OVA/CpG的Zeta电位为负，这一结果说明可以通过静电相互作用实现MSN与OVA/CpG的结合；进一步地，MSN/OVA/CpG、MSN-IgG/OVA/CpG、MSN-CD40/OVA/CpG的Zeta电位都为负电荷，表明我们制备的纳米载体复合物可以在体内避免非特异性吸附，为纳米载体实现有效的体内靶向和在特定位点的释放奠定了理论基础；
利用马尔文粒度电位仪对MSN-CD40/OVA/CpG动态分布检测结果如图2F所示，可以看出，所制备合成的纳米载体复合物具有良好的分散性，这也为其体内进一步应用奠定了材料特性基础。
未成熟DC具有跟强的吞噬能力，而且可以表达很多胞内外病原体识别受体，比如Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）。而DC作为功能最强的抗原提呈细胞，一定要实现有效的刺激成熟后，才能高表达共刺激分子、并有效激活CD8+T细胞和诱发强烈的CTL反应，以实现有效抗肿瘤目的。由于TLR激动剂可以引发DC的表型变化，促进抗原加工、MHC提呈和细胞因子分泌。因此，本实施例中，对于不同类型Toll样激动剂进行了初步筛选验证，结果表明，CpG可以有效促进BMDC的激活（其机理为：CpG ODNs作为TLR 9的激动剂，可以通过与DC内溶酶体区室TLR 9的结合与激活，从而最终促进1型辅助T细胞和细胞毒性淋巴细胞的激活），明显增强BMDC表面共刺激分子CD80和CD86的表达，因此，实际的DC疫苗制备过程中，采用CpG作为免疫佐剂。
总之，本实施例中，发明人以DC表面高表达CD40分子作为“靶标”，以纳米级介孔二氧化硅作为基本载体，利用CD40抗体修饰了介孔二氧化硅表面以实现对DC的特异性主动靶向；具体DC疫苗设计中，以OVA蛋白作为模式抗原，以CpG作为免疫佐剂来制备了具体的MSN-CD40/OVA/CpG纳米复合物，从而为进一步DC疫苗制备奠定了技术基础。
实施例2
需要解释和说明的是，为便于观察和检测，参考现有常规操作和实施例1的描述，本实施例所采用相关纳米复合物中，OVA蛋白结合有荧光标记FITC，据此，制备了荧光纳米复合物MSN-CD40/OVA/CpG（MSN-CD40/OVA-FITC/CpG）、MSN-IgG/OVA/CpG（MSN-IgG/OVA-FITC/CpG）、MSN/OVA/CpG（MSN/OVA-FITC/CpG）。本实施例中，发明人对通过对相关细胞的吞噬实验、MTT活性检测、抗原交叉递呈能力评价等实验，对纳米复合物的体外活性效果进行了初步研究，相关实验情况简要介绍如下。
（一）对小鼠脾脏细胞不同亚群的靶向实验
选取6周-8周龄雌性C57BL/6小鼠，脱颈处死后， 75%酒精浸泡5min进行消毒，随后解剖取出小鼠脾脏，碾磨破碎后过滤单细胞悬液至离心管（可PBS7.2），4℃、3000rpm离心5min，弃上清；
将上述离心后细胞沉淀用1×红细胞裂解液室温裂解10min，补加适量PBS7.2后，4℃、3000rpm离心5min，弃上清；
PBS7.2调节细胞密度为4×105个/mL，铺6孔板，加不同类型纳米复合物作为不同实验组别，孵育4h；具体实验组别设计如下：
MSN-CD40/OVA-FITC/CpG组（CpG浓度为7.5μg /mL，细胞与纳米复合物体积用量比为1:1，以下各实验组相同，不再赘述）；
MSN-IgG/OVA-FITC/CpG 组（CpG浓度为7.5μg /mL）；
MSN/OVA-FITC/CpG组（CpG浓度为7.5μg /mL）；
OVA-FITC实验组（OVA-FITC浓度为12.5μg /mL）；
孵育结束后，收集细胞，PBS7.2洗一次后，再根据细胞特性区别加入不同抗体，再次4℃孵育30min，具体细胞类型及抗体而言：
B细胞：anti-Mouse CD45-PE 、anti-Mouse B220-efluo710、 anti-Mouse CD19-APC；
DC细胞：anti-Mouse CD45-PE 、anti-Mouse CD11c-APC；
Macrophage（巨噬细胞）：anti-Mouse CD45-PE 、anti-Mouse F4/80-efluo710、anti-Mouse CD11b-APC；
孵育结束后，补加适量PBS7.2，4℃、3000rpm离心5min，弃上清，PBS7.2重悬，200目滤网过滤后，流式上样检测FITC的荧光Mean值。
DC实现对纳米载体的特异性吞噬，以及防止被其他免疫细胞的吞噬清除是定向发挥纳米疫苗功能的关键，因此，我们检测了纳米复合物对小鼠脾脏细胞不同亚群的内化实验，以验证其靶向性。具体实验结果如图3所示。
具体分析可以看出：
图3（A）是小鼠脾脏DC亚群细胞对MSN-CD40/OVA-FITC/CpG等实验组的内化结果，可以看出CD40纳米实验组对比同型IgG组和MSN/OVA-FITC/CpG组具有差异，与OVA-FITC/CpG和NS对照组相比具有显著差异，说明：CD40修饰的MSN-CD40/OVA-FITC/CpG纳米复合物具有更好靶向性，可以更好特异性靶向DC，进而可以实现DC对MSN-CD40/OVA-FITC/CpG有效吞噬；
图3（B）是小鼠脾脏B细胞亚群对MSN-CD40/OVA-FITC/CpG等实验组的内化结果，可以看出CD40纳米实验组对比同型IgG组和MSN/OVA-FITC/CpG组具有差异，与OVA-FITC/CpG和NS对照组相比具有极显著差异，说明：CD40修饰的纳米实验组可以有效靶向B细胞，因为B细胞表面也表达CD40分子，进而说明所制备的CD40靶向的纳米实验组可以实现有效的连接固有免疫和获得性免疫系统；
图3（C）是小鼠脾脏巨噬细胞细胞亚群对MSN-CD40/OVA-FITC/CpG等实验组的内化结果，结果表明CD40纳米实验组与其他各实验组都没有差异。
（二）对BMDC的靶向实验
取诱导第六天的BMDC，1640培养基调整密度为2×105个/mL，铺于6孔板；
设置实验组别：
MSN-CD40/OVA-FITC/CpG、MSN-IgG/OVA-FITC/CpG、MSN/OVA-FITC/CpG、OVA-FITC实验组，和抑制剂组（先用细胞抑制剂genistein (50μg/mL)和chlorpromazine (10μg/mL)与BMDC孵育1h，再加入OVA-FITC浓度为12.5μg /mL的MSN-CD40/OVA-FITC/CpG）；OVA-FITC终浓度为12.5μg /mL，CpG终浓度为7.5μg /mL；
各实验组分别与BMDC在37℃培养箱共孵育4h；
孵育结束后，补加适量PBS7.2，4℃、3000rpm离心5min，弃上清，再加入anti-mouseCD11c-APC，4℃避光孵育30min；
最后，补加1×破膜剂于Ep管中，3000rpm离心5min，弃上清，PBS7.2重悬，200目滤网过滤后，流式上样检测。
前述实验已经初步证明，MSN-CD40/OVA-FITC/CpG纳米复合物可以特异性靶向小鼠脾脏DC，为进一步确定此纳米复合物是否可以同样靶向小鼠骨髓来源的BMDC，同时，为进一步确定DC的内吞途径，在利用抑制剂处理BMDC后（纳米载体通过多种途径进入细胞，本实施例选用了抑制网格蛋白介导的内吞抑制剂genistein和胞膜窖途径抑制剂chlorpromazine），在将相关细胞与本申请所制备纳米复合物进行孵育结合，对靶向效果进行了具体评价。具体实验结果如图4所示。具体而言：
图4是流式检测BMDC对MSN-CD40/OVA-FITC/CpG等实验组的吞噬实验，图4A、图4C结果是小鼠BMDC对MSN-CD40/OVA-FITC/CpG等实验组的内化结果，可以看出CD40纳米实验组对比同型IgG组和MSN/OVA-FITC/CpG组具有差异，与OVA-FITC/CpG和NS对照组相比具有显著差异，说明：CD40靶向修饰的纳米组可以更好的靶向BMDC，实现BMDC对MSN-CD40/OVA-FITC/CpG有效吞噬；
图4B、图4D中，chlorpromazine抑制剂处理细胞后，MSN-CD40/OVA-FITC/CpG实验组吞噬能力受到抑制；genistein抑制剂处理细胞后，MSN-CD40/OVA-FITC/CpG实验组吞噬能力与NS组和MSN/OVA-FITC/CpG组相比较没有差异，但是FITC的Mean值大小还是相对有下降趋势。
上述结果说明，MSN-CD40/OVA-FITC/CpG纳米载体可以更好的靶向脾脏细胞DC亚群和骨髓来源的BMDC，并且是通过多途径内化进入细胞。
（三）对BMDC的CLSM（激光共聚焦扫描）成像
取诱导第六天的BMDC，1640培养基调整密度为2×105个/mL，铺于6孔板；
设置实验组别：
MSN-CD40/OVA-FITC/CpG、MSN-IgG/OVA-FITC/CpG、MSN/OVA-FITC/CpG、OVA-FITC实验组；OVA-FITC终浓度为12.5μg /mL，CpG终浓度为7.5μg /mL；
各实验组分别与BMDC在37℃培养箱共孵育4h；
孵育结束后，补加适量PBS7.2，4℃、3000rpm离心5min，弃上清，再PBS7.2洗涤2次；
加入LysotrackerTM Red DND-99（终浓度50nM)，37℃、共孵育1h后，4℃、3000rpm离心5min，弃上清，再PBS7.2洗涤2次；
再加入DAPI（终浓度2μg/mL），37℃、共孵育40min后，4℃、3000rpm离心5min，弃上清，再PBS7.2洗涤2次；
再4%多聚甲醛固定15min后，PBS洗两次，最后加入10uL防荧光猝灭剂重悬细胞，再滴加到载玻片上，盖上盖玻片，置于共聚焦显微镜下观察。
成像结果如图5A所示，具体而言：
图5A是MSN-CD40/OVA-FITC/CpG等实验组与BMDC的CLSM成像，LysotrackerTM RedDND-99染色BMDC的溶酶体，视野是红色荧光，DAPI复染细胞核，视野是蓝色荧光，模式抗原FITC标记的OVA蛋白，视野显示绿色荧光；从成像结果可以看出，与OVA-FITC/CpG、MSN/OVA-FITC/CpG和MSN-IgG/OVA-FITC/CpG对比结果可以看出，CD40纳米组OVA-FITC荧光最强，用chlorpromazine抑制剂处理细胞后，CD40纳米组OVA-FITC荧光明显减弱，这也进一步证明了纳米复合物进入DC的途径。
（四）对BMDC的活性影响
取诱导第六天的BMDC，无血清RPMI-1640培养基调整密度为5×105个/mL，吸取100uL铺于96孔板，37℃恒温培养4h，饥饿处理细胞，以使细胞同步化；
补加血清，每孔血清含量为10%FBS，设置：
调零孔（无细胞只有培养基）、PBS组、OVA/CpG组、MSN/OVA /CpG组、MSN-IgG/OVA/CpG 组、MSN-CD40/OVA/CpG组；
OVA-FITC终浓度为12.5μg /mL，CpG终浓度为7.5μg /mL；
各实验组分别与BMDC在37℃培养箱共孵育24h；
实验结束前4h，每孔加20μL的MTT工作液，继续恒温培养至时间结束，终止培养；
弃去旧的培养液，每孔加入150μL的DMSO，室温震荡10min；酶标仪设置波长490nm，测定各孔吸光度值。
图5B是以OVA蛋白浓度为12.5μg/mL 定量的MSN-CD40/OVA/CpG、MSN-IgG/OVA/CpG、MSN/OVA/CpG、OVA/CpG实验组与BMDC共孵育的MTT实验结果，分析结果可以看出各实验组与BMDC共孵育24h后，对细胞活性没有影响。
（五）对BMDC的成熟影响
对BMDC成熟影响主要从BMDC表面Maker变化和TNF-α释放情况进行评价。具体实验操作参考如下。
流式检测BMDC表面Maker变化时：
取诱导第六天的BMDC，1640培养基调整密度为2×105个/mL，铺于6孔板；
设置实验组别：
MSN-CD40/OVA-FITC/CpG、MSN-IgG/OVA-FITC/CpG、MSN/OVA-FITC/CpG、OVA-FITC实验组；OVA-FITC终浓度为12.5μg /mL，CpG终浓度为7.5μg /mL；
各实验组分别与BMDC在37℃培养箱共孵育24h；
孵育结束后，补加适量PBS7.2，4℃、3000rpm离心5min，弃上清；
加入各抗体0.3μL：anti-Mouse CD11c-APC、anti-Mouse CD80-eflour710、anti-Mouse CD86-FITC，4℃避光孵育30min；再4℃、3000rpm离心5min，弃上清，PBS7.2重悬后过滤，流式上样检测。
法检测BMDC细胞上清TNF-α释放情况时：
首先，将TNF-α的Capture antibody 的1×稀释液按100μL每孔量加入96孔板进行包被；
随后，利用PBST溶液对96孔板进行洗涤，并对各孔加入封闭液（200μL每孔）室温封闭1h；
再后，加入TNF-α标品（吸取标品原液230μL，取出115μL进行倍比稀释，设置8个浓度梯度）和细胞上清100μL于96孔板中，以稀释液做空白对照，盖上封板，室温孵育2h；
将TNF-α的Detection antibody 的1×稀释液，按100μL每孔量加入96孔板，盖上封板，室温孵育1h；再将250×Avidin HRP的1×稀释液，按100μL每孔量加入96孔板，盖上封板，室温孵育30min；
PBST溶液洗涤后，各孔加入100μL 的TMB溶液，室温避光孵育15min，根据颜色深浅判定终止反应时机（10-20min左右即可），每孔加入50μL的H3PO4溶液，终止反应10min；
最后，酶标仪上检测490nm检测OD值，根据结果绘制曲线。
一般而言，未成熟的DC吞噬能力具有很强的，而成熟的DC细胞表面则高表达激活T细胞的共刺激分子，同时分泌细胞因子。为了验证MSN-CD40/OVA/CpG实验组是否可以促进DC成熟，通过上述CD80/CD86荧光值检测及TNF-α分泌情况进行判定。结果如图6所示，具体而言：
图6A、图6C是MSN-CD40/OVA/CpG与诱导的未成熟BMDC孵育24h，流式细胞仪检测CD11c+DC表面Maker CD80的表达，结果可以看出MSN-CD40/OVA/CpG与MSN-IgG/OVA/CpG、MSN /OVA/CpG和OVA/CpG实验组相比，CD80荧光Mean值具有差异，与NS对照组相比具有显著差异；
图6B、图6D是MSN-CD40/OVA/CpG与诱导的未成熟BMDC孵育24h，流式细胞仪检测CD11c+DC表面Maker CD86的表达，结果可以看出：MSN-CD40/OVA/CpG与MSN-IgG/OVA/CpG和MSN /OVA/CpG相比，CD80荧光Mean值没有差异，与OVA/CpG和NS对照组相比具有差异；
图6（E）是ELISA检测细胞上清TNF-α的表达，CD40靶向组与其他非靶向组相比，TNF-α的分泌量具有差异；结果表明：MSN-CD40/OVA/CpG不仅可以有效的被BMDC吞噬，同时促进BMDC成熟，也可增加相关细胞因子的分泌，为后续验证DC发挥抗原交叉能力提供了实验基础。
（六）靶向BMDC的抗原交叉递呈实验
首先，参考前述操作及现有常规操作，将OT-1小鼠（6-8周龄OT-1雌性小鼠）脱颈处死后，解剖取老鼠的脾脏、腹股沟和面部淋巴结，碾磨破碎、离心后，红细胞裂解液裂解处理，裂解完成后，4℃、3000rpm离心5min；
随后，用含1mM EDTA和2%FBS的PBS（7.4）重悬细胞后，调整密度为1×108，并加入大鼠血清室温封闭3min；
再后，参考EasySepTM鼠源CD8+T细胞分选试剂盒说明书，分选获得脾脏和淋巴结的CD8+T细胞。
参考现有常规操作及CFSE说明书，利用CSFE标记分选所得CD8+T细胞，并调整标记后细胞密度为1×106。
最后，取诱导第六天的BMDC，1640培养基调整密度为1×106个/mL；设置实验组别：
MSN-CD40/OVA-FITC/CpG、MSN-IgG/OVA-FITC/CpG、MSN/OVA-FITC/CpG、OVA-FITC实验组；OVA-FITC终浓度为12.5μg /mL，CpG终浓度为7.5μg /mL；
各实验组分别与BMDC在37℃培养箱共孵育4h；
孵育结束后，离心收集细胞，调整细胞密度为1×105，按100μL/孔量加入到事先铺有CFSE染色的CD8+T细胞的96孔板上（CD8+T细胞，100μL/孔），混匀后，37℃恒温共孵育72h；
孵育结束后，离心，加入各抗体0.5μL：anti-mouse-CD3 eflour710、anti-mouse-CD8 APC，放置冰上，避光孵育30min；
最后，PBS7.2洗两次，并用200目筛网过滤细胞后，流式细胞仪检测。
上述实验设计中，利用经典的DC/OVA/OT-I交叉递呈模型验证C57BL/6小鼠骨髓来源BMDC的抗原递呈能力。具体实验结果如图7所示，具体而言：
图7（A）的流式结果可以看出， MSN-CD40/OVA/CpG实验组有效促进CD8+T细胞增殖（20.1%）；
图7（B）ELISA检测BMDC与CD8+T共孵育72h后细胞上清中IFN-γ的分泌量，结果可以看出，MSN-CD40/OVA/CpG与同型对照MSN-IgG/OVA/CpG相比具有显著差异，与MSN /OVA/CpG、OVA/CpG和NS对照组相比，细胞上清IFN-γ的分泌量具有极显著差异。
基于DC纳米疫苗的构建是要实现有效的促进DC成熟和抗原递呈，激活CD8+T细胞，产生强烈的CTL反应是免疫抗肿瘤的关键。从上述相关体外实验结果可以看出：MSN-CD40/OVA-FITC/CpG可以有效的促进脾脏细胞DC亚群和B细胞亚群的内化，而避免了“清道夫”巨噬细胞的吞噬，更有利于CD40靶向的纳米载体对DC的激活。B细胞是发挥固有免疫的主要效应细胞，而我们构建的MSN-CD40/OVA-FITC/CpG纳米载体同样可以有效靶向B细胞，表明我们的CD40靶向的纳米载体既可以激活适应性免疫系统，也可以连接固有免疫系统发挥功效。骨髓诱导来源BMDC同样可以有效的内化MSN-CD40/OVA-FITC/CpG，CLSM成像也可以直观看出MSN-CD40/OVA-FITC/CpG实验组FITC绿色荧光最强，并且共定位于BMDC的溶酶体区域（视野红色荧光）。另一方面，MSN-CD40/OVA /CpG能有效促进BMDC的成熟，以及促进DC表面共刺激分子CD80CD86的表达和细胞因子TNF-α的分泌，并且该纳米复合物对BMDC细胞活性没有影响。而进一步的抗原递呈实验结果表明，MSN-CD40/OVA/CpG纳米复合物可以有效促进CD8+T的增值，说明BMDC纳米载体刺激成熟后增强了抗原交叉递呈能力，有助于产生强烈的CTL反应，对于确保有效的抗肿瘤活性具有重要意义。
实施例3
前述实施例2中，已经初步证明MSN-CD40/OVA/CpG纳米复合物不仅可以有效的靶向脾脏细胞的DC亚群，还对BMDC可以有效的激活，同时可以促进抗原的递呈反应，诱发强烈的CTL反应。为进一步验证该MSN-CD40/OVA/CpG纳米复合物的体内免疫效果，发明人进一步进行了相关动物活体实验，具体实验情况简介如下。
（一）体内免疫活性实验
实验分组情况：
将C57BL/6小鼠鼠随机分为5组（每组5只小鼠），设置5组实验：
生理盐水组、OVA/CpG组、MSN/OVA/CpG组、MSN-IgG/OVA/CpG组、MSN-CD40/OVA/CpG组；
小鼠尾基根部多点注射，生理盐水组每只小鼠30μg CpG ODN1826，OVA/CpG组、MSN/OVA/CpG组、MSN/OVA/CpG组和MSN-CD40/OVA/CpG组，每只小鼠100μg OVA和30μg CpgODN 1826；
每隔7天免疫一次，总共免疫3次，最后一次免疫结束后5天处死小鼠（操作流程如图8A所示）。
参考前述操作及现有技术常规操作，解剖、制备小鼠脾脏和淋巴结单细胞悬液，并调整细胞密度为1×107；随后进行脾脏细胞-胞内因子染色和脾脏细胞-ELISA铺板，具体而言：
脾脏细胞-胞内因子染色铺板时：24孔板，200μL细胞+800μL培养基，混匀后，每孔加1μL阻断剂和20μL OVA257-264多肽，刺激6h；
脾脏细胞-ELISA铺板时：6孔板，2.5mL细胞+2.5mL培养基，混匀后，每孔加100μL的OVA257-264多肽，刺激5天。
取OVA257-264多肽刺激6h的脾脏细胞，参考前述及现有常规操作，加抗体（anti-mouse-CD3-FITC、anti-mouse-CD8α-PE），流式进行IFN-γ分泌情况检测。进一步，取多肽刺激5天细胞，ELISA检测培养基上清中IFN-γ分泌量。
取淋巴结单细胞悬液，参考现有技术及常规操作，孵育抗体（anti-mouse CD45-PE、anti-mouse CD11c-APC、anti-mouse MHC-II-FITC、anti-mouse CD80-eflour710、anti-mouse CD86-FITC）后，流式检测淋巴结细胞表面Maker表达情况。
（二）B16-OVA荷瘤模型验证
参考现有常规操作，构建B16-OVA荷瘤模型（6~8周龄C57BL/6小鼠，按每只老鼠荷瘤200μL量（细胞密度为1×106）进行荷瘤）；
荷瘤3天后，小鼠随机分为5组，每组5只小鼠，设置5组实验：
生理盐水组、OVA/CpG组、MSN/OVA/CpG组、MSN-IgG/OVA/CpG组、MSN-CD40/OVA/CpG组；
小鼠尾基根部多点注射，生理盐水组每只小鼠30μg Cpg ODN 1826，OVA/CpG组、MSN/OVA/CpG组、MSN/OVA/CpG组和MSN-CD40/OVA/CpG组，每只小鼠100μg OVA和30μg CpgODN 1826；
每隔7天免疫一次，总共免疫3次，最后一次免疫结束后5天处死小鼠（免疫流程如图9A所示）。
实验过程中，从荷瘤第7天开始，每隔2天测量记录每只小鼠的背部肿瘤的长、宽、高，根据公式：1/2（长×宽×高）计算肿瘤体积，同时用天平称量每只小鼠的体重。根据记录数据绘制小鼠的体重和肿瘤体积的生长曲线。
参考现有常规操作，处死小鼠后，取出荷瘤小鼠肿瘤组织，孵育抗体（anti-mouseCD45- FITC、anti-mouse CD3-eflour710、anti-mouse CD8α-APC、anti-mouse CD4-PE）后，流式检测肿瘤部位CD3+CD8+T与CD4+T的比率；
另一方面，对荷瘤小鼠脾脏细胞胞内分泌的IFN-γ比率情况进行检测；同时，取各组小鼠器官（心脏、肝脏、肾脏）送去武汉赛维尔公司进行HE免疫染色。
体内免疫活性实验设计中，以MSN-CD40/OVA/CpG纳米复合物正常免疫C57BL/6小鼠，同时以抗原肽段OVA 257-264体外对脾脏细胞的刺激作为对照。实验结果如图8所示。具体而言：
图8B为流式细胞仪胞内因子染色检测脾脏细胞IFN-γ的分泌，MSN-CD40/OVA/CpG对比MSN-IgG/OVA/CpG、MSN/OVA/CpG和OVA/CpG表达升高，与NS对照组相比，具有显著差；
图8C是ELISA检测免疫小鼠脾脏细胞用OVA257-264多肽刺激5天后细胞上清IFN-γ的分泌量，结果可以看出， MSN-CD40/OVA/CpG与MSN-IgG/OVA/CpG、MSN/OVA/CpG和OVA/CpG相比IFN-γ分泌量具有显著差异，与NS对照组相比，具有极显著差异；说明MSN-CD40/OVA/CpG显著增强了小鼠的免疫活性，诱发了强烈的CTL反应。
淋巴结是DC与T细胞相互作用的主要区域，能有效递送抗原给DC，促进DC成熟是激活CD8+T细胞功能的关键。图8D是免疫小鼠淋巴结DC亚群表面Maker MHCII的检测，结果表明MSN-CD40/OVA/CpG与MSN-IgG/OVA/CpG、MSN/OVA/CpG和OVA/CpG相比MHCII表达具有差异，与NS对照相比MHCII表达具有显著差异。DC成熟的标志之一就是细胞表面MHC-II类分子表达增加，而DC的成熟是加工处理抗原进行抗原递呈的前提，说明我们构建的MSN-CD40/OVA/CpG在小鼠体内也可以实现促进DC的成熟。
图8E流式检测CD40靶向纳米实验组促进DC表面共刺激分子CD80CD86的表达，与同型IgG组对比没有差异，与生理盐水组相比有差异，表明MSN-CD40/OVA/CpG同样可以增加淋巴结DC细胞表达刺激T细胞功能激活的共刺激分子。
综上结果说明：MSN-CD40/OVA/CpG纳米载体可以在小鼠体内通过促进DC的成熟和活化，将抗原递呈给CD8+T细胞，产生强烈的CTL反应。
肿瘤相关抗原特异性的CD8+T细胞的数量和活性是强大的抗肿瘤免疫应答的重要决定因素，在肿瘤存在的情况下，增强CD8+T细胞应答是治疗性疫苗的关键优势。进一步的荷瘤小鼠模型实验结果如图9所示。具体而言：
图9B的体重结果表明，相关复合物应用没有明显差异，表明相关复合物不具有明显毒性；
图9C和图9D肿瘤体积结果表明，不同实验组肿瘤大小表现出明显差异，其中又以MSN-CD40/OVA/CpG实验组的抗肿瘤效果最为明显；
图9E、图9F分别是小鼠肿瘤部位CD3+CD8+T、CD3+CD4+T细胞的浸润情况，MSN-CD40/OVA/CpG纳米实验组与MSN-IgG/OVA/CpG、MSN/OVA/CpG、OVA/CpG和NS组相比具有差异；
图9G是流式检测各实验组小鼠脾脏细胞分泌IFN-γ的比例，MSN-CD40/OVA/CpG纳米实验组与MSN-IgG/OVA/CpG、MSN/OVA/CpG、OVA/CpG和NS组相比具有差异；
图9H是流式检测各实验组小鼠淋巴结细胞分泌IFN-γ的比例，MSN-CD40/OVA/CpG纳米实验组与MSN-IgG/OVA/CpG组相比具有差异，与MSN/OVA/CpG、OVA/CpG和NS组相比具有显著差异；
图9I是各实验组小鼠器官（心脏、肝脏、肾脏）HE染色，结果表明各实验组对小鼠没有毒性损伤。
综合上述各实验结果可以看出：MSN-CD40/OVA/CpG不仅在体内可以实现将抗原有效递送给DC并促进其成熟，而且可以引发抗原OVA特异性的CD8+T细胞免疫反应。肿瘤相关抗原特异性CD8+T细胞的数量和活性是诱发强烈抗肿瘤免疫反应的关键。增强CD8+T细胞反应实现抗肿瘤是治疗性疫苗的优势。进一步小鼠体内荷瘤实验结果表明，MSN-CD40/OVA/CpG纳米载体组中，在CD4+T细胞的辅助下CD8+T细胞在肿瘤部位的浸润程度增加，即，可以有效增强肿瘤部位T细胞的浸润，有利于发挥抗肿瘤作用，同时也可以有效激活各实验组小鼠脾脏细胞和淋巴结细胞CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力，而且HE染色证实各实验组小鼠器官也没有毒性作用。这些结果表明：所构建的MSN-CD40/OVA/CpG纳米载体组不仅可以有效实现抗肿瘤免疫反应，同时具有良好的生物相容性，是一个有潜力的DC纳米疫苗。

Claims (5)

1.一种CD40靶向树突状细胞纳米疫苗，其特征在于，该疫苗命名为：MSN-CD40/抗原/Toll激动剂，具体通过如下步骤制备：
（一）CD40抗体修饰MSN制备MSN-CD40
采用碳二亚胺法，将CD40抗体与氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒进行偶联，制备化学偶联的MSN-CD40；
（二）负载抗原
将抗原制备成溶液，利用步骤（一）中的CD40抗体标记修饰后介孔二氧化硅MSN-CD40对抗原进行吸附负载，分离获得负载抗原的复合物MSN-CD40/抗原；
（三）负载激动剂
取步骤（二）中所制备复合物MSN-CD40/抗原，在溶液状态下，负载吸附Toll激动剂，最后，分离获得同时负载抗原和Toll激动剂的纳米复合物：MSN-CD40/抗原/Toll激动剂。
2.如权利要求1所述CD40靶向树突状细胞纳米疫苗，其特征在于，步骤（一）中，所述介孔二氧化硅为电位为正电荷的氨基化的介孔二氧化硅MSN-NH2；
步骤（二）中，所述抗原，具体为OVA蛋白；
步骤（三）中，所述Toll激动剂，具体为：CpG ODN1826、2‘,3’cGAMP、R848、Poly:IC。
3.权利要求1所述CD40靶向树突状细胞纳米疫苗的制备方法，其特征在于，
（一）CD40抗体修饰MSN制备MSN-CD40
采用碳二亚胺法，将CD40抗体与氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒进行偶联，制备化学偶联的MSN-CD40；
（二）负载抗原
将抗原制备成溶液，利用步骤（一）中的CD40抗体标记修饰后介孔二氧化硅MSN-CD40对抗原进行吸附负载，分离获得负载抗原的复合物MSN-CD40/抗原；
（三）负载激动剂
取步骤（二）中所制备复合物MSN-CD40/抗原，在溶液状态下，负载吸附Toll激动剂，最后，分离获得同时负载抗原和Toll激动剂的纳米复合物：MSN-CD40/抗原/Toll激动剂。
4.权利要求1或2所述CD40靶向树突状细胞纳米疫苗在制备肿瘤药剂中的应用，其特征在于，作为DC疫苗进行应用。
5.如权利要求4所述CD40靶向树突状细胞纳米疫苗在制备肿瘤药剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤。
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