CN111346236B - 负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子及其制备方法与应用，负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子是将肿瘤抗原通过迈克尔加成和席夫碱反应共价连接到聚多巴胺纳米颗粒的表面上制备而成；其中，肿瘤抗原包括但不限于特异的肿瘤抗原肽段、肿瘤细胞裂解物、特异的肿瘤抗原DNA片段及佐剂CpG中的一种或多种。本发明制备得到的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子具有良好的生物相容性，可以有效激活体内的抗肿瘤免疫，显著地抑制肿瘤细胞的生长，还能改善肿瘤免疫抑制微环境，进一步增强肌体的抗肿瘤活性；可用于肿瘤的免疫治疗；制备方法温和简单、无污染。

Description

负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子及其制备方法与应用。
背景技术
全世界每年死于恶性肿瘤者大约880万人，新发病例1400万。最新统计资料显示，近二十年来，中国癌症死亡率上升了近百分之三十，每四、五个死亡者中就有一个死于癌症，居死亡原因前三位。虽然临床上应用手术治疗、放化疗等方法治疗恶性肿瘤，但依然有不少患者出现术后复发，耐受不了放化疗的毒副作用等状况。新兴的肿瘤免疫治疗给中晚期肿瘤患者带来希望，但目前临床受益不明显。
肿瘤免疫治疗主要有两方面的障碍：一是无法有效激活体内的抗肿瘤免疫，二是很难克服肿瘤微环境对已经激活的免疫杀伤细胞的免疫抑制作用。有效的抗原呈递是抗肿瘤免疫的关键先决条件，其需要激活抗原提呈细胞(APC)，而树突状细胞(DC细胞)是最强的抗原提呈细胞。通常大多数抗原被DC细胞吞噬后不能从溶酶体中逃逸，最终由MHC II分子提呈抗原，其仅引发体液免疫。为了诱导对抗肿瘤免疫至关重要的特异性的细胞免疫，即细胞毒性T淋巴细胞(CTL)产生，抗原必须由MHC I分子提呈，并同时在DC细胞表面表达相应的共刺激分子。因此，有必要设计一种肿瘤抗原递送系统，其能够向DC细胞质中递送肿瘤抗原，促进在DC细胞质中的交叉呈递以激活MHC I介导的呈递，并最终诱导细胞免疫，激活CTL对肿瘤的杀伤活性。
负载肿瘤抗原的纳米颗粒递送系统由于具有更容易被DC吸收和更有效地促进抗原呈递等优点受到越来越多的关注。纳米颗粒递送有可能弥补传统肿瘤疫苗的缺陷。尽管已经将多种纳米材料用于抗原递送，但是那些纳米材料的表面改性仍然具有挑战性。由于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)或聚乳酸(PLA)纳米粒子固有的化学惰性，一些偶联剂或活化的连接臂是抗原修饰所必需的。此外，改性过程通常是多步反应，随后的纯化效率低且繁琐。生物安全问题也是纳米材料开发和医学应用中的主要问题。阳离子聚合物，如壳聚糖(CS)和聚乙烯亚胺(PEI)，可有效传递抗原并引发免疫反应，但由于它们造成细胞膜受损，故其可能具有较高的细胞毒性。因此，研发作为抗原递送系统的高效、无毒生物材料仍然是一个瓶颈。
聚多巴胺(PDA)纳米粒子由于其优异的生物相容性，已迅速应用于生物成像，光热疗法和药物传递系统等许多生物学领域。作为单体的多巴胺不仅是关键神经递质之一，也是神经系统和免疫系统之间重要的信号分子。作为细胞外信息分子，多巴胺通过与免疫细胞上的多巴胺受体相互作用来调节免疫系统，并能触发多个关键T细胞功能。此外，研究发现多巴胺通过激活内皮细胞和肿瘤细胞上的多巴胺受体使其具有抗血管生成和抗癌活性。因此，作为多巴胺自聚物的PDA将可能成为肿瘤免疫疗法中的抗原递送载体的优异材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效的肿瘤抗原递送系统，即负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子，即将肿瘤抗原共价连接到聚多巴胺纳米粒子表面而成；其中，肿瘤抗原包括但不限于特异的肿瘤抗原肽段、肿瘤细胞裂解物、特异的肿瘤抗原DNA片段及佐剂CpG中的一种或多种。
本发明的第二目的是提供一种负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，包括步骤：将聚多巴胺纳米粒子溶液与肿瘤抗原溶液混合，在0～37℃条件下反应1～24小时；将反应得到的产物离心后洗涤，收集得到负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子。需要说明的是，本发明是将肿瘤抗原通过迈克尔加成和席夫碱反应共价连接到聚多巴胺纳米颗粒的表面以形成负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子；负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备过程需要在0～37℃有氧条件下进行。将反应得到的产物离心，能离下负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的任何转速和时间都可，在实验过程中，通常采用的离心力为5000～29000g，离心的时间为3～30分钟。
优选地，聚多巴胺纳米粒子和肿瘤抗原的质量比为1：(0.1～10)；肿瘤抗原溶液的质量浓度为0.1～50mg·mL-1。
优选地，还包括在聚多巴胺纳米粒子溶液与肿瘤抗原溶液的混合溶液中加入介质溶液得到混合反应体系的步骤；其中，介质溶液为水溶液或者有机物/水混合溶液。需要说明的是，通过加入介质溶液，可以增加肿瘤抗原在聚多巴胺纳米粒子的负载量，尤其是加入有机物/水混合溶液。
进一步优选地，水溶液为盐酸水溶液、硫酸水溶液、磷酸水溶液、醋酸水溶液、氯化钠水溶液、磷酸缓冲液(PBS)、醋酸缓冲液、碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液、氢氧化钠水溶液和氢氧化钾水溶液中的一种或多种；水溶液中溶质(如HCl、H2SO4、H3PO4、CH3COOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、KOH等)的质量与混合反应体系的质量的比值为(0.000001～0.1)：100；水溶液的pH值为2～9。
进一步优选地，介质溶液为有机物/水混合溶液时，混合反应体系中有机物的质量分数为0.01％～10％；有机物选自甲醛、戊二醛、京尼平、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)、3-(2-吡啶二硫基)丙酸氮-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐中的一种或多种；3-(2-吡啶二硫基)丙酸氮-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐为Sulfo-SPDP或Sulfo-LC-SPDP。需要说明的是，在实验过程中，有机物/水混合溶液中有机物的质量分数可以为0.001％～40％。
优选地，负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子用水重悬后储存在0～12℃备用；水优选为去离子水。
优选地，聚多巴胺纳米粒子溶液的制备方法包括步骤：将多巴胺盐酸盐溶解在水中，得到多巴胺盐酸盐溶液；在37～70℃搅拌下加入氢氧化钠水溶液，得到混合反应体系；随后反应1～6小时；将反应得到的产物离心后洗涤，收集得到聚多巴胺纳米粒子；将聚多巴胺纳米粒子重悬于水中，得到聚多巴胺纳米粒子溶液。需要说明的是，聚多巴胺纳米粒子溶液的制备中的反应依次包括氧化、重排和聚合等。将反应得到的产物离心，能离下聚多巴胺纳米粒子的任何转速和时间都可以，在实验过程中，通常采用的离心力为5000～15000g，离心的时间为3～25分钟。重悬采用的水的体积可多可少，只要能没过纳米粒子即可；如需要接肿瘤抗原分份时，可根据实际需求调整聚多巴胺纳米粒子的悬浮体积；在实验过程中，通常重悬采用的水的体积与多巴胺盐酸盐的质量的比值为(0.15～10)mL：10mg。
进一步优选地，多巴胺盐酸盐溶液的浓度为1～60mg·mL-1；混合反应体系中，氢氧化钠的质量分数为0.0001％～0.1％；水为去离子水。需要说明的是，在实验过程中，氢氧化钠水溶液的摩尔浓度可以为0.1～2mol·L-1；多巴胺盐酸盐的质量与氢氧化钠的质量的比值可以为1：(0.1～500)。
本发明的第三目的是提供一种负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子在肿瘤的免疫治疗领域中的应用。
本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：(1)本发明以聚多巴胺纳米粒子为基础，负载肿瘤抗原，制备高效、安全和高负载力的肿瘤抗原递送系统，荷瘤动物体内实验提示负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子一方面能有效的激活了体内的抗肿瘤免疫，显著地抑制肿瘤细胞的生长，另一方面能改善肿瘤免疫抑制微环境，进一步增强肌体的抗肿瘤活性；(2)本发明提供的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子具有良好的生物相容性，可用于肿瘤的免疫治疗；(3)本发明提供的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法温和简单、无污染。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子(TA@PDA)的制备反应示意图；
图2为本发明实施例1中负载肿瘤模式抗原OVA的聚多巴胺纳米粒子(OVA@PDA)表征及存储稳定性评价结果图；
图3为本发明实施例1中与各种浓度的游离OVA，PDA和OVA@PDA纳米粒子共培养48小时骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)的活力结果图；
图4为本发明实施例1中BMDCs对游离抗原OVA和OVA@PDA的摄取结果图；
图5为本发明实施例1中OVA@PDA纳米粒子对体外BMDC成熟和细胞因子分泌的影响结果图；
图6为本发明实施例1中体内跟踪Cy7荧光标记游离OVA和OVA@PDA纳米粒子的迁移结果图；
图7为本发明实施例1中OVA@PDA纳米粒子的体内抗肿瘤作用结果图；
图8为本发明实施例1中OVA@PDA纳米粒子对携带结肠癌的小鼠体内CD8+和CD4+T细胞的影响结果图；
图9为本发明实施例1中OVA@PDA纳米粒子对OVA特异性T细胞增殖、活化和记忆T细胞的影响结果图；
图10为本发明实施例1中OVA@PDA纳米粒子对肿瘤内免疫细胞的影响结果图；
图11为本发明实施例2中负载肿瘤细胞裂解物的聚多巴胺纳米粒子(TCL@PDA)表征及稳定性评价结果图；
图12为本发明实施例2中与各种浓度的TCL，PDA和TCL@PDA共培养48小时后BMDCs的活力结果图；
图13为本发明实施例2中TCL@PDA纳米粒子在体外增强BMDCs对抗原的摄取结果图；
图14为本发明实施例2中TCL@PDA纳米粒子对BMDCs体外成熟和细胞因子分泌的影响结果图；
图15为本发明实施例2中体内跟踪Cy7荧光标记TCL和TCL@PDA纳米粒子的迁移结果图；
图16为本发明实施例2中体内TCL@PDA纳米粒子的抗肿瘤作用结果图；
图17为本发明实施例2中TCL@PDA纳米粒子对荷瘤小鼠体内CD8+和CD4+T细胞的影响结果图；
图18为本发明实施例2中TCL@PDA纳米粒子对免疫细胞活化和记忆T细胞反应影响结果图；
图19为本发明实施例2中TCL@PDA纳米粒子对肿瘤内免疫细胞的影响结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
本发明提供了一种负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子，其是将肿瘤抗原通过迈克尔加成和席夫碱反应共价连接到聚多巴胺纳米粒子表面而成；其中，肿瘤抗原包括但不限于特异的肿瘤抗原肽段、肿瘤细胞裂解物、特异的肿瘤抗原DNA片段及佐剂CpG中的一种或多种。
负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法包括步骤：
将多巴胺盐酸盐溶解在去离子水中，得到多巴胺盐酸盐溶液；在37～70℃搅拌下，在多巴胺盐酸盐溶液中加入氢氧化钠水溶液，得到第一混合反应体系，第一混合反应体系中氢氧化钠的质量分数为0.0001％～0.1％，随后经历氧化、重排、聚合反应共1～6小时；其中，多巴胺盐酸盐溶液的浓度为1～60mg·mL-1；
将反应得到的产物5000～15000g离心3～25分钟后洗涤，收集得到聚多巴胺纳米粒子；将聚多巴胺纳米粒子重悬于去离子水中，得到聚多巴胺纳米粒子溶液；
将聚多巴胺纳米粒子溶液与肿瘤抗原溶液混合，在0～37℃条件下反应1～24小时；其中，聚多巴胺纳米粒子和肿瘤抗原的质量比为1：(0.1～10)；肿瘤抗原溶液的质量浓度为0.1～50mg·mL-1；
将反应得到的产物5000～29000g离心3～30分钟后洗涤，收集得到负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子，之后用去离子水重悬后储存在0～12℃备用。
在本发明的进一步实施方式中，还包括在聚多巴胺纳米粒子溶液与肿瘤抗原溶液的混合溶液中加入介质溶液得到第二混合反应体系的步骤；其中，介质溶液选自pH值为2～9的水溶液或者有机物/水混合溶液；水溶液为盐酸水溶液、硫酸水溶液、磷酸水溶液、醋酸水溶液、氯化钠水溶液、磷酸缓冲液(PBS)、醋酸缓冲液、纯水、氢氧化钠水溶液和氢氧化钾水溶液中的一种或多种；水溶液中溶质的质量与混合反应体系的质量的比值为(0.000001～0.1)：100；介质溶液为有机物/水混合溶液时，混合反应体系中有机物的质量分数为0.01％～10％；有机物选自甲醛、戊二醛、京尼平、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)、3-(2-吡啶二硫基)丙酸氮-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐中的一种或多种；3-(2-吡啶二硫基)丙酸氮-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐为Sulfo-SPDP或Sulfo-LC-SPDP。
图1为本发明负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备反应示意图；其中，聚多巴胺纳米粒子(Polydopamine nanoparticles，PDA NPs)，缩写为PDA，肿瘤抗原(tumorantigen)，缩写为TA，负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子缩写为TA@PDA。
下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。
实施例1：载肿瘤模式抗原OVA的聚多巴胺(OVA@PDA)纳米粒子的制备和应用
1、OVA@PDA纳米粒子的合成
将30mg多巴胺盐酸盐溶解在10mL去离子(DI)水中，在45℃搅拌条件下加入氢氧化钠水溶液，得到第一混合反应体系，第一混合反应体系中氢氧化钠的质量分数为0.1％，之后反应3小时；将反应得到的产物7000×g离心10分钟，收集聚多巴胺纳米粒子(PDA纳米粒子)，并用去离子水洗涤以除去残留的多巴胺，之后将PDA纳米粒子重悬于3mL去离子水中，得到PDA纳米粒子溶液。
将5mg OVA溶解在5mL去离子水中，然后在30℃搅拌条件下加入0.5mL PDA纳米粒子溶液和甲醛水溶液，得到第二混合反应体系，第二混合反应体系中甲醛的质量分数为0.06％，之后30℃反应过夜，随后16000×g离心20分钟，收集OVA@PDA纳米粒子，并用去离子水洗涤。将OVA@PDA纳米粒子用水重悬并储存在8℃。
2、OVA@PDA纳米粒子的表征
使用粒度和Zeta电位分析仪(Nano-ZS 90，Malvern Instrument，UK)测量平均粒度，粒度分布和zeta电位。用扫描电子显微镜(SEM)观察OVA@PDA纳米粒子的形态。通过使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES，SPECTROBLUE公司，德国)检测硫含量，最终确定每毫克PDA纳米粒子对OVA的负载量高达754±70.1μg。图2显示为OVA@PDA纳米粒子表征及存储稳定性评价。(A)显示OVA@PDA的尺寸分布较窄，(B)OVA@PDA的扫描电镜图像显示粒径均一且为球形。观察30天期间OVA@PDA纳米粒子的粒径(C)和zeta电位(D)皆无明显变化，提示OVA@PDA具有较好的储存稳定性。图2数据表示为平均值±标准差(n＝6)。
3、细胞毒性测定
使用骨髓来源的树突细胞(BMDCs)评估OVA@PDA纳米粒子的细胞毒性，具体包括步骤：从C57BL/6小鼠的股骨中分离BMDCs，然后在含有10％胎牛血清(FCS)，1％青霉素和链霉素，GM-CSF(20ng·mL-1)和IL-4(10ng·mL-1)的RPMI 1640培养基中培养。在37℃下培养6天，将细胞以每孔1×104细胞密度接种在96孔板中，并在37℃培养过夜，然后与不同浓度OVA，PDA或OVA@PDA纳米粒子(OVA含量范围为0.5～100μg·mL-1)，在37℃下48小时共培养后，进行MTT测定以评估细胞活力。图3显示了与各种浓度的游离OVA，PDA和OVA@PDA纳米粒子共培养48小时BMDCs的活力。实验数据显示了OVA@PDA纳米粒子共培养48小时后对BMDCs无毒性，甚至还能促进BMDCs的生长。图3数据表示为平均值±标准差(n＝3)。
4、OVA@PDA纳米粒子的细胞摄取
使用流式细胞术和共聚焦激光扫描显微术来分析FITC标记的OVA(FOVA)和FOVA@PDA纳米粒子的细胞摄取。将如上3(细胞毒性测定)所述获得的BMDC以每皿1×106个细胞的密度接种在培养皿内的盖玻片上，随后用游离FOVA和FOVA@PDA纳米粒子(OVA含量相当于50μg·mL-1)分别孵育12小时。收集细胞用于流式细胞术分析。为了进行形态学观察，在与纳米颗粒共孵育后，用含有红色溶酶体荧光探针的培养基更换含纳米粒子的培养基，并在37℃下再孵育2小时，然后用PBS洗涤。最后，将细胞用DAPI染色20分钟，然后用PBS洗涤。用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM410，蔡司，德国)观察细胞形态。图4显示了BMDCs对游离抗原OVA和OVA@PDA的摄取。(A)与FOVA或FOVA@PDA纳米粒子共孵育12小时后BMDC的共聚焦显微图像，其中OVA用FITC(绿色)标记，溶酶体用Lyso-Tracker(红色)标记，细胞核用DAPI染色(蓝色)。没有与溶酶体共定位的OVA颗粒用白色箭头标示。显微观察表明OVA@PDA纳米粒子被DC摄入后部分存在于细胞质非溶酶体区域，这可促进DC细胞对抗原的交叉提呈。(B-C)通过流式细胞术确定的BMDCs的平均荧光强度(MFI)的直方图。图4数据表示为平均值±标准差(n＝3)；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。总之，流式细胞术和共聚焦激光扫描显微术检测的摄入结果提示了OVA@PDA纳米粒子在体外增强BMDCs对抗原的摄取，促进了BMDCs的交叉提呈。
5、在体外用OVA@PDA纳米粒子致敏并促进BMDC成熟
如上3(细胞毒性测定)所述获得BMDC。在原代培养后第6天，分别用OVA+ploy I:C，PDA和OVA@PDA纳米粒子(OVA含量相当于20μg·mL-1)刺激未成熟DC。12小时后，收集DC并与稀释的抗CD11c-PerCP-Cyanine5.5，抗CD40-PE，抗MHCI-APC，抗MHCII-FITC，抗CCR7-PE和抗-CD86-FITC单克隆抗体在4℃下孵育30分钟。通过流式细胞仪(FACSCalibur，BD公司，美国)测量BMDCs上抗原提呈相关蛋白的表达。通过酶联免疫吸附法(ELISA)测量BMDCs释放到培养基中的细胞因子浓度。图5显示了OVA@PDA纳米粒子对体外BMDC成熟和细胞因子产生的影响。(A-F)通过流式细胞术测定BMDCs表面上MHC I，MHC II，CD40，CD86，CD80，CCR7的表达。(G-I)通过ELISA测试的BMDCs的培养物上清液中IL-6，IFN-γ和TNF-α的产生。图5数据表示为平均值±标准差(n＝3)；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。结果提示了OVA@PDA纳米粒子促进小鼠BMDCs在体外成熟和对抗原的提呈及促炎性细胞因子的分泌。
6、OVA@PDA纳米粒子的体内运输
C57BL/6小鼠皮下接种Cyanine 7(Cy7)荧光分子标记的OVA(Cy7-OVA)或Cy7-OVA@PDA纳米粒子的PBS溶液，OVA含量为每只小鼠100μg。使用Maestro EX小动物活体成像系统(美国剑桥科研仪器公司)以预定的时间间隔拍摄并定量注射部位的荧光强度，以评估体内分布和迁移至引流淋巴结的能力。用CRI Maestro分析软件分析获得的图像。图6是体内跟踪Cy7荧光标记游离OVA和OVA@PDA纳米粒子的迁移。(A)在0、6、12、24和48小时，在注射部位和右腹股沟淋巴结中存在OVA，OVA@PDA纳米粒子。(B)在相应时间点的淋巴结中的Cy7荧光的平均荧光强度。(C-F)淋巴结中DC细胞表面MHC I，MHC II，CD40和CD86的表达。图6数据表示为平均值±标准差(n＝4)；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。结果显示纳米粒子OVA-Cy7@PDA显著延长了在右腹股沟淋巴结中的滞留时间并促进了小鼠淋巴结中的抗原提呈DC细胞的成熟和抗原提呈。
7、荷瘤动物模型的抗肿瘤效果
将6至8周龄雌性C57BL/6小鼠右腹侧皮下注射1×106OVA-MC38细胞，并分成4组(每组6只小鼠)，分别是PBS对照组(简写成PBS)，OVA+ploy I:C组，PDA组和OVA@PDA纳米粒子组(简写成OVA@PDA)，每只小鼠注射的OVA含量为100μg。在第4、11和18天对小鼠进行三次免疫。肿瘤体积计算为1/2×肿瘤长度(mm)×[肿瘤宽度(mm)]2。图7为OVA@PDA纳米粒子的体内抗肿瘤作用。(A)整个免疫过程中小鼠的平均体重。(B)整个免疫治疗中各组荷瘤鼠肿瘤生长曲线。(C)在第21天测量的肿瘤重量。(D)从实验各组荷瘤小鼠体内剥离的OVA-MC38肿瘤的照片。图7数据表示为平均值±标准差(n＝6)；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。实验结果显示了OVA@PDA纳米粒子对过表达OVA的小鼠结肠癌OVA-MC38移植瘤模型具有显著的抗肿瘤作用。
8、荷瘤小鼠中的CD8+和CD4+T细胞亚群分析
在第21天处死接种的小鼠，取脾脏，淋巴结和肿瘤组织并制备成单细胞悬液。然后根据制造商的抗体说明书，用抗CD3e-PE-Cyanine5.5，抗CD8a-APC和抗CD4-FITC抗体染色各组细胞。通过流式细胞仪分析荷瘤小鼠中T细胞的亚群。图8为OVA@PDA纳米粒子对携带结肠癌的小鼠体内CD8+和CD4+T细胞的影响。在OVA-MC38肿瘤细胞接种后21天，在脾中T细胞亚群分析：CD3+CD8+(A)和CD3+CD4+T细胞亚群(B)。OVA-MC38肿瘤细胞接种后21天淋巴结(C)和肿瘤中的CD3+CD8+T细胞亚群(D)。图8数据表示为平均值±标准差(n＝6)；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。实验结果显示接受OVA@PDA纳米粒子免疫的小鼠脾脏、淋巴结、肿瘤中CD8+和CD4+T细胞的百分比显著增加，说明OVA@PDA纳米粒子增强了体内抗肿瘤活性。
9、体外CD8+T细胞的增殖及体内T细胞应答
从上述4组的C57BL/6小鼠中分离获得脾细胞，并根据制造商的说明书用5,6-羧基荧光素乙酸酯N-琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记。将CFSE标记的脾细胞(4×106mL-1)在含20μg·mL-1可溶性OVA培养基的24孔板中培养5天。随后，收集细胞并根据制造商的说明用抗CD8和抗CD3e抗体染色。通过流式细胞术评估CD8+T细胞的增殖。图9A显示与OVA共培养5天后，OVA@PDA纳米粒子组的CD8+T细胞(即清除肿瘤细胞的特异性免疫细胞，CTL)明显增殖。
在第4天，用PBS，PDA，OVA+polyI:C或OVA@PDA纳米粒子(每只小鼠100μg OVA)免疫六至八周龄雌性C57BL/6小鼠，在最后一次免疫后第3天，取脾并制备细胞悬液，在24孔板中每孔种植4×106个脾细胞，每孔加20μg mL-1OVA，在37℃下培养72小时。随后使用抗CD8，抗CD4和抗CD69染色，并通过流式细胞术分析活化T细胞(CD69+)中CD4+或CD8+T细胞的数量；用抗CD8，抗CD4，抗CD62L和抗CD44抗体染色脾细胞，通过流式细胞仪测量中枢记忆T细胞(CD44HiCD62LHi)的数量。通过ELISA测定T细胞释放到培养基中的细胞因子IFN-γ的浓度。图9B和C显示在用20μg mL-1OVA培养72小时后OVA@PDA组的CD69+CD8+和CD69+CD4+T细胞显著增加。图9D和E提示经OVA抗原刺激后，OVA@PDA组的中枢记忆T细胞(CD44HiCD62LHi)的CD4+T细胞和CD8+T细胞显著扩增，说明OVA@PDA组在体内产生了中枢记忆型T细胞，这可以预防肿瘤的转移和复发。图9F OVA@PDA组中T细胞分泌的IFN-γ也显著地升高。图9数据表示为平均值±标准差(n＝3)；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。总之，实验结果显示了OVA@PDA纳米粒子显著增强了体内免疫细胞激活和记忆T细胞反应，并提高细胞因子的分泌以维持T细胞的功能。
10、OVA@PDA纳米粒子对肿瘤内免疫细胞的影响
在第0天，对6至8周龄雌性C57BL/6小鼠右侧的皮下注射1×106OVA-MC38细胞。在第4、11和18天，用PBS，PDA，OVA+poly I:C，OVA@PDA纳米粒子(每只小鼠100μg OVA剂量)免疫小鼠三次。在最后一次免疫后第3天，肿瘤从小鼠收集肿瘤组织并制备成单细胞悬浮液，随后用抗F4/80，抗CD206，抗Gr1，抗CD11b，抗CD45抗CCR7，抗Foxp3，抗CD4和抗CD25抗体染色。。通过流式细胞仪测量骨髓来源的免疫抑制细胞(myeloid-derived suppressorcells，MDSC，CD45+CD11b+Gr1+)，调节性T细胞(regulatory T cells，Treg，Foxp3+CD4+CD25+)和肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM，M1型：F4/80+CCR7+；M2型：F4/80+CD206+)的数量。图10为OVA@PDA纳米粒子对肿瘤内免疫细胞的影响。A-D)在最后一次免疫后第3天通过流式细胞术确定的肿瘤内MDSCs，T细胞亚群中的Treg细胞，M2型TAM，M1型TAM的百分比。图10数据以平均值±标准差(n＝3)表示；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001。实验结果显示OVA@PDA纳米粒子显著减少了肿瘤内免疫抑制性细胞MDSC、Tregs、M2-TAM的百分比，同时明显增加了免疫炎性细胞M1-TAM的百分比，实验结果说明OVA@PDA纳米粒子治疗后显著改善了肿瘤内免疫抑制的微环境，这可以有效提高肌体的抗肿瘤活性。
实施例2：载肿瘤细胞裂解物的聚多巴胺纳米粒子的制备和应用
1、肿瘤细胞裂解液(TCL)的制备
将MC-38细胞中添加完全培养基(含10％的FBS和1％抗生素的RPMI1640)，在5％CO2温箱中37℃培养。当细胞生长达到80％-90％汇合时，常规消化细胞，制备细胞密度为1×107mL-1的细胞悬液。取2mL细胞悬液经历五次冻融循环进行裂解，随后离心裂解物以除去细胞碎片(1500g，10分钟)。通过BCA方法测量TCL溶液的浓度，并将得到的TCL稀释至合适的浓度用于体内和体外实验。
2、PDA纳米粒子和TCL@PDA纳米粒子的合成
将20mg多巴胺盐酸盐溶解在10mL去离子水中，然后在50℃剧烈搅拌条件下加入氢氧化钠水溶液，得到第一混合反应体系，第一混合反应体系中氢氧化钠的质量分数为0.08％，之后反应3小时；将反应得到的产物20000×g离心15分钟，收集聚多巴胺纳米粒子(PDA纳米粒子)，并用去离子水洗涤以除去残留的多巴胺；并将PDA纳米粒子重悬于2mL去离子水中，得到PDA纳米粒子溶液。
为了将TCL共价连接到PDA纳米粒子上，将5mL TCL溶液(1mg·mL-1)与0.5mL PDA纳米粒子悬浮液混合，并在20℃下在磁力搅拌下反应5小时。随后20000×g离心10分钟，收集TCL@PDA纳米粒子，并用去离子水洗涤。
通过使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES，SPECTROBLUE公司，德国)测量硫元素的含量来确定每毫克PDA中TCL负载量为480±21.4μg。图11显示为TCL@PDA纳米粒子表征及存储稳定性评价。(A)TCL@PDA的尺寸分布，(B)OVA@PDA的扫描电镜图像显示纳米粒子为球形且粒径均一，(C)TCL@PDA的zeta电位分布。观察30天期间TCL@PDA纳米粒子的粒径(D)和zeta电位(E)皆无明显变化，提示TCL@PDA具有较好的储存稳定性。图11实验数据是平均值±标准差(n＝6)。
3、细胞毒性测定
实验方法参照实施例1中的3(细胞毒性测定)。图12显示了与各种浓度的游离TCL，PDA和TCL@PDA纳米粒子共培养48小时BMDCs的活力。图12数据以平均值±标准差(n＝3)表示；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001。实验数据显示了TCL@PDA纳米粒子共培养48小时后对BMDCs无毒性。
4、TCL@PDA纳米粒子的细胞摄取
实验方法参照实施案例1中的4(OVA@PDA纳米粒子的细胞摄取)。图13显示了骨髓来源的DC细胞(BMDCs)对肿瘤细胞裂解物TCL和TCL@PDA的摄取。(A)FTCL或FTCL@PDA被BMDC摄取的共聚焦显微图像，其中TCL用FITC(绿色)标记，溶酶体用Lyso-Tracker(红色)标记，细胞核用DAPI染色(蓝色)。没有与溶酶体共定位的TCL颗粒用白色箭头标示。显微观察表明TCL@PDA纳米粒子被DC摄入后部分存在于细胞质而非溶酶体区域，这可促进DC对抗原的交叉提呈。(B-C)通过流式细胞术确定的BMDCs的平均荧光强度(MFI)的直方图。摄入结果提示了TCL@PDA纳米粒子在体外增强BMDCs对抗原的摄取，并可促进BMDCs的交叉提呈。图13的数据代表三次独立的实验，数据以平均值±标准差(n＝3)表示；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
5、在体外用TCL@PDA纳米粒子致敏并促进BMDC成熟
实验方法参照实施例1中的5(在体外用OVA@PDA纳米粒子致敏并促进BMDC成熟)。图14显示了TCL@PDA纳米粒子对体外BMDC成熟和细胞因子产生的影响。(A-E)通过流式细胞术测定BMDCs表面上MHC I，MHC II，CD86，CD80，CD40的表达。(F-H)通过ELISA测试的BMDCs的培养物上清液中IL-6，IFN-γ和TNF-α的产生。图14数据以平均值±标准差(n＝3)表示；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。结果提示了TCL@PDA纳米粒子促进小鼠BMDCs在体外成熟和对抗原的提呈及促炎性细胞因子的分泌。
6、TCL@PDA纳米粒子的体内运输
实验方法参照实施例1的6(OVA@PDA纳米粒子的体内运输)。图15是体内跟踪Cy7荧光标记TCL和TCL@PDA纳米粒子的迁移。(A)在0、6、12、24和48小时，在注射部位和右腹股沟淋巴结中存在TCL，TCL@PDA纳米粒子。(B)在相应时间点的淋巴结中的Cy7荧光的平均荧光强度。(C-G)淋巴结中DC细胞表面MHC I，MHC II，CD40，CD86和CCR7的表达。图15数据以平均值±标准差(n＝3)表示；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。结果显示纳米粒子TCL-Cy7@PDA显著延长了在右腹股沟淋巴结中的滞留时间并促进了小鼠淋巴结中的DC细胞的成熟和抗原提呈。
7、荷瘤动物模型的抗肿瘤效果
实验方法参照实施例1的7(荷瘤动物模型的抗肿瘤效果)。图16为TCL@PDA纳米粒子的体内抗肿瘤作用。(A)整个免疫过程中小鼠的平均体重。(B)整个免疫治疗中各组荷瘤鼠肿瘤生长曲线。(C)在第21天测量的肿瘤重量。(D)从实验各组荷瘤小鼠体内剥离的MC38肿瘤的照片。图16数据以平均值±标准差(n＝3)表示；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。实验结果显示了TCL@PDA纳米粒子对小鼠结肠癌MC38移植瘤模型具有显著的抗肿瘤作用。
8、荷瘤小鼠中的CD8+和CD4+T细胞亚群分析
实验方法参照实施案例1中的8(荷瘤小鼠中的CD8+和CD4+T细胞亚群分析)。图17为TCL@PDA纳米粒子对携带结肠癌的小鼠体内CD8+和CD4+T细胞的影响。在MC38肿瘤细胞接种后21天，在脾中T细胞亚群分析：CD3+CD8+(A)和CD3+CD4+T细胞亚群(B)。MC38肿瘤细胞接种后21天，在淋巴结中T细胞亚群分析：CD3+CD8+T(C)和CD3+CD4+T细胞亚群(D)。图17数据以平均值±标准差(n＝3)表示；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。实验结果显示免疫小鼠的脾脏和淋巴结中CD8+和CD4+T细胞的百分比显著增加，说明TCL@PDA纳米粒子增强了体内抗肿瘤活性。
9、免疫细胞活化及记忆T细胞响应
实验方法参照实施例1的9(体外CD8+T细胞的增殖及体内T细胞应答)。图18A和B显示TCL@PDA组的CD69+CD8+和CD69+CD4+活化T细胞显著增加。图18C和D提示经TCL刺激后，TCL@PDA组的中枢记忆T细胞(CD44HiCD62LHi)的CD4+T细胞和CD8+T细胞显著扩增，说明TCL@PDA组在体内产生了中枢记忆型T细胞，这可以预防肿瘤的转移和复发。图18E显示TCL@PDA组中T细胞分泌的IFN-γ也显著地升高。图18数据以平均值±标准差(n＝3)表示；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。总之，实验结果提示了TCL@PDA纳米粒子显著增强了体内免疫细胞活化和记忆T细胞反应，并提高T细胞分泌的细胞因子干扰素IFN-γ，以维持T细胞的功能。
10、TCL@PDA纳米粒子对肿瘤内免疫细胞的影响
实验方法参照实施例1的8(荷瘤小鼠中的CD8+和CD4+T细胞亚群分析)和10(OVA@PDA纳米粒子对肿瘤内免疫细胞的影响)。图19为TCL@PDA纳米粒子对肿瘤内免疫细胞的影响。A-C是最后一次免疫后第3天通过流式细胞术确定的肿瘤内CD8+T细胞(CTL)，M1型肿瘤相关巨噬细胞(M1型TAM)和骨髓来源的免疫抑制细胞(MDSCs)的百分比。图19数据以平均值±标准差(n＝3)表示；采用单因素方差分析和Tukey’s显著性差异检验确定各组之间的差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。实验结果显示TCL@PDA纳米粒子明显增加了清除肿瘤细胞的特异性免疫细胞CD8+T细胞(CTL)和抑制肿瘤进展的M1型TAM的百分比，显著减少了肿瘤内免疫抑制性细胞MDSC的百分比。实验结果提示了TCL@PDA突出的抗肿瘤能力可部分归因于足够数量的CTL和M1型TAM，这有助于打破免疫抑制环境。另一方面TCL@PDA纳米粒子治疗后显著改善了肿瘤内免疫抑制微环境，又进一步促进了肌体的抗肿瘤活性。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子，其特征在于：
所述负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子是将肿瘤抗原和/或佐剂CpG共价连接到聚多巴胺纳米粒子表面而成；其中，所述肿瘤抗原包括特异的肿瘤抗原肽段和/或肿瘤细胞裂解物；
所述聚多巴胺纳米粒子与肿瘤抗原和/或佐剂CpG的质量比为1：(0.1～10)。
2.权利要求1所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括步骤：
将聚多巴胺纳米粒子溶液与肿瘤抗原和/或佐剂CpG溶液混合，在0～37℃条件下反应1～24小时；将反应得到的产物离心后洗涤，收集得到所述负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，其特征在于：
所述肿瘤抗原和/或佐剂CpG溶液的质量浓度为0.1～50mg·mL-1。
4.根据权利要求2所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，其特征在于：
还包括在聚多巴胺纳米粒子溶液与肿瘤抗原和/或佐剂CpG溶液的混合溶液中加入介质溶液得到混合反应体系的步骤；其中，所述介质溶液为水溶液或者有机物/水混合溶液。
5.根据权利要求4所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，其特征在于：
所述水溶液为盐酸水溶液、硫酸水溶液、磷酸水溶液、醋酸水溶液、氯化钠水溶液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸氢钠水溶液、碳酸钠水溶液、氢氧化钠水溶液和氢氧化钾水溶液中的一种或多种；
所述水溶液中溶质的质量与所述混合反应体系的质量的比值为(0.000001～0.1)：100；
所述水溶液的pH值为2～9。
6.根据权利要求4所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，其特征在于：
所述介质溶液为有机物/水混合溶液时，所述混合反应体系中有机物的质量分数为0.01％～10％；
所述有机物选自甲醛、戊二醛、京尼平、N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、3-(2-吡啶二硫基)丙酸氮-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐中的一种或多种；所述3-(2-吡啶二硫基)丙酸氮-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐为Sulfo-SPDP或Sulfo-LC-SPDP。
7.根据权利要求2所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，其特征在于：
所述负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子用水重悬后储存在0～12℃备用。
8.根据权利要求2所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述聚多巴胺纳米粒子溶液的制备方法包括步骤：
将多巴胺盐酸盐溶解在水中，得到多巴胺盐酸盐溶液；在37～70℃搅拌下，
在所述多巴胺盐酸盐溶液中加入氢氧化钠水溶液，得到混合反应体系；随后反应1～6小时；将反应得到的产物离心后洗涤，收集得到所述聚多巴胺纳米粒子；
将所述聚多巴胺纳米粒子重悬于水中，得到所述聚多巴胺纳米粒子溶液。
9.根据权利要求8所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子的制备方法，其特征在于：
所述多巴胺盐酸盐溶液的浓度为1～60mg·mL-1；
所述混合反应体系中，氢氧化钠的质量分数为0.0001％～0.1％；
所述水为去离子水。
10.权利要求1所述的负载肿瘤抗原的聚多巴胺纳米粒子在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
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