KR20220080681A - 면역항암치료제로의 적용을 위한 수지상세포 모방 나노구조체 및 이의 제조방법 - Google Patents
면역항암치료제로의 적용을 위한 수지상세포 모방 나노구조체 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 수지상세포 모방 나노구조체, 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상세하게는 수지상세포의 표면 항원제시능을 이용하기 위하여 나노입자 코어에 수지상세포 유래 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘을 도입한 나노구조체이며, 체내에서 사멸하지 않고 표적화가 가능하여, 효과적인 면역 반응을 유도하는 효과를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 수지상세포를 이용하여 면역세포를 모방하는 나노구조체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
암은 우리나라 국민 사망원인 중 1위를 차지하고 있다. 대표적인 암 치료방법은 암을 절제하는 외과적 수술, 방사선 치료, 화학약물 치료가 있을 수 있는데, 이들 치료방법은 예후가 불량하고 심각한 부작용이 뒤따른다는 문제점이 있다.
암 발생은 면역력 감소 또는 암세포의 면역회피 작용으로 인해 면역반응에 따라 제거되지 못한 암세포의 종양 형성을 주요 원인으로 들 수 있다. 따라서 환자 본인의 면역 반응을 증대시켜 암 치료를 도울 수 있는 면역항암치료제는 근본적인 암 치료법이 될 수 있다. 현재 개발된 면역항암치료제는 면역기능을 높이는 약물을 직접 주입하는 것이 대부분인데, 약물 주입술은 전달 효율이 매우 낮고, 추가 부작용이 존재할 수 있다는 점에서 여전히 한계가 존재한다. 이에 따라 암 치료 효율을 획기적으로 높이고, 재발율 및 부작용을 낮추면서 면역기능을 증대시킬 수 있는 치료제의 개발에 연구가 집중되고 있다.
한편, 나노기술을 바이오 의료 분야에 접목한 나노-바이오 융합기술에 대한 연구가 지속되어 오고 있다. 하지만 대부분의 나노재료는 합성을 통해 얻어지며, 나노재료를 이용한 표면 개질 시, 합성물이 첨가되는 과정이 수반되므로 체내 독성, 원치 않는 면역반응 유도, 암 유발 등의 부작용이 생길 수 있다. 그러므로 생체를 직접 모사하는 방식의 표면 개질 방법을 사용하여 부작용을 최소화하고, 생체특성에 따라 다양한 기능을 구현할 수 있도록 함으로써 기존 나노기술이 가진 한계점을 극복할 수 있다.
특히 나노입자-세포화 기술은 특정 세포의 전체 세포막을 코팅 재료로 활용하여 나노입자 표면을 물리적으로 클로킹(Cloaking)하는 기술로 단백질, 지질 및 탄수화물과 함께 세포막의 복합적 성질을 유지할 수 있어 나노입자 표면에 특정 세포의 특성을 그대로 구현할 수 있다.
2015년 University of California 의 Liangfang Zhang연구팀에서 처음으로 혈소판을 PLGA(poly(lactic-co-glycolic) acid) 입자 표면에 도입한 기술을 바탕으로, 현재까지 다양한 세포에 적용되고 있다.
PLGA 코어에 독소루비신(doxorubicin)을 담지한 후, 적혈구 막으로 코팅하여 면역적합성 나노캐리어를 제조해 고형 종양을 제거하거나, 적혈구 막과 암세포의 세포막을 멜라닌 나노입자에 동시에 코팅하여 하이브리드 세포막을 지닌 나노입자를 제조해 체내 순환시간을 증가시키고 종양 표적능을 증대시킨 연구가 보고되었다.
하지만 종래의 세포막 코팅 기술은 대부분 암세포, 혈액세포 위주로 진행되었고, 그 응용 역시 혈액 내 안정적 전달 등을 목표로 하는 연구들이 주를 이루었다. 또한 암세포막을 항원으로 직접 도입하여 체내에 전달하는 경우, 항원 내성으로 인한 면역반응 저하, 암세포 유래 물질에 대한 거부감 등의 단점이 존재한다. 따라서 직접적인 항원제시 면역세포의 기능을 가질 수 있는 면역치료제를 개발하여 중간 과정 없이 T 세포의 분화 및 증식을 유도하는 것이 매우 필요하다.
Hu, Che-Ming J., et al. Nature, 2015, 526 (7571) 118-12
Brian T. Luk et al., Theranostics. 2016, 6(7), 1004-101
Q. Jiang et al., Biomaterials 2019, 192, 292-308
본 발명은 종래기술의 재료적인 한계에서 벗어나 항원제시 기능을 가지는 세포를 사용하여 면역반응 증대에 따른 암치료 효과를 구현하고자 한다. 구체적으로 수지상세포를 모방하는 나노구조체를 제작하여, 체내에서 수지상세포의 항원제시 기능에 따라 세포독성 T 세포를 직접 활성화하여 암세포의 선택적 사멸을 유도하고, 면역 반응을 증대시켜 우수한 면역항암치료 효과를 제공하는 것이다. 아울러 나노입자의 표적화 및 광열효과를 이용하여 한층 강화된 면역항암치료 효과를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 열역학적으로 매우 안정하여, 체내에서 장기 체류함에 따라 T 세포의 증식 및 분화 촉진에 최적화된 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 나노입자-세포화 기술 (nanoparticle-cellularization technology)을 이용한 수지상세포 모방 나노구조체를 제공한다. 구체적으로 나노입자 코어; 및 수지상세포로부터 유래된 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘;을 포함하는 나노구조체로서, 상기 쉘은 상기 지질 분자의 이중층을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 쉘은 5 내지 20 ㎚일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 나노구조체의 표면 커버리지는 70% 이상, 바람직하게는 표면 커버리지는 85% 이상일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 나노구조체의 표면 전위의 절대값은 수지상세포로부터 유래된 지질 분자의 표면 전위의 절대값보다 작은 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 나노구조체는 상기 나노입자 및 상기 수지상세포 유래의 세포막을 초음파 처리하여 제조된 리포좀이 융합된 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 나노구조체는 상기 리포좀 및 나노입자를 공압출하여 제조한 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 리포좀의 입경은 200 ㎚ 이하일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 나노구조체의 표면 제타전위는 -35 내지 -25 ㎷일 수 있다.
또한 본 발명은 수지상세포 모방 나노구조체 제조방법을 제공하며, 구체적으로 수지상세포로부터 세포막을 정제하는 단계; 상기 세포막에 초음파를 처리하여 세포막 현탁액을 형성하는 단계; 상기 세포막 현탁액을 멤브레인 필러를 통해 여과하여 리포좀을 수득하는 단계; 나노입자 및 상기 리포좀을 혼합한 후, 필터압축하여 세포막이 도입된 나노입자를 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 나노입자 및 리포좀은 1:150 내지 1:300의 부피비율로 혼합될 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 세포막이 도입된 나노입자에 항원을 펄싱하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 항원은 종양 항원 유래 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 리포좀의 평균 입경은 200 ㎚ 이하일 수 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기 세포막이 도입된 나노입자는 세포막 도입 전 나노입자와 대비하여 표면전위의 절대값이 작을 수 있다.
또한 본 발명은 상술한 수지상세포 모방 나노구조체를 포함하는 면역항암치료제를 제공한다.
또한 본 발명은 상술한 수지상세포 모방 나노구조체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러 본 발명은 상술한 제조방법에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체를 제공한다.
본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체는 수지상세포의 항원제시능을 그대로 나노입자 표면에 도입하여, 수지상세포의 항원제시기능은 보존함과 동시에 사멸하지 않고 나노입자의 표적화 기능 및 광열효과 기능을 추가적으로 부여하여 강화된 기능의 면역항암치료 효과를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체는 수지상세포를 이용하여 면역세포를 모방한 것으로서, 수지상세포 유래 세포막을 쉘로 도입함으로써, 장기간 체내에서 체류하며 항원 특이적 T 세포의 증식 및 분화를 지속적으로 유도함으로써 면역반응을 증대시키는 효과를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체는 기존의 화학 요법이나 방사선 요법 기반 항암 치료방법에 비하여, 환자 자신의 면역 시스템을 활용하기 때문에 부작용을 최소화할 수 있고, 진단이 어려운 미세 크기의 암세포 또는 전이된 암세포를 선택적으로 제거할 수 있다.
본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체는 그 자체로도 항암활성을 가져 면역항암치료제로 사용될 수 있으며, 다른 항암제와의 병용을 통해 더욱 강한 항암활성을 기대할 수 있으므로 부작용을 최소화하고 강력한 항암효과를 나타내는 새로운 항암제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1 (a)는 활성화된 수지상세포와 금 나노입자를 나노입자-세포화 기술을 통해 필터압출하여 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이고, (b)는 본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체가 T 세포와의 결합을 통해 면역 반응을 증대시키는 것을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 나노입자 및 리포좀의 혼합비율에 따른 표면 코팅정도를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체의 SEM 이미지 및 표면 커버리지를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체의 표면 제타전위를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예 1에 따른 수지상세포 모방 나노구조체를 항원 특이적 T 세포와 공배양한 결과로, CTV, CD44, IFNg, TNFα, IL-2의 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실험예 1에 따른 수지상세포 모방 나노구조체의 용융온도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 비교예 2에 따라 초음파를 처리하는 과정 없이 제조한 수지상세포 모방 나노구조체의 공압출 전(Membrane suspension), 후(Extrusion)의 표면 제타전위를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실험예 3에 따라 금 나노입자(gold nanoparticle (NPs)), 추출한 수지상세포막(Dendritic cell membrane (DCm)), 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP), 및 항원을 펄싱한 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP/Ag (Antigen))의 전자현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실험예 3에 따라 금 나노입자(Gold NP), 수지상세포막(DCm), 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP), 항원을 펄싱한 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP/Ag)의 표면 제타전위 값을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실험예 3에 따라 수지상세포 모방 나노구조체 표면에 수지상세포의 주요 표면 단백질인 CD80, CD86, MHC class I, II의 유무를 FACS를 통해 확인한 데이터이다.
도 11a 및 도 11b는 본 발명의 실험예 3-5에 따라 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP)와 골수 유래 수지상세포 각각의 항원을 펄싱하지 않은 그룹, OVA257-264 항원을 펄싱한 그룹, GP33-41 항원을 펄싱한 그룹의 T세포 증식 및 분화 효율을 In vitro 시험을 통해 나타낸 것이다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 실험예 3-6에 따라 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP)와 골수 유래 수지상세포 각각의 항원을 펄싱하지 않은 그룹, GP33-41 항원을 펄싱한 그룹의 T세포 증식 및 분화 효율을 In vivo 시험을 통해 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실험예 3-7에 따른 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP)의 안정성 테스트 결과로서, 10일, 20일 및 30일 경과에 따른 T 세포 증식 및 분화 효율의 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 나노입자 및 리포좀의 혼합비율에 따른 표면 코팅정도를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체의 SEM 이미지 및 표면 커버리지를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체의 표면 제타전위를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예 1에 따른 수지상세포 모방 나노구조체를 항원 특이적 T 세포와 공배양한 결과로, CTV, CD44, IFNg, TNFα, IL-2의 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실험예 1에 따른 수지상세포 모방 나노구조체의 용융온도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 비교예 2에 따라 초음파를 처리하는 과정 없이 제조한 수지상세포 모방 나노구조체의 공압출 전(Membrane suspension), 후(Extrusion)의 표면 제타전위를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실험예 3에 따라 금 나노입자(gold nanoparticle (NPs)), 추출한 수지상세포막(Dendritic cell membrane (DCm)), 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP), 및 항원을 펄싱한 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP/Ag (Antigen))의 전자현미경 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실험예 3에 따라 금 나노입자(Gold NP), 수지상세포막(DCm), 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP), 항원을 펄싱한 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP/Ag)의 표면 제타전위 값을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 실험예 3에 따라 수지상세포 모방 나노구조체 표면에 수지상세포의 주요 표면 단백질인 CD80, CD86, MHC class I, II의 유무를 FACS를 통해 확인한 데이터이다.
도 11a 및 도 11b는 본 발명의 실험예 3-5에 따라 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP)와 골수 유래 수지상세포 각각의 항원을 펄싱하지 않은 그룹, OVA257-264 항원을 펄싱한 그룹, GP33-41 항원을 펄싱한 그룹의 T세포 증식 및 분화 효율을 In vitro 시험을 통해 나타낸 것이다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 실험예 3-6에 따라 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP)와 골수 유래 수지상세포 각각의 항원을 펄싱하지 않은 그룹, GP33-41 항원을 펄싱한 그룹의 T세포 증식 및 분화 효율을 In vivo 시험을 통해 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실험예 3-7에 따른 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP)의 안정성 테스트 결과로서, 10일, 20일 및 30일 경과에 따른 T 세포 증식 및 분화 효율의 변화를 나타낸 것이다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 본 발명의 설명에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서의 실시예 및 첨부된 도면은 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로서, 실시예 및 도면에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 실시예 및 도면으로 한정되는 것은 아니다. 본 발멸의 기술적 사상을 변화시키지 않는 범위 내에서 다른 형태로 구체화될 수 있다.
또한 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 효과 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도될 수 있다.
이하 본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체, 이의 제조방법 및 이의 제조방법에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체 및 이를 포함하는 면역항암치료제 및 암 치료용 약학적 조성물에 관하여 상세히 설명한다.
본 발명은 나노입자-세포화 기술을 이용한 수지상세포 모방 나노구조체를 제공한다. 수지상세포의 항원제시능을 그대로 나노입자 표면에 도입하여, (1) 수지상세포의 항원제시기능을 보존함과 동시에, (2) 나노입자의 표적화 기능과 광열 효과를 통해 현저히 증대된 면역항암치료 효과를 발휘할 수 있다.
나노입자-세포화 기술은 3가지 대표적인 단계로 진행된다. (1) 살아있는 세포의 세포막을 손상 없이 추출하고 (2) 필터 압출기를 이용하여 소정 사이즈의 나노 리포좀을 생성한 뒤, (3) 코팅하고자 하는 나노입자와의 필터압출을 반복함으로써 물리적인 힘을 가해 세포막 전체를 나노입자 표면에 옮길 수 있다. 또한, 세포막 및 나노입자의 종류에 상관없이 원하는 대로 특정 세포를 모방하는 나노입자를 제조할 수 있다는 점에서 파생되는 기술이 다양하다.
수지상세포를 이용한 암치료백신의 경우 환자의 혈액 내 단핵세포 (monocyte)로부터 분화시킨 수지상세포에 암 항원을 발현시키게 한 후 해당 암환자에게 다시 주입함으로써 암환자 체내 암항원 특이적 T 세포를 활성화시키는 전략을 사용하였다. 하지만 이러한 형태의 수지상세포 암치료백신은 주입한 수지상세포의 짧은 생존기간 및 약한 T 세포 자극 능력 등의 한계로 인해 뚜렷한 항암효과를 나타내지 못했다.
또한 면역항암치료 이외에도 류마티스 관절염을 포함한 자가면역질환의 치료를 위해서 면역관용(immune tolerance)이 유도된 수지상세포를 치료제로 사용하고자 하는 노력들이 있었으나, 마찬가지로 면역관용 수지상세포의 짧은 생존기간 및 약한 면역억제 능력 등으로 인해 충분한 치료효과를 나타내지 못했다.
본 발명은 이러한 한계를 극복하기 위한 새로운 형태의 면역치료제를 제공하고자 하는 것이며, 종래 기술들과는 달리 체내 생존기간이 길고, 장기 보관시에도 구조적 안정성이 담보되며, T 세포 활성화능에서도 현저히 향상된 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명은 구체적으로, 나노입자 코어; 및 수지상세포로부터 유래된 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘;을 포함하는 나노구조체로서, 상기 쉘은 지질 분자의 이중층을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 나노입자는 생체적합성을 가지며, 바람직하게는 근적외선 영역의 빛을 흡수하여 발열하는 성질을 가진 것이 좋다. 구체적으로 예를 들면, 광열 효과를 나타낼 수 있는 금속 나노입자, 유기 고분자 나노입자, 멜라닌 나노입자, 그래핀 나노입자, 무기 나노입자 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 반드시 한정되는 것은 아니다. 다만, 본 발명의 바람직한 일 실시 형태에 있어서, 상기 나노입자는 환원전위가 높아 체내에서 안전한 상태를 유지할 수 있고, 표면 개질이 용이한 금 나노입자일 수 있다.
수지상세포(Dendrictic cell:DC)는 강력한 항원제시 세포(antigen presenting cells: APC)로서, 체내 면역반응 유도 및 면역 조절에 중요한 역할을 담당한다. 항원과 접한 적이 없는 원시 T 세포(na
ve T cell)를 활성화시켜, 일차면역반응(primary immune response)을 유도할 수 있으며, 항원 특이적인 후천성 기억면역을 유도할 수 있는 면역세포로 기능한다.
또한 세포막 표면에 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex I/II: MHC I/II)뿐만 아니라, CD80 및 CD86과 같은 보조자극인자(co-stimulatory molecules) 및 ICAM-1과 같은 세포부착 분자(cell adhesion molecules)가 고도로 발현되어 있고, T 세포 활성화와 관련된 인터페론, IL-12, IL-18 등의 다양한 사이토카인을 다량 분비함으로써, 강력한 항원제시 기능을 나타낸다.
구체적으로 수지상세포가 체내 T 세포를 분화시키고, 면역반응을 활성화하여 항원성 물질을 제거하는 일련의 과정은 다음과 같다.
먼저, 수지상세포는 말초 조직에 존재하여, 외부자극 신호에 의해 활성 신호를 받게 되어 성숙된다. 동시에 외부 단백질 항원을 펩타이드 형태로 MHC class I, II 에 제시한다. 이후, 수지상세포는 배수 림프절(draining lymphnode)로 이동하여, 수지상세포 표면의 MHC-펩타이드 복합체와 결합가능한 T 세포 수용체(TCR)을 보유한 T 세포와 결합하고, 수지상세포에서 발현되는 CD80, CD86과 같은 공동자극 리간드가 T 세포에서 발현되는 공동자극 수용체인 CD28과 보조적으로 결합하여 T 세포를 완전하게 활성화한다. 활성화된 T 세포는 증식 및 분화하여 림프절에서 말초조직으로 이동하며, 외부 항원을 발현하는 세포(예. 암세포)를 제거한다.
본 발명은 수지상세포의 상기 항원제시 기능을 구현하기 위하여, 수지상세포 유래의 세포막을 나노입자 표면에 도입한다. 수지상세포로부터 유래된 지질 분자의 세포막은 지질 분자의 이중층을 포함하고, 이때 쉘 외부를 향한 제1 지질 분자층은 나노입자 표면을 향한 제2 지질 분자층에 비하여 전기적으로 더 강한 음전하를 나타내도록 배향된 것이 바람직하다. 후술할 본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체 제조방법에 있어서, 수지상세포 유래의 지질 분자의 세포막을 초음파 처리함으로써, 상기 쉘 외부를 향한 제1지질 분자층이 나노입자 표면을 향한 제2 지질 분자층에 비하여 전기적으로 더 강한 음전하를 나타내도록 배향되게 할 수 있다.
본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체는 활성화된 수지상세포의 세포막을 추출하고, 나노입자와 함께 필터압출하여 세포막이 나노입자 표면에 도입되도록 유도하는 방식에 따라 제조된다.
상기 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘은 2 내지 50 ㎚, 좋게는 5 내지 20 ㎚의 범위로 나노입자 코어 표면에 얇고 균일하게 코팅되는 것이 바람직하다. 이때 표면 커버리지는 70% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상인 것이 열역학적으로 안정하고, 나노구조체의 안정성이 우수하게 나타날 수 있다.
본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체는 수지상세포 유래의 세포막을 초음파 처리하여 제조된 리포좀(liposome)과 나노입자를 융합하여 제조한 것으로서, 상기 융합은 리포좀 및 나노입자를 혼합하여 공압출하는 것을 의미할 수 있다.
구체적으로 상기 수지상세포 유래의 세포막을 초음파 처리한 후, 나노사이즈의 멤브레인 필터를 통해 여과하여, 입경 200 ㎚이하의 리포좀을 수득할 수 있다. 상기 리포좀의 입경은 바람직하게 50 내지 150 ㎚일 수 있다.
본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체의 표면 제타전위는 -40 내지 -20 ㎷, 구체적으로 -35 내지 -25 ㎷일 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
구체적으로, (a) 수지상세포로부터 세포막을 정제하는 단계; (b) 상기 세포막에 초음파를 처리하여 세포막 현탁액을 형성하는 단계;(c) 상기 세포막 현탁액을 멤브레인 필터를 통해 여과하여 리포좀을 수득하는 단계; 및 (d) 나노입자 및 상기 리포좀을 혼합한 후, 필터압축하여 세포막이 도입된 나노입자를 수득하는 단계;를 포함한다.
나아가 본 발명은 항원 제시를 위하여 세포막이 코팅된 나노입자에 항원을 펄싱하는 단계;를 더 포함하여, 수지상세포의 기능을 하는 나노구조체를 완성할 수 있다.
도 1 (a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하는 모식도를 나타낸 것이다. 골수 유래 수지상세포를 마우스로부터 추출하여 내재면역반응 및 적응면역반응을 유도할 수 있다. 구체적으로, 수지상세포로부터 정제된 세포막을 소정의 나노입자와 적절한 비율로 혼합하여 필터 압출을 실시하면, 상대적으로 높은 음전하의 제타전위를 가지는 바깥부분의 세포막과 음전하를 가지는 나노입자는 정전기적 반발(electrostatic repulsion)을 나타내므로, 상대적으로 낮은 음전하의 제타전위를 가지는 부분이 나노입자 표면과 상호작용하여 흡착되면서 right-side-out orientation 방식에 따라, 즉 세포막이 바람직한 방향으로 코팅이 이루어진다.
본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체는 체내에 존재하는 T 세포의 활성을 효과적으로 증대시킬 뿐 아니라, 우수한 투과성 및 장기간 안정적인 체류로 인해 림프절 뿐만 아니라 종양을 포함한 염증 부위에 머물 수 있으며, 이때 해당 부위에 추가로 근적외선을 조사하면 나노입자의 광열효과로 인해 암세포 및 염증세포를 더 효과적으로 제거할 수 있는 이점이 있다.
구체적으로, 수지상세포로부터 세포막을 정제하는 단계는 급속 냉동-해동 및 원심분리를 통하여 진행될 수 있다. 상기 정제된 세포막에 초음파를 처리하면 수백 나노 또는 수 마이크로 단위의 세포막 현탁액을 형성할 수 있다. 이후 상기 세포막 현탁액을 멤브레인 필터를 통해 여과하면 원하는 크기의 세포막 리포좀을 수득할 수 있다. 상기 세포막 리포좀 및 나노입자를 혼합하고, 필터압축하여 세포막이 도입된 나노입자를 수득할 수 있다. 즉, 수지상세포의 세포막이 상기 나노입자 표면에 코팅된 형태가 얻어진다. 이때 나노입자 및 리포좀의 농도를 달리하여 코팅되는 표면 커버리지를 자유자재로 조절할 수 있다.
나노입자 및 리포좀의 혼합비율은 나노입자의 표면적에 대한 세포막의 표면적의 비로 표시되는 하기 식 1의 값으로 표현할 수 있다. 구체적으로 예를 들어, 하기 식 1의 XDM은 0.7 내지 1.8일 수 있다. 보다 바람직하게는 XDM은 0.9 내지 1.3일 수 있다. 이 경우 나노입자의 표면 대부분이 세포막으로 코팅되어 70% 이상 또는 85% 이상의 높은 표면 커버리지를 나타낸다. 다만, XDM 
2의 값을 가지는 경우 overcoating되어, 오히려 열역학적 안정성이 떨어질 수 있다.
[식 1]
상기 식 1에 따를 때, 나노입자의 종류, 평균 입경 및 수지상세포의 농도에 따라 나노입자 및 수지상세포 유래의 리포좀의 혼합비율을 결정할 수 있다. 이때 수지상세포는 나뭇가지 모양의 돌기가 발달된 방사형의 형태를 가지므로 리포좀 형태로부터 표면적을 산출하는 것이 바람직하다.
본 발명 개시 내용에 따라 나노입자 및 리포좀의 농도, 나노입자의 종류 및 사이즈에 따른 표면적을 종합적으로 고려하여 나노입자 및 수지상세포 유래의 리포좀의 최적 혼합비율을 산출할 수 있다.
구체적으로 하기 표 1에 기재된 바에 따라 설계될 수 있다.
상기 개수 농도 비(A)는 1 ㎖당 포함된 나노입자 및 리포좀의 개수의 비를 의미할 수 있다. 즉, 1 ㎖에 리포좀이 한 개 있다고 한다면, 나노입자는 1 ㎖에 a개가 포함된 것을 가리킨다. 보다 정확하게는 상기 리포좀 한 개는 1×106개인 것으로 정의될 수 있다.
상기 단위 표면적 비(B)는 나노입자 및 리포좀 하나 단위 각각의 표면적을 구하여 나노입자를 기준으로 비율을 산정한 것이다. 이 때 나노입자 및 리포좀은 구형으로 간주하여, 나노입자 및 리포좀의 평균 입경으로부터 4πr2에 따라 계산하였다. 또한 총 표면적 비는 개수 농도 비(A)와 단위 표면적 비(B)를 곱한 값으로서, 총 표면적의 비는 a:b가 된다.
본 발명에 있어서, 나노입자는 세포막 리포좀과 필터 공압출을 수행하기 전, 분산력 증대를 위하여 초음파를 처리할 수 있다. 이 경우 초음파는 나노입자 2~3개가 단위입자가 될 수 있을 정도로 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서 상기 식 1에서 이상적인 표면 커버리지를 구현하기 위하여 상기 초음파 처리된 단위 나노입자 및 리포좀의 혼합비율은 실질적으로 b/3a : 1 내지 b/2a : 1인 것이 좋다.
상기 나노입자 및 수지상세포 유래의 리포좀의 최적의 혼합비율은 상기 식 1에 따라 모든 나노입자 표면에 세포막이 코팅될 수 있도록 100%의 표면 커버리지를 갖는 수지상세포 모방 나노구조체를 구현하는 것을 가능케 한다.
본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체 제조방법에 있어서, 상기 세포막이 도입된 나노입자에 항원을 펄싱하는 단계는 수지상세포화된 상기 나노입자를 항원에 노출시킴으로써 항원이 세포막에 탑재되는 단계로서, 이를 통해 강력한 항원 특이적 T 세포의 활성화를 유도할 수 있다.
상기 항원은 종양 항원 유래 펩타이드 또는 단백질일 수 있고, 상기 종양 항원은 종양 연관 항원 또는 종양 특이 항원일 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 생쥐 암 모델에 있어서, 오브알부민(ovalbumin, OVA), LCMV(Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus) glycoprotein, retrovirus protein 유래의 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 보다 구체적으로 OVA257-264, GP33-41, p15E 모델의 암 항원 펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
또한 인간 암 항원에 있어서, (1) HER2/Neu, tyrosinase, gp100, MART, HPV E6/E7, EBV EBNA-1, carcinoembryonic antigen, a-fetoprotein, GM2, GD2, testis antigen, prostate antigen, 및 CD20를 포함하는 종양 연관 항원 및 (2) 다양한 돌연변이에 의해 생성될 수 있는 신생항원(neoantigen)을 포함하는 종양 특이 항원으로부터 유래된 펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 바람직하게는 상기 항원은 상술한 암 항원 펩타이드 1종 또는 2종 이상의 상이한 펩타이드일 수 있다.
상기 펄싱은 당업계에 알려진 다양한 펄싱 프로토콜이 가능하나, 보다 좋게는 5% CO2 및 37℃ 가습 조건에서 0.5 내지 6 시간 동안 종양 항원 유래 펩타이드 또는 단백질과 혼합 배양하여 펄싱을 수행하는 것일 수 있다.
구체적으로 본 발명의 비제한적인 일 예로서, OVA257-264, GP33-41 항원을 처리하는 경우 0.1 내지 0.3 ㎍/㎖, p15E 항원을 처리하는 경우 2 내지 7 ㎍/㎖의 농도로 처리하며, 처리 후 30분간 37 ℃ 인큐베이터에서 보관함으로써 상기 항원을 펄싱할 수 있다.
항원이 펄싱된 수지상세포 모방 나노구조체는 나노사이즈의 크기로 인하여 암 표적기능이 매우 뛰어나며(negative targeting), 안정적이고, 부피 대비 넓은 표면적을 가지고 있기 때문에 T 세포와 쉽게 접촉할 수 있다. 따라서 수지상세포 모방 나노구조체의 활성화 및 그에 따른 특이적인 T 세포 반응의 활성화를 통해 효과적인 항암 면역반응을 유발할 수 있다. 또한, 체내에서 사멸의 위험이 없기 때문에 체내 순환 시간이 굉장히 길다는 장점이 있다.
본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체의 제조과정은 단순하며, 직접적 방법으로 면역반응이 이미 진행된 면역세포를 모방하여 중간 과정 없이 T 세포의 활성화를 유도할 수 있는 장점이 있다. 또한, 나노입자의 광열효과가 더해지는 경우 종양 억제 효능이 증대되기 때문에 면역항암치료제로 널리 활용될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 수지상세포 모방 나노구조체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 비경구를 위한 제형인 것이 바람직하다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 정맥 내 주사, 비강 내 흡입, 근육 내 투여, 복강 내 투여, 경피 흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 항암제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 항암제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
아울러 본 발명은 상기 수지상세포 모방 나노구조체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 암 치료방법을 제공할 수 있다. 상기 약학적 조성물을 개체에 투여함으로써 개체에서 종양 특이적 면역 반응을 유도하거나 개체에서 암의 증상을 치료 및/또는 완화시킬 수 있다. 이때 상기 개체는 인간 또는 비인간 포유동물일 수 있다.
도 1 (b)는 제조된 본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체의 T 세포 자극에 대한 이미지를 나타낸 것이다. 나노구조체의 MHC class I, II/ CD80, CD86이 T 세포의 T cell receptor (TCR)/CD28과 각각 결합하여 T 세포의 증식과 더불어 T 세포의 분화를 유도할 수 있음을 보여주고 있다.
이하 실시예 및 실험예를 들어 발명을 더 자세히 설명한다.
실시예 1. 수지상세포 모방 나노구조체의 제조
6주~8주령 Na
ve B6 마우스(Orient Bio)의 대퇴골에서 분리된 골수세포로부터 분화된 수지상세포를 추출하여, 2,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 순수한 수지상세포를 수득하였다. 이후, Protease Inhibitor Tablet-PBS buffer를 처리하여 1~2×106 cells/㎖ 농도로 분산시켰다. 그리고 -70 ℃에서 급속 냉동, 상온에서의 해동 과정 및 원심분리를 거쳐 세포막만을 정제하였다. 이후 20%의 진폭으로, 3초 켜기/끄기 및 사이클간 2초의 냉각기를 갖는 3초 1회전을 총 60회 수행하는 초음파(VC505, Sonics & materials)를 처리하여, 마이크로 단위의 세포막 현탁액을 확보하였으며, 이를 나노 사이즈의 필터를 갖는 폴리카보네이트 막(기공크기 1㎛, 400 ㎚, 100 ㎚)으로 걸러내 각 기공 크기의 직경을 갖는 나노 리포좀을 생성하였다. 나노입자 표면 상에 코팅되는 세포막의 표면적을 고려하여, 나노입자 및 리포좀이 최적화된 혼합비율을 가지는 경우를 XDM=1로 전제하였다.
[식 1]
이에 따라, 상기 XDM = 1이 되도록 폴리스타이렌(PS) 나노입자 5 ㎕ 및 리포좀 1 ㎖을 혼합한 후, 함께 필터압축 (filter extrusion)하여, 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하였다. 상기 제조된 수지상세포 모방 나노구조체에 0.2 ㎍/㎖의 GP-33 항원을 약 30분간 37 ℃에서 처리함으로써 MHC class I, II 표면에 항원을 제시할 수 있도록 유도하여, 항원이 펄싱된 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하였다.
실시예 2. 수지상세포 모방 나노구조체의 제조
나노입자를 60 ㎚의 금 나노입자를 사용한 것을 제외하면, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 수지상세포 모방 나노구조체 및 항원이 펄싱된 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하였다. 상기 수지상세포 모방 나노구조체는 크기가 대략 80 ㎚로 측정되었다.
비교예 1. 나노입자 및 리포좀의 혼합비율을 달리한 수지상세포 모방 나노구조체 제조
하기 표 2에 기재된 혼합비율인 것을 제외하면, 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하였다.
비교예 2. 초음파 처리 없이, 수지상세포 모방 나노구조체 제조
수지상세포로부터 초음파 처리 없이, lysis buffer를 이용하여 수득한 세포막 현탁액을 사용한 것을 제외하면, 실시예 2와 동일한 방법을 수행하여 수지상세포 모방 나노구조체를 제조하였다.
실험예 1. 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 따른 수지상세포 모방 나노구조체의 특성 평가
1-1. 표면 커버리지 분석
본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체의 표면 커버리지를 주사전자현미경(7610F-plus, JEOL)을 이용하여 평가하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다. XDM 값이 커질수록 표면 커버리지도 높게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
1-2. 표면 제타전위 및 PL 강도 분석
동적광산란식 나노입도분석기(DLS, SZ100, Horiba)를 이용하여, 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체의 표면 제타전위를 측정하였다.
또한 형광분광광도계(FP-8300, JASCO)를 이용하여 PL(photoluminescence) 강도를 측정하였다.
1-3. T 세포 증식 및 분화 유도 분석
96 well U bottom plate에 P14 mouse로부터 분리한 CD8 T 세포 2×105개, DC를 4×104개를 활용하여 실시예 1 및 비교예 1에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP)를 같은 well에 배양액 10% RPMI 200 ㎕을 통해 넣고, 37 
에서 3일간 공배양하였다. 3일 후, 해당 플레이트를 인큐베이터에서 회수하여 형광이 달린 항체를 통해 염색을 진행하고 유세포 분석기를 통하여 CD8 T 세포의 활성화 정도를 분석하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5는 FACS 데이터를 그래프화한 것으로서, XDM이 1인 실시예 1의 경우 CTV를 진행하였을 때, CD44, IFNg, TNFα, IL-2 모두 가장 높은 발현율을 나타냈다. 이는 본 발명에 따른 최적화된 혼합비율에 의할 때, 수지상세포 모방 나노구조체의 T 세포의 증식 및 활성화 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
1-4. SDT 데이터 분석
동시 DSC/TGA 분석기(SDT 650, TA instruments) 장비를 사용해 XDM = 0, 0.25, 0.5, 1, 2 각각의 열적 안정성을 평가하였다. 30 ~ 1000 ℃ 까지 10 ℃/min의 속도로 N2 환경에서, Tm (bilayer transition temperature), Tg (Glass transition temperature), Tm (melting temperature)를 측정하여, 하기 표 3 및 도 6에 그 결과를 나타내었다.
도 6(a)는 40 내지 150 ℃ 범위에서의 세부적인 분석을 위한 그래프를 도시한 것이다. XDM = 0의 경우, XDM = 0.25, 0.5, 1, 2 에서 보인 약 80 ℃ 에서 피크는 형성되지 않은 것으로 보아, 80 ℃ 부근에서 피크는 세포막에 의해 나타난 피크로 보여진다.
80 ℃ 부근에서 피크를 나타낸 XDM = 0.25, 0.5, 1, 2 중에서 XDM = 1 의 피크가 가장 저온(79.83 ℃)에서 형성된 것을 확인할 수 있다. 이중결합의 수가 증가할수록 Tm(bilayer transition temperature)은 낮아지기 때문에 이는 XDM = 1 의 경우, 막을 구성하고 있는 지방산에 이중결합이 가장 많이 분포되어 있다는 것을 의미하며, 입자 표면을 거의 100% 감싸고 있기에 curvature가 가장 커 가장 저온에서 피크가 형성된 것으로 해석된다. 즉, XDM = 1일 때 세포막이 가장 안정적으로 입자 표면 위에 형성돼 있음을 알 수 있다.
104 ℃ 내지 112 ℃ 부근에서는 모든 그룹에서 피크가 형성되었다. 따라서 이는 PS(폴리스타이렌) 입자로 인한 피크이며, PS의 Tg(Glass transition temperature)의 변화를 확인할 수 있다. XDM = 0의 경우, 111.52 ℃ 에서 피크가 형성되었는데 이는 알려진 PS의 Tg (Glass transition temperature) 범위에 해당한다. XDM = 0.25, 0.5, 1, 2의 경우 Tg 값이 XDM = 0 보다 낮은데, 이는 세포막이 코팅되었기 때문인 것으로 보여진다. XDM = 1일 때 가장 고온(106.99 ℃)에서 피크가 형성된 것을 볼 때, XDM = 1 이 가장 열역학적으로 안정한 것을 확인할 수 있다.
도 6(b)는 250 내지 500 ℃ 범위에서의 세부적인 분석을 위한 그래프를 도시한 것이다. XDM = 0, 0.25, 0.5, 1, 2 모두에서 피크가 형성되어, 이는 PS입자로 인한 피크이며, Tm(melting temperature)을 나타낸다. XDM = 0, 0.25, 0.5, 1, 2 각각을 비교해보면, XDM = 1 일 때 Tm(melting temperature)이 가장 고온(418.95 ℃) 에서 형성되어, 열역학적으로 가장 안정적이라고 해석된다. 이는 XDM = 0 보다도 높은 온도로서, XDM = 1의 구조적 안정성이 굉장히 높음을 시사한다.
실험예 2. 본 발명의 실시예 2 및 비교예 2에 따른 수지상세포 모방 나노구조체의 특성 평가
본 발명의 실시예 2 및 비교예 2에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체의 표면 제타전위를 분석하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 초음파를 처리하지 않고 공압출 과정을 거친 비교예 2에 따라 제조된 나노구조체는 표면 제타전위의 값에 거의 변함이 없고, variation이 크게 나타났다. 특히, 제타전위의 variation이 20.7로서 매우 큰 수치이다. 이는 공압출 후, 금 나노입자에 세포막 유래 리포좀이 코팅된 나노구조체와 코팅되지 않은 나노입자가 공존하는, 나노입자에 세포막의 균일한 코팅이 이루어지지 않은 상태임을 확인할 수 있다.
반면 초음파를 처리한 실시예 2에 따라 제조된 나노구조체는 표면 제타전위의 절대값이 52.7에서 31.7로 현저히 감소된 것을 확인할 수 있다. 세포막 유래 리포좀 또한 인지질 구조로 인하여 음의 제타 전위를 가지지만, 금 나노입자는 시트르산으로 분산되어 있어, 보다 강한 음의 제타 전위를 가진다. 수지상세포 모방 나노구조체는 강한 음의 제타전위를 가지는 금 나노입자 표면에 세포막을 코팅하는 것이므로 세포막이 금 나노입자의 표면에 잘 코팅될수록 금 나노입자의 강한 음의 제타전위는 감소하여, 상대적으로 낮은 음의 제타전위 값이 나타날 것임을 가정하면, 본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체는 세포막 코팅이 균일하게 잘 이루어졌음을 알 수 있다.
실험예 3. 실시예 2에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체 특성 분석
실시예 2에 따른 수지상세포 모방 나노구조체가 제대로 제조되었는지를 확인하기 위해 물리화학적 및 생물학적인 분석을 진행하였다.
3-1. TEM 이미지 분석
도 8은 수지상세포 모방 나노구조체를 제조한 후, TEM으로 분석한 결과이다. 금 나노입자(gold NP)는 높은 분산력을 가지며, 80 nm 정도의 크기를 가지는 것을 확인하였으며, 추출한 세포막(DCm)은 낮은 전자밀도로 인해 선명하지는 않지만, 약 100 nm 정도의 리포좀들이 형성됨을 확인할 수 있다. 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP)의 경우, 약 10-20 nm 정도의 두께를 가지면서 코팅이 이루어져 수지상세포 모방 나노구조체가 안정적으로 형성되었음을 확인할 수 있다.
3-2. 제타전위 측정
금 나노입자(AuNPs), 수지상세포막(DC vesicle), 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP), 항원 펄싱된 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP+GP33-41)의 제타전위 측정을 통해 표면 전하를 확인하였고, 그 결과는 도 9에 도시되었다.
금 나노입자는 시트르산으로 분산되어 있기 때문에 강한 음의 제타 전위를 가지며, 세포막 리포좀은 역시 인지질 구조로 인하여 음의 제타 전위를 나타낸다. 수지상세포 모방 나노구조체는 강한 음의 제타전위를 가지는 금 나노입자 표면에 세포막이 코팅되어, 금 나노입자와 비교하여 상대적으로 낮아진 음의 제타전위 값을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 표면에 항원인 GP-33을 로딩시킬 경우, GP-33의 아미노산 서열(Lys-Ala-Val-Tyr-Asn-Phe-Ala-Thr-Cys) 내의 약한 양의 전하로 인해 제타전위 값이 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 결과적으로 코팅된 수지상세포 나노구조체가 성공적으로 제조되었음을 간접적으로 증명할 수 있다.
3-3. 수지상세포막 단백질 분포 확인
수지상세포막을 추출하는 과정 및 초음파 처리 및 필터압출 과정에서 수지상세포막에 존재하는 면역 관련 단백질들이 응집되거나 변성되지 않았는지를 확인하기 위해 단백질 크기 분포 확인 (SDS-PAGE)을 진행하였다.
수지상세포 모방 나노구조체의 제조 과정에서 발생할 수 있는 단백질 변성을 확인함과 동시에 나노입자 표면에 안정적으로 세포막이 코팅되었는지 여부를 확인하고자 SDS-PAGE를 통하여 총 단백질 분포정도를 확인하였다. 나노구조체 제조 중간 단계에서 진행하는 초음파 처리 전후 단백질 분포에 큰 변화가 없음을 통하여 제조단계에서 단백질의 변성은 크게 일어나지 않음을 확인할 수 있었다. 최종적으로 제조된 나노구조체의 단백질 분포 또한 세포막의 단백질 분포 정도와 일치하는 것을 통해 나노구조체에 성공적으로 수지상세포의 세포막이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
3-4. 수지상세포 막 단백질의 분석
금 나노입자와 수지상세포 유래 세포막을 함께 필터압출하는 과정에서 세포막이 right-side-out membrane orientation으로 금 나노입자에 코팅되었는지 확인하기 위해, 제조한 수지상세포 모방 나노구조체의 면역 관련 주요 막 단백질들인 CD80, CD86, MHC class I, II의 유무를 유세포 분석기로(FACS)를 통해 확인하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
대표적인 막 단백질인 CD80, CD86, MHC class I, II을 형광이 달린 항체를 통해 분석하였을 때, 수지상세포 모방을 하지 않은 그룹에 비해 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP)를 제조하여 항체를 붙인 경우, positive한 형광시그널을 확인하였으며, 이를 통하여 입자 표면에 막 단백질들이 정상적으로 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
3-5. In vitro 상에서 T 세포 증식 및 분화 유도
실험예 1-3과 동일한 방식으로 수지상세포 모방 나노구조체의 T 세포 증식 및 분화 유도 효과를 평가하기 위한 T 세포와의 공배양 분석을 수행하였고, 그 결과는 도 11a 및 도 11b에 도시되었다.
수지상세포 모방 나노구조체에 GP-33를 처리하지 않고 CD8 T 세포와 공배양을 진행한 경우에는 T 세포 증식척도인 CTV가 늘어나지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 마찬가지로 해당 그룹에서 활성화 척도인 CD44나, 기능성 사이토카인인 IFNg, IL-2, TNFa 등도 CD8 T 세포에서 거의 나오지 않는 것을 확인할 수 있었다. 반면에, 수지상세포 모방 나노구조체에 GP-33을 처리하여 P14에서 분리한 CD8 T 세포의 T 세포 수용체에 결합할 수 있도록 처리한 결과, CTV가 진행되어 CD8 T 세포가 증식한 것을 확인할 수 있었으며, 높은 CD44 발현을 통해 CD8 T 세포가 활성화된 것을 확인할 수 있었다. 더불어 IFNg와 TNFα가 현저하게 많이 CD8 T 세포로부터 나오는 것 또한 확인할 수 있었다. 이를 통해, 수지상세포의 세포막만 분리하여 이를 모방하는 나노구조체를 제조하더라도 in vitro 상에서 항원특이적인 CD8 T 세포의 증식과 활성화에 기여하는 것을 확인할 수 있었다.
3-6. In vivo 상에서 T 세포 증식 및 분화 유도
congenic marker(Thy1.1)가 달린 P14 mouse에서 CD8 T 세포를 분리한 후 naive recipient mouse에 양자면역세포이입(adoptive transfer)를 해주고, 24시간 후 수지상세포 또는 수지상세포 모방 나노구조체를 각 그룹마다 다른 조건으로 양자면역세포이입을 진행하였다. 그 후 48시간이 경과한 다음, 마우스의 비장에서 면역세포를 분리하여, 형광이 달린 항체를 통해 염색을 진행하고 유세포 분석기를 통하여 CD8 T 세포의 활성화 정도를 분석하였다. 그 결과는 도 12a 및 도 12b에 도시되었다.
G1은 CD8 T 세포만 넣어준 그룹, G2는 GP33-41을 처리하지 않은 수지상세포 및 CD8 T 세포를 넣어준 그룹, G3은 GP33-41을 처리한 수지상세포 및 CD8 T 세포를 넣어준 그룹, G4는 GP33-41을 처리하지 않은 수지상세포 모방 나노구조체 및 CD8 T 세포를 넣어준 그룹, G5는 GP33-41을 처리한 수지상세포 모방 나노구조체 및 CD8 T 세포를 넣어준 그룹이다. GP-33을 처리하지 않은 G2와 G4의 경우, negative control인 G1과 마찬가지로 CD8 T 세포 활성화 지표들이 모두 나타나지 않은 것을 확인할 수 있었던 반면, G3에서는 CTV를 통해 CD8 T 세포의 증식 및 CD44을 통한 활성화, 그리고 기능성 사이토카인인 IFNg와 TNFα의 분비를 확인할 수 있었다. G5의 경우, G3에 비해서 그 정도가 약하기는 하지만 negative control에 비해서는 어느 정도 CD8 T 세포가 활성화 되고 증식되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 in vivo 상에서는 GP-33를 처리한 수지상세포 모방 나노구조체가 CD8 T 세포를 활성화시킬 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
3-7. 안정성 테스트
실시예 2에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP)를 동결건조 후 상온에서 보관, PBS에 분산된 상태로 냉장(4 ℃) 및 냉동(-20 ℃) 보관, 원심분리하여 펠릿 상태로 냉장(4 ℃) 및 냉동(-20 ℃) 보관하여 각각 10일, 20일, 30일 경과 후 항원을 펄싱하였다. 상기 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP)에 항원을 펄싱한 그룹 및 골수 유래 수지상세포에 항원을 펄싱한/하지 않은 그룹과 함께 T 세포 증식 및 분화 효율을 평가하였다. 그 결과는 도 13에 도시되었다. 본 발명에 따른 수지상세포 모방 나노구조체(DCm-NP)는 30일 이상 구조적 안정성을 유지함과 동시에 수지상세포의 항원제시기능 또한 보존됨을 확인할 수 있었다.
본 발명은 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다.
Claims (18)
- 나노입자 코어; 및 수지상세포로부터 유래된 지질 분자의 세포막을 포함하는 쉘;을 포함하는 나노구조체로서, 상기 쉘은 상기 지질 분자의 이중층을 포함하는 것을 특징으로 하는 수지상세포 모방 나노구조체.
- 제 1항에 있어서,
상기 쉘은 5 내지 20 ㎚인, 수지상세포 모방 나노구조체. - 제 1항에 있어서,
상기 나노구조체의 표면 커버리지는 70% 이상인, 수지상세포 모방 나노구조체. - 제 1항에 있어서,
상기 나노구조체의 표면 커버리지는 85% 이상인, 수지상세포 모방 나노구조체. - 제 1항에 있어서,
상기 나노구조체는 상기 수지상세포 유래의 세포막을 초음파 처리하여 제조된 리포좀 및 상기 나노입자가 융합된 것인, 수지상세포 모방 나노구조체. - 제 5항에 있어서,
상기 나노구조체의 표면 전위의 절대값은 수지상세포로부터 유래된 지질 분자의 리포좀 표면 전위의 절대값보다 작은, 수지상세포 모방 나노구조체. - 제 5항에 있어서,
상기 나노구조체는 상기 리포좀 및 나노입자를 공압출하여 제조한 것인, 수지상세포 모방 나노구조체. - 제 5항에 있어서,
상기 리포좀의 입경은 200 ㎚ 이하인, 수지상세포 모방 나노구조체. - 제 1항에 있어서,
상기 나노구조체의 표면 제타전위는 -35 내지 -25 ㎷인, 수지상세포 모방 나노구조체. - 수지상세포로부터 세포막을 정제하는 단계;
상기 세포막에 초음파를 처리하여 세포막 현탁액을 형성하는 단계;
상기 세포막 현탁액을 멤브레인 필터를 통해 여과하여 리포좀을 수득하는 단계; 및
나노입자 및 상기 리포좀을 혼합한 후, 필터압축하여 세포막이 도입된 나노입자를 수득하는 단계;를 포함하는 수지상세포 모방 나노구조체 제조방법. - 제 10항에 있어서,
상기 나노입자 및 리포좀은 1:150 내지 1:300의 부피비율로 혼합되는 것인, 수지상세포 모방 나노구조체 제조방법. - 제 10항에 있어서,
상기 세포막이 도입된 나노입자에 항원을 펄싱하는 단계;를 더 포함하는 수지상세포 모방 나노구조체 제조방법. - 제 12항에 있어서,
상기 항원은 종양 항원 유래 펩타이드 또는 단백질인, 수지상세포 모방 나노구조체 제조방법. - 제 10항에 있어서,
상기 리포좀의 평균 입경은 200 ㎚ 이하인, 수지상세포 모방 나노구조체 제조방법. - 제 10항에 있어서,
상기 세포막이 도입된 나노입자는 세포막 도입 전 나노입자와 대비하여 표면전위의 절대값이 작은, 수지상세포 모방 나노구조체 제조방법. - 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 수지상세포 모방 나노구조체를 포함하는 면역치료제.`
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 수지상세포 모방 나노구조체를 포함하는 암치료용 약학적 조성물.
- 제 10항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 수지상세포 모방 나노구조체.
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| Brian T. Luk et al., Theranostics. 2016, 6(7), 1004-101 |
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|---|---|---|---|---|
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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