CN116763907A - 一种水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗及其制备方法，首先，通过双乳液蒸发法制备壳聚糖PLGA纳米颗粒(CS‑NPs)，且该纳米颗粒中装载了HPV16E744‑62肽；再利用米托蒽醌和姜黄素的混合物在体外诱导肿瘤细胞发生ICD，提取获得ICD肿瘤细胞膜(IM)；进而利用IM包裹装饰的CS‑NPs，与三磷酸腺苷一起包含于海藻酸钠水凝胶溶液中，从而形成水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗。体外证实，该纳米颗粒疫苗在体外明显刺激了DCs细胞的迁移、抗原摄取、成熟标记物的表达，及多种炎性因子的释放，且具备溶酶体逃逸的能力。在体内促进了肿瘤抗原在注射部位的保留和缓释，以及在淋巴结的靶向积累。本发明为肿瘤疫苗的开发提供了一种细胞膜工程纳米颗粒疫苗新策略。
Description
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，特别涉及一种水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗及其制备方法。
背景技术
肿瘤疫苗旨在通过激活患者自身免疫系统和恢复免疫监视能力来识别和根除肿瘤细胞。肿瘤疫苗在临床治疗中具有良好的应用前景；然而，目前治疗成功仍然存在重要障碍，包括抗原免疫原性和肿瘤免疫抑制。肿瘤抗原的耐受性、异质性、免疫逃逸和肿瘤免疫抑制机制使疫苗设计具有挑战性。
一个传统的和有吸引力的想法是开发一种基于肿瘤细胞的疫苗，它可以提供广泛的肿瘤抗原；然而，复杂的细胞质蛋白和组分以及大量其他因子和信号分子可能抑制免疫应答。相反，来源于肿瘤细胞的膜被提出作为候选疫苗，因为它不含遗传物质，避免了细胞内成分的干扰，并可能富集肿瘤相关抗原(TAA)。近年来，纳米生物技术在疫苗递送中的应用发展迅速，利用肿瘤细胞膜修饰纳米颗粒(NPs)的策略越来越受到关注。纳米颗粒作为细胞膜的物理支撑，提供纳米级结构，保护负载物质免受酶降解，并形成抗原和佐剂沉积以控制释放。聚乳酸共乙醇酸(PLGA)是FDA批准用于临床应用的可生物降解共聚物，其纳米颗粒具有作为疫苗载体的巨大潜力。据报道，PLGA纳米颗粒负载咪喹莫特和CpG1826等佐剂，并进一步包被肿瘤细胞膜，实现了肿瘤细胞膜抗原和佐剂的纳米级共递送，并在小鼠4T-1乳腺癌模型或B16-F10黑色素瘤模型中分别引发了体内抗肿瘤免疫应答。树突状细胞(dc)的激活和成熟是疫苗诱导有效的细胞介导的抗肿瘤免疫应答的先决条件。目的提高抗原提呈细胞(APCs)对肿瘤细胞膜包裹纳米颗粒的特异性摄取效率。Hu等制备了高免疫刺激剂多肌苷：多胞酸修饰的B16黑色素瘤细胞膜，可有效增强DC活化和抗原交叉递呈，诱导抗肿瘤细胞免疫；Liu等人用甘露糖修饰肿瘤细胞膜，促进了纳米粒子被apc结合和摄取。Gao等人通过制备表达多肽CBP-12的肿瘤细胞膜包封PLGA纳米颗粒，通过CBP-12肽与DC表面的Clec9a相互作用，将纳米颗粒靶向DC，并共同递送STING激动剂，获得协同抗肿瘤作用。此外，还开发了膜融合策略，对膜封装的纳米颗粒进行功能修饰。如将原发肿瘤组织提取的膜与大肠杆菌细胞质膜融合包封纳米颗粒或与外膜囊泡融合形成纳米囊泡，对荷瘤小鼠的肿瘤生长、转移和复发、延长生存期和长期保护作用均有显著效果。虽然已经进行了一些修饰肿瘤细胞膜和加载免疫刺激剂以增强疫苗效力的尝试，但考虑到战略性细胞膜表面配体的合成效率、稳定性、修饰过程以及实际免疫学性质和安全性等方面可能存在的挑战，寻找更多的肿瘤细胞膜配体修饰策略仍具有很大的吸引力。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗及其制备方法，所述纳米颗粒疫苗通过ICD细胞膜上的“EatMe”吃我信号与树突状细胞(DC)上的受体特异性结合，可以促进DC的吞噬摄取；与海藻酸钠一起嵌入的ATP补充了ICD细胞膜上的“FindMe”找我信号，进一步促进了DC细胞的募集。
免疫原性细胞死亡(Immunogeniccelldeath,ICD)是一种由化疗药物、溶酶病毒、物理化疗、光动力治疗和放射治疗等引发的程序性细胞死亡。发生ICD的细胞增加损伤相关分子模式(DAMPs)和促炎细胞因子的表达、释放或易位，对免疫系统产生强烈刺激。DAMPs包括高迁移率基团蛋白B1(HMGB1)和“FindMe”信号三磷酸腺苷(ATP)，其促进dc等先天免疫细胞的募集；“EatMe”信号钙网蛋白(CARL)，热休克蛋白HSP70和HSP90，其向专业抗原呈递细胞(APCs)传递吞噬信号，提高其摄取和呈递抗原的能力。
在本发明中，发明人试图探索一种新的基于膜的仿生纳米疫苗，其特点是利用肿瘤细胞ICD的独特免疫刺激机制并共同递送关键的肿瘤特异性抗原。壳聚糖修饰PLGA纳米粒子后，使其表面带正电，有利于其进一步被细胞膜包裹。首先制备了壳聚糖修饰的PLGA纳米颗粒，将HPV16E744-62肽作为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的重要表位，包被在ICD肿瘤细胞的膜上，然后将纳米颗粒与ATP一起包埋在海藻酸钠(ALG)水凝胶中。发明人评估了纳米疫苗制剂在体外促进dc迁移、活化、成熟和抗原溶酶体逃逸的能力，并在hpv16相关小鼠TC-1肿瘤模型中评估了纳米疫苗的抗肿瘤能力，该模型在接种疫苗时肿瘤已完全建立。
基于此，本发明的第一方面提供了一种水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，壳聚糖PLGA纳米颗粒的制备：
分别配置聚乙烯醇溶液和壳聚糖溶液，混合溶解后得到壳聚糖溶液；称取PLGA纳米颗粒，加入二氯甲烷搅拌，至PLGA纳米颗粒完全溶解，得到PLGA纳米颗粒油相；
将PBS溶解的HPV16E744-62肽加入PLGA纳米颗粒油相中，超声形成初乳液；将所述壳聚糖溶液加入初乳液中，超声固化PLGA纳米颗粒，形成第二乳液；蒸发去除所述第二乳液中的二氯甲烷，离心弃上清、收集沉淀，即制备得到壳聚糖PLGA纳米颗粒(CS-NPs/E7)；
步骤2，ICD肿瘤细胞膜的制备：
利用米托蒽醌和姜黄素联合处理肿瘤细胞，使肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，刮取下处理后肿瘤细胞并进行细胞破碎处理，收集细胞膜碎片，即为ICD肿瘤细胞膜；
步骤3，水凝胶嵌入ICD细胞膜包裹纳米颗粒的制备：
首先，将步骤2制备得到的ICD肿瘤细胞膜通过多孔聚碳酸酯膜形成的癌细胞囊泡(IM)；然后，将癌细胞囊泡与步骤1制备得到的壳聚糖PLGA纳米颗粒一起通过孔径更小的多孔聚碳酸酯膜，得到膜包裹的纳米颗粒；
随后，将海藻酸钠(Sodiumalginate,ALG)水凝胶溶解在水中，同时加入三磷酸腺苷(ATP)，得到水凝胶溶液；
将所述水凝胶溶液与膜包裹的纳米颗粒混合，当该混合物在体外或体内遇到钙离子时，即形成水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗(IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG)。
进一步的，步骤1所述壳聚糖PLGA纳米颗粒制备的具体步骤包括：
(1)分别配置聚乙烯醇溶液、壳聚糖溶液，低温下磁力搅拌过夜至聚乙烯醇完全溶解，通过滤膜过滤后得到第二水相——壳聚糖溶液，低温保存；
(2)称取PLGA纳米颗粒，放入烧杯加入二氯甲烷，磁力搅拌直至PLGA纳米颗粒完全溶解，得到PLGA纳米颗粒油相；
(3)用PBS溶解HPV16E744-62肽获得第一水相，将第一水相加入(2)所述PLGA纳米颗粒油相中，超声、充分乳化形成初乳液；
(4)向所述初乳液中加入(1)获得的第二水相，超声固化PLGA纳米颗粒，形成第二乳液；
(5)将所述第二乳液置于磁力搅拌器上，并于通风橱中磁力搅拌以充分蒸发二氯甲烷；
(6)低温离心处理，弃上清、收集沉淀，即为壳聚糖PLGA纳米颗粒。
进一步的，步骤2中采用TC-1细胞制备所述ICD肿瘤细胞膜，具体步骤包括：
当细胞培养瓶里的细胞密度达90％时，加入2～5μmol/L米托蒽醌与40～60μmol/L姜黄素联合处理TC-1细胞12～24h后，用细胞刮子刮下细胞，收集细胞离心、弃上清，PBS洗涤后，向细胞中加入苯甲基磺酰氟，放置冰上10～15min，将冰浴后的细胞在液氮和室温反复冻融3～4次，紧接着通过简单超声使细胞进一步破碎，直到细胞破碎的程度达80％以上，再进行4℃，5000g离心15min，收集上清液至离心管中，随后4℃，15000g离心45min，以沉淀细胞膜碎片，即为ICD肿瘤细胞膜，存于-80℃后续备用。
进一步的，步骤3中，将步骤2制备得到的ICD肿瘤细胞膜通过400nm多孔聚碳酸酯膜形成的癌细胞囊泡；然后，将癌细胞囊泡与步骤1制备得到的壳聚糖PLGA纳米颗粒一起通过200nm的多孔聚碳酸酯膜，得到膜包裹的纳米颗粒。
本发明第二方面提供了一种水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗，所述纳米颗粒疫苗由上述制备方法制备得到。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本发明通过双乳液蒸发法制备壳聚糖PLGA纳米颗粒，壳聚糖对PLGA纳米颗粒的装饰使其表面带正电，这有利于纳米颗粒对肿瘤抗原的荷载以及与细胞膜的进一步包裹；并且所述壳聚糖PLGA纳米颗粒中，装载了HPV16E744-62肽，这是一个重要的细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocyte,CTL)表位，有助于提高ICD细胞膜的低免疫原性，带动针对膜广谱抗原的应答，从而克服临床肿瘤异质性问题；
2、本发明所述的水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗中，壳聚糖装饰的PLGA纳米颗粒表面涂覆ICD的肿瘤细胞膜，ICD细胞膜上具有“EatMe”信号CARL、HSP70和HSP90，与树突状细胞(DC)上的受体特异性结合，可以促进DC的吞噬摄取；与海藻酸钠一起嵌入的ATP补充了ICD细胞膜上除“EatMe”信号以外的“FindMe”信号，进一步促进了DC细胞的募集；同时海藻酸钠水凝胶的加入对整个纳米颗粒疫苗进一步起缓释作用；
3、本发明整合了ICD免疫刺激机制以及肿瘤特异抗原与膜广谱抗原的纳米共递送，制备获得的水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗具有克服肿瘤免疫抑制的潜力，并且其中所用肿瘤细胞膜可以来自患者自体肿瘤细胞，是开发个性化肿瘤疫苗的新方法；同时，本发明所述纳米颗粒疫苗作为肿瘤靶向和免疫调节的输送平台，与其他治疗方法相结合可以进一步提高抗肿瘤免疫反应。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
图1为实施例1所述水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗构建过程及抗肿瘤作用机理图示意图；
图2为测试例1显微镜下正常细胞和ICD细胞的形态观察对比图；
图3为测试例1不同时间点ICD细胞表面“Eatme”信号的表达结果图；
图4为测试例1不同时间点ICD细胞上清中免疫刺激信号的表达结果图；其中，A：不同时间点ATP的表达；B：不同时间点HMGB1的表达；
图5为测试例1所述ICD肿瘤细胞膜囊泡的TEM图；
图6为测试例1免疫印迹检测IM中“EatMe”信号的含量结果图；
图7为测试例2所述NPs、CS-NPs和IM-CS-NPs的TEM、DLS和Zeta电位分析结果图；其中，A：纳米颗粒的TEM图像，比例尺＝200纳米；B：通过DLS检测的纳米颗粒的尺寸分布；C：纳米颗粒的Zeta电位分析；
图8为测试例2中CS-NPs负载FITC-E744-62的荧光图；
图9为测试例2中IM在CS-NPs表面成功包裹结果图；其中，A：共聚焦观察DID-IM和CS-NPs/FITC-E7的共定位；B：SDS-PAGE中IM蛋白质成分的分布模式；
图10为测试例2中体外水凝胶的特性测试结果图；其中，A：加入CaCl2溶液后ALG溶液转变为水凝胶的照片；B：体外IM-CS-NPs/E7/ATP和IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG的E7释放曲线；C：体外ATP在IM-CS-NPs/E7/ATP和IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG中的释放曲线；
图11为测试例3中Transwell细胞迁移试验结果图(n＝3)；其中，A：纳米疫苗和BMDCs细胞共培养8h后代表性图片；B：迁移细胞的统计数据；
图12为测试例3中纳米颗粒疫苗促DC2.4细胞的摄取结果图；其中，上面两幅为CS-NPs/FITC-E7，下面两幅为膜包裹的纳米颗粒DID-IM-CS-NPs/FITC-E7；
图13为测试例3中流式细胞术分析BMDCs上CD86、CD80、MHCI和MHCII的表达结果图(n＝5)；其中，A：BMDCs中CD86、CD80、MHCI和MHCII的流式代表图；B：CD86流式结果统计图；C：CD80流式结果统计图；D：MHCI流式结果统计图；E：MHCII流式结果统计图；
图14为测试例3不同疫苗刺激BMDCs细胞后细胞因子的表达情况(n＝3)；图中，A：IFN-γ的统计图；B：IL-1β的统计图；C：IL-6的统计图；D：TNF-α的统计图；
图15为测试例4中所述纳米颗粒疫苗促进BMDCs中抗原的溶酶体逃逸结果图；其中，E744-62肽用FITC标记，溶酶体用Lyso-TrackerRed标记；
图16为测试例5抗原在注射部位的滞留和在淋巴结的积累结果图；其中，A：通过体内FXPRO成像系统检测注射部位的抗原驻留；B：用于抗原生物分布分析的主要器官和腹股沟淋巴结的离体荧光图像；
图17为测试例6中ICD细胞膜包裹纳米颗粒显著抑制了肿瘤的生长结果图(n＝5)；其中，A：肿瘤的生长曲线；B：肿瘤的组织图片；C：肿瘤组织重量统计图；D：脾脏组织重量统计图；
图18为测试例6中脾细胞分泌IFN-γ的效应细胞水平增强(n＝5)结果图；其中，A：ELISPOT代表性图；B：E749-57肽刺激特异性分泌IFN-γ的T细胞水平的统计图；C：混合肽特异性分泌IFN-γ的T细胞水平的统计图；
图19为测试例6脾细胞中CTL的水平提高(n＝5)结果图；其中，A：脾细胞经E749-57肽刺激后CTL的流式代表图和统计图；B：脾细胞经混合肽刺激后CTL的代表性流式图和统计图；
图20为测试例6脾细胞中MDSCs细胞水平降低(n＝5)结果图；其中，A：脾细胞中MDSCs的代表性流式图；B：脾细胞中MDSCs流式结果统计图；
图21为测试例7水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗显著抑制已建立的2-3mm肿瘤生长(n＝5)结果图；其中，A：肿瘤的生长曲线；B：肿瘤的组织图片；C：肿瘤组织重量统计图；D：脾脏组织重量统计图；
图22为测试例7在2-3mm肿瘤模型增强了脾脏组织中抗肿瘤免疫细胞应答(n＝5)结果图；其中，A：ELISPOT统计分析，分离的脾细胞体外用E749-57肽或ICD细胞膜成分刺激；B：小鼠脾细胞中MDSCs水平的流式代表图和统计图；C：脾细胞经E749-57肽和ICD细胞膜刺激后小鼠脾脏中CD8+T细胞水平的流式代表图和统计图；
图23为测试例7水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗有效抑制了5-6mm的肿瘤生长(n＝7)结果图；其中，A：肿瘤的生长曲线；B：肿瘤的组织图片；C：肿瘤组织重量统计图；D：脾脏组织重量统计图；
图24为测试例7在5-6mm肿瘤模型增强了脾脏组织中抗肿瘤免疫细胞应答(n＝7)结果图；其中，A：ELISPOT统计分析，分离的脾细胞体外用E749-57肽或E7混合肽刺激；B：小鼠脾细胞中MDSCs水平的流式代表图和统计图；C：脾细胞经E749-57肽和混合肽刺激后小鼠脾脏中CD8+T细胞水平的流式代表图和统计图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗，如图1所示，所述纳米颗粒疫苗的制备方法包括以下步骤：
步骤1，采用双乳液溶剂蒸发法制备壳聚糖PLGA纳米颗粒(CS-NPs/E7)：
(1)配置2％聚乙烯醇溶液(Polyvinylalcohol,PVA)+0.5％的壳聚糖溶液(2gPVA+100mL水；0.5g壳聚糖+98mL无菌水+2mL乙酸)，4℃磁力搅拌过夜至第二天PVA完全溶解，通过0.22μm滤膜过滤后在4℃保存。
(2)称取180mgPLGA纳米颗粒(购自济南岱罡生物)，放入烧杯加入6mLDCM(二氯甲烷)，磁力搅拌大约15min，直至PLGA纳米颗粒完全溶解，即为PLGA纳米颗粒油相。
(3)将第一水相PBS(W1)HPV16E744-62肽(浓度1mg/mL)加入所述PLGA纳米颗粒油相中，超声(总2min，超声30s，间隔5s，4℃，30％功率)形成初乳液(WI/0)。所述HPV16E744-62肽(44QAEPDRAHYNIVTFCCKCD62)由上海吉尔生化公司合成(中国)，冻干后存于-80℃。
(4)观察初乳液，若出现油水分层的现象，则表明第一水相与油相得到充分乳化，可进行下一步操作。
(5)向初乳液中加入24mL第二水相(2％PVA+0.5％壳聚糖)，超声固化PLGA纳米颗粒(总5min，超声30s，间隔5s，4℃，30％功率)，形成第二乳液(W1/0/W2)。
(6)将超声好的样品置于磁力搅拌器上，并于通风橱中磁力搅拌8h以充分蒸发DCM。
(7)4℃，21000rpm离心30min，弃上清，收集沉淀的纳米颗粒，即为壳聚糖PLGA纳米颗粒(CS-NPs/E7)。
(8)用无菌水以相同的离心条件洗涤2-3次，最后用适量的PBS重悬，-80℃冻存。
步骤2，ICD肿瘤细胞膜(IM)的制备：
首先，在体外药物诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(ICD)：当细胞培养瓶里的细胞密度约90％时，加入3μmol/L米托蒽醌(Mitoxantrone,MTX)与50μmol/L姜黄素(Curcumin,Cur)联合处理，以不进行任何处理的TC-1细胞作为对照组，置于37℃，5％的CO2恒温细胞培养箱培养，期间用显微镜观察细胞生长情况以及形态学变化。
MTX、Cur联合处理TC-1细胞24h后。用细胞刮子刮下细胞，收集细胞800g离心5min弃上清，PBS洗涤两遍，取少量细胞用于计数。加适量PMSF至2000-5000万细胞中，放置冰上10-15min，将冰浴后的细胞在液氮和室温反复冻融3-4次，紧接着通过简单超声使细胞进一步破碎，然后取少量在显微镜下观察细胞的破碎的程度，直到细胞破碎的程度为80％左右，再进行下一步操作。4℃，5000g离心15min，收集上清液至离心管中，随后4℃，15000g离心45min，以沉淀细胞膜碎片，即获得ICD肿瘤细胞膜(IM)，存于-80℃后续备用。
步骤3，水凝胶嵌入ICD细胞膜包裹纳米颗粒的制备：
首先，将步骤2制备的IM在挤出机(LiposoFast-1，加拿大Avestin公司)的作用下通过400nm多孔聚碳酸酯膜(Whatman公司)形成的癌细胞囊泡。然后IM囊泡和步骤1制备的CS-NPs/E7一起通过200nm多孔聚碳酸酯膜(Whatman公司)，每次共挤出15个循环。进一步，将海藻酸钠水凝胶溶解在无菌水中(工作浓度10mg/mL)，同时加入三磷酸腺苷ATP，然后将制备的水凝胶溶液与膜包裹的纳米颗粒混合，当该混合物在体外或体内遇到钙离子时，就会形成水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG。
测试例1——肿瘤细胞发生ICD的指标检测
本测试例对实施例1步骤2所述ICD肿瘤细胞膜(IM)制备中，肿瘤细胞发生ICD后，观察细胞形态的变化、对相关免疫刺激信号进行了检测，并观察IM的形态，结果如下：
1、ICD肿瘤细胞的形态变化
用米托蒽醌(MTX)3μmol/L和姜黄素(Cur)50μmol/L组合处理TC-1肿瘤细胞，观察正常的TC-1细胞和由药物诱导24h后的TC-1细胞，如图2所示，在显微镜下可以看到细胞形态发生了变化，细胞趋于死亡。
2、ICD细胞表面“EatMe”信号的检测
通过免疫荧光法观察诱导肿瘤细胞ICD后“EatMe”信号的表达情况。如图3结果显示，6h时可见CALR、HSP70和HSP90蛋白的积累，在细胞浆内相对均匀分布，12h和24h时沿细胞边缘的荧光信号越来越强，说明“EatMe”信号随着ICD的诱导通过转运在细胞膜表面定位。
3、ICD肿瘤细胞上清中免疫刺激信号的表达
在不同的时间点，分别用ATP检测试剂盒和WesternBlotting动态测量了经药物处理的肿瘤细胞上清液中“FindMe”信号ATP和HMGB1的水平。
图4结果显示细胞培养基上清液中ATP(图4中A)和HMGB1(图4中B)的释放量随着MTX和Cur的诱导从3h到30h逐渐增加。
4、制备的ICD细胞膜囊泡在电镜下的形态
如图5透射电子显微镜(TEM)观察到，实施例1步骤2制备的ICD肿瘤细胞膜通过挤出机的挤出，通过400nm多孔聚碳酸酯膜形成的癌细胞囊泡呈现为纳米级的囊泡，其大小从200nm到400nm不等，红框显示为有代表性的细胞膜囊泡。
5、ICD肿瘤细胞膜中“EatMe”信号的含量
以细胞膜上的Na+K+/ATP酶蛋白作为内参蛋白，利用WesternBlotting进行分析，如图6所示结果可知，制备的ICD肿瘤细胞膜(IM)中“EatMe”信号CALR、HSP70和HSP90的含量明显高于没有诱导ICD的细胞膜含量。
测试例2——膜包裹纳米颗粒的表征
本测试例对实施例1步骤1、步骤3中壳聚糖PLGA纳米颗粒、膜包裹纳米颗粒的表征进行观测，结果如下：
1、纳米颗粒的形态特征、粒径和电位分布
在成功诱导TC-1肿瘤细胞的ICD后，提取ICD的肿瘤细胞膜，制备壳聚糖PLGA纳米颗粒并进一步在表面包裹ICD的细胞膜，构建了基于ICD细胞膜的仿生纳米颗粒疫苗(即实施例1所述水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗)。用透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)来分析在所述纳米颗粒疫苗制备过程中，不同阶段下纳米颗粒的形态特征和粒径分布。
如图7在TEM观察下，PLGA纳米颗粒(NPs)呈现出规则的球形形态，大小在100nm到150nm之间，壳聚糖PLGA纳米颗粒(CS-NPs)具有与NPs相似的形态和大小分布，但在NPs的表面覆盖着一层半透明的壳聚糖。IM包裹的壳聚糖PLGA纳米颗粒(IM-CS-NPs)显示出150nm至200nm的球形形状，具有典型的核壳结构(图7中A)。DLS分析表明，所制备的纳米颗粒是相对均匀的，NPs、CS-NPs和IM-CS-NPs的平均尺寸和PDI分别为227.9nm、0.164；277.7nm、0.184和326.1nm、0.165(图7中B)；并且，NPs、CS-NPs和IM-NPs的纳米颗粒表面的Zeta电位分别为-2.32mv、8.96mv和-12mv(图7中C)。颗粒形态、粒径和Zeta电位的结果分析表明，壳聚糖被有效地负载在PLGA纳米颗粒上，IM也成功包裹于CS-NPs上。
2、壳聚糖纳米颗粒对FITC-E744-62肽的包封效率
为了进一步提高纳米粒子的抗原性，CS-NPs被加载了肿瘤特异性CTL表位HPV16E744-62(CS-NPs/E7)。本测试例中用FITC-E744-62代替E744-62，以方便检测肽的包裹效率，其他制备步骤均同实施例1。FITC-E744-62是由FITC标记的E744-62(44QAEPDRAHYNIVTFCCKCD62)，用于PLGA纳米颗粒的荧光定位。
如图8所示，CS-NPs/FITC-E7的荧光强度非常强，而第二次乳化液的上清液中游离的FITC-E744-62的强度极低，这一结果表明CS-NPs有效地封装了E7肽。此外，使用间接定量方法测量CS-NPs的封装率约为60％。
3、ICD细胞膜包裹于CS-NPs纳米颗粒表面
为了进一步证明ICD膜被成功地包裹在CS-NPs上，将CS-NPs负载FITC-E744-62肽，用DID红色染料标记IM囊泡进行共聚焦分析。DID-IM和CS-NPs/FITC-E7通过挤出机共挤后，观察到绿色和红色荧光重叠产生的黄色荧光，这表明CS-NPs被IM成功修饰(图9中A)。进一步，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析了蛋白质成分在细胞膜囊泡和仿生纳米颗粒中的分布模式。在IM-CS-NPs中发现了与IM相似的蛋白成分模式，支持IM被包覆在CS-NPs上的结论，也表明肿瘤细胞膜上的蛋白成分在包裹后具有一定的稳定性(图9中B)。
4、体外水凝胶的形态以及对E744-62肽和ATP的释放
为了模拟ICD细胞产生的“Findme”信号，步骤3中通过将膜包裹纳米颗粒与ATP一起嵌入海藻酸钠水凝胶中，进一步装配ATP，这可能提供可控释放的效果。通过加入氯化钙溶液(钙离子浓度0mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL)，在体外观察水凝胶的形成，结果显示具有一定的流动性(图10中A)。
此外，用简单的透析实验分析E744-62肽和ATP的释放。具体的：将500μL的IM-CS-NPs/E7/ATP和IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG置于7kDa透析袋，用10mg/mL的氯化钙浓度，在37℃下轻轻摇晃透析。在指定时间点采集200μL透析液，采用Micro-BCAProteinAssayKit测定E744-62抗原的累积释放浓度，采用ATP AssayKit测定ATP的累积释放浓度。结果表明，ATP在与纳米颗粒混合的IM-CS-NPs/E7/ATP中快速释放，而E7由于包裹在纳米颗粒里面，相对于ATP表现出明显的可控释放；此外，与IM-CS-NPs/E7/ATP相比，实施例1制备得到的纳米颗粒疫苗IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG中水凝胶的形成显著延缓了E7和ATP的释放(图10中B-C)。
测试例3——水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗对DCs细胞的作用
为了了解实施例1制备得到水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗作为有效疫苗的潜力，本测试例在体外评估了所述纳米颗粒疫苗对DCs细胞迁移和激活、抗原摄取及DCs细胞成熟的影响。
1、水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗促BMDCs细胞迁移
使用迁移试验检测BMDCs细胞的迁移，PBS、CS-NPs/E7、IM-CS-NPs/E7、IM-CS-NPs/E7/ATP和ATP与BMDCs细胞孵育8h。在光学显微镜下随机拍摄代表性图像(图11中A)，统计分析了三个视野(图11中B)。结果表明，IM-CS-NPs/E7/ATP促进BMDCs细胞迁移的能力最强，而游离ATP和IM-CS-NPs/E7也促进BMDCs细胞迁移，CS-NPs/E7的效果与PBS相似。结果表明IM和ATP在纳米颗粒疫苗中具有趋化能力。
2、水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗促DC2.4细胞的摄取
为了追踪DCs细胞对膜包裹CS-NPs的摄取，将CS-NPs/FITC-E7和DID-IM-CS-NPs/FITC-E7分别与DC2.4细胞孵育，并用共聚焦显微镜分析其摄取情况。图12结果显示，在0.5h时可以看到清晰的黄色荧光，在4h时荧光强度增强，这表明IM-CS-NPs/FITC-E7被DC2.4细胞快速有效地摄取，也表明IM成功地包裹在CS-NPs/FITC-E7纳米颗粒上。相比之下，CS-NPs/FITC-E7表现出明显但弱于IM-CS-NPs/FITC-E7的绿色荧光。结果表明，与CS-NPs/FITC-E7相比，IM-CS-NPs/FITC-E7纳米疫苗中的IM成分和纳米颗粒结构对DC2.4细胞摄取抗原的作用增强。
3、水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗促BMDCs细胞表面成熟标志物表达
通过与BMDCs细胞体外培养24h，收集BMDCs细胞，对其细胞表面的成熟分子进行染色，用流式细胞仪分析细胞表面共刺激分子的表达，评估了实施例1所述纳米颗粒疫苗对DCs细胞成熟的影响。图13中A为各个分子的流式代表图，结果显示，与PBS对照组相比，IM-CS-NPs/E7/ATP和IM-CS-NPs/E7比CS-NPs/E7更有效地刺激了BMDCs的成熟，表现为CD86(图13中B)、CD80(图13中C)、MHCI(图13中D)和MHCII(图13中E)的更高表达，通过两组之间的比较，IM-CS-NPs/E7/ATP显示出比IM-CS-NPs/E7更强的效果，表明ATP的辅助性作用。
4、水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗促BMDCs细胞上清中相关免疫介质释放
通过与BMDCs细胞体外培养24h，收集BMDCs细胞上清，用ELISA分析培养上清液中促炎症细胞因子的积累，评估了实施例1所述纳米颗粒疫苗对DCs激活的影响。图14结果显示，与PBS对照组相比，IM-CS-NPs/E7/ATP和IM-CS-NPs/E7比CS-NPs/E7更有效地刺激了BMDCs的活化，表现为IFN-γ(图14中A)、IL-1β(图14中B)、IL-6(图14中C)、TNF-α(图14中D)的释放。通过两组之间的比较，IM-CS-NPs/E7/ATP显示出比IM-CS-NPs/E7更强的效果，表明ATP的辅助性作用。
测试例4——溶酶体逃逸试验
交叉呈现是通过MHCI分子方式促进抗原处理和呈现并产生细胞免疫反应的关键机制。如图15溶酶体逃逸试验的结果表明，CS-NPs/FITC-E7和IM-CS-NPs/FITC-E7都能被BMDCs有效吸收，这与IM-CS-NPs/FITC-E7在DC2.4细胞中的发现一致(图12)。而且，IM-CS-NPs/FITC-E7比CS-NPs/FITC-E7呈现更强烈的信号，这表明覆盖的膜成分促进了CS-NPs/E7纳米颗粒的吸收效率，这加强了从测试例3中DC2.4细胞实验中得到的相关结论。此外，发现在CS-NPs/FITC-E7孵育的细胞中，除了黄色荧光外，还有明显的绿色信号存在，说明除了一部分抗原被拖在内体/溶酶体系统中，还有很大一部分逃到了血浆中，可能有助于交叉呈现。值得注意的是，在IM-CS-NPs/FITC-E7处理的细胞中，随机选择的视野中很少看到黄色荧光，而绿色荧光很强，说明膜的包裹可能进一步提高了纳米颗粒从内体/溶酶体中逃逸的能力(图15)。这些结果与MHCI表达增强的发现一致，强烈表明IM包裹的纳米颗粒能够促进交叉呈现，并可能引起强大的细胞免疫力。
测试例5——纳米颗粒疫苗的体内追踪
抗原在注射部位的持续滞留可能提供一种控制释放的效果，并延长了抗原激活免疫系统的时间。为了研究疫苗制剂在注射部位的持久性及其在体内的生物分布，对C57BL/6J小鼠皮下注射(s.c.)100μLPBS、CS-NPs/FITC-E7、IM-CS-NPs/FITC-E7和IM-CS-NPs/FITC-E7/ATP@ALG，用In-FinoFXPRO成像系统检测注射部位的FITC荧光信号，获得不同时间点的体内荧光成像，在平行实验中，注射疫苗8h后解剖并收集小鼠的主要器官，包括心、肝、脾、肺、肾和腹股沟淋巴结进行体外荧光成像，同时记录结果。
图16结果显示，所有组别中注射部位的荧光强度随着时间的推移而降低。然而，IM-CS-NPs/FITC-E7/ATP@ALG的荧光信号在注射24h后比其他组更强烈。而在第72h，CS-NPs/FITC-E7的信号不再被检测到，IM-CS-NPs/FITC-E7在注射部位仍有相对较弱的信号，而IM-CS-NPs/FITC-E7/ATP@ALG仍保持较强的荧光信号(图16中A)结果表明，ALG水凝胶可能对纳米颗粒包裹的FITC-E744-62抗原肽提供保护或控制释放的作用。在平行实验中，在8h时分离并收集小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和腹股沟淋巴结，通过In-FinoFXPRO成像系统的体外成像检测荧光强度。结果发现，所有组别的荧光信号主要聚集在淋巴结中(图16中B)，但IM-CS-NPs/FITC-E7和IM-CS-NPs/FITC-E7/ATP@ALG表现出比CS-NPs/FITC-E7更明显的强烈荧光信号，这似乎意味着包裹在纳米颗粒上的膜成分对DCs细胞的吸收或淋巴结(Lymphonodus，LNs)迁移有一定作用。
测试例6——IM-CS-NPs/E7纳米颗粒的抗肿瘤免疫作用
为了评估ICD细胞膜修饰CS-NPs/E7纳米颗粒的效果，先给小鼠接种TC-1肿瘤细胞，具体的：采用TC-1细胞皮下移植C57BL/6J小鼠右背部皮下接种肿瘤细胞(5×105cells/100μL)与基质凝胶混合成100μL，建立HPV感染相关肿瘤模型。在肿瘤完全建立后间隔7天给小鼠注射三次PBS、CS-NPs/E7和IM-CS-NPs/E7，使用游标卡尺定期监测肿瘤生长情况。在肿瘤大小达到伦理规定前，对小鼠实施安乐死，收集脾脏和肿瘤进行称重和相关免疫水平的检测。
(1)所有疫苗的免疫方式均采取皮下免疫；
(2)肿瘤体积计算公式：
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤最长直径×肿瘤最短直径2×0.5。
1、显著抑制小鼠肿瘤生长
对肿瘤生长的动态监测显示，与PBS对照组相比，IM-CS-NPs/E7诱导的肿瘤抑制作用比CS-NPs/E7更为明显(图17中A)。实验结束时记录的肿瘤块的大小(图17中B)和重量(图17中C)数据充分支持了这一结果。相应地，在IM-CS-NPs/E7纳米颗粒免疫的小鼠中，由肿瘤生长引起的脾脏重量也减少了，提示肿瘤生长引起的脾肿大减轻(图17中D)。
2、促进小鼠脾脏组织中抗肿瘤免疫细胞应答
(1)增强了不同抗原肽刺激脾细胞后分泌IFN-γ的效应细胞水平
肿瘤抗原特异性刺激的IFN-γ分泌的淋巴细胞代表了抗肿瘤效应细胞的一个重要群体。为了阐明IM-CS-NPs/E7免疫的可能细胞机制，本测试例分离了脾细胞，并用特异性抗原肽刺激脾细胞进行ELISPOT检测。在使用E749-57肽刺激脾细胞的实验中，结果显示，与PBS对照组相比，IM-CS-NPs/E7刺激的分泌IFN-γ的脾细胞的水平高于CS-NPs/E7(图18中A-B)。为了反映更广泛的抗原谱反应，还使用了不包括E749-57的E7肽的混合物而不是E749-57来刺激分离的脾细胞，显示出与E749-57抗原肽刺激类似的反应情况(图18中C)，说明IM-CS-NPs/E7的确可以激发机体对广谱抗原的免疫应答，从而呈现出较理想的抗肿瘤免疫效应。
(2)提高了不同抗原肽刺激脾细胞后CTL的水平
用特异性抗原肽E749-57刺激脾细胞进行流式细胞术检测。与接受CS-NPs/E7免疫的小鼠相比，IM-CS-NPs/E7免疫的小鼠脾脏中CD8+T细胞的水平明显增加(图19中A)，同样的为了反映更广泛的抗原谱反应，还使用了E7肽的混合物刺激分离的脾细胞，流式细胞仪检测脾脏中的CD8+T细胞(图19中B)，显示出与E749-57抗原肽刺激类似的反应情况，与PBS和CS-NPs/E7相比，加载E744-62肽的ICD肿瘤细胞膜包裹的纳米颗粒IM-CS-NPs/E7能够引发更强烈的抗肿瘤免疫反应，表明ICD细胞膜的重要性，它提供了“EatMe”的信号，并可能提供广谱的肿瘤抗原。
(3)下调了MDSC水平
对分离出的脾细胞进行了流式细胞术检测，结果表明，与PBS组和CS-NPs/E7组相比，IM-CS-NPs/E7组显著有效的抑制了免疫抑制性MDSCs(Gr-1+CD11b+)的水平(图20中A-B)。这个结果与脾细胞中分泌IFN-γ的T细胞水平和CTL水平相反，总体而言IM-CS-NPs/E7组发挥了更有效的抗肿瘤免疫反应。
测试例7——水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗对肿瘤生长的抑制作用
1、纳米颗粒疫苗显著抑制已建立的2-3mmTC-1肿瘤生长
测试例6在ICD膜包裹CS-NPs/E7纳米颗粒被证明能显著提高纳米颗粒诱导抗肿瘤免疫的能力后，通过进一步提供“Findme”信号ATP和ALG水凝胶的嵌入，开发了完全模拟ICD细胞免疫刺激功能的纳米颗粒疫苗配方，即实施例1制备获得的水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗-IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG。
本测试例为了评估所述纳米颗粒疫苗的治疗效果和提供ATP的重要性，在小鼠的肿瘤长到2-3mm大小后，使用IM-CS-NPs、IM-CS-NPs/ATP@ALG、IM-CS-NPs/E7和IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG进行了疫苗接种。肿瘤生长的动态监测(图21中A)显示，与PBS对照组相比，IM-CS-NPs/E7比IM-CS-NPs和IM-CS-NPs/ATP@ALG更明显地抑制了肿瘤的生长；然而，IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG比所有其他制剂的抑制效果最好，甚至在五只小鼠中的两只完全消除了已形成的肿瘤。在实验结束的第46天，小鼠的肿瘤组织和脾脏从体内分离，肿瘤大小的结果(图21中B)，肿瘤重量(图21中C)和脾脏重量(图21中D)与动态肿瘤生长曲线的结果很一致，IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG组显出显著的抑制肿瘤生长的效果。
2、在2-3mm肿瘤模型增强了脾脏组织中抗肿瘤免疫细胞应答
随后，分析IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG疫苗免疫后激发的抗肿瘤免疫应答，抗原特异性刺激分泌IFN-γ的T细胞是疫苗发挥抗肿瘤免疫的主要效应细胞。因此在实验终点，分离小鼠的脾脏淋巴细胞，ELISPOT结果显示，在特异性E749-57肽和肿瘤细胞膜成分刺激的脾细胞中，IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG疫苗接种的小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞水平显著升高，其他脾淋巴细胞也呈增加趋势(图22中A)。此外，流式细胞术分析表明，与PBS对照相比，IM-CS-NPs/E7和IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG组的脾细胞中免疫抑制MDSCs(Gr-l+CD11b+)的频率比IM-CS-NPs和IM-CS-NPs/ATP@ALG组更显著，而IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG组的抑制最为显著(图22中B)；相比之下，在特异性肽E749-57和肿瘤细胞膜成分刺激的脾细胞中，接受IM-CS-NPs/E7或IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG的小鼠CD8+T细胞水平比IM-CS-NPs或IM-CS-NPs/ATP@ALG更显著，并且IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG诱导的效果最为明显(图22中C)，提示疫苗设计中包括特异抗原的重要性。
3、水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗有效抑制已建立的5-6mmTC-1肿瘤生长
基于本测试例上述纳米颗粒疫苗在2-3mm肿瘤小鼠肿瘤模型中显示有效的抗肿瘤效果，为了进一步证明所述水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗(IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG)的抗肿瘤效力，在一个平行实验中，在免疫纳米疫苗制剂之前，在小鼠身上形成了5-6mm大小的较大肿瘤，对小鼠进行3次免疫治疗，隔周免疫。肿瘤生长曲线(图23中A)显示，与其他组相比，IM-CS-NPs/ATP@ALG更明显地抑制了肿瘤的生长；在实验结束的第46天，分离小鼠的肿瘤组织和脾脏组织，并对离体的肿瘤组织进行拍照记录，肿瘤大小(图23中B)、肿瘤重量(图23中C)和脾脏重量(图23中D)与动态肿瘤生长曲线的结果一致，IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG组显示出显著的抑制肿瘤生长的效果，提示其即使面对更大肿瘤的免疫抑制挑战，仍能够激发有效的抗肿瘤细胞免疫应答。
4、在5-6mm肿瘤模型增强了脾脏组织中抗肿瘤免疫细胞应答
分泌IFN-γ的T细胞和CD8+T细胞是疫苗发挥抗肿瘤免疫的主要效应细胞，MDSCs(Gr-l+CD11b+)细胞是肿瘤免疫的抑制性细胞。分离小鼠的脾脏淋巴细胞，体外经过E749-57肽和混合的E7肽刺激，利用ELISPOT和流式细胞术检测分泌IFN-γ的T细胞和CD8+T细胞的水平，ELISPOT检测显示，IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG疫苗接种的小鼠分泌IFN-γ的脾脏淋巴细胞水平明显增加(图24中A)。流式细胞仪分析表明，与PBS对照组相比，IM-CS-NPs/E7和IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG组比IM-CS-NPs和IM-CS-NPs/ATP@ALG组的脾细胞中免疫抑制性MDSCs(Gr-l+CD11b+)的频率更明显降低，IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG组呈现最明显的抑制(图24中B)。相反，脾细胞无论是特异性肽E749-57还是混合E7肽刺激，IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG仍然诱发了最显著的CD8+T细胞水平(图24中C)。总体而言，肿瘤抑制的结果和抗肿瘤细胞免疫的反应与2-3mm肿瘤的小鼠相似，这清楚地表明，更大的肿瘤给纳米疫苗带来了更大的挑战，IM-CS-NPs/E7/ATP@ALG比其他纳米疫苗制剂诱发了更显著的抗肿瘤免疫力和效果。
综上，本申请利用米托蒽醌和姜黄素的混合物在体外诱导TC-1肿瘤细胞发生ICD，提取ICD的肿瘤细胞膜；制备荷载HPV16E744-62抗原肽的壳聚糖(CS)包被的聚乳酸共聚物(PLGA)纳米颗粒(NPs)——壳聚糖PLGA纳米颗粒(CS-NPs/E7)；用制备的ICD肿瘤细胞膜(IM)进行CS-NPs/E7的包裹装饰；进一步，将IM装饰的纳米颗粒与三磷酸腺苷(ATP)一起包含于海藻酸钠(ALG)水凝胶溶液，获得所述纳米颗粒疫苗IM-CS-PLGA-E7/ATP@ALG。肿瘤细胞的ICD被成功诱导，其特征是“EatMe”信号钙网蛋白(CALR)和热休克蛋白(HSPs)的表达，高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和“FindMe”信号ATP和的释放。纳米颗粒形态与表面电位，ICD膜与E7的荧光共定位，以及纳米颗粒中膜蛋白成分的SDS-PASG分析，表明抽提的ICD膜成功包裹于荷载了E7的PLGA纳米颗粒表面，在Ca2 +存在情况下，纳米颗粒疫苗形成水凝胶。
体外实验显示，该纳米颗粒疫苗在体外明显刺激了DCs细胞的迁移、抗原摄取和成熟标记物CD80，CD86，MHC-I与MHC-II的表达，及炎性因子IL-1β，IL-6，IFN-γ与TNF-α的释放，且具备溶酶体逃逸的能力。在体内促进了肿瘤抗原在注射部位的保留和缓释，以及在淋巴结的靶向积累。在皮下移植的TC-1肿瘤模型中，证实ICD膜的包裹显著增强了PLGA纳米颗粒疫苗的抗肿瘤效应，IM-CS-PLGA-E7/ATP@ALG的治疗性免疫面对2-3mm及5-6mm大的肿瘤都激发了强有力的抗肿瘤免疫应答，表现为已建立的肿瘤的进一步生长受到明显抑制，抗肿瘤的表达IFN-γ的脾细胞和CD8+T细胞水平显著增加，而脾细胞中免疫抑制的MDSCs(Gr-l+CD11b+)的水平降低。该策略具有克服肿瘤免疫抑制和逃避的潜力。
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.一种水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤1，壳聚糖PLGA纳米颗粒的制备：
分别配置聚乙烯醇溶液和壳聚糖溶液，混合溶解后得到壳聚糖溶液；称取PLGA纳米颗粒，加入二氯甲烷搅拌，至PLGA纳米颗粒完全溶解，得到PLGA纳米颗粒油相；
将PBS溶解的HPV16E744-62肽加入PLGA纳米颗粒油相中，超声形成初乳液；将所述壳聚糖溶液加入初乳液中，超声固化PLGA纳米颗粒，形成第二乳液；蒸发去除所述第二乳液中的二氯甲烷，离心弃上清、收集沉淀，即制备得到壳聚糖PLGA纳米颗粒；
步骤2，ICD肿瘤细胞膜的制备：
利用米托蒽醌和姜黄素联合处理肿瘤细胞，使肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，刮取下处理后肿瘤细胞并进行细胞破碎处理，收集细胞膜碎片，即为ICD肿瘤细胞膜；
步骤3，水凝胶嵌入ICD细胞膜包裹纳米颗粒的制备：
首先，将步骤2制备得到的ICD肿瘤细胞膜通过多孔聚碳酸酯膜形成的癌细胞囊泡；然后，将癌细胞囊泡与步骤1制备得到的壳聚糖PLGA纳米颗粒一起通过孔径更小的多孔聚碳酸酯膜，得到膜包裹的纳米颗粒；
随后，将海藻酸钠水凝胶溶解在水中，同时加入三磷酸腺苷，得到水凝胶溶液；
将所述水凝胶溶液与膜包裹的纳米颗粒混合，当该混合物在体外或体内遇到钙离子时，即形成水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1利用双乳液蒸发法制备所述壳聚糖PLGA纳米颗粒，具体步骤包括：
(1)分别配置聚乙烯醇溶液、壳聚糖溶液，低温下磁力搅拌过夜至聚乙烯醇完全溶解，通过滤膜过滤后得到第二水相——壳聚糖溶液，低温保存；
(2)称取PLGA纳米颗粒，放入烧杯加入二氯甲烷，磁力搅拌直至PLGA纳米颗粒完全溶解，得到PLGA纳米颗粒油相；
(3)用PBS溶解HPV16E744-62肽获得第一水相，将第一水相加入(2)所述PLGA纳米颗粒油相中，超声、充分乳化形成初乳液；
(4)向所述初乳液中加入(1)获得的第二水相，超声固化PLGA纳米颗粒，形成第二乳液；
(5)将所述第二乳液置于磁力搅拌器上，并于通风橱中磁力搅拌以充分蒸发二氯甲烷；
(6)低温离心处理，弃上清、收集沉淀，即为壳聚糖PLGA纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中采用TC-1细胞制备所述ICD肿瘤细胞膜，具体步骤包括：
当细胞培养瓶里的细胞密度达90％时，加入2～5μmol/L米托蒽醌与40～60μmol/L姜黄素联合处理TC-1细胞12～24h后，用细胞刮子刮下细胞，收集细胞离心、弃上清，PBS洗涤后，向细胞中加入苯甲基磺酰氟，放置冰上10～15min，将冰浴后的细胞在液氮和室温反复冻融3～4次，紧接着通过简单超声使细胞进一步破碎，直到细胞破碎的程度达80％以上，再进行4℃，5000g离心15min，收集上清液至离心管中，随后4℃，15000g离心45min，以沉淀细胞膜碎片，即为ICD肿瘤细胞膜，存于-80℃后续备用。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中，将步骤2制备得到的ICD肿瘤细胞膜通过400nm多孔聚碳酸酯膜形成的癌细胞囊泡；然后，将癌细胞囊泡与步骤1制备得到的壳聚糖PLGA纳米颗粒一起通过200nm的多孔聚碳酸酯膜，得到膜包裹的纳米颗粒。
5.一种水凝胶包埋的纳米颗粒疫苗，其特征在于，所述纳米颗粒疫苗由如权利要求1～4所述制备方法制备得到。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN117599158A (zh) * | 2024-01-24 | 2024-02-27 | 深圳湾实验室 | 包含细胞膜囊泡的3d打印疫苗、其制备方法及应用 |
| CN117731777B (zh) * | 2023-12-21 | 2024-05-31 | 海南医学院 | 一种生物模拟纳米级药物传递系统及其制备方法和应用 |
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2023
- 2023-05-26 CN CN202310604186.0A patent/CN116763907A/zh active Pending
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