CN113786481A - 一种抗肿瘤疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤疫苗及其制备方法，抗肿瘤疫苗是通过将EGFR抗原肽、TAT穿膜肽、CpG配体、MPLA配体、水凝胶自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT‑CM，并将短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT‑CM负载在DC细胞上形成的DC/EGFRTAT‑CM疫苗。制备方法包括：首先在EGFR抗原肽的多肽端引入一段TAT穿膜肽得到经TAT穿膜肽修饰的EGFR抗原肽，然后利用静电吸附和亲疏水的共同作用将经TAT穿膜肽修饰的EGFR抗原肽和CpG配体、MPLA配体、水凝胶自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT‑CM，再将短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT‑CM负载在DC细胞上得到DC/EGFRTAT‑CM疫苗。本发明提出的抗肿瘤疫苗及其制备方法，提高了表位免疫原性和特异性细胞免疫反应。

Description

一种抗肿瘤疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤疫苗及其制备方法。
背景技术
肿瘤疫苗是为了根除肿瘤细胞而采取的一种疗法。疫苗属于主动免疫治疗，旨在通过增强抗原肽的免疫原性，进而充分调动机体免疫系统对肿瘤的杀伤活力，是抵抗肿瘤最理想的方式之一。但是其主要应用瓶颈在于难以产生足够强的免疫应答来有效地抑制肿瘤生长。设计有效抗肿瘤策略时需要关注的因素很多，例如DC的生物学特征在免疫治疗中的影响，如何组合和使用免疫佐剂来增强免疫效应以及怎样合理利用技术独特的调控能力来解决免疫治疗中遇到的挑战等都是现阶段亟待解决的问题。
以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种抗肿瘤疫苗及其制备方法，提高了表位免疫原性和特异性细胞免疫反应。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的一个实施例公开了一种抗肿瘤疫苗，是通过将EGFR抗原肽、TAT穿膜肽、CpG配体、MPLA配体、水凝胶自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM，并将短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载在DC细胞上形成的DC/EGFRTAT-CM疫苗。
优选地，所述水凝胶采用PLGA-PEG-PLGA共聚物的水凝胶溶液。
优选地，EGFR抗原肽采用分子量为1112.30D的抗原肽CLTSTVQLET。
本发明的另一实施例公开了一种抗肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：首先在EGFR抗原肽的多肽端引入一段TAT穿膜肽得到经TAT穿膜肽修饰的EGFR抗原肽，然后利用静电吸附和亲疏水的共同作用将经TAT穿膜肽修饰的EGFR抗原肽和CpG配体、MPLA配体、水凝胶自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM，再将短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载在DC细胞上得到DC/EGFRTAT-CM疫苗。
优选地，具体包括：
S1：制备水凝胶；
S2：制备EGFRTAT-CM溶液：首先制备EGFRTAT溶液以在EGFR抗原肽的多肽端引入一段TAT穿膜肽，然后将CpG配体溶液和MPLA配体溶液同时加入到水中，混合均匀得到配体水相溶液，再将EGFRTAT溶液在超声的条件下加入到配体水相溶液中，得到EGFRTAT-CM溶液；
S3：将EGFRTAT-CM溶液与水凝胶混合得到自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM；
S4：制备DC细胞；
S5：将自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载在DC细胞上得到DC/EGFRTAT-CM疫苗。
优选地，所述水凝胶采用PLGA-PEG-PLGA共聚物的水凝胶溶液。
优选地，EGFR抗原肽采用分子量为1112.30D的抗原肽CLTSTVQLET。
优选地，所述水凝胶的浓度为10～20％。
优选地，短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM的pH为6～8。
优选地，其中经TAT穿膜肽修饰的EGFR抗原肽与CpG配体中的氮磷比为(1～4)：1。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明构建了一种自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载DC的抗肺癌疫苗(DC/EGFRTAT-CM)，为多功能水凝胶和多肽-配体自组装纳米材料输送肿瘤抗原肽和免疫佐剂至DC中，改变表位肽在疫苗中的存在形式，提高免疫原性，改善表位肽疫苗的细胞免疫应答效应，有着良好的抗肿瘤免疫治疗效果，以唤醒先天免疫和适应性免疫系统共同抑制肿瘤的生长。
本发明采用自组装短肽水凝胶支架负载DC疫苗(DC/EGFRTAT-CM)，可以通过局部注射的方式，提高疫苗的体内活性、归巢能力及抗肿瘤的效率，明确免疫途径与作用机制，提高其肿瘤免疫治疗的效果。
本发明的DC/EGFRTAT-CM疫苗是自组装短肽水凝胶纳米颗粒负载DC形成的疫苗结节，提高了外源性DC活性并募集了内源性DC，水凝胶与抗原肽-配体自组装使其分子量增大，形成的纳米结构提高了疫苗的免疫原性与体内稳定性，通过促进DC的摄取和提呈激活了特异性的淋巴细胞增殖，提高了抗肿瘤作用，浸润到肿瘤组织内表现出良好的肿瘤预防和免疫治疗效果。
附图说明
图1是本发明优选实施例提出的抗肿瘤疫苗的制备方法流程图；
图2是水凝胶的体外温敏性特征示意图；
图3是不同浓度的水凝胶对多肽的释放能力示意图；
图4a和图4b分别是EGFRTAT-CM与EGFR-CM的形态示意图；
图5是EGFRTAT-CM纳米颗粒在水凝胶溶液中粒径分布图；
图6是在pH＝4和pH＝7时EGFRTAT、CpG、MPLA和EGFRTAT-CM的表面电势比较图；
图7a和图7b分别表示pH＝7时和酸性环境下EGFRTAT-CM水凝胶溶液的粒径分布；
图8是不同氮磷比的EGFRTAT-CM的表面电势比较图；
图9是通过罗丹明模拟自组装短肽水凝胶纳米颗粒对疏水药物的装载示意图；
图10a是比较PBS、EGFR-CM、EGFRTAT-CM与DC混合孵育3h后被DC细胞的摄取情况示意图；
图10b是比较PBS、EGFR-CM、EGFRTAT-CM与DC混合孵育6h后被DC细胞的摄取情况示意图；
图10c是比较PBS、EGFR-CM、EGFRTAT-CM与DC混合孵育9h后被DC细胞的摄取情况示意图；
图11a和图11b是比较DC/gel-CM、DC/EGFR-CM和DC/EGFRTAT-CM进行免疫治疗的非小细胞肺癌转移能力示意图；
图12a和图12b是比较多个平台中输送EGFR-CM、EGFRTAT-CM进行免疫治疗的非小细胞肺癌转移能力示意图；
图13是比较多个平台中输送EGFR-CM、EGFRTAT-CM进行免疫治疗的小鼠的生存期示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式并对照附图对本发明做进一步详细说明。其中相同的附图标记表示相同的部件，除非另外特别说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
下面结合附图通过具体实施例对本发明进行详细的介绍，以使更好的理解本发明，但下述实施例并不限制本发明范围。另外，需要说明的是，下述实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构思，附图中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的形状、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局形态也可能更为复杂。
抗原肽作为一种新型肿瘤疫苗，在肿瘤个性化免疫治疗领域受到极大关注。然而，表位肽分子量小，化学结构简单，导致其免疫原性弱，在体内容易被降解，无法诱发足够强度的免疫反应，抑瘤效果不明显。本发明通过自组装技术设计并构建新型表位肽疫苗，提高表位免疫原性和特异性细胞免疫反应。将抗原肽以共价键的方式连接到TLR配体上，在水凝胶中键合体组装成为具有纳米结构的水凝胶颗粒，这种水凝胶-抗原肽-TLR配体的共价结合物增加DC对抗原肽的摄取以达到增强免疫应答的目的，从而改变表位肽在疫苗中的存在形式，提高免疫原性，改善表位疫苗的细胞免疫应答效应，提高其肿瘤免疫治疗效果。
为了避免手术植入过程，制备可注射支架是设计免疫治疗策略的首选。一般材料存在难以制备，难以生物降解或是毒副作用高的缺点，限制了其在肿瘤免疫治疗中的推广和应用。本发明选用温敏型水凝胶具有生物相容性好、材料利用率高、能够近100％包埋药物并且实现药物在靶组织的聚集和缓释等特点，能够增强DC的驻留并保持细胞活性，为应用其创造适宜的微环境以调节回输细胞的命运提供了新的选择。
本发明构建一种DC/EGFRTAT-CM疫苗，是一种自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载DC的抗肺癌疫苗，通过局部注射的方式，提高肿瘤疫苗的体内活性、归巢能力及抗肿瘤的效率，明确免疫途径与作用机制，提高其肿瘤免疫治疗的效果。
本发明优选实施例提出的抗肿瘤疫苗，是通过将EGFR抗原肽、TAT穿膜肽、CpG配体、MPLA配体、水凝胶自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM，并将短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载在DC细胞上形成的。具体地，水凝胶采用PLGA-PEG-PLGA共聚物的水溶液，浓度为10～20％，短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM的pH为6～8。
如图1所示，本发明优选实施例提出的抗肺癌疫苗的制备方法包括：
S1：制备水凝胶
将PLGA-PEG-PLGA共聚物水凝放置在不同温度的水浴锅中，观察其凝结情况。下面对本发明优选实施例中制得的水凝胶的温敏性和缓释能力进行测试和说明。
(a1)水凝胶的体外温敏性
本发明中使用PLGA-PEG-PLGA共聚物，该PLGA-PEG-PLGA共聚物的水溶液在32℃下时为溶液状态，当高于此温度则转为凝胶状态，如图2。PLGA和PEG都是常用的药物辅料，水凝胶制剂准备过程简单，可以实现量产，具有很好医用应用前景。水凝胶在体内强大的支架功能和调节机体免疫系统能力，能够实现DC对抗原肽的原位摄取和加工；本发明具体实施例中选用37℃水凝胶状态进行研究。
(a2)水凝胶的体外缓释能力
将含FITC的多肽的PLGA-PEG-PLGA溶液加到24孔板中，然后将24孔板放置在37℃的培养箱中，当PLGA-PEG-PLGA溶液转换为凝胶状态时，再向孔板中加入一定体积37℃的PBS，每隔一段时间收集凝胶上的PBS并补充同样体积的新PBS；通过酶标仪进对取得的PBS进行荧光以检测(激发488nm，发射515nm)，计算多肽的释放情况，得到多肽在凝胶中的释放动力学。
本发明优选实施例中选用浓度为10～20％的水凝胶，如图3所示，PLGA-PEG-PLGA水凝胶浓度同多肽的释放速率成反比。在第七天时，约74.9％的EGFR从10％的水凝胶中释放出来，而在浓度为20％的凝胶中释放量为61.1％；总之，PLGA-PEG-PLGA水凝胶能够对多肽进行缓释，也可以通过使用不同浓度的水凝胶对缓释速率进行调节；本发明更优选的实施例中选用10％水凝胶。
S2：制备EGFRTAT-CM溶液；
其中EGFRTAT-CM溶液的制备过程具体包括：
S21：制备EGFRTAT溶液以在EGFR抗原肽的多肽端引入一段TAT穿膜肽；
S22：将CpG配体溶液和MPLA配体溶液同时加入到水中，混合均匀得到配体水相溶液；
具体地，在100μL水中加入4μL的MPLA(1mg/mL)和2μL CpG(10mg/mL)溶液，震荡混匀得到配体水相溶液。
S23：将EGFRTAT溶液在超声的条件下加入到配体水相溶液中，得到EGFRTAT-CM溶液；
具体地，取10μLEGFRTAT溶液在超声的条件下缓慢加入至配体水相溶液中(100W，3min)，配制成EGFRTAT-CM溶液。
S3：将EGFRTAT-CM溶液与水凝胶混合得到自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM；
同时用不带穿膜肽的EGFR进行相同处理，配制成EGFR-CM溶液作为对照组。取EGFRTAT-CM溶液滴至云母片并烘干，利用AFM(原子力显微镜)观测溶液中多肽组装的形貌，并测试自组装溶液在不同pH条件下的粒径和电位情况。
下面对自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM的设计、表征、不同pH下粒径及点位、包封率分别进行测试和说明。
(b1)自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM的设计
在本发明中，需要同时将非小细胞肺癌抗原肽表位肽多肽EGFR以及两种小分子免疫佐剂CpG ODN 1826和MPLA共同输送至树突状细胞，使其能够发挥协同免疫效应。将抗原肽EGFR氮端修饰上TAT穿膜肽，该穿膜肽具有强正电荷，可以吸附带负电的核酸CpG ODN。仅有十个氨基酸的EGFR多肽是一种疏水性多肽，TAT穿膜肽的修饰使得整个抗原肽表位肽表现出一种两亲性质，当CpG ODN加入到两亲性多肽的体系中时，TAT穿膜肽表面的正电荷被屏蔽，抗原肽的水溶性变差，尤其是疏水性的部分在溶液中会因为疏水作用力而倾向聚合，疏水的MPLA也会倾向于进入疏水核心。CpG ODN和TAT穿膜肽组成了自组装颗粒亲水外壳，而抗原肽和MPLA组成疏水内核，最终形成自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM(EGFRTAT：TAT穿膜肽修饰的EGFR抗原肽，C：CpG，M：MPLA)。
小分子配体CpG ODN的受体TLR9位于内体内，未纳米化的CpG ODN在细胞中很快被核酸酶降解，影响了CpG同受体的结合和发挥作用的时间。EGFRTAT-CM对CpG产生的保护作用可以一定程度上抵抗核酸酶降解，而且EGFRTAT-CM因为酸性环境而发生解离，CpG直接被位于内体TLR9识别。同时因为细胞表面带负电荷，所以带正电荷的EGFRTAT-CM容易吸附到细胞上并被DC摄取，增加了DC细胞对抗原肽和配体的摄取，而TAT本身的穿膜能力还能帮助EGFR多肽从内体中逃逸出来到高尔基体去，然后被MHC Class I展示和呈递给T细胞发挥功能。这种自组装短肽水凝胶纳米颗粒体系不仅能增加EGFR抗原肽的摄取和呈递，还能提高小分子配体的有效输送。
(b2)自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM的表征
EGFRTAT-CM的形态数据通过AFM进行检测。如图4a所示，EGFRTAT-CM样品中可以观察处于分散状态的球形纳米颗粒，颗粒直径在50nm左右；而如图4b所示，对照样品EGFR-CM中是长的纤维和无序片状结构。AFM结果初步说明在TAT穿膜肽的帮助下，抗原肽EGFR、TLR配体(CpG ODN和MPLA)能自组装成球形纳米颗粒。
通过激光粒度分析仪(DLS)研究了EGFRTAT-CM的在水凝胶溶液中的粒径、分散度和表面电势。从图5可以看出，EGFRTAT-CM纳米颗粒在水凝胶溶液中粒径分布较窄，PDI为0.141，说明EGFRTAT-CM的分散性较好。EGFRTAT带正电，核酸CpG带负电，带有一个磷酸基团的MPLA也带负电，EGFRTAT-CM纳米颗粒表面电势为正，可以通过调节CpG和MPLA的量改变纳米颗粒表面电势情况。
(b3)自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM的pH
如图6所示，pH降低时多肽EGFRTAT、CpG、MPLA和自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM的表面电势均有增加，而自组装纳米结构的基础就是静电吸附和疏水作用力，表面电势的变化会影响到整个体系的平衡。
pH的变化对EGFRTAT-CM的粒径分布也有很大影响，实验结果如图7a和图7b显示；如图7a，当pH＝7时，EGFRTAT-CM粒径分布均一，PDI＝0.242，水合粒径的大小为100nm左右；如图7b，酸性环境下EGFRTAT-CM水凝胶溶液的粒径变得很小，整个体系PDI(＝0.694)也增大。粒径分布的变化暗示自组装颗粒在酸性条件的不稳定性和颗粒解离的发生。
本发明优选实施例中选用pH＝6～8(例如pH＝7)的自组装短肽水凝胶纳米颗粒。
(b4)自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM的包封率
将EGFRTAT配成浓度为10mg/mL的DMSO溶液(即以DMSO为溶剂，EGFRTAT为溶质，配制成浓度为10mg/mL的溶液)，CpG ODN配制成10mg/mL的水溶液(即以水为溶剂，CpG ODN为溶质，配制成浓度为10mg/mL的溶液)得到CpG纯水体系备用。将EGFRTAT的DMSO溶液按照氮磷比4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、3:1和1:4加入到含有CpG纯水体系内，超声水浴3min，静置1小时。将混合液以14000rpm的转速离心30min。上清液用NanoDrop进行定量，通过差量法计算EGFRTAT吸附的CpG的量。
将FITC标记的EGFRTAT配制成1mg/mL的DMSO溶液备用。EGFRTAT溶液按照氮磷比4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，3:1，1:4加入到含有CpG纯水体系内，超声水浴3min，静置1小时。将混合液以14000rpm的转速离心30min。对上清中的FITC-EGFRTAT定量，计算EGFRTAT的包封率。
将疏水染料罗丹明同EGFRTAT混合，然后按照EGFRTAT和CpG的氮磷比4:1加入到含有CpG的纯水体系内，超声3min后静置1小时。然后将混合以14000rpm的转速离心30min。测上清中罗丹明的含量，计算在自组装体系对疏水染料的包封率，用来模拟MPLA的包封情况。
正负电荷复配是EGFRTAT-CM自组装的结构基础。首先研究电荷变化对组装包封率的影响。通过不同氮磷比条件下EGFRTAT和CpG ODN的包封率来评价在组装过程中二者相互吸附的能力。如表1所示，当CpG比例增加时，更多的EGFRTAT被吸附，所以EGFRTAT的包封率越来越高；而随着CpG的不断增加，水凝胶溶液中游离的CpG越来越多，CpG的包封率下降。
表1不同氮磷比条件下EGFRTAT和CpG ODN的包封率
组 氮磷比 EGFR：CPG ERFG包封率 CPG包封率
1 4:1 11.4:1 76.2％ 97.2％
2 3:1 8.6:1 81.1％ 94.4％
3 2:1 5.7:1 86.9％ 91.8％
4 1:1 2.85:1 90.6％ 86.7％
5 1:2 1.42:1 90.1％ 47.5％
6 1:3 0.95:1 92.1％ 33.7％
7 1:4 0.5:1 91.6％ 22.1％
DLS检测不同比例下自组装颗粒的表面电势，结果如图8所示。随着CpG ODN的增加，EGFRTAT的正电位被CpG的负电荷屏蔽，EGFRTAT-CM的表面电势下降。可以通过调节二者比例，定性控制自组装短肽水凝胶纳米颗粒表面电性来实现不同的功能。本发明中优选实施例选用氮磷比为(1～4)：1的纳米颗粒(更有选地，选用氮磷比为3：1的纳米颗粒)。该正电荷EGFRTAT-CM易于吸附在带负电的DC表面，同时也保证了EGFR和CpG较高的包封率。
根据设计，EGFRTAT多肽和CpG形成的纳米颗粒的疏水核心可以用来载带疏水的磷脂配体MPLA。发明中用疏水的罗丹明模拟自组装短肽水凝胶纳米颗粒对疏水药物的装载，如图9所示，EGFRTAT-CpG纳米颗粒对可载带约20％的疏水药物。
S4：制备DC细胞；
DC细胞的培养具体包括以下步骤：
S41：抽取抗凝外周血50ml，800g，15min室温离心(不间断)；
S42：自体血浆制备：取上清血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后-20℃静置10min；最后4℃，1100g，离心15min，4℃保存备用；
S43：取上述离心后下部细胞成分，加D-PBS至50ml，混匀，加到2个装有12.5ml医疗级人淋巴细胞分离液的50ml高效离心管中，800g，15min室温离心(不间断)；
S44：取细胞层，加入培养基至50ml，600g 10min，弃上清液。
S45：分离出的PBMC制成细胞悬液30ml，加入到T75培养瓶，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中培养2h。
S46：悬浮细胞移至CIK包被瓶，加入10毫升培养基，左右晃动清洗细胞，移液枪轻微缓慢吹洗悬浮细胞，将悬浮细胞尽量全部转移至T175中行CIK培养，剩下T75培养瓶细胞为半贴壁细胞行DC培养。
S47：向DC培养瓶中，加入30ml未加因子的201培养基，加入5ml血浆，加入GM-CSF。
S48：第二天，向DC培养瓶中，加入IL-4
S49：第五天，向DC培养瓶中，加入TNF-a。
S410：第七天，收集DC细胞。
S5：将自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载在DC细胞上制得抗肿瘤疫苗。
下面对自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM的DC细胞摄取能力、以及制得的抗肿瘤疫苗的肿瘤转移能力、肿瘤大小和生存曲线分别进行测试和说明。
(c1)自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM的DC细胞摄取
将收集的DC细胞接种在6孔板中，用罗丹明6B标记的EGFR和EGFRTAT，然后分别向孔板中加入制备的荧光标记多肽EGFR-CM和EGFRTAT-CM。DC和EGFR-CM和EGFRTAT-CM在37℃下分别孵育3h、6h和9h后收集，洗去未被摄取的多肽后，利用流式细胞仪进行检测，每组采集10000个细胞。
使用罗丹明6G对EGFR和EGFRTAT进行修饰，制备成有荧光标记的混合物EGFR-CM和自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM。将二者与DC分别混合后孵育不同时间，洗去未被摄取的部分，流式检测DC对多肽的摄取情况。实验结果如图10a、图10b和图10c所示，自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM可以有效的被DC摄取，与没有被TAT修饰的多肽相比，TAT修饰够提高多肽的摄取量；这表明纳米化可以有效地提高和延长抗原肽的摄取，为后面功能实验的研究提供了初步实验证据。本发明具体实施例中选用自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM与DC混合后孵育6h进行研究。
(c2)DC/EGFRTAT-CM疫苗的抗肿瘤能力
尾静脉注射B16F10细胞(2×105个/小鼠)到C57BL/6J小鼠，肿瘤接种后第3天，用不同处理的DC免疫小鼠(1×106个/小鼠)，分组如下：1)DC/gel-CM，2)DC/EGFR-CM，3)DC/EGFRTAT-CM。
同时将EGFR-CM和EGFRTAT-CM分别用不用的平台(Montanide ISA51和水凝胶)进行荷瘤小鼠抗肿瘤免疫治疗。在肿瘤接种15天后解剖小鼠对其肺部的肿瘤进行计数。
生存曲线：尾静脉注射B16F10细胞(2×105个/小鼠)到C57BL/6J小鼠，肿瘤接种后第2和第9天，用不同处理的DC免疫小鼠(1×106个/小鼠)，分组如下：1)DC/gel-CM，2)DC/EGFR-CM，3)DC/EGFRTAT-CM。记录小鼠死亡情况，并绘制生存曲线。
本发明使用EGFR突变位点非小细胞肺癌转移模型评估自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载DC(DC/EGFRTAT-CM疫苗)肿瘤疫苗的抗肿瘤效果。
首先尾静脉注射肿瘤细胞第3天时，将不同疫苗制剂在注射前与DC共孵育6小时，将小鼠随机分成3组接种疫苗处理，注射肿瘤后第15天时终止实验，取出小鼠肺部并统计肿瘤转移的数目，结果如图11a和图11b所示。同DC/gel-CM和DC/EGFR-CM免疫的小鼠相比，DC/EGFRTAT-CM免疫小鼠的肺部肿瘤数量最少。而在DC/EGFR-CM虽然展示了一定的肿瘤抑制能力，但抗肿瘤免疫水平不如DC/EGFRTAT-CM。
另外，本发明同时比较了在多个平台中输送EGFRTAT-CM纳米颗粒进行免疫治疗的非小细胞肺癌转移能力，如图12a和图12b所示，其中包括对照例(不做任何处理)、
Figure BDA0003282642230000111
DC/EGFR-CM、DC/EGFRTAT-CM、DC/MSV/EGFR-CM、DC/MSV/EGFRTAT-CM、H+EGFR-CM、H+EGFRTAT-CM、Monta+EGFR-CM、Monta+EGFRTAT-CM，实验结果总结如下：
c21)利用TAT修饰的抗原肽EGFR和TLR配体自组装的结构在多个平台中都能提高肿瘤免疫治疗效果。
c22)当不使用TAT序列时修饰抗原肽时，将抗原肽和配体装载到多孔圆盘硅(MSV)后再制备成DC疫苗免疫荷瘤小鼠，虽然纳米材料的包裹能够适度的提高免疫治疗的效果(DC/EGFR/CM同DC/MSV.EGFR/CM)，但是如果引入TAT多肽形成自组装结构，不需要进行包裹也能显著抑制肺部肿瘤的生长。
c23)在水凝胶中使用EGFRTAT-CM纳米颗粒时，显示出很好抗免疫治疗效果。
c24)商品化佐剂MontanideTM ISA51输送EGFRTAT-CM和EGFR-CM进行免疫时，发现EGFRTATCM比EGFR-CM的抗肿瘤效果虽然有差异，但是荷瘤小鼠的治疗效果并不令人满意，这种有限性可能有两方面原因，一是水相的自组装溶液同油相的MontanideTM ISA51混合后乳化过程中自组装体系平衡受影响，二是乳化体系不利于纳米颗粒的释放；因此，商品化佐剂MontanideTM ISA51这个平台输送的效果不佳。
c25)在以恶性行程度极高的非小细胞肺癌为研究对象时，发现三种纳米治疗平台明显好于商品化的佐剂MontanideTM ISA51，说明运用纳米技术进行抗肿瘤免疫治疗中比传统的策略有很多优势。
如图13所示，DC/gel-CM组小鼠22天内全部死亡，DC/EGFR-CM组在25天内所有的小鼠死亡，在相同的免疫条件下，DC/EGFRTAT-CM组小鼠生存得到了显著的延长(数据的显著性差异***p<0.001)，小鼠中位生存期延长了约1个月，说明DC/EGFRTAT-CM疫苗具有很高的抗肿瘤免疫治疗效果，其他免疫方式虽然在抗转移过程中也展现出很好的效果，但是对生存时间的改善效果不佳，非小细胞肺癌EGFR抗原肽特异性淋巴细胞的百分比和我们检测生存曲线趋势一致。
在利用MSV输送EGFRTAT-CM测试小鼠生存时间时得到一些结果不符合预期。在MSV中装载自组装颗粒后应该能够产生多级释放效果，增强抗原肽呈递达到改善免疫治疗效果，延长病患的存活时间；但结果发现使用DC/MSV/EGFRTAT-CM对荷瘤小鼠免疫治疗时，虽然对肺部转移的抑制效果同DC/EGFRTAT-CM类似，但是DC/MSV/EGFRTAT-CM延长荷瘤小鼠生存时间并无优势，这可能是由于肿瘤抗原肽进行过度缓释过程演变为肿瘤抗原肽的少量多次免疫，也就是抗原肽脱敏使机体不再识别肿瘤抗原肽，产生免疫抑制而非免疫治疗效应。
本发明优选实施例提出的DC/EGFRTAT-CM疫苗是由自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载DC而成，自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM是通过将EGFR突变短肽多肽抗原肽CLTSTVQLET(分子量1112.30D)、穿膜肽TAT、CpG和MPLA配体(TLR配体)、多功能水凝胶设计成多肽-配体自组装短肽水凝胶纳米颗粒。
本发明优选实施例提出的DC/EGFRTAT-CM疫苗是利用可注射的温敏水凝胶缓释细胞因子、抗原肽和免疫刺激剂，提高了DC对抗原肽摄取、加工和呈递的能力，构建免疫微环境以提高免疫细胞的激活效率，增强抗肿瘤疗效。
本发明优选实施例提出的DC/EGFRTAT-CM疫苗通过EGFR抗原肽的多肽端引入一段具有丰富正电荷的TAT穿膜肽，利用静电吸附和亲疏水作用将抗原肽和配体佐剂(TLR配体)组装成纳米颗粒，使抗原肽和佐剂可一起被DC摄取，实现DC对肿瘤抗原肽的有效摄取，并呈递抗原肽给T细胞，进而激活特异性的抗肿瘤免疫反应。
本发明优选实施例提出的DC/EGFRTAT-CM疫苗是利用静电吸附和亲疏水作用，将肿瘤抗原肽EGFR和两种TLR配体组装成纳米颗粒。抗原肽-TLR配体自组装短肽水凝胶纳米颗粒，能同时激活先天免疫和适应性免疫，使抗原肽呈递和DC成熟发生在同一DC中。
本发明优选实施例提出的DC/EGFRTAT-CM疫苗将自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载到DC中制备成肿瘤疫苗，并评价其抗肿瘤效果。证实DC/EGFRTAT-CM疫苗在体内能够很好地激发抗原肽特异性免疫反应，诱导高效低毒的抗肿瘤免疫效应，抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的存活时间。
本发明还评估了利用不同输送平台输送自组装短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载DC对抗肿瘤效果的影响，分析输送方式如何在影响肿瘤疫苗中发挥作用。这种自主装短肽水凝胶纳米颗粒结构紧凑制备简单，组成纳米颗粒的每一部分都有其具体的免疫功能和结构功能，实现了纳米结构和免疫功能高度统一。
本发明的背景部分可以包含关于本发明的问题或环境的背景信息，而不是由其他人描述现有技术。因此，在背景技术部分中包含的内容并不是申请人对现有技术的承认。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。在本说明书的描述中，参考术语“一种实施例”、“一些实施例”、“优选实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管已经详细描述了本发明的实施例及其优点，但应当理解，在不脱离由所附权利要求限定的范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和变更。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤疫苗，其特征在于，是通过将EGFR抗原肽、TAT穿膜肽、CpG配体、MPLA配体、水凝胶自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM，并将短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载在DC细胞上形成的DC/EGFRTAT-CM疫苗。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述水凝胶采用PLGA-PEG-PLGA共聚物的水凝胶溶液。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤疫苗，其特征在于，EGFR抗原肽采用分子量为1112.30D的抗原肽CLTSTVQLET。
4.一种抗肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
首先在EGFR抗原肽的多肽端引入一段TAT穿膜肽得到经TAT穿膜肽修饰的EGFR抗原肽，然后利用静电吸附和亲疏水的共同作用将经TAT穿膜肽修饰的EGFR抗原肽和CpG配体、MPLA配体、水凝胶自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM，再将短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载在DC细胞上得到DC/EGFRTAT-CM疫苗。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，具体包括：
S1：制备水凝胶；
S2：制备EGFRTAT-CM溶液：首先制备EGFRTAT溶液以在EGFR抗原肽的多肽端引入一段TAT穿膜肽，然后将CpG配体溶液和MPLA配体溶液同时加入到水中，混合均匀得到配体水相溶液，再将EGFRTAT溶液在超声的条件下加入到配体水相溶液中，得到EGFRTAT-CM溶液；
S3：将EGFRTAT-CM溶液与水凝胶混合得到自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM；
S4：制备DC细胞；
S5：将自组装成短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM负载在DC细胞上得到DC/EGFRTAT-CM疫苗。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述水凝胶采用PLGA-PEG-PLGA共聚物的水凝胶溶液。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，EGFR抗原肽采用分子量为1112.30D的抗原肽CLTSTVQLET。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述水凝胶的浓度为10～20％。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，短肽水凝胶纳米颗粒EGFRTAT-CM的pH为6～8。
10.根据权利要求4至9任一项所述的制备方法，其特征在于，其中经TAT穿膜肽修饰的EGFR抗原肽与CpG配体中的氮磷比为(1～4)：1。
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