CN113274352B - 一种纳米制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种纳米制剂及其制备方法与应用，所述纳米制剂包括纳米胶束和包载于所述纳米胶束内的抗肿瘤药物和免疫调节剂，所述纳米胶束由TfR‑T12‑PEG‑PLGA和TATH7‑PEG‑PLGA自组装而成；所述TfR‑T12‑PEG‑PLGA是TfR‑T12短肽中的氨基与PEG‑PLGA中的羧基通过缩合反应得到；所述TATH7‑PEG‑PLGA是TATH7短肽中的氨基与PEG‑PLGA中的羧基通过缩合反应得到。该纳米胶束作为药物载体，可同时递送抗肿瘤药物如紫杉醇和免疫调节剂如米喹莫唑，使其顺利穿过血脑屏障，实现药物靶向递送，并调节肿瘤微环境免疫抑制现象。

Description

一种纳米制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及脑胶质瘤治疗领域，尤其涉及一种纳米制剂及其制备方法与应用。
背景技术
脑胶质瘤是一种常见的颅内恶性肿瘤，临床上采取的一线治疗方案是手术切除后联合放疗、化疗。由于血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)的存在，阻碍了几乎98％的药物有效到达脑组织，严重影响术后化疗的效果。因此，如何突破BBB的限制，是目前治疗脑胶质瘤的瓶颈问题。
发明内容
转铁蛋白受体(Trabsferrin Receptor,TfR)是一种最具代表性的转胞吞作用受体，其在脑内皮细胞上高表达，靶向TfR的药物可以穿过BBB系统。
TfR受体是一类存在于细胞表面的糖蛋白，其在人体各种细胞上均有表达，特别是某些肿瘤细胞表面，如在脑肿瘤细胞、肝肿瘤细胞表面TfR受体的表达明显高于正常细胞。除此以外，TfR受体在脑内皮细胞上高表达，理论上靶向TfR的药物既可以穿越血脑屏障，又可以特异性识别脑胶质瘤细胞，富集至脑内恶性脑瘤部位。基于以上理论，TfR配体修饰的药物，与TfR受体结合后，会通过脑内皮细胞的转胞吞作用穿过血脑屏障，而在恶性脑瘤细胞中，在受体TfR的介导下，TfR配体修饰的药物能够特异性地被脑胶质瘤细胞摄取，使得治疗药物特异性地富集到肿瘤区域并抑制恶性脑瘤的生长，达到靶向递送的作用。因此，TfR配体修饰的载体是一种理想的能穿越血脑屏障并特异性被脑胶质瘤细胞摄取的药物载体，用于抗肿瘤药物的靶向递送。
肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是肿瘤微环境中数量最多的间质细胞，TAMs作为肿瘤中浸润白细胞的最重要成分，其在介导肿瘤炎症的发生和肿瘤进展方面发挥重要作用。巨噬细胞根据功能表型不同，分为经典活化巨噬细胞(M1型)和替代活化巨噬细胞(M2型)，M1型巨噬细胞通过分泌促炎因子如IL-1、IL-2、TNF-a参与炎症反应和抗肿瘤免疫过程，而M2型巨噬细胞下调免疫刺激因子IL-12，高表达免疫抑制因子IL-10，并抑制肿瘤中CD8+T细胞的细胞毒性。浸润在肿瘤局部的TAMs更接近M2型巨噬细胞的表型功能，因此，TAMs促进肿瘤的恶化并对肿瘤的侵袭迁移起积极作用。鉴于M1型巨噬细胞的抗肿瘤免疫功能，以及巨噬细胞的可塑性，诱导TAMs向M1型巨噬细胞转化对增强肿瘤免疫功能具有重要意义，因此，阻断TAMs在肿瘤局部募集，诱导TAMs向M1型巨噬细胞极化，杀灭、清除TAMs已成为肿瘤免疫疗法的新策略。咪喹莫特(Imiquimod,R837)是一个小分子免疫调节剂，它是toll-样受体7的激动剂，R837可促使TAMs向M1巨噬细胞极化。利用纳米胶束作为载体递送化疗药物和R837治疗癌症，具有显著的治疗效果。
随着纳米技术的发展，为解决药物溶解性低的问题提供了新的突破点，其中聚合物纳米胶束是近年来的研究热点之一，纳米胶束由两亲性的嵌段聚合物组成，即同时具有亲脂性的疏水聚乳酸段(PLA)及其衍生物(PLGA)和亲水的聚乙二醇(PEG)片段，聚乙二醇-聚乳酸或其衍生物在自组装的条件下形成胶束后，疏水性内核可以包载亲脂性药物如紫杉醇，而亲水性外壳部分具有较好的生物相容性，同时可以提高胶束在水溶液中的稳定性，延长药物在体内的循环时间。另外，由于纳米级的载药胶束粒径较小，有利于提高实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR效应)，所谓EPR效应是实体瘤组织特有的高通透性和滞留性效应，其中实体瘤中毛细血管内皮细胞裂隙的存在造成大分子药物具有高通透性，另外由于实体瘤内毛细淋巴管结构完整性和淋巴系统受损特征，导致大分子药物滞留性，促使大分子或微粒在肿瘤组织中的选择性分布。由此可见，纳米胶束不仅可以解决难溶性药物溶解度问题，还可以利用肿瘤组织特有的EPR效应产生的对肿瘤的被动靶向效应来增强药物在肿瘤组织的蓄积，提高抗肿瘤药物的生物利用度，增强抗肿瘤药物对肿瘤的杀伤性。
因此，开发一种副作用小，且可以顺利穿过BBB系统，并在实现化疗的同时，改善肿瘤微环境免疫抑制现象的多功能纳米制剂具有良好的研究价值。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供一种纳米制剂，所述纳米制剂包括纳米胶束和包载于所述纳米胶束内的抗肿瘤药物和免疫调节剂，所述纳米胶束由TfR-T12-PEG-PLGA和TATH7-PEG-PLGA自组装而成；
所述TfR-T12-PEG-PLGA是TfR-T12短肽中的氨基与PEG-PLGA中的羧基通过缩合反应得到；
所述TATH7-PEG-PLGA是TATH7短肽中的氨基与PEG-PLGA中的羧基通过缩合反应得到。
本发明中，所述TfR-T12-PEG-PLGA是TfR-T12短肽中的氨基与PEG-PLGA中的羧基通过缩合反应，以酰胺键连接得到。所述TATH7-PEG-PLGA是TATH7短肽中的氨基与PEG-PLGA中的羧基通过缩合反应得到，以酰胺键连接得到。所述TfR-T12-PEG-PLGA和所述TATH7-PEG-PLGA具有良好的生物安全性、且含有亲水部分和疏水部分，故在水中可自组装形成纳米胶束。该纳米胶束可作为药物载体，同时包载抗肿瘤药物和免疫调节剂，实现化疗联合免疫疗法的协同治疗作用，可用于脑胶质瘤的有效治疗。
也就是说，本发明纳米制剂中，纳米胶束由两种两亲性共聚物(TfR-T12-PEG-PLGA两亲性共聚物和TATH7-PEG-PLGA两亲性共聚物)制备得到。其中，两亲性嵌段共聚物TfR-T12-PEG-PLGA由PEG-PLGA通过酰胺键连接TfR-T12短肽获得，该TfR-T12-PEG-PLGA安全无毒，生物相容性好，且TfR-T12可特异性识别血脑屏障内皮细胞，有利于实现血脑屏障穿过效应，即可携带抗肿瘤药物跨过血脑屏障。其中，两亲性嵌段共聚物TATH7-PEG-PLGA由PEG-PLGA通过酰胺键连接pH敏感性细胞穿膜肽(TATH7)获得，所述TATH7由细胞穿膜肽TAT和7-聚组氨酸构成，在pH为7.4介质中，7-聚组氨酸与PLGA具有较强结合力，TATH7短肽隐藏于PEG亲水层内部，结构稳定，释药缓慢。而在pH为5.5介质中，7-聚组氨酸与PLGA结合力下降，TATH7短肽暴露于胶束表面。
因此，本发明纳米制剂具有pH敏感性，在生理条件下，该纳米制剂结构稳定。在偏酸性的肿瘤微环境中，TATH7短肽暴露于胶束表面，增强其被肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞摄取效率。
可选地，所述抗肿瘤药物为紫杉醇，其分子量896，紫杉醇与两亲性嵌段共聚物TfR-T12-PEG-PLGA和TATH7-PEG-PLGA形成的胶束，具有药理学效应，实现血脑屏障的穿过效应并靶向脑胶质瘤。
可选地，所述免疫调节剂为咪喹莫特。如此，使得纳米制剂具有促使肿瘤相关巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化的作用，改善肿瘤微环境免疫抑制现象。
可选地，所述TfR-T12短肽由12个氨基酸序列组成，其分子量为1490，其氨基酸序列为THRPPMWSPVWP，其高表达于脑内皮细胞和脑胶质瘤细胞上。纳米胶束含有所述TfR-T12短肽，可以顺利穿过BBB系统，并特异性识别脑胶质瘤细胞。
可选地，所述TATH7短肽由23个氨基酸序列组成，其氨基酸序列为RRRQRRKKRGYGGGCGHHHHHHH，TAT是一种非特异性的细胞穿膜肽，H7与PLGA在不同pH条件下结合力不同。
可选地，所述纳米制剂的粒径在220nm左右。
本发明的第二方面，提供一种本发明所述的纳米制剂的制备方法，其包括步骤：
提供TfR-T12-PEG-PLGA和TATH7-PEG-PLGA；
将所述TfR-T12-PEG-PLGA和TATH7-PEG-PLGA溶解于溶剂中，加入抗肿瘤药物和免疫调节剂，得到混合液；
将所述混合液加入水中，进行搅拌，经透析、干燥，得到所述纳米制剂。
可选地，将所述TfR-T12-PEG-PLGA和TATH7-PEG-PLGA按1:1的质量比溶解于溶剂中。
本发明的第三方面，提供一种本发明所述的纳米制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。
有益效果：
(1)本发明的纳米制剂，可穿过血脑屏障系统，特异性强，具有良好的靶向脑胶质瘤的效果，毒副作用小，具有良好的安全性；
(2)本发明的纳米制剂，其中同时包载抗肿瘤药物(如紫杉醇)和免疫调节剂(如米喹莫唑)，抗肿瘤药物、免疫调节剂与载体材料形成稳定性良好的纳米制剂，具有药理活性和免疫学效应；
(3)本发明的纳米制剂具有pH敏感性，在生理条件下，该纳米制剂结构稳定。在偏酸性的肿瘤微环境中，其被肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞摄取效率增强。
附图说明
图1为TfR-T12短肽、PEG-PLGA和TfR-T12-PEG-PLGA的红外图谱。
图2为TATH7短肽、PEG-PLGA和TATH7-PEG-PLGA的核磁氢谱。
图3为纳米制剂的理化性质：(A)粒径；(B)Zeta电位；(C)电镜结果；(D)在pH7.4和pH5.5释放介质中的PTX的累计释放；(E)在pH7.4和pH5.5释放介质中的R837的累计释放。
图4为纳米制剂在不同pH介质中被GL261(A)BMDM(B)、Raw264.7(C)细胞摄取情况。
图5为激光共聚焦显微镜观察纳米制剂被GL261细胞摄取。
图6为纳米制剂被GL261的摄取机制研究。
图7为CCK-8法分析纳米制剂对GL261细胞的增殖抑制情况。
图8为纳米制剂对GL261细胞克隆形成的抑制效果。
图9为流式细胞仪分析纳米制剂对GL261细胞凋亡的影响。
图10为Hochest染色法分析GL261凋亡。
图11为Q-PCR实验结果分析：(A、B、C、D)在BMDM细胞系中考察纳米胶束对细胞因子TNF-a、IL-6、IL-10、TGF-β产生的影响；(E、F、G、H)在Raw64.7细胞系中考察纳米胶束对细胞因子TNF-a、IL-6、IL-10、TGF-β表达的影响。
图12为皮下脑胶质瘤模型中肿瘤抑制效果考察：(A)荷瘤小鼠肿瘤体积变化；(B)荷瘤小鼠给药过程中体重变化。
图13为免疫组化法分析皮下脑胶质瘤模型中肿瘤抑制效应。
图14为皮下脑胶质瘤模型小鼠生存周期考察。
图15为免疫组化结果分析：分别测定不同给药组肿瘤组织的CD206、Foxp3、IFN-γ。
图16为BBB穿过效应考察结果：(A)体外血脑屏障模型构建；(B)流式细胞术考察BBB效应；(C)健康小鼠体内BBB穿透效应；(D)小动物成像仪测定TfR/TATH7/DiR在脑内的聚集。
图17为ELISA实验结果：(A)原位脑胶质瘤模型血清中TNF-α含量测定；(B)原位脑胶质瘤模型血清中TGF-β含量测定(n＝4)。
图18为原位脑胶质瘤模型小鼠生存周期考察,n＝5。
图19为安全性评价：原位脑胶质瘤小鼠给药结束后各组织器官进行H&E染色。
具体实施方式
本发明提供一种纳米制剂及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
TfR-T12-PEG-PLGA的合成
两亲性聚合物HOOC-PEG-PLGA 30mg溶于2mL DMF中，加入缩合剂1.5mg EDC和1mgHoBt，室温活化2h，继续加入TfR-T12短肽8mg，同时加入三乙胺10uL，继续反应至24h，将反应产物置于透析袋中(截留分子量3500Da)，去离子水中透析48h，冷冻干燥24h，既得合成产物TfR-T12-PEG-PLGA。
实施例2
TATH7-PEG-PLGA的合成
两亲性聚合物HOOC-PEG-PLGA 50mg溶于2mL DMSO溶液中，加入缩合剂20mg EDC和14mgHoBt，室温活化3h，继续加入TATH7短肽15mg，同时加入三乙胺12uL，继续反应至24h，将反应产物置于透析袋中(截留分子量3500Da)，去离子水中透析48h，冷冻干燥24h，既得合成产物TATH7-PEG-PLGA。
实施例3
通过透析法制备包载PTX和R837的纳米制剂，该纳米制剂记为TfR/TATH7/PTX/R837 NMs
将实施例1制备的TfR-T12-PEG-PLGA和实施例2制备的TATH7-PEG-PLGA两亲性共聚物按1:1质量比混合，溶解于DMSO中，同时按载药比1:10(载体与药物之比)加入PTX和R837，将混合液逐滴加入50mL去离子水中，室温搅拌30min，将搅拌后混合液置于截留分子量3500Da的透析袋中，去离子水中透析24h后，冷冻干燥24h，得到TfR/TATH7/PTX/R837NMs。去离子水溶解，过滤除去杂质后，紫外分光光度法测该TfR/TATH7/PTX/R837 NMs的包封率和载药量。
实施例4
粒径及Zeta电位测定
将实施例3制备的TfR/TATH7/PTX/R837 NMs稀释一定倍数后，采用马尔文粒径仪测定其粒径分布及Zeta电位，稀释介质是去离子水。
实施例5
透射显微镜观察纳米制剂形态
将实施例3制备的浓度为1mg/ml的TfR/TATH7/PTX/R837 NMs混悬液约10μL滴至蜡块表面，另取表面膜化处理过的铜网覆于液滴上，10min后，取下铜网，并用滤纸吸干表面液体，取磷钨酸溶液(1％质量浓度)滴于蜡块表面，随后将铜网覆于磷钨酸液滴上，室温静置10min后，将铜网置于灯下烤干，然后用透射电子显微镜观察纳米粒的外观形态。
实施例6
PTX和R837外释放度考察
考察TfR/TATH7/PTX/R837 NMs在pH＝7.4和pH＝5.5条件下的体外释放情况。简单地说，将2mL的TfR/TATH7/PTX/R837 NMs置于透析袋中(透析袋截留分子量MWCO＝7000Da)，然后将其浸入100mL释放介质中，在37℃下以200rpm的振荡速度反应48h。在预定时间点，提取0.2mL样品，并用类似体积的新鲜培养基代替。对样品进行处理、稀释，用紫外分光光度法分析PTX和R837的浓度，计算PTX和R837在不同时间点的累计释放度。
实施例7
考察纳米制剂在GL261细胞中摄取情况
将处于对数生长期的GL261细胞，以5×104/孔的密度铺于12孔板中，37℃条件下培养过夜。以DiR代替药物包载于纳米胶束中制备TfR-T12/TATH7/DiR，以DiR剂量100pmol/孔转染入相应孔中，培养6h后，比较不同pH条件下，纳米制剂被GL261肿瘤细胞的摄取情况，将未处理的细胞设为空白组。转染结束后，用浓度为0.25％的胰蛋白酶消化收集各孔内的细胞，并分散于0.5mL PBS溶液，避光保存，1h内流式细胞仪检测。
实施例8
流式细胞术考察纳米制剂在BMDM细胞中摄取情况
将处于对数生长期的BMDM细胞，以8×104/孔的密度铺于12孔板中，37℃条件下培养过夜。以DiR代替药物包载于纳米胶束中制备TfR-T12/TATH7/DiR，培养6h后，比较不同pH条件下，纳米制剂被GL261肿瘤细胞的摄取情况，将未处理的细胞设为空白组。转染结束后，用浓度为0.25％的胰蛋白酶消化收集各孔内的细胞，并分散于0.5mL PBS溶液，避光保存，1h内流式细胞仪检测。
实施例9
流式细胞术考察纳米制剂在RAW264.7细胞中摄取
将处于对数生长期的RAW264.7细胞，以6×104/孔的密度铺于12孔板中，37℃条件下培养过夜。以DiR代替药物包载于纳米胶束中制备TfR-T12/TATH7/DiR，转染入相应孔中，培养6h后，比较不同pH条件下，纳米制剂被GL261肿瘤细胞的摄取情况，将未处理的细胞设为空白组。转染结束后，用浓度为0.25％的胰蛋白酶消化收集各孔内的细胞，并分散于0.5mL PBS溶液，避光保存，1h内流式细胞仪检测。
实施例10
观察纳米制剂在GL261细胞中的摄取情况
将处于对数生长期的GL261细胞，以3×104/孔的密度接种于有无菌爬片的24孔板中，培养过夜。以DiR代替药物包载于纳米胶束中制备TfR-T12/TATH7/DiR转染入相应孔中培养6h后。吸去培养基，PBS洗2遍，用质量浓度为4％的多聚甲醛避光固定15min，PI工作液染核15min，用PBS洗2遍，取出爬片，荧光淬灭剂处理过的载玻片，激光共聚焦显微镜观察纳米胶束入胞情况。
实施例11
流式细胞术考察纳米制剂摄取机制
将处于对数生长期的GL261肿瘤细胞，以5×104/孔的密度铺于12孔板中，培养过夜。然后分别用甲基-β-环糊精、EIPA、氯丙嗪和染料木黄酮处理细胞，以DiR代替药物包载于纳米胶束中制备TfR-T12/TATH7/DiR，培养一定时间后，比较不同pH＝7.4和pH＝5.5条件下，纳米制剂被GL261肿瘤细胞的摄取情况，将未处理的细胞设为空白组。转染结束后，用质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化收集各孔内的细胞，并分散于0.5mL PBS溶液，避光保存，1h内流式细胞仪检测。
实施例12
考察纳米制剂对GL261细胞的增殖抑制情况
将处于对数生长期的GL261细胞以8×103/孔的密度铺于96孔板中，培养24h，用不同制剂处理细胞，分别是PBS组、空白胶束组，TfR/TATH7/PTX NMs,TfR/TATH7/PTX/R837NMs(pH＝7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝5.5)，给药24h，吸去上层培养基，CCK8工作液处理，每组设3个复孔。酶标仪于测定吸收值。
实施例13
克隆形成抑制实验
培养GL261细胞，以500个/孔的密度接种于6孔板，同时对细胞进行处理，分别加入TfR/TATH7/PTX NMs,TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝5.5)，PBS处理作对照，待培育12天后，显微镜下可以观察到克隆形成情况，轻轻移去培养液，PBS洗涤3次，甲醇固定15min,吉姆萨染液处理0.5h，PBS洗涤，拍照记录。
实施例14
细胞凋亡实验
将处于对数生长期的GL261细胞以4×104/孔的密度铺于12孔板中，培养箱中培养过夜，分别加入TfR/TATH7/PTX NMs,TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝5.5)，PBS处理作对照，给药结束后，PBS清洗2次，用0.25％胰酶消化细胞，将细胞悬浮于300μL缓冲溶液中，加入5μL annexin V-FITC和10μL PI后，混合均匀，流式细胞仪上机检测。
实施例15
Hochest染色实验
将处于对数生长期的GL261细胞以5×104/孔的密度铺于24孔板中，培养箱中培养24h，分别加入TfR/TATH7/PTX NMs,TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝5.5)，PBS处理作对照，给药结束后，PBS清洗3次，4％多聚甲醛固定10min，Hochest溶液处理各组细胞，荧光显微镜拍照观察细胞凋亡情况。
实施例16
考察纳米制剂对BMDM细胞产生细胞因子的影响
从C57小鼠骨髓中提取骨髓细胞，CFS处理10-12天后，骨髓细胞分化成巨噬细胞BMDM，分别用TfR/TATH7/PTX NMs，TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH5.5)，处理BMDM，PBS做对照组，R837的浓度为2ug/ml,4h后，收集RNA，逆转录cDNA,q-PCR法测各组的TNF-α、IL-10、IL-6、TGF-β的mRNA水平。
实施例17
考察纳米制剂对RAW264.7细胞产生细胞因子的影响
培养RAW264.7细胞，以5×104/孔的密度铺于12孔板中，培养24h，分别用TfR/TATH7/PTX NMs,TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝5.5)处理RAW264.7细胞，PBS做对照组，R837的浓度为2ug/ml，4h后，收集RNA，逆转录cDNA，q-PCR法测各组的TNF-α、IL-10、IL-6、TGF-β的mRNA水平。
实施例18
皮下脑胶质瘤模型的建立
取20只6-8周龄左右的雄性C57小鼠，右侧腋下接种GL261细胞，建立脑胶质瘤皮下模型，接种细胞数量为1*107个/只。
实施例19
纳米制剂对脑胶质瘤的抑制性研究
取20只6-8周龄的雄性雄性C57小鼠，选择处于对数生长期的GL261肿瘤细胞，以1*107/只的数量接种于C57小鼠右侧腋下，建立脑胶质瘤皮下模型。待肿瘤生长至100-120mm3时，将肿瘤体积均匀的荷瘤鼠随机为3组(n＝5)：分别注射PBS、TfR/TATH7/PTX和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs治疗组，隔天给药，共给药5次。分别于给药前称量小鼠肿瘤体积和小鼠体重。肿瘤体积按照下式计算：V＝0.5×L×D2(V为肿瘤体积,L为肿瘤长径,D为肿瘤短径)。给药结束后，处死小鼠，提取各组小鼠肿瘤组织，称重，拍照。
采用免疫组化的方法，对各组荷瘤小鼠的肿瘤组织进行Ki-67和TUNEL染色，观察PBS、TfR/TATH7/PTX和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs对肿瘤细胞的增殖、凋亡的影响。
实施例20
纳米制剂对肿瘤微环境的调节
采用免疫组化的方法，对各组荷瘤小鼠的肿瘤组织进行CD206、Foxp3和IFN-γ进行染色，观察PBS、TfR/TATH7/PTX和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs对荷瘤小鼠的肿瘤相关巨噬细胞、Treg及CD8+T细胞活化的影响。
实施例21
荷瘤小鼠生存周期的考察
取6-8周龄的雄性雄性C57小鼠，选择处于对数生长期的GL261肿瘤细胞，以1*107/只的数量接种于C57小鼠右侧腋下，建立脑胶质瘤皮下模型。待肿瘤生长至100-120mm3时，将肿瘤体积均匀的荷瘤鼠随机为3组(n＝8)：分别注射PBS、TfR/TATH7/PTX和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs治疗组，隔天给药，共给药5次，观察荷瘤小鼠的生存周期。
实施例22
原位脑胶质瘤模型的建立
取20只6-8周龄左右的雄性C57小鼠，右侧脑部接种GL261细胞，建立脑胶质瘤皮下模型，接种细胞数量为0.5*107个/只，待两周后，肿瘤形成。
实施例23
体外BBB穿过效应考察
利用脐性内皮细胞HUVE和GL261细胞共培养建立体外BBB模型，共培养结束后，在不同条件下刺激细胞，DiR包裹于纳米胶束内，追踪纳米胶束的穿过血脑屏障效应，检测GL261细胞摄取量，评价纳米胶束血脑屏障穿过效应。
实施例24
体内BBB穿过效应考察
利用健康小鼠评价TfR-T12短肽修饰的纳米胶束和未修饰的纳米胶束穿过血脑屏障的效应，DiR包载于胶束中，追踪纳米胶束的体内分布，用小动物活体成像仪观察不同给药组在脑部的聚集。
实施例25
考察纳米制剂对原位脑胶质瘤小鼠免疫因子的影响
利用GL261细胞构建原位脑胶质瘤模型，待肿瘤形成后，将小鼠随机分成3组，分别给生理盐水、単载PTX纳米胶束和共载PTX和R837的纳米胶束，给药结束后，各组小鼠眼球取血，Elisa测量其血清中TNF-α和TGF-β变化情况。
实施例26
生存周期考察
利用GL261细胞构建原位脑胶质瘤模型，待肿瘤形成后，将小鼠随机分成3组，分别给生理盐水、単载PTX纳米胶束和共载PTX和R837的纳米胶束，给药结束后，不做其他处理，观察各组小鼠生存周期。
实施例27
红外光谱法测定TfR-T12-PEG-PGLA的分子结构
TfR-T12短肽的特征吸收峰在δ＝3273.78cm-1和δ＝1620cm-1，它们分别来源于TfR-T12短肽酰胺的N-H伸缩振动和C＝O伸缩振动。而PEG-PLGA的特征吸收峰在δ＝2878.67cm-1和δ＝1750.55cm-1,它们分别归属于C-H的伸缩震动吸收峰和羰基的C＝O伸缩震动吸收峰，δ＝1456.61cm-1为C-C伸缩震动吸收峰，δ＝1093.88cm-1为PEG中醚键C-O-C的伸缩震动吸收峰。在TfR-T12-PEG-PGLA的红外图谱中(图1)，可以观察到δ＝3274.20cm-1，δ＝2878.49cm-1和δ＝1091.14cm-1特征吸收峰，它们分别来源于TfR-T12短肽的N-H伸缩振动、PLGA的C-H的伸缩震动吸收峰和PEG中醚键C-O-C的伸缩震动，因此，可以得出结论：TfR-T12短肽成功连接于PEG-PLGA的表面。
实施例28
1H-NMR测定TATH7-PEG-PLGA的分子结构
δ＝1.55处出现丙交酯-CH3-上的质子的化学位移峰，而δ＝3.7ppm处是乙二醇-CH2-上质子的化学位移峰。而TATH7上的质子的化学位移主要集中在δ＝4.8-5.3ppm左右。在TATH7-PEG-PLGA的1H-NMR图谱中可以清晰的看到δ＝3.7ppm和δ＝4.8-5.3ppm的化学位移(图2)，因此，可以得出结论：TATH7短肽成功连接于PEG-PLGA的表面。
实施例29
制备的TfR/TATH7/PTX/R837 NMs，应用马尔文粒径仪测定纳米粒的粒径分布，结果显示，TfR/TATH7/PTX/R837 NMs的粒径在220nm左右(图3(A))，多分散系数PDI为0.202，Zeta电位+14.8(图3(B))，纳米胶束的表面带正电荷，外观圆整，表面光滑，粒径分布均匀(图3(C))，说明形成的纳米胶束粒径大小适中，可用于恶性肿瘤的治疗。
实施例30
体外累计释放结果显示(图3(D,E))，在pH＝7.4条件下，TfR/TATH7/PTX/R837 NMs释药缓慢，说明在此条件下，该纳米制剂性质稳定，而在pH＝5.5条件下，TfR/TATH7/PTX/R837 NMs释放PTX和R837的速度均明显增高，说明在酸性条件下，纳米制剂稳定性降低，因此，该纳米胶束在肿瘤微环境中可迅速释放药物。
实施例31
纳米制剂在GL261、BMDM、Raw264.7细胞中的摄取情况
选择未处理的细胞作为对照，比较TfR-T12/TATH7/DiR NMs在pH＝7.4和pH＝5.5的条件下被GL261、BMDM、Raw264.7细胞摄取情况，如图4(A,B,C,)的实验结果表明：在三种细胞系中，TfR-T12/TATH7/DiR NMs在pH＝5.5条件下的细胞摄取率明显高于pH＝7.4组，这是由于在酸性条件下，TATH7短肽与PLGA之间的吸引力减弱，致使TATH7短肽暴露于PEG表面，导致TfR-T12/TATH7/DiR NMs被细胞摄取时，除了通过TfR-T12实现的受体介导的入胞情况，也有通过细胞穿膜肽介导的入胞，因此在pH＝5.5条件在TfR-T12/TATH7/DiR NMs被细胞摄取的更多。
实施例32
观察TfR-T12/TATH7/DiR NMs被GL261肿瘤细胞摄取
通过激光共聚焦显微镜法比较了TfR-T12/TATH7/DiR NMs在pH＝7.4和pH＝5.5条件下被GL261肿瘤细胞摄取的情况，如图5所示，给药相同时间后，在pH＝7.4组，只能观察到较弱的红色荧光，这是因为在这种条件下，纳米胶束被肿瘤细胞摄取是通过TfR-T12短肽介导的，而在pH＝5.5的条件下，TATH7短肽暴露于PEG表面，在这种情况下除了TfR-T12介导入胞外，TATH7也介导纳米胶束进入肿瘤细胞，所以，TfR-T12/TATH7/DiR NMs在酸性条件下更容易被肿瘤细胞摄取，呈现更强烈的红色荧光。
实施例33
流式细胞数检测纳米制剂在肿瘤细胞内的摄取机制
选择细胞摄取抑制剂氯丙嗪、染料木黄酮、EIPA和甲基-β-环糊精，处理细胞肿瘤细胞，这些抑制剂可通过不同机制影响內吞作用。氯丙嗪抑制网格蛋白介导的内吞作用，染料木黄酮是小窝蛋白抑制剂，EIPA抑制巨胞饮形式的內吞作用，而甲基-β-环糊精可抑制包括网格蛋白介导的内吞作用和网格蛋白非依赖性的内吞作用，用这些摄取抑制剂处理GL261细胞后，观察TfR-T12/TATH7/DiR NMs被GL261的摄取情况，发现在pH＝7.4条件下，各种摄取抑制剂几乎对TfR-T12/TATH7/DiR NMs被GL261的摄取没有影响，这是因为在pH＝7.4的条件下，TfR-T12/TATH7/DiR NMs被GL261的摄取是通过TfR-T12短肽发挥的受体介导形式，摄取抑制剂不影响此过程，因此可以看到摄取曲线向右偏移不大，而在pH＝5.5条件下，TATH7短肽暴露出来，TfR-T12/TATH7/DiR NMs被GL261的摄取情况变得复杂，除了TfR-T12介导的入胞，细胞穿膜肽TAT也发挥重要作用，图6结果显示甲-β-环糊精和染料木黄酮两种细胞摄取抑制剂对TfR-T12/TATH7/DiR NMs被GL261的摄取的影响较小，而氯丙嗪和EIPA显著影响TfR-T12/TATH7/DiR NMs的摄取，这说明在pH＝5.5的条件下TfR-T12/TATH7/DiR NMs主要是通过网格蛋白介导的內吞形式进入肿瘤细胞的，此外EIPA对TfR-T12/TATH7/DiR NMs被GL261的摄取也有一定影响，说明可有部分纳米胶束是通过巨胞饮的方式被肿瘤细胞摄取的。
实施例34
CCK8实验结果
采用CCK8法考察了TfR/TATH7/PTX/R837 NMs对GL261细胞的增殖抑制情况，如图7所示，在PTX相同给药剂量时，TfR/TATH7/PTX NMs,TfR/TATH7/PTX/R837 NMs对GL261细胞抑制效果几乎相同，没有统计学差异，这说明共载纳米胶束中，对肿瘤细胞有杀伤作用的是PTX，而R837对肿瘤细胞几乎没有抑制效果。当体系中pH降到5.5后，由于TAT的暴露，摄取增加，TfR/TATH7/PTX/R837 NMs对GL261的抑制效果略有增加，但是由于PTX抑制浓度已达上限，抑制效果不再随着PTX的剂量的增加而增加，因此，在pH＝7.4和pH＝5.5的介质中，抑制效果没有显著区别。
实施例35
克隆形成抑制实验
如图8，考察了不同给药组对GL261克隆形成的抑制效果，研究结果显示，TfR/TATH7/PTX NMs,TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝5.5)对GL261细胞的克隆形成均有不同程度的抑制，比较TfR/TATH7/PTX NMs和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)两组在相同pH条件下的抑制效应，发现TfR/TATH7/PTX NMs组略好于TfR/TATH7/PTX/R837 NMs组，这可能是由于TfR/TATH7/PTX NMs粒径小于TfR/TATH7/PTX/R837 NMs，更容易被肿瘤细胞摄取所致，而比较TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝5.5)两组对GL261细胞的克隆形成抑制效果，发现pH＝5.5条件下，抑制效果显著强于pH＝7.4条件下，这可能是因为在偏酸性环境中，TAT的暴露，致使GL261细胞摄取更多纳米胶束，因此抑制效果更加显著。
实施例36
TfR/TATH7/PTX/R837 NMs引起GL261凋亡实验
采用流式细胞术考察TfR/TATH7/PTX/R837 NMs诱导GL261细胞凋亡的情况，实验结果显示(图9)：在给药相同时间内，TfR/TATH7/PTX和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4条件下)诱导凋亡率分别是24.53％和20.1％，这可能是因为R837对GL261凋亡没有影响，而同时包载PTX和R837的纳米胶束粒径较大，影响其被肿瘤细胞摄取，而TfR/TATH7/PTX/R837NMs(pH＝5.5)诱导凋亡率23.17，相比于pH＝7.4的环境中，细胞凋亡率略有增加，这是由于在偏酸环境中，TAT的暴露，致使纳米胶束被肿瘤细胞摄取增加。
实施例37
Hochest实验结果
通过荧光显微镜，观察给药后各组细胞凋亡形态，实验结果如图所示(图10)，空白组细胞的细胞核完整，且细胞形态未发生变化，而TfR/TATH7/PTX、TfR/TATH7/PTX/R837NMs(pH＝7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837NMs(pH＝5.5)组，细胞形态改变，细胞密度降低，细胞核发生不同程度的破碎，且能观察到凋亡小体。
实施例38
TfR/TATH7/PTX/R837 NMs影响BMDM细胞产生细胞因子
如图11所示，比较TfR/TATH7/PTX和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)两组对BMDM细胞产生TNF-a的影响，发现加入R837后，能够引起引起BMDM细胞大量释放肿瘤坏死因子TNF-a，而TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝5.5)同样能够引起TNF-a的产生，但与pH＝7.4组没有显著差异；同样比较TfR/TATH7/PTX和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)两组对BMDM细胞产生IL-6的影响，发现TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)能够引起BMDM细胞释放IL-6增加，而pH＝5.5条件下，TfR/TATH7/PTX/R837 NMs诱导BMDM细胞释放IL-6显著增加；TfR/TATH7/PTX和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)对BMDM细胞产生IL-10的影响较小，没有显著差异。而pH＝5.5条件下，TfR/TATH7/PTX/R837 NMs诱导BMDM细胞释放IL-10略有增加；TfR/TATH7/PTX,TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝5.5)对BMDM细胞产生TGF-β没有显著影响(图11A-D)。
实施例39
TfR/TATH7/PTX/R837 NMs影响RAW264.7细胞产生细胞因子
如图11E-H所示，比较TfR/TATH7/PTX和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)两组对RAW264.7细胞产生TNF-a的影响，发现同时载入R837后，能够引起引起RAW264.7细胞大量释放TNF-a，而TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝5.5)同样能够引起TNF-a的释放，但与pH＝7.4组没有显著差异；同样比较TfR/TATH7/PTX和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)两组对RAW264.7细胞产生IL-6的影响，发现TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝5.5)均能够引起RAW264.7细胞释放IL-6增多，但是两组之间没有显著性差异；与BMDM的实验结果不同，在RAW264.7细胞系中，TfR/TATH7/PTX能够引起IL-10的释放,同时共载R837后，TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝5.5)均能引起RAW264.7细胞产生IL-10的影响降低，且在pH＝5.5条件下IL-10产生减少更显著；TfR/TATH7/PTX NMs,TfR/TATH7/PTX/R837 NMs(pH＝7.4)和TfR/TATH7/PTX/R837NMs(pH＝5.5)对BMDM细胞产生TGF-β没有显著影响。
实施例40
皮下脑胶质瘤模型的建立
在雄性C57小鼠右侧腋下接种GL261细胞，建立皮下脑胶质瘤模型，接种3周后，在C57小鼠右侧腋下即平均体积约120mm2左右的肿瘤，肿瘤形状呈圆形，大小均一。
实施例41
TfR/TATH7/PTX/R837 NMs体内抗肿瘤效果
研究结果表明(图12A-B)，给药结束后，TfR/TATH7/PTX NMs和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs对荷瘤小鼠肿瘤增长均有显著抑制效果，且两者之间差异不明显，这可能是因为在肿瘤生长抑制方面，PTX起主要作用，而R837对肿瘤增长没有抑制效果。给药结束后对各组荷瘤小鼠进行肿瘤组织分离后，并对其进行免疫组化染色，检测肿瘤组织中Ki-67(肿瘤细胞增殖的标志)和TUNEL(肿瘤细胞凋亡的标志)的变化，发现TfR/TATH7/PTX/R837NMs组存在明显肿瘤细胞生长抑制现象，但是TfR/TATH7/PTX NMs和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs诱导细胞凋亡效果不显著(图13)。荷瘤小鼠生存周期考察结果显示，PBS、TfR/TATH7/PTX NMs和TfR/TATH7/PTX/R837 NMs各组小鼠的生存周期分别是46天、59天和66天，共载组荷瘤小鼠的生存周期明显延长，这可能是因为TfR/TATH7/PTX/R837 NMs中，由于R837的存在，使该组小鼠肿瘤组织中的肿瘤相关巨噬细胞明显减少，解除免疫抑制现象，近而活化CD8+T细胞，增强了免疫学效应，因此相比于単载化疗药物组，改组小鼠具有更强的肿瘤抑制效果(图14)。
实施例42
TfR/TATH7/PTX/R837 NMs促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化
从免疫组化结果，如图15，可以看出，相比于単载PTX的TfR/TATH7/PTX NMs组，TfR/TATH7/PTX/R837 NMs对CD206影响更显著，CD206是肿瘤相关巨噬细胞标志分子，CD206的下降，说明在肿瘤微环境中，肿瘤相关巨噬细胞明显减少，而IFN-γ是CD8T细胞的活化的标志，研究结果发现，TfR/TATH7/PTX/R837 NMs能够促进CD8T细胞的活化。而对Treg细胞影响较小。
实施例43
原位脑胶质瘤模型的建立
在雄性C57小鼠右脑接种GL261细胞，建立原位脑胶质瘤模型，接种2周后，肿瘤形成，此时小鼠生理状态欠佳，毛发不光滑。
实施例44
TfR/TATH7/DiR NMs血脑屏障穿过效应
体外血脑屏障穿过效应研究结果表明(图16A-D)，相比于pH＝7.4条件，TfR/TATH7/DiR NMs在pH＝5.5的介质中更容易穿过BBB系统，这是因为pH减低的条件下TAT暴露于纳米胶束表面，而TAT是通过网格蛋白介导方式被细胞摄取的，因此TAT的细胞穿膜效应特异性低。另外，在健康小鼠体内，比较了TfR-T12修饰纳米胶束和未修饰纳米胶束在小鼠体内的分布，尤其在脑组织的分布，发现TfR-T12修饰纳米胶束更容易在脑部聚集，而未修饰的纳米胶束在脑补聚集较少，因此得出结论：TfR-T12修饰纳米胶束更容易穿过血脑屏障。
实施例45
TfR/TATH7/PTX/R837 NMs改善肿瘤微环境的肿瘤抑制现象
原位接种脑胶质瘤两周后开始给药，给药结束后，各组小鼠眼球取血，ELISA法测量小鼠血清中相关免疫因子的变化，ELISA实验结果ru图17A和B显示：相比于単载化药组，TfR/TATH7/PTX/R837 NMs引起TNF-a增多，而TGF-β显著下降。这主要是R837的存在，作用于Toll-7受体，引发系列免疫学效应，而改变了肿瘤微环境中免疫抑制现象，有助于肿瘤的治疗。
实施例46
TfR/TATH7/PTX/R837 NMs延长小鼠生存周期
原位脑胶质瘤小鼠生存周期考察结果表明(图18)：生理盐水组(saline)、TfR/TATH7/PTX NMs组小鼠的生存周期在给药结束后均快速死亡，相比于单独给化疗药物，共载PTX和R837组荷瘤小鼠的生存周期明显延长了，这是由于R837的存在，致使肿瘤微环境中抑制肿瘤生长的细胞因子日TNF-a增加，而促进肿瘤生长、恶化的细胞影子如TGF-β明显降低，近而增强了免疫学效应，因此相比于単载化疗药物的纳米胶束，共载胶束更有利于荷瘤小鼠的肿瘤治疗。
实施例47
纳米制剂安全性评价
重要器官的H&E染色结果可以直接反映纳米制剂的副作用。给药结束后，对各组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾组织切片进行染色，各器官没有发现明显的损伤，表明该纳米复合制剂毒性较低(图19)。
综上所述，本发明提供的一种纳米制剂及其制备方法与应用，该纳米胶束以PEG-PLGA为载体，通过酰胺键连接TfR-T12短肽和pH敏感性细胞穿膜肽(TATH7)。该纳米胶束作为药物载体，可同时递送抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)和免疫调节剂米喹莫唑(R837)，使其顺利穿过血脑屏障，实现药物靶向递送，并调节肿瘤微环境免疫抑制现象。此外该纳米制剂具有毒副作用小，顺利穿过血脑屏障系统，增强肿瘤细胞及肿瘤相关巨噬细胞摄取效率等优点，具有广泛的应用前景。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种纳米制剂，其特征在于，所述纳米制剂包括纳米胶束和包载于所述纳米胶束内的抗肿瘤药物和免疫调节剂，所述纳米胶束由TfR-T12-PEG-PLGA和TATH7-PEG-PLGA自组装而成；
所述TfR-T12-PEG-PLGA是TfR-T12短肽中的氨基与PEG-PLGA中的羧基通过缩合反应得到；
所述TATH7-PEG-PLGA是TATH7短肽中的氨基与PEG-PLGA中的羧基通过缩合反应得到；
所述抗肿瘤药物为紫杉醇，所述免疫调节剂为咪喹莫特，所述TfR-T12短肽的氨基酸序列为THRPPMWSPVWP，所述TATH7短肽的氨基酸序列为RRRQRRKKRGYGGGCGHHHHHHH，所述纳米制剂的粒径为220nm。
2.一种权利要求1所述的纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：
提供TfR-T12-PEG-PLGA和TATH7-PEG-PLGA，其中所述TfR-T12-PEG-PLGA是TfR-T12短肽中的氨基与PEG-PLGA中的羧基通过缩合反应得到，所述TATH7-PEG-PLGA是TATH7短肽中的氨基与PEG-PLGA中的羧基通过缩合反应得到；
将所述TfR-T12-PEG-PLGA和TATH7-PEG-PLGA溶解于溶剂中，加入抗肿瘤药物和免疫调节剂，得到混合液；
将所述混合液加入水中，进行搅拌，经透析、干燥，得到所述纳米制剂。
3.根据权利要求2所述的纳米制剂的制备方法，其特征在于，将所述TfR-T12-PEG-PLGA和TATH7-PEG-PLGA按1:1的质量比溶解于溶剂中。
4.一种权利要求1所述的纳米制剂在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。
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