CN112569207A - 一种载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗及其制备方法和用途 - Google Patents

一种载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属生物制药技术领域，涉及一种载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗及其制备方法和用途。本发明基于树突状细胞(DC)吞噬抗原的特点，制备一种仿生纳米制剂利用巨胞饮途径增加DC对疫苗的摄取，促进DC的成熟和抗原呈递，改善体内的免疫应答效果的仿生纳米肿瘤疫苗，该纳米疫苗以生物可降解材料作为纳米内核包载疏水性的免疫佐剂，以脂质作为外壳负载肿瘤相关抗原肽，并在脂质上修饰载脂蛋白，从而高效激活DC利用巨胞饮途径吞噬纳米疫苗。本纳米制剂疫苗适于针对一种或多种抗原或佐剂预防或治疗肿瘤。

Description

一种载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗及其制备方法和用途
技术领域
本发明属生物制药技术领域，涉及一种载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗及其制备方法和用途。该仿生纳米疫苗具有核壳结构，主要包括内层的纳米内核和外层的脂质结构部分，采用载脂蛋白修饰于仿生纳米疫苗表面：该仿生纳米疫苗能高效激活DC的巨胞饮途径，促使DC大量摄取纳米疫苗。
背景技术
恶性肿瘤是世界公认的对人类健康危害最为严重的疾病之一，本领域科学家们对此进行了大量的研究，并取得了一定的成果，却仍未能达到理想的效果，尤其对于肿瘤的转移及复发，迄今，临床实践中仍需要更良好的治疗干预手段。随着免疫学及生命科学的发展，肿瘤的免疫治疗作为一种新的治疗手段，为肿瘤的治疗及预防带来新希望。研究显示，肿瘤的生长及转移是由于机体免疫抑制及肿瘤免疫逃逸造成的，而肿瘤免疫治疗即是通过激活患者自身的免疫系统靶向杀伤肿瘤细胞，与传统治疗手段相比，免疫治疗具有可产生持久的抗肿瘤效果，降低肿瘤的转移及复发的优势，在肿瘤治疗领域展现出良好的应用前景，成为继手术治疗、放疗、化疗后的第四种重要手段。
据研究报道，肿瘤免疫治疗可根据其是否包含针对肿瘤的系统免疫激活，或改变局部免疫状态，分为系统、局部免疫治疗两种方式；其中，系统免疫治疗包括细胞因子疗法，肿瘤疫苗，过继T细胞疗法(ACT)；局部免疫疗法是指调节肿瘤微环境(TME)中免疫抑制状态的治疗手段，包括免疫检查点阻断剂及小分子抑制剂；在肿瘤的实践治疗中，与单一治疗手段相比，联合系统、局部两种免疫疗法，可发挥协同作用，显示出更强的治疗效果。
现有技术公开了Ipilimumab单抗可通过靶向Treg细胞表面CTLA-4，阻断Treg免疫抑制作用，从而激活抗肿瘤免疫功能；之后，另一种免疫检查点阻断剂PD-1，PD-L1单克隆抗体也被批准用于黑色素瘤及非小细胞肺癌的治疗中，并取得了很好的治疗效果；但是，肿瘤细胞具有高度异质性，免疫检查点与其配体的表达也具有可变性，因此仅依赖免疫检查点抑制剂不足以完全达到治疗效果。
近年来，肿瘤疫苗成为肿瘤免疫治疗的研究热点，其与免疫检查点抑制剂的联合使用，在肿瘤的治疗研究中初见效果。肿瘤疫苗通常是由肿瘤相关抗原及可刺激机体产生免疫反应的佐剂两部分构成，佐剂作为一种“危险信号”可刺激树突状细胞(DCs)的成熟，之后DCs将疫苗中的肿瘤抗原呈递给MHC分子，进而激活T细胞抗肿瘤反应。目前已上市和正在开发的中国的肿瘤疫苗大致可分为四类，包括：全细胞疫苗、肿瘤多肽疫苗、基因工程疫苗和抗体肿瘤疫苗；所述在临床上已取得了一定疗效，但多数疫苗的临床试验失败，其原因主要归结为：免疫原性低；抗原和佐剂不能高效的迁移至淋巴结，产生抗原特异性的细胞免疫反应；存在免疫耐受问题，等，
针对以上问题和基于现有技术的现状和基础，本申请的发明人为增强纳米制剂靶向性、提高DC对其摄取量及增强免疫治疗效果，拟提供一种载脂蛋白修饰的仿生纳米递释系统，尤其涉及一种载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗及其制备方法和用途。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的现状和基础，提供一种载脂蛋白修饰的仿生纳米递释系统，尤其涉及一种载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗及其制备方法和用途。本申请的仿生纳米肿瘤疫苗能增强纳米制剂靶向性、提高DC对其摄取量及增强免疫治疗效果，
本发明提供的一种载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗，其特征在于，共载肿瘤相关抗原肽和佐剂，能激活DC的巨胞饮途径，高效促进DC细胞的成熟和抗原呈递，提高免疫应答的响应。
本发明所述的载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗是一种具有核壳结构的纳米级仿生粒子，由生物可降解材料构成的纳米内核和脂质外壳通过疏水作用相结合，采用载脂蛋白修饰于仿生纳米疫苗表面。
本发明中，核壳结构主要包括内层的纳米内核和外层的脂质结构部分，内层的纳米内核是一种能够包载疏水性免疫佐剂的纳米颗粒；外层的脂质结构是一种模拟细胞膜流动性的材料，能够负载肿瘤相关抗原肽，其特点是能高效激活DC的巨胞饮途径，促使DC大量摄取纳米疫苗。
本发明中，采用的载脂蛋白为重组人ApoE3蛋白，修饰于仿生纳米疫苗表面。
本发明基于纳米材料其灵活可调的理化性质被引入肿瘤疫苗设计领域；以及基于经实践证明的纳米肿瘤疫苗的优势：(1)共递送抗原及佐剂；纳米材料可同时载负肿瘤抗原及佐剂，实现共递送，防止抗原及佐剂在体内的降解，提高DCs摄取效率，为进一步激活强烈的T细胞反应提供有力保障；(2)佐剂效应，某些纳米材料本身具有调节细胞、体液免疫反应的作用，因而可以促进抗原递呈，甚至代替佐剂激活免疫反应；(3)淋巴结靶向作用；等；且，所述纳米粒能借助其天然尺度效应，在皮下注射后可随淋巴管进入淋巴结，增加淋巴结中DCs对纳米制剂的摄取，等等，构建了一种载脂蛋白修饰的仿生纳米递释系统，其包括：联合乳化溶媒蒸发法及薄膜水化法构建磷脂聚合物复合纳米粒，将小分子Toll样受体激动剂R837包载于PLGA内核中，可在被DC细胞摄取后刺激其成熟；通过自组装方式制备载脂蛋白修饰的仿生纳米制剂，并将模型抗原肽通过与一段强亲脂性α螺旋肽的连接高效结合至制剂表面。该制剂可激活DC的巨胞饮途径，促使DC大量摄取该纳米疫苗，促进DC的成熟和抗原呈递。
本发明的该递释系统可作为一种肿瘤疫苗，尤其是载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗，在皮下注射后，该纳米疫苗可靶向淋巴结内的DC，激活固有免疫及适应性免疫，可应用于肿瘤复发、转移的预防；与免疫检查点疗法，αPD-1抗体联合使用，有望发挥协同作用，增强免疫应答，用于原位肿瘤的治疗。
本发明的仿生纳米肿瘤疫苗中，采用的生物可降解材料的纳米内核选自聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)中的一种；所述脂质外壳选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰基胆碱、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰亚油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二辛酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱和(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺中的一种。
在各种实施方案中，本发明所采用的生物可降解材料的纳米内核选自PLGA，其中的脂质外壳选自二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱。
本发明所采用的肿瘤相关抗原肽为α螺旋肽(氨基酸序列为Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD)连接的肿瘤相关抗原肽段，利用α螺旋肽将抗原肽锚定在脂质外壳上。
作为代表性的肿瘤相关抗原肽，本发明所采用的肿瘤相关抗原肽为αOVA，即抗原肽OVA与α螺旋肽连接(氨基酸序列为Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-SIINFEKL)。
本发明所采用的佐剂为免疫佐剂，能与抗原一起注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。
本发明所采用的具有免疫刺激作用的佐剂选自R837和R848中的一种，属于Toll样受体激动剂，可以激活B细胞和DC，促进Th1型免疫反应的发生。
在各种实施方案中，本发明所采用的免疫佐剂为R837。R837作为Toll样受体7激动剂已被FDA批准，将其包载于PLGA内核中，一方面能够实现佐剂的缓释作用，另一方面能够与αOVA抗原肽段共同被DC有效摄取。
本发明所采用的生物可降解材料的纳米内核平均粒径小于100nm，结合脂质外壳后的纳米疫苗平均粒径在100nm左右。
本发明描述了该纳米疫苗的具体制备方案，并提供了该仿生纳米疫苗体内外免疫激活的试验结果，以及联合其他药物的药效学评价结果。
本申请的载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗，制备工艺简单，易于重现，所采用的材料均具有良好的生物相容性，具有一定的临床转化价值。
本申请的载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗中，脂蛋白作为天然纳米载体，体内稳定性、生物相容性好，同时在一些细胞中，高密度脂蛋白仿生纳米制剂可通过激活巨胞饮通路而被大量摄取，因此在药物靶向递释中有很好的应用前景。
附图说明：
图1 R837-αOVA-ApoE3-HNP的表征，其中，
(A)R837-NP、R837-HNP和R837-αOVA-ApoE3-HNP的粒径分布，
(B)R837-NP、R837-HNP和R837-αOVA-ApoE3-HNP的平均粒径，
(C)R837-NP、R837-HNP和R837-αOVA-ApoE3-HNP的Zeta电位，
(D)透射电镜照片(a)R837-NP，(b)R837-HNP，(c)R837-αOVA-ApoE3-HNP。
图2 ApoE3的修饰促进BMDC摄取纳米粒，其中，
(A)流式细胞仪测定BMDC细胞摄取cou6标记的纳米制剂的直方图，
(B)BMDC细胞摄取cou6标记的纳米制剂的平均荧光强度。数据以平均值±SD(n＝3)进行分析，***P＜0.001，
(C)不同浓度下，BMDC摄取纳米制剂的平均荧光强度。数据以平均值±SD(n＝3)表示，
(D)不同孵育时间下，BMDC摄取纳米制剂的平均荧光强度。数据以平均值±SD(n＝3)表示。
图3 ApoE3修饰纳米粒在BMDC上的摄取机制研究，其中，
(A)BMDC细胞与荧光制剂及内吞标记物共孵育2h后，共聚焦荧光图片，
(B)BMDC细胞与荧光制剂及内吞标记物共孵育2h后，共定位系数测定结果，数据以平均值±SD(n＝3)表示，
(C)定量评价多种摄取通路抑制剂对BMDC摄取cou6-αOVA-ApoE3-HNP的影响。数据以平均值±SD(n＝3)表示。***P＜0.001。
图4 R837-αOVA-ApoE3-HNP诱导BMDC的成熟和抗原呈递，其中，
(A)不同成分及制剂对BMDC表面成熟标记物CD80和CD86表达情况影响，
(B)定量评价不同成分及制剂对BMDC表面CD80和CD86表达情况影响，数据以平均值±SD(n＝3)表示。*P＜0.05，***P＜0.001，
(C)不同成分及制剂对BMDC表面成熟标记物MHC II表达情况影响，
(D)定量评价不同成分及制剂对BMDC表面MHC II表达情况影响。数据以平均值±SD(n＝3)表示。*P＜0.05，***P＜0.001，
(E)共聚焦显微镜下模型抗原在BMDC细胞的亚细胞器定位情况，
(F)成像流式分析纳米疫苗促进BMDC抗原递呈效果，数据以平均值±SD(n＝3)表示，***P＜0.001。
图5 ApoE3修饰的仿生纳米粒皮下注射后活体成像图，其中，
(A)活体荧光成像分析DiR-αOVA-HNP和DiR-αOVA-ApoE3-HNP注射后，不同时刻体内分布情况，
(B)DiR-αOVA-HNP和DiR-αOVA-ApoE3-HNP注射48h后，体外引流淋巴结成像图，
(C)半定量分析DiR-αOVA-HNP和DiR-αOVA-ApoE3-HNP注射后的体外引流淋巴结荧光值。数据以平均值±SD(n＝4)表示，**P＜0.01，
(D)αOVA(FITC)-HNP和αOVA(FITC)-ApoE3-HNP注射48h后，体外引流淋巴结成像图，
(E)半定量分析αOVA(FITC)-HNP和αOVA(FITC)-ApoE3-HNP注射后的体外引流淋巴结荧光值。数据以平均值±SD(n＝4)表示，*P＜0.05。
图6 R837-αOVA-ApoE3-HNP介导C57BL/6小鼠体内适应性免疫系统的激活，其中，
(A)R837-αOVA-ApoE3-HNP免疫过后的C57BL/6小鼠外周血中OVA特异性T细胞数量流式细胞图，
(B)R837-αOVA-ApoE3-HNP免疫过后的C57BL/6小鼠脾脏中的IFN-γ+CD8+T细胞流式细胞图，
(C)图A中的OVA特异性的CD8+T细胞测定定量结果。数据以平均值±SD(n＝3)表示，**P＜0.01，***P＜0.001，
(D)图B中的IFN-γ+CD8+T细胞测定定量结果。数据以平均值±SD(n＝3)表示，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，
(E)R837-αOVA-ApoE3-HNP免疫过后，小鼠脾脏体外抗原刺激培养72h后，IFN-γ的定量分析，数据以平均值±SD(n＝3)表示，*P＜0.05，
(F)R837-αOVA-ApoE3-HNP免疫过后，小鼠脾脏体外抗原刺激培养72h后，IL-4的定量分析。
图7 R837-αOVA-ApoE3-HNP免疫后的小鼠体内抗肿瘤效果，其中，
(A)制剂在小鼠肺转移模型上的抑制实验结果，
(B)小鼠肺转移病灶的数量分析，数据以平均值±SD(n＝3)进行分析，*p＜0.05，***p＜0.001，
(C)B16-OVA小鼠皮下瘤模型的给药方案示意图，
(D)肿瘤生长曲线图。数据以平均值±SD(n＝6)表示。
具体实施方式：
实施例1：R837-αOVA-ApoE3-HNP的制备和表征
通过乳化溶媒蒸发法制备包载R837的PLGA纳米粒；称取20mg R837溶于10mL DMSO中，制得R837储备液；量取50μL R837储备液，950μL二氯甲烷于5mL EP管中，混合后沿壁缓慢加入2mL 1％的胆酸钠溶液，0℃水浴探头超声2.4min，超声功率为220W。将所得乳剂加入8mL 0.5％的胆酸钠溶液中，充分搅拌分散后，置于旋转蒸发仪上去除有机溶剂二氯甲烷；将该纳米粒溶液在4℃条件下14000rpm，离心45min，弃上清，沉淀用水重悬得到包载R837的纳米核心(R837-NP)；称取2mg DMPC置于250mL圆底烧瓶中，加入4mL三氯甲烷，置旋转蒸发仪上抽真空1h，水浴温度为37℃，制备得到磷脂薄膜；加入制备的R837-NP溶液4mL(含PLGA10mg)，继续37℃水浴条件下震摇至薄膜水化脱落，转移至EP管中，冰浴探头超声1min，160W，得到磷脂聚合物复合纳米粒R837-HNP；将200μg αOVA，400μg的重组ApoE3蛋白，加入制备的R837-HNP溶液中，轻柔混合，置于摇床上，120rpm，37℃孵育48h，置于截留分子量为100kDa的超滤管中，超滤洗涤三次，去除未结合的游离蛋白及抗原，所获得的溶液即为ApoE3修饰的仿生纳米递释系统R837-αOVA-ApoE3-HNP，采用马尔文粒径测定仪测定纳米粒的粒径，透射电子显微镜观察其形态；
结果如图1所示：图1显示，R837-NP、R837-HNPR837-αOVA-ApoE3-HNP和三种制剂的粒径分别为80.87、91.37和98.48nm，均在100nm以下，PDI在0.10～0.22之间，具有较窄的分布宽度；R837-HNP比R837-NP直径大12nm左右，表明磷脂聚合物纳米粒得到成功制备；由于磷脂成分DMPC净电荷为0，重组ApoE3蛋白带负电，最终制备得到的递释系统R837-NP、R837-HNP和R837-αOVA-ApoE3-HNP电位分别为-34.30mV、-20.23mV及-24.93mV；
如图1所示，R837-HNP，R837-αOVA-ApoE3-HNP具有形态完整的核壳结构，粒径分布均一；载R837的聚合物内核粒径在70nm左右，从R837-HNP磷脂聚合物复合纳米粒电镜图中看到，在聚合物内核表面，均匀覆盖着厚度为6nm左右的磷脂分子层，证明制剂成功构建；ApoE3的修饰及模型抗原肽的组装对纳米制剂的形态并未造成明显影响，仿生纳米粒R837-αOVA-ApoE3-HNP保持了规整的核壳结构。
实施例2：ApoE3的修饰促进BMDC摄取纳米粒
制备包载荧光染料香豆素6(cou-6)的制剂，将NP制备过程中的R837替换为cou6，按10mg PLGA，10μg cou-6的比例加入，其余制备方法同实施例1；取培养6天的BMDC细胞，转移至流式管中，2000rpm离心弃上清，加入不同纳米制剂的培养液重悬混匀，几组纳米制剂浓度以cou6计，均为50ng/mL，置于37℃摇床孵育30min，离心弃上清，PBS洗一次，用100μLCD11c抗体溶液重悬，冰上孵育30min，重悬流式细胞仪检测D11c阳性细胞摄取cou6荧光强度值；
考察时间和浓度：BMDC细胞，加入不同浓度的纳米制剂溶液重悬混匀，37℃培养2h后流式细胞仪测定BMDC摄取值；同理，测定cou6浓度为100ng/mL时，孵育不同时间下制剂的摄取值；
结果显如图2所示，cou6-αOVA-ApoE3-HNP组荧光强度最强，分别为cou6-NP、cou6-HN、cou6-αOVA-HNP、cou6-ApoE3-HNP制剂组摄取荧光强度的3.68、3.06、2.36和1.14倍，修饰了ApoE3的cou6-ApoE3-HNP和cou6-αOVA-ApoE3-HNP两组制剂，摄取值明显高于其他组，表明载脂蛋白ApoE3可促进BMDC细胞摄取纳米粒；
在不同浓度及孵育时间条件下，流式细胞仪测定cou6-NP、cou6-HNP、cou6-αOVA-HNP、cou6-ApoE3-HNP以及cou6-αOVA-ApoE3-HNP在BMDC细胞上的摄取情况如图2所示，ApoE3修饰的仿生纳米递释系统的细胞摄取值明显高于其它制剂组，且摄取值随浓度的升高及摄取时间的延长而增加，表明BMDC摄取ApoE3修饰的纳米制剂为浓度及时间依赖性；
综上，ApoE3的修饰可促进BMDC摄取纳米粒，有利于BMDC摄取负载抗原的纳米疫苗。
实施例3：ApoE3修饰的纳米粒在BMDC上的摄取机制研究
为进一步探究BMDC对ApoE3修饰的仿生纳米制剂摄取机制，选用巨胞饮通路标记物FITC-dextran，小窝蛋白介导的内吞标记物AF647-Cholera toxin，网格蛋白介导的内吞标记物TexasRed-Transferrin，与荧光制剂共培养，考察其转运通路；包括：BMDC加入包载荧光染料的ApoE3修饰的仿生纳米制剂，以及荧光标记的内吞标记物，Hochest33258后，倒置荧光显微镜下定性观察纳米制剂与内吞标记物共定位情况，并计算共定位系数；
使用多种摄取通路抑制剂在BMDC细胞进行摄取抑制实验，考察BMDC细胞摄取ApoE3修饰的纳米制剂机制，取BMDC细胞，加入500μL各种摄取抑制剂溶液，37℃孵育0.5h后，加入500μL培养基稀释的cou6-αOVA-ApoE3-HNP溶液，继续孵育1h，流式检测BMDC对制剂的摄取情况，
结果显示：如图3所示，大胞饮通路抑制剂阿米洛利及其衍生物EIPA显著抑制BMDC细胞对仿生纳米制剂的摄取，摄取抑制率分别为54.9％及75.5％，该两种抑制剂可抑制巨胞饮体的形成，同时对其它内吞途径无影响，其次对制剂摄取影响较大的还有穴样凹陷通路(小窝蛋白介导)抑制剂染料木黄酮，包被凹陷通路(网格蛋白介导)抑制剂氯丙嗪，摄取抑制率为分别37.6％和41.7％，说明纳米粒可通过受体介导的内吞进入细胞，能量组合抑制剂可明显抑制纳米制剂的摄取，表明BMDC摄取纳米制剂为能量依赖型，所述结果BMDC对ApoE3修饰的纳米制剂摄取为能量依赖型，主要通过巨胞饮途径摄取，同时也存在小窝蛋白、网格蛋白介导的内吞作用；
巨胞饮通路标记物FITC-Dextran与包载DiD的纳米制剂明显共定位，而小窝蛋白、网格蛋白介导的内吞标记物与纳米制剂基本不重合，共定位相关系数计算结果也显示，纳米制剂与巨胞饮通路标记物FITC-Dextran共定位相关系数为0.66，与其它两种标记物共定位相关系数小于0.2；
综上，BMDC主要通过巨胞饮途径摄取ApoE3修饰的仿生纳米递释系统。
实施例4：R837-αOVA-ApoE3-HNP诱导BMDC的成熟和抗原呈递
收集BMDC细胞，将细胞分别用含αOVA，ApoE3，αOVA-ApoE3-HNP、ree(R837+αOVA)、R837-αOVA-HNP、R837-αOVA-ApoE3-HNP，LPS的培养基重悬，接种于24孔板中继续培养24h，未经处理及LPS处理组分别作为阴性、阳性对照，24h后，收集各组细胞，离心用PBS清洗两次后各分为两份，一份加入CD11c、CD 80及CD86抗体，另一份加入CD11c及MHCII抗体，室温条件下避光孵育30min，流式细胞仪检测CD11c阳性细胞表明成熟标记物表达量；
进一步观察抗原呈递情况，选用FITC标记的模型抗原肽αOVA为原料，制得αOVA(FITC)-ApoE3-HNP及αOVA(FITC)-HNP。细胞用αOVA(FITC)-ApoE3-HNP及αOVA(FITC)-HNP孵育后，用Lyso Tracker Red DND-99(Invitrogen)标记溶酶体，Hoechst 33258染核后在激光共聚焦显微镜下观察；
定量测量抗原呈递情况，在制剂孵育后，用SIINFEKL/H-2Kb抗体孵育，ImageStreamXMark II量化成像分析流式细胞仪检测；
结果如图4所示，单纯游离抗原αOVA和ApoE3无诱导DC成熟作用，未负载佐剂的纳米载体αOVA-ApoE3-HNP本身可发挥一定佐剂效应，激活DC细胞，游离R837作为一种有效的免疫佐剂，直接作用于DC细胞可诱导其成熟，与游离抗原及佐剂的组合相比，采用ApoE3修饰的、抗原及佐剂共包载的纳米递释系统处理DC细胞，能达到与阳性对照组LPS相当的、强烈的诱导DC成熟作用；
αOVA(FITC)-ApoE3-HNP制剂组在摄取6h后，模型抗原与溶酶体高度共定位，表明整个纳米粒通过巨胞饮通路摄取进入了DC细胞；24h的激光共聚焦结果显示，抗原均匀分布于DC细胞膜表面，形成环状结构，表明抗原肽在经溶酶体加工后，可以从细胞内转移至细胞膜表面，此时抗原肽可能已经与MHC分子形成了复合物，为下一步刺激T细胞免疫反应做好准备；相反，未经ApoE3修饰的纳米递释系统αOVA(FITC)-HNP，在DC细胞内摄取量低，24h时，细胞表面仅有很少的抗原肽分布，不足以激活下游的T细胞免疫反应；
检测抗原呈递结果显示，游离抗原所产生的荧光信号最弱，其次为游离抗原与R837的组合处理，尽管佐剂的加入可促进DC细胞成熟，但可能由于抗原的摄取值过低，最终并不能有效的提呈在DC细胞表面；共包载抗原及佐剂的纳米递释系统凭借其制剂优势，可增强抗原与MHC分子复合物的形成，而ApoE3的修饰更是借助其高效的摄取，诱导DC细胞成熟，显示出强烈的促进抗原呈递功能；
综上，R837-αOVA-ApoE3-HNP可有效诱导BMDC的成熟，并促进抗原呈递。
实施例5：ApoE3修饰的仿生纳米粒有效迁移至淋巴结
观察纳米制剂在小鼠体内的分布，构建包载荧光探针DiR、αOVA(FITC)的纳米制剂DiR-αOVA-HNP，DiR-αOVA-ApoE3-HNP，αOVA(FITC)-HNP及αOVA(FITC)-ApoE3-HNP；足垫注射后，采用活体成像技术观察不同时刻纳米制剂向引流淋巴结转移、蓄积情况；分别于48h和24h时分离引流淋巴结，定量测定DiR及FITC标记的αOVA在淋巴结的蓄积量；
结果如图5所示，与DiR-αOVA-HNP相比，ApoE3修饰的纳米递释系统在注射后4h即可在腋窝淋巴结处观察到强荧光信号，并且集中于淋巴结区域，24h时蓄积量最大，48h时荧光强度依然较高；相反，DiR-αOVA-HNP在注射后向引流淋巴结迁移速度较慢，在腋窝处的分布较为分散，24h及48h荧光强度较弱；
将DiR标记的DiR-αOVA-HNP，DiR-αOVA-ApoE3-HNP，以及FITC标记的αOVA(FITC)-HNP，及αOVA(FITC)-ApoE3-HNP经足垫注射后，48h和24h分离引流淋巴结，DiR及FITC含量定量结果显示，ApoE3修饰的纳米制剂在引流淋巴结的蓄积量相比普通制剂增加一倍以上；
综上表明，ApoE3修饰的仿生纳米粒可有效迁移至引流淋巴结。
实施例6：R837-αOVA-ApoE3-HNP诱导强烈的T细胞免疫反应
C57BL小鼠皮下注射不含抗原及佐剂的纳米材料组α-ApoE3-HNP、游离药物组free(R837+OVA)、纳米疫苗R837-αOVA-HNP及ApoE3修饰的纳米疫苗R837-αOVA-ApoE3-HNP，按每只每次15μg OVA，14μg R837的剂量计算给药，以注射PBS溶液组作为阴性对照，收集小鼠外周血测定抗原特异性T细胞数量，并分离小鼠脾脏淋巴细胞，进行T细胞IFN-γ分泌能力检测和IFN-γ、IL-4细胞因子的检测；
结果如图6所示，与游离药物组相比，本纳米疫苗明显增加抗原特异性CD8+T细胞所占比例，R837-αOVA-ApoE3-HNP更是将其比例增加了7.56倍，表明该疫苗在肿瘤的预防及治疗中有良好的应用前景；ApoE3修饰的纳米疫苗R837-αOVA-ApoE3-HNP治疗组IFN-γ分泌性T细胞所占百分比最高，分别为游离药物组及普通纳米疫苗组的4.18和3.71倍，分泌的IFN-γ显著增加，而IL-4细胞因子并无显著改变；综上表明，R837-αOVA-ApoE3-HNP可诱导强烈的T细胞免疫应答。
实施例7：R837-αOVA-ApoE3-HNP联合αPD-1抗体的抗肿瘤疗效
建立小鼠肺转移模型，并考察纳米疫苗抗肿瘤转移预防效果；20天内使用各组制剂免疫小鼠3次，20天后每只小鼠按照5×105个B16OVA细胞尾静脉进行注射，建立小鼠肺转移模型；20天后取小鼠肺部进行观察，记录肺转移病灶的数量；构建小鼠原位瘤治疗模型，给予纳米疫苗和αPD-1抗体(100μg/只)，每三天用游标卡尺测量肿瘤长径a和短径b，计算肿瘤体积大小V＝0.5*a*b2；
结果如图7所示，单纯纳米载体材料不具有抗肿瘤转移效果，游离抗原及佐剂的组合，仅能抑制39％肿瘤转移结节，而纳米疫苗R837-αOVA-HNP，及R837-αOVA-ApoE3-HNP均明显抑制肺转移灶的形成，R837-αOVA-ApoE3-HNP处理的6只小鼠中，仅有两只出现了肺转移结节，数据表明ApoE3修饰的仿生纳米疫苗，在预防肿瘤转移领域具有巨大潜力；在小鼠黑色素瘤原位模型上的实验结果表明，与未治疗组相比，游离抗原、佐剂作为肿瘤疫苗，对原位瘤的生长几乎无抑制作用，皮下瘤生长迅速；同样，单纯给予纳米疫苗，虽然在第18天前均能较好的控制肿瘤的发展，但在此之后，肿瘤又呈现快速生长，这可能是由于此时肿瘤以形成免疫抑制微环境，单纯给予疫苗不能激活肿瘤微环境中的免疫反应；相比而言，将纳米疫苗与αPD-1抗体联合使用，几乎可以完全控制肿瘤的增长，表明本申请的纳米疫苗可通过与免疫检查点抑制剂联合使用，应用于原位瘤的治疗中。

Claims (10)

1.一种载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗，其特征在于，该疫苗共载肿瘤相关抗原肽和佐剂；所述佐剂为免疫佐剂；
所述疫苗为有核壳结构的纳米级仿生粒子，由生物可降解材料构成的纳米内核和脂质外壳通过疏水作用相结合，采用载脂蛋白修饰于仿生纳米疫苗表面；
所述的核壳结构，主要包括内层的纳米内核和外层的脂质结构部分，内层的纳米内核是一种能包载疏水性免疫佐剂的纳米颗粒；外层的脂质结构是一种模拟细胞膜流动性的材料，能负载肿瘤相关抗原肽；
所述的仿生纳米肿瘤疫苗，能激活DC的巨胞饮途径，高效促进DC细胞的成熟和抗原呈递，提高免疫应答的响应。
2.如权利要求1所述的载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗，其特征在于，所述载脂蛋白为重组人ApoE3蛋白。
3.如权利要求1所述的载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗，其特征在于，所述的生物可降解材料的纳米内核选自聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)中的一种；所述脂质外壳选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、蛋黄磷脂酰基胆碱、硬脂酰油酰磷脂酰胆碱、硬脂酰亚油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二辛酰磷脂酰胆碱、二己酰磷脂酰胆碱和(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺中的一种。
4.如权利要求3所述的载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗，其特征在于，所述的生物可降解材料的纳米内核选自PLGA。
5.如权利要求3所述的载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗，其特征在于，所述的脂质外壳选自二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱。
6.如权利要求1所述的载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗，其特征在于，所述的肿瘤相关抗原肽为α螺旋肽连接的肿瘤相关抗原肽段，该α螺旋肽的氨基酸序列为Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD。
7.如权利要求6所述的载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗，其特征在于，所述的肿瘤相关抗原肽为抗原肽OVA与α螺旋肽连接的抗原肽αOVA，其氨基酸序列为Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-SIINFEKL。
8.如权利要求1所述的载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗，其特征在于，所述的免疫佐剂为Toll样受体激动剂，选自咪喹莫特R837或瑞喹莫德R848。
9.如权利要求1所述的载脂蛋白修饰的仿生纳米肿瘤疫苗，其特征在于，所述的生物可降解材料的纳米内核平均粒径小于100nm，结合脂质外壳后的纳米疫苗平均粒径为100nm左右。
10.如权利要求1-9中任一项所述的载脂蛋白修饰的纳米肿瘤疫苗在制备预防或治疗肿瘤制剂中的用途，其中，所述的载脂蛋白修饰的纳米肿瘤疫苗单独或与其他药物联合应用。
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