CN111116755B - Ta多肽及其修饰的药物递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种TA多肽及其修饰的药物递送系统及其制备方法和应用。该多肽包含氨基酸序列RKKRRQRRR和氨基酸序列ATWLPPR。具备生物屏障穿透能力，并且能够通过靶向结合VEGFR‑2和NRP‑1受体抑制新生血管的增殖、迁移等活性。该多肽可以用于肿瘤新生血管的靶向治疗和诊断，将其修饰至基因药物递送系统中，能够携带治疗基因穿透血脑屏障BBB和血瘤屏障BBTB，并且促进基因药物在肿瘤及新生血管部位的摄取和表达，实现对原位胶质瘤有效的靶向治疗。

Description

TA多肽及其修饰的药物递送系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种TA多肽及其修饰的药物递送系统及其制备方法 和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视 为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
脑胶质瘤是一种最常见的颅内肿瘤，发病率高，多呈恶性表现，手术较难完全切除且复 发率高。当前胶质瘤的治疗方法主要以手术切除为主，辅以放疗和化疗，但是由于手术前胶 质瘤在正常脑组织呈浸润生长，分界模糊，手术难以精确的将其切除，残留胶质瘤细胞极度 容易复发，术后放疗副作用较大，使患者生存质量降低，化疗药物毒性较大，且大多化疗药 物难以透过血脑屏障入脑又进一步限制其药效发挥。脑胶质瘤中新生血管十分丰富，胶质瘤 间质的血管参与组建肿瘤微环境，并为胶质瘤细胞的生长、繁殖、浸润等提供充足的营养物 质。血管内皮细胞增殖和高度血管化已经成为了恶性胶质瘤的主要的生理组织特征之一。内 皮抑素(Endostatin，ES)是目前已知功能最强的血管生成抑制因子，能特异性地抑制血管 内皮细胞增殖，从而有效地抑制血管生成和肿瘤生长。2005年，我国已将新型融合人内皮抑 素(恩度)应用于临床非小细胞肺癌的治疗，成为新一代抗肿瘤药物。Endostatin的生物学 功能如下：(1)抑制内皮细胞的增殖、迁移、侵袭及诱导内皮细胞的凋亡，且不影响正常静 息血管内皮细胞的生理功能。(2)抑制肺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤等多种恶性 肿瘤的生长和转移，发挥广谱的抗肿瘤作用。但是Endostatin存在以下缺点：其纯化工艺复 杂，造价高；理化性质不稳定，容易失活；需要频繁给药，给患者造成极大不便；因为其为 蛋白大分子药物难以透过血脑屏障。
基于以上不足，发明人发现若采用基因靶向递送系统将ES的基因递送至胶质瘤血管内 皮细胞和肿瘤细胞内并使其高效表达，以自分泌或旁分泌的形式抑制血管生成及肿瘤生长将 会较大程度的提高其疗效及临床应用价值；但是，治疗脑胶质瘤的Endostatin基因靶向递送 系统需要克服以下两个问题：血脑屏障(Blood–Brain Barrier，BBB)、血-脑-肿瘤屏障 (Blood–Brain-Tumor Barrier，BBTB)对药物的阻挡作用，基因药物对肿瘤组织的非选择性。
发明内容
为解决以上问题，本发明的目的在于提供一种新结构的多功能TA多肽，其包含氨基酸 序列RKKRRQRRR和氨基酸序列ATWLPPR。该多肽具备穿透生理性屏障的能力，又能与血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)和神经纤毛蛋白-1(NRP-1)受体有更强的靶向结合能力，并且能与重组人血管内皮生长因子165(VEGF165)较强的竞争性结合VEGFR-2和 NRP-1受体，抑制内皮细胞的增殖、迁移等活性。
本发明的第二目的在于提供该TA多肽修饰的聚合物材料及其制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种载药纳米复合物及其制备方法，该载药纳米复合物包含 上述TA多肽修饰的聚合物材料和至少一种药物。
本发明的第四目的在于提供一种靶向递送系统，其包括上述TA多肽；或者包括上述TA 多肽修饰的聚合物材料。
本发明的第五目的在于提供一种载药靶向递送系统，其包括上述靶向递送系统和至少一 种药物；或者包括上述载药纳米复合物。
本发明的第六目的在于提供一种组合物或制剂或试剂盒，其包括上述TA多肽、上述TA 多肽修饰的聚合物材料、上述载药纳米复合物、上述靶向递送系统或上述载药靶向递送系统 中的一种或多种，也可以包含适宜的辅料或载体。
本发明的第七目的在于提供一种造影物质(或造影剂)，其包括上述TA多肽、上述TA 多肽修饰的聚合物材料、上述载药纳米复合物、上述靶向递送系统或上述载药靶向递送系统 中的一种或多种和一个或多个可检测标记。
标记可为可在化学反应、物理反应或酶反应中检测到的化合物或在反应中直接或间接地 产生信号的化合物。标记和检测可根据本技术领域所熟知的方法来执行。标记包含荧光标记、 酶标记、显色标记、发光标记、辐射标记、半抗原、生物素、金属复合体、金属和胶体金， 但不限于这些。该标记的所有形式在此工作领域是众所周知的，该标记的所有形式可自各供 货商购得。
本发明的第八目的在于提供上述TA多肽、上述TA多肽修饰的聚合物材料、上述载药 纳米复合物、上述靶向递送系统、上述载药靶向递送系统、上述造影物质的应用。
具体地，本发明提供了上述TA多肽在制备上述TA多肽修饰的聚合物材料、上述载药 纳米复合物、上述靶向递送系统、上述载药靶向递送系统或上述造影物质中的应用。
以及，本发明提供了上述TA多肽、上述TA多肽修饰的聚合物材料、上述载药纳米复合物、上述靶向递送系统、上述载药靶向递送系统或上述造影物质在下述(1)至(6)所列 事项中的应用：
(1)在制备特异性靶向结合VEGFR-2和/或NRP-1受体的药物或制剂或试剂盒中的应 用。
(2)在制备与VEGF165竞争性结合VEGFR-2和/或NRP-1受体的药物或制剂或试剂盒中的应用。
(3)在制备靶向性药物或制剂或试剂盒中的应用。
(4)在制备治疗抗肿瘤的药物或制剂或试剂盒中的应用。
(5)在制备抗血管生成抑制剂中的应用。
(6)在制备抑制内皮细胞增殖和/或迁移和/或血管生成的药物或制剂或试剂盒中的应 用。
具体地，本发明的技术方案涉及以下方面：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种TA多肽，其包含氨基酸序列RKKRRQRRR和氨基酸序列ATWLPPR。
所述氨基酸序列RKKRRQRRR和氨基酸序列ATWLPPR以半胱氨酸作为连接臂；优选地，所述多肽包括氨基酸序列RKKRRQRRRCATWLPPR。
本发明的多肽具备穿透生物屏障(如血脑屏障、血-脑-肿瘤屏障、眼球屏障等)的能力， 又能与血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)和/或神经纤毛蛋白-1(NRP-1)受体有更强的 靶向结合能力，并且能与重组人血管内皮生长因子165(VEGF165)较强的竞争性结合 VEGFR-2和/或NRP-1受体，抑制内皮细胞的增殖、迁移、血管生成等活性。
本发明包括上述多肽序列中经过缺失，插入，或者顺序改变但具备相同的生物学活性或 生理功能的多肽。
具体地，本发明TA多肽的构建始于发明人的以下构思：
如背景技术中所述，为克服已知常规Endostatin的缺陷，发明人发现若采用基因靶向递 送系统将ES的基因递送至胶质瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞内并使其高效表达，以自分泌或 旁分泌的形式抑制血管生成及肿瘤生长将会较大程度的提高其疗效及临床应用价值；但是， 治疗脑胶质瘤的Endostatin基因靶向递送系统需要克服以下两个问题：血脑屏障(Blood–Brain Barrier，BBB)、血-脑-肿瘤屏障(Blood–Brain-Tumor Barrier，BBTB)对药物的阻挡作用， 基因药物对肿瘤组织的非选择性。
发明人发现若在基因靶向递送系统中修饰合适的配体，克服以上问题，便能有效的提高 Endostatin基因药物对脑胶质瘤的治疗效果。
肿瘤组织部位往往高表达有很多特征分子和蛋白受体，是药物靶向递送有效的靶点。 VEGFR-2是一种蛋白酪氨酸激酶受体，其在胶质瘤新生血管部位高表达，当它被VEGF165 刺激后，能促进血管内皮细胞的I型跨膜糖蛋白，NRP-1通常在肿瘤血管内皮细胞及一些肿 瘤细胞(如胶质瘤，黑色素瘤等)部位高表达，是VEGFR-2的共受体，当和VEGF165结合 以后，不仅能够增强VEGFR-2的活化，而且能通过单独下游通路促进血管生成，因此，VEGFR-2和NRP-1可作为肿瘤新生血管及肿瘤血管的重要靶标。
ATWLPPR(AT7)是从噬菌体展示库中筛选出来的一种小肽，由七个氨基酸组成，其与VEGFR-2和NRP-1两种受体具有靶向结合能力，能够靶向于VEGFR-2和NRP-1两种受体 高表达的新生血管及肿瘤等部位。但是AT7对血脑屏障BBB的穿透性较弱，阻碍了其对脑 部肿瘤及新生血管的靶向作用的发挥。
Tat蛋白是源自人类I型免疫缺陷病毒HIV-I的反式激活因子。其第49-57位氨基酸残 基序列是一段碱性区域并具有蛋白转导功能，其氨基酸序列为RKKRRQRRR(TAT PTD)，能够自主穿透细胞膜进入细胞，TAT PTD携带货物分子能够穿透BBB、眼球屏障(blood-retina barrier,BRB)等生理屏障，可以在治疗脑神经胶质瘤、中枢神经系统等疾病中表现出巨大优 势。血脑屏障由血管内皮细胞和胶质细胞交织形成，NRP-1受体同样表达于血管内皮细胞表 面，与NRP-1的结合可以增加配体的内化及增加血管通透性。具有C端R/KXXR/K序列的 多肽能够特异性识别NRP-1受体，增强其受体介导的肿瘤组织和血管渗透性。
本发明利用或不利用连接臂，用TAT PTD对AT7进行修饰，比如，在本发明的一些实施方式中，本发明构建了一种以半胱氨酸作为连接臂的新型多功能多肽RKKRRQRRRCATWLPPR(即TA)，其既具备生物屏障穿透性和组织血管渗透性，又能更强 的靶向结合于VEGFR-2和NRP-1两种受体，在体内外表现出强烈的抑制血管新生的作用， 将TA修饰至基因递送系统中，便能使其携带治疗药物在穿透生物屏障后通过受体介导的主 动靶向策略将基因药物递送至肿瘤部位，发挥更有效的治疗作用。比如，当不使用连接臂时， 氨基酸序列RKKRRQRRR和氨基酸序列ATWLPPR可直接相连；比如，连接臂可以为1个 或多个氨基酸或功能肽，氨基酸可选自甘氨酸、丙氨酸和半胱氨酸中一种或多种；多肽可以 有一种或多种，多肽可由若干数量的上述氨基酸中的一种或多种组成。
比如，在本发明的一些实施方式中，本发明创新性的利用半胱氨酸将两部分氨基酸序列 (即氨基酸序列RKKRRQRRR和氨基酸序列ATWLPPR)连接，体内外的活性评价实验发现半胱氨酸的存在更好的促进了TA活性的发挥，并且相比于单独的AT7有着更强的血管新生抑制活性。此外，在本发明多个实施方式中，相较于上述两组氨基酸序列的直接相连或以功能肽作为连接臂，比如以若干个半胱氨酸组成的功能肽作为连接臂，或者以数量不等的甘 氨酸和/或丙氨酸组成的1个或多个功能肽为连接臂，以及相较于以甘氨酸或丙氨酸作为连接 臂形成的多肽，以半胱氨酸作为连接臂总是能够显示出更好的更强的血管新生抑制活性，能 够更好的促进TA活性的发挥。
在本发明的第二方面，本发明提供了上述TA多肽修饰的聚合物材料及其制备方法，所 述聚合物材料为阳离子聚合物材料；比如可以为聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖、脂质体、树枝 状阳离子聚合物等。进行修饰时TA的半胱氨酸的巯基与聚合物的相应基团连接，比如TA 的半胱氨酸的巯基可以选择或不选择与连接臂相连(比如通过加成等反应)，然后与聚合物 上的相关基团(比如氨基)反应连接(比如与伯氨基进行缩合反应)。
根据本发明的一个实施方式，本发明提供了一种TA修饰的聚乙烯亚胺(PEI-PEG-TA)材 料，其具有式(I)所示结构：
Figure BDA0002220882650000051
其中，分子量为6-160KD，进一步为16-90KD，比如，在本发明的实施方式中，其分子量可以为38KD左右。
根据本发明的一个实施方式，上述TA修饰的聚乙烯亚胺材料(PEI-PEG-TA材料，即式 (I))的制备方法，其以马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯(MAL-PEG-NHS)作为连接臂与TA反应，再与聚乙烯亚胺(PEI)缩合；
其中，马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯具有式(II)所示结构：
Figure BDA0002220882650000052
式(II)中，从左至右的基团依次来自于NHS、PEG和MAL(因此，式(II)化合物 MAL-PEG-NHS也可写作NHS-PEG-MAL)。
其中，MAL-PEG-NHS的分子量为1-20KD，进一步为2-10KD，优选为2-8KD(如2KD,3.5KD,5KD和7.5KD等)，比如在本发明的一个实施方式中，其分子量为2KD。
其中，聚乙烯亚胺具有式(III)所示结构：
Figure BDA0002220882650000053
其中，聚乙烯亚胺的分子量为1-70KD，进一步为10-25KD，比如在本发明的一个实施 方式中，其分子量为25KD。
进一步地，根据本发明的实施方式，所述PEI-PEG-TA材料的制备方法包括 TA的半胱氨酸的巯基与连接臂MAL-PEG-NHS的马来酰亚胺MAL端发生加成 反应，生成NHS-PEG-TA，通过其琥珀酰亚胺乙酸酯NHS端与PEI的伯氨基发 生缩合反应，合成TA修饰的PEI-PEG-TA材料(式I)。
NHS-PEG-TA的分子量为2-30KD，进一步为2-20KD，比如，在本发明的 实施方式中，其分子量可以为4KD左右。
根据本发明的一个实施方式，本发明所述PEI-PEG-TA材料的制备方法可按以下合成路 线进行：
Figure BDA0002220882650000062
在本发明的某些实施方式中，在所述PEI-PEG-TA材料的制备方法中，TA和 NHS-PEG-MAL分别溶解于溶剂中，比如DMSO或DMF中反应，在惰性气体(比如氮气) 保护下反应，比如反应1-24小时或12小时，分离得到产物NHS-PEG-TA，分离可采用常规 方法，比如可采用柱凝胶，举例而言，反应结束后将反应产物转入Sephadex S30凝胶柱，用 流速为1ml/min的磷酸盐缓冲液流动相对产物进行分离纯化，产物NHS-PEG-TA冻干。PEI 溶解于磷酸盐缓冲溶液中，pH在6.8-7.5之间，优选7.2，将得到的NHS-PEG-TA溶解于溶 剂中，比如DMSO中，搅拌下加入到PEI溶液中，在惰性气体(比如氮气)保护下反应，用 截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析48h，冻干得PEI-PEG-TA材料。
进一步地，在本发明的某些实施方式中，在所述PEI-PEG-TA材料的制备方法中，TA与NHS-PEG-MAL摩尔比为1～4：1～3，优选为4：3。PEI与NHS-PEG-TA的摩尔比1～8：1～2， 优选为4：1。
在本发明的第三方面，本发明还提供了一种载药纳米复合物，其包含上述TA多肽修饰 的聚合物材料和至少一种药物。
在本发明的一个实施方式中，所述载药纳米复合物包括上述PEI-PEG-TA材料和至少一 种药物。
举例而言，所述药物可以为基因药物，比如Endostatin基因。
在本发明的第四方面，本发明提供了上述载药纳米复合物的制备方法，其包括将药物逐 滴加入TA多肽修饰的聚合物材料中。
在本发明的一个实施方式中，所述载药纳米复合物的制备方法包括将药物逐滴加入上述 PEI-PEG-TA材料中、涡旋、静置。
在某些实施方式中，所述滴加过程在涡旋条件下进行。所述涡旋为低速涡旋，所述低速， 比如可以为200-300r/min的速度。涡旋时间视材料量而定的，比如可以为10-60s、比如30s、 40s、45s、50s、60s等等。静置时间为10-60min，优选30min。
举例而言，当所述药物为基因药物，比如为Endostatin基因时，所述Endostatin基因的 制备方法包括将Endostatin质粒在低速涡旋条件下逐滴加入到PEI-PEG-TA基因递送材料中， 涡旋30s，静置30min。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种靶向递送系统，其包括上述TA多肽；或者包 括上述TA多肽修饰的聚合物材料(比如上述PEI-PEG-TA材料)。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种载药靶向递送系统，其包括上述靶向递送系统 和至少一种药物；或者包括上述载药纳米复合物。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种组合物或制剂或试剂盒，其包括上述TA多肽、 上述TA多肽修饰的聚合物材料、上述载药纳米复合物、上述靶向递送系统或上述载药靶向 递送系统中的一种或多种，也可以包含适宜的辅料或载体。
在本发明的第八方面，本发明提供了一种造影物质(或造影剂)，其包括上述TA多肽、 上述TA多肽修饰的聚合物材料、上述载药纳米复合物、上述靶向递送系统或上述载药靶向 递送系统中的一种或多种和一个或多个可检测标记。
标记可为可在化学反应、物理反应或酶反应中检测到的化合物或在反应中直接或间接地 产生信号的化合物。标记和检测可根据本技术领域所熟知的方法来执行。标记包含荧光标记、 酶标记、显色标记、发光标记、辐射标记、半抗原、生物素、金属复合体、金属和胶体金， 但不限于这些。该标记的所有形式在此工作领域是众所周知的，该标记的所有形式可通过供 应商购得。
通过使本发明的TA多肽、TA多肽修饰的聚合物材料、载药纳米复合物、靶向递送系统 或载药靶向递送系统中的一种或多种与一个或多个可检测标记(比如异硫氰酸荧光素FITC、 荧光素酶luciferase、红色荧光蛋白mCherry、近红外染料吲哚菁绿ICG等等)缀合，可将其 用作对比造影物质以监测药物的移动过程或在体内的分布情况或基因的移动、表达及分布情 况细胞移植的过程或在细胞治疗中的移植细胞等等。
在本发明的第八方面，本发明提供了上述TA多肽、上述TA多肽修饰的聚合物材料、上述载药纳米复合物、上述靶向递送系统、上述载药靶向递送系统、上述造影物质的应用。
具体地，本发明提供了上述TA多肽在制备上述TA多肽修饰的聚合物材料、上述载药 纳米复合物、上述靶向递送系统、上述载药靶向递送系统或上述造影物质中的应用。
以及，本发明提供了上述TA多肽、上述TA多肽修饰的聚合物材料、上述载药纳米复合物、上述靶向递送系统、上述载药靶向递送系统或上述造影物质在下述(1)至(6)所列 事项中的应用：
(1)在制备特异性靶向结合VEGFR-2和/或NRP-1受体的药物或制剂或试剂盒中的应 用。
(2)在制备与VEGF165竞争性结合VEGFR-2和/或NRP-1受体的药物或制剂或试剂盒中的应用。
(3)在制备靶向性药物或制剂或试剂盒中的应用，尤其脑靶向性。
(4)在制备治疗抗肿瘤的药物或制剂或试剂盒中的应用，尤其脑部肿瘤，比如脑胶质 瘤。
(5)在制备抗血管生成抑制剂中的应用，比如胶质瘤血管。
(6)在制备抑制内皮细胞增殖和/或迁移和/或血管生成的药物或制剂或试剂盒中的应 用。
以及，在本发明的第九方面，本发明提供了上述TA多肽、上述TA多肽修饰的聚合物材料、上述载药纳米复合物、上述靶向递送系统、上述载药靶向递送系统或上述造影物质在疾病的靶向治疗和诊断中的应用，比如对肿瘤血管新生、脑胶质瘤等的靶向治疗、肿瘤成像及诊断的应用。
本发明首次证明了穿膜肽TAT不仅能够穿透细胞膜和生物屏障，还能够靶向结合NRP-1 受体，增强受体介导的细胞摄取和组织渗透。本发明结合穿膜肽TAT和靶向肽AT7的结构 特征和功能，通过固相合成法设计合成了一种新型多功能多肽TA，通过实验证明相比于TAT 和AT7，TA与VEGFR-2和NRP-1受体具备更高的亲和活性，能够显著抑制内皮细胞的增殖、 迁移，抑制新生血管的生成及肿瘤的生长，实现对肿瘤新生血管的靶向诊断及治疗。与此同 时，TA还具备较强的生理性屏障穿透能力及脑靶向性。由TA修饰的聚乙烯亚胺递送材料构 建的基因递送系统，对细胞的毒性降低，能够被溶酶体摄取并逃逸出来，基因转染效率明显 提高，并且可以携带基因药物高效的穿透血脑屏障，靶向到脑肿瘤部位，显著增加基因药物 的肿瘤组织渗透性，增强治疗基因在脑肿瘤部位的表达及对肿瘤生长的抑制效果。
此外，本发明首次通过体内外实验证明了新构建的多功能多肽TA不仅可以单独作为一 种血管生成抑制剂和诊断剂，还可以作为一种高效的脑靶向配体，对化疗药物、纳米递药系 统等进行修饰，增强血脑屏障透过性和脑肿瘤的靶向性，发挥更好的治疗效果。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性 实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细 说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1中TA的HPLC纯化图谱(左图)和ESI-MS结构鉴定图谱(右图)。
图2为实施例1中FITC-TA的HPLC纯化图谱(左图)和ESI-MS结构鉴定图谱(右图)。
图3为实施例2和实施例7中所述PEI和PEI-PEG-TA的1H NMR图谱。
图4为实施例3中AT7、TAT、TA分别与NRP-1(A)和VEGFR-2(B)的结合能力SPR 传感曲线图。kD值越小，结合能力越强。
图5为实施例3中TA与VEGF165竞争性结合NRP-1(A)和VEGFR-2(B)的能力的 SPR传感曲线图。
图6为实施例4中FITC-TA与人脐静脉内皮细胞HUVEC高表达的VEGFR-2(A)及 NRP-1(B)受体的共定位。蓝色表示细胞核，红色表示经免疫染色后的VEGFR-2及NRP-1 受体，绿色分别代表FITC-AT7、FITC-TAT、FITC-TA。
图7为实施例5中TA对人脐静脉内皮细胞HUVEC小管形成的影响。
图8为实施例5中TA对人脐静脉内皮细胞HUVEC迁移作用的影响。
图9为实施例6中FITC-TA的在裸鼠脑原位胶质瘤组织内的分布。蓝色表示细胞核，红 色表示带红色蛋白mCherry标记的U87脑胶质瘤组织，绿色分别代表FITC-AT7、FITC-TAT、 FITC-TA。
图10为实施例7中PEI-PEG-TA对人脐静脉内皮细胞HUVEC的细胞毒性。PEI为未 被修饰的基因材料，PPA为PEI-PEG-AT7，PPT为PEI-PEG-TAT，PPTA为PEI-PEG-TA。图 10中每组浓度的4根柱状图中，从左至右依次对应PEI、PPA、PPT、PPTA。
图11为实施例8中目的基因质粒Endostatin的基因测序结果图。
图12为实施例8中PEI-PEG-TA载Endostatin基因纳米复合物的表征结果图；A为PEI-PEG-TA/Endostatin纳米复合物的粒径分布图和电位分布图；B为不同载基因材料复合物 的透射电镜图；C为琼脂糖凝胶电泳图。
图13为实施例9中载红外染料吲哚菁绿(ICG)的PEI-PEG-TA对裸鼠脑原位胶质瘤靶向 性实验，图为活体红外分布结果。
图14为实施例10中PEI-PEG-TA载pEGFP基因纳米复合物体外细胞转染荧光拍照图。
图15为实施例10中PEI-PEG-TA载pEGFP基因纳米复合物裸鼠脑内转染荧光拍照图。
图16为实施例11中PEI-PEG-TA载Endostatin基因纳米复合物体内抗裸鼠原位脑胶质 瘤药效学研究；A为在不同的时间点检测的裸鼠脑原位胶质瘤生物发光照片；B为裸鼠脑原 位胶质瘤生物发光强度随时间变化统计折线图(不同折线以垂直于横坐标点20的方向，自 上而下依次对应于saline、PEI、PPA、PPT、PPTA、TMZ、基线)。*represent*p<0.05compared with PEI group.#represent#p<0.05compared with PPA group,&represent&p<0.05compared with PPT group.
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件 或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相 同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明中涉及的序列信息如表1所示：
表1
Figure BDA0002220882650000101
Figure BDA0002220882650000111
实施例1 TA、Fluorescein-TA的合成和表征。
(1)取一定量的树脂放入反应器，加入二氯甲烷(DCM)溶胀半小时，然后抽掉DCM，加入序列中的第一个氨基酸及二异丙基乙胺(DIEA)，适量的DMF，氮气鼓泡反应60min。 然后加入甲醇，反应半小时，抽掉反应液，用DMF、MEOH洗净；
(2)往反应器中加入序列中第二个氨基酸、1-羟基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸盐 (HBTU)及DIEA，氮气鼓泡反应半小时，洗掉液体，茚三酮检测，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗净，加入适量的脱帽液去除9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护基，洗净，茚三酮检测； 按以上方式依次加入序列中不同的氨基酸直至全序列合成完毕。
(3)将树脂用氮气吹干后从反应柱中取下，倒入烧瓶中，然后往烧瓶中加一定量(切 割液和树脂大约以10ml/克的比例)的切割液(组成是95％三氟乙酸，2％乙二硫醇，2％三异 丙基硅烷，1％水)，震荡，滤掉树脂，然后向得到的滤液中加入大量乙醚，析出粗产物，然 后离心，清洗即可得到序列的粗产物；
(4)高效液相色谱将粗品提纯后，放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末，采用电 喷雾质谱(ESI-MS)对TA结构进行表征。
(5)当(2)TA序列中全部氨基酸序列合成后，取出一部分，通过前述氨基偶联方法将Fmoc-e-Ahx-OH偶联到肽树脂的氨基末端。在吡啶/DMF/DCM中制备FITC溶液(12:7:5)，将其加入肽树脂反应器内，反应过夜，用茚三酮检查反应的完成情况。用DMF、异丙醇和 DCM清洗树脂。取下树脂，切割FITC-TA，用HPLC纯化(操作同(3))，冻干机冻干后， 同样用ESI-MS对FITC-TA结构进行表征。
TA的HPLC纯化图谱和ESI-MS结构鉴定图谱如图1所示。
FITC-TA的HPLC纯化图谱和ESI-MS结构鉴定图谱如图2所示。
实施例2 PEI-PEG-TA的合成和表征。
分别称取13.50mg的TA及9.0mg NHS-PEG-MAL分别溶解于500μL DMSO中，在氮气保护条件下反应12h,反应产物转入Sephadex S30凝胶柱，用流速为1ml/min的磷酸盐缓冲液流动相对产物进行分离纯化，产物NHS-PEG-TA冻干。称取15mgPEI溶解于0.1mM pH
为7.2的磷酸盐缓冲液中，称取6.40mg NHS-PEG-TA溶解于500μL DMSO中，在搅拌的条件下逐滴加入至PEI溶液中，氮气保护下反应过夜，用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析48h，冻干得产物，通过1H NMR表征终产物，如图3所示。
实施例3 TA与VEGFR-2及NRP-1受体蛋白结合力测定。
(1)利用表面等离子共振(SPR)技术，①偶联蛋白。通过pH scouting测试选定VEGFR-2 和NRP-1蛋白分别的最佳偶联溶液为：pH为4.0醋酸钠溶液。先用EDC/EHS对CM5芯片 进行羧基活化，将VEGFR-2和NRP-1蛋白分别用pH为4.0的醋酸钠溶液稀释至50μg/mL,以蛋白质的氨基与CM5芯片的羧基反应形成共价键的方式偶联在2，4通道上，再用乙醇胺进行通道封闭；1，3通道分别只进行EDC/NHS活化和乙醇胺封闭，作为参比通道。②结合 力分析。通过表面测试，将分析物TA母液稀释至0.25μmoL作为进样最高浓度，依次梯度 稀释6个浓度，以30μL/min流速进样90s，解离220s，使用pH 2.5甘氨酸-盐酸作为再生试 剂，再生30s。运行Biacore S200 Control软件自带的Kinetics/Affinity程序进行动力学测定。 通过Biacore S200 Evaluation软件进行Kinetics/Affinity分析，得到的KD值反应TA与两受体 蛋白的亲和力大小。结果如图4所示。
在SRR结果中(图4)，KD值(解离平衡常数)的大小反映了多肽与VEGFR-2蛋白和NRP-1蛋白的结合水平的高低，KD值越小，结合能力越强(KD＜10-6代表强结合，10-6＜KD＜10-3代表中等强度结合，KD＜10-3代表弱结合)。通过图4可以看到三种小肽AT7、TAT与 TA和NRP-1的KD值相近，均属于强结合，TA与NRP-1的KD最小，结合能力最强。TA与 VEGFR-2蛋白的KD值小于AT7，TA与VEGFR-2的结合能力大于AT7，而TAT和VEGFR-2 结合为非特异性结合。
(2)利用表面等离子共振(SPR)技术，进行竞争性结合实验，分析TA与VEGF165 竞争性结合VEGFR-2及NRP-1受体蛋白的能力。①偶联蛋白。VEGFR-2和NRP-1蛋白偶 联同(1)步骤，②竞争性结合分析。将VEGF165母液分别用256nmoL的TA作为溶剂稀释 至8.125nmoL作为最高进样浓度，依次梯度稀释6个浓度，以30μL/min流速进样120s，解 离220s，使用pH1.5甘氨酸-盐酸作为再生试剂，再生30s。运行Biacore S200 Control软件 自带的Kinetics/Affinity程序进行动力学测定。通过Biacore S200 Evaluation软件进行Kinetics/Affinity分析，通过响应曲线和相应值的变化分析TA与VEGF165竞争性结合受体的能力。结果如图5所示。
图5A、5B分别为TA与VEGF165竞争性结合VEGFR-2和NRP-1蛋白的响应图谱。当 TA浓度为零时，VEGF165与VEGFR-2和NRP-1蛋白的作用响应曲线为缓慢结合与缓慢解 离的动力学模式，且经过Evaluation软件分析得到VEGF165与VEGFR-2和NRP-1作用的 KD值分别为1.65×10-9M和2.44×10-9M。当用256nmoL的TA稀释VEGF165时，不同浓度 的VEGF165与VEGFR-2和NRP-1的结合和解离的曲线的响应值均降低。VEGF165与NRP-1 作用的响应曲线几乎重叠为接近零的一条曲线，其结合和解离曲线完全被抑制。以上结果表 明TA能够与VEGF165竞争性结合VEGFR-2和NRP-1蛋白，且与VEGF165竞争性结合 NRP-1蛋白的能力更强。
实施例4 TA在细胞水平上与VEGFR-2及NRP-1受体结合能力测定。
免疫染色法测定FITC-TA与HUVEC细胞高表达的VEGFR-2及NRP-1受体的共定位。①细胞铺皿。将处于对数生长期的HUVEC用胰酶消化，细胞计数，调整细胞密度为1×105/mL， 将其接种于35mm3激光共聚焦小皿内，每皿1mL，37℃，5％CO2培养箱过夜培养使其贴壁，换用含1％血清的培养基饥饿处理。②加药。吸弃小皿内旧培养基，用无血清的培养基冲洗两遍，不同皿分别加入40μM/L的FITC-TAT、FITC-AT7、FITC-TA，37℃，5％CO2培养箱 内孵育2h。③固定。将小皿上清吸除，用冷PBS洗3遍，每次3min。用1mL 4％多聚甲醛 固定液固定15min。移除固定液，用冷PBS洗3遍，每次3min，④封闭。用含5％BSA的 PBST(吐温-20)缓冲液室温封闭30min，冷PBST洗3遍，每次5min。⑤孵育一抗。分别 按照1：400和1：200的比例用免疫染色稀释液稀释VEGFR-2抗体和NRP-1抗体，4℃孵育 过夜，冷的PBST洗3遍，每次5min。⑥孵育二抗。按照1：600的比例用含1％BSA的PBST 稀释二抗，室温避光孵育1h。冷的PBST洗3遍，每次5min。⑦核染。将Hoochest 33252按 照1：2000的比例用PBST稀释，室温避光孵育15min，冷的PBST洗3遍，每次5min。⑧ 拍照观察。在激光共聚焦小皿中央滴加一滴抗荧光淬灭剂，分别在不同的激发波长下观察荧 光发光情况并拍照。结果如图6所示，蓝色表示细胞核，红色表示经免疫染色后的VEGFR-2 (A)及NRP-1(B)受体，绿色分别代表FITC-AT7、FITC-TAT、FITC-TA。在FITC标记 的多肽与表达NRP-1(B图)与VEGFR-2(A图)的HUVEC内皮细胞共孵育2h后，FITC-AT7、 FITC-TAT和FITC-TA与NRP-1均有较强的共定位(B图中呈现大范围绿色)，FITC-AT7、 FITC-TA和VEGFR-2蛋白有较强的共定位，而FITC-TAT与VEGFR-2共定位作用较弱(A 图中呈现大范围红色)。通过以上结果可以得出三种小肽均和NRP-1有较强的结合能力，AT7、TA和VEGFR-2结合能力较强，而TAT与VEGFR-2结合能力较弱。
实施例5 TA体外活性评价。
(1)成管实验检测TA对HUVEC体外血管形成的作用。
①准备。提前一天将96孔板和灭菌黄枪头置于-20℃冰箱预冷，将Matrigel基质胶从-20℃ 转移至4℃使其融化待用。②铺胶。将融化的Matrigel基质胶用低温离心机10000rpm，离心 5min去除气泡。离心机取出后置于冰上，迅速转移至超净台内，以每孔60μL均匀铺于96 孔板中，轻轻振板使基质胶均匀无气泡。将96孔板转移入37℃，5％CO2培养箱培养60min 使其凝固。③处理细胞及加药。将处于对数生长期的HUVEC用胰酶消化，细胞计数，调整 细胞密度为3.0×104/mL，将细胞悬液以每孔100μL接种于铺有Matrigel基质胶的96孔板中， TAT、AT7和TA用无血清的培养基稀释，每孔加100μL，使每孔TA终浓度依次为320μM/L， 每个浓度做三个复孔，与细胞共培养6h后置于倒置显微镜下观察并拍照。结果如图7所示， 6h后，不加药对照组(control)形成明显的管状结构，TA组相比于TAT和AT7，管状结构 形成最少，表明TA能够显著抑制HUVEC体外血管形成。
(2)细胞划痕法检测TA对HUVEC迁移能力的作用。
①铺板。将处于对数生长期的HUVEC用胰酶消化，细胞计数，调整细胞密度为3×105/mL， 将其接种于6孔细胞板中，每孔2mL，37℃，5％CO2培养箱过夜培养使其贴壁。②划痕。 取出6孔细胞板，用200μL无菌黄枪头在无菌直尺比对下，从孔一段向着另一端划一条直线， 每孔重复划三条直线。③给药。将6孔板中旧培养基吸出，用无菌PBS润洗三遍，将其置 于倒置显微镜下观察并拍照(0h)。TAT、AT7和TA用无血清的培养基稀释至320μM/L，加入孔板中，分别在24h观察并拍照。结果如图8所示，相比于不加药对照组(control)，在 24h时，TA组的划痕宽度明显宽于对照组、TAT和AT7，表明TA能够显著抑制HUVEC的 迁移。
实施例6 TA体内跨血脑屏障和脑肿瘤靶向性评价。
将带有荧光素酶luciferase标签的U87(U87-Luc-mCherry)细胞胰酶消化，PBS洗一遍， 纯DMEM培养基重悬，调整细胞密度至1×107/mL，待用。将裸鼠用异氟烷麻醉后，将裸鼠 俯卧位固定于脑室定位仪上，口鼻部位持续通异氟烷保持裸鼠麻醉状态。用碘液消毒裸鼠头 部，剪皮暴露出颅骨，找到前囟点，在前囟点的右2mm，前1mm处用颅骨钻打孔，用无菌微量注射器吸取5μL细胞悬液，进针3mm，退针0.5mm，留针30s，缓慢拔出针头，无菌手 术线缝合伤口，碘伏消毒。裸鼠脑原位U87-Luc-mCherry胶质瘤造模后4天，腹腔注射 150mg/Kg的荧光素钠底物，异氟烷麻醉裸鼠，用活体成像仪进行裸鼠脑部生物发光检测。 将造模成功的裸鼠根据生物发光强度进行随机分组，共分为4组，对照组静脉注射生理盐水， 药物组分别静脉注射100μL FITC-TAT、FITC-AT7、FITC-TA，1小时后，处死裸鼠，取脑 组织，4％多聚甲醛固定过夜，制作冰冻切片，荧光显微镜观察多肽在脑组织内的分布。结果 如图9所示。蓝色代表细胞核，红色代表表达红色荧光mCherry蛋白的胶质瘤细胞，绿色代 表三种FITC标记的小肽。从图9中可以看出，相比于FITC-TAT和FITC-AT7，FITC-TA在 脑组织内的荧光强度最强。这表明TA能够更好的穿透血脑屏障靶向于脑肿瘤组织部位。
实施例7 PEI-PEG-TA的细胞毒性评价。
将处于对数生长期的HUVEC用胰酶消化，细胞计数，调整细胞密度为5×103/mL，将其 接种于96孔细胞板中，每孔100μL，37℃，5％CO2培养箱过夜培养使其贴壁。将PEI、 PEI-PEG-TAT(缩写为PPT)、PEI-PEG-AT7(缩写为PPA)、PEI-PEG-TA(缩写为PPTA) 用培养基梯度稀释，每孔100μL加入96孔板，使终浓度依次为32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、 4μg/mL、2μg/mL，每个浓度设4个复孔，同时设置空白对照组。37℃，5％CO2培养箱培养 24h。避光条件下每孔加20μL的5mg/mL的MTT溶液，37℃，5％CO2培养箱培养4h。取 出96孔板，3000rpm离心10min，用1mL注射器沿壁轻轻吸弃上清液，每孔加入150μL DMSO， 震荡15min，待紫色结晶全部溶解后，用酶标仪测490nm的吸光度值。计算不同浓度下的细 胞存活率。结果如图10所示。从结果中可以看出，不同的聚合物材料对HUVEC细胞的毒 性作用均呈现出浓度依赖性；且在相同的浓度条件下，与未经修饰的PEI相比，PEI-PEG-TAT、 PEI-PEG-AT7、PEI-PEG-TA的细胞毒性均显著降低，表现出良好的生物相容性。
实施例8 PEI-PEG-TA载基因纳米复合物的制备和表征。
(1)分泌型内皮抑素Endostatin基因的构建。本发明中以Endostatin基因为治疗基因， 采用被FDA批准的可用于人体实验的真核表达质粒pVAX1做为载体,构建可分泌表达Endostatin的具有高度生物安全性真核表达质粒pVAX1/Endostatin,目的基因序列为： TTAGGTACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGA TACCACCGGACACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAAC AGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGC AGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCA GGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTC AAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGC TGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTGACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCAC CTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGA GAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCG CTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCG TGCTCTGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGCGGCGAATTCCTTGGAGGCA GTC
基因质粒Endostatin的基因测序结果如图11所示。
(2)在N/P比为12条件下，将80μg/mL的Endostatin质粒在低速涡旋条件下逐滴加入 到PEI、PEI-PEG-TAT(缩写为PPT)、PEI-PEG-AT7(缩写为PPA)、PEI-PEG-TA(缩写为PPTA)基因递送材料中，涡旋30s，静置30min。通过电镜观察不同纳米复合物的形态，粒 径电位仪测定粒径大小和Zeta电位，琼脂糖凝胶电泳观察材料对DNA的包载能力。其中，PPTA/Endostatin纳米复合物的粒径分布图和电位分布图、以及不同载基因材料复合物的透射 电镜图、琼脂糖凝胶电泳图如图12所示。从图12A可以看出，PPTA/Endostatin纳米复合物 的粒径在100nm左右，带较强的正点荷。图12B电镜结果显示，经过修饰后的PPA、PPT及PPTA组相比于未经修饰的PEI组，粒径有一定程度增加，但纳米复合物均为大小均匀紧密的近圆形颗粒。图12C的琼脂糖凝胶电泳结果显示，经过修饰后的PPA、PPT及PPTA材 料均能够完全包合DNA。
实施例9 PEI-PEG-TA跨血脑屏障和脑肿瘤靶向性评价。
按照实施例6方法构建脑原位胶质瘤U87-Luc-mCherry荷瘤裸鼠动物模型，用近红外染 料吲哚菁绿(ICG)作为体内成像剂，尾静脉注射PEI/ICG、PEI-PEG-TAT/ICG、 PEI-PEG-AT7/ICG、PEI-PEG-TA/ICG纳米复合物各100μL,分别在1h，2h，6h时间点通过 小动物活体成像仪观察ICG在裸鼠活体的分布情况。结果如图13所示，PEI-PEG-TA/ICG组 相比与其他组在脑部的荧光强度最强，这表明了PEI-PEG-TA不仅具备穿透血脑屏障的能力， 而且能够更有效地的靶向聚集于脑胶质瘤组织部位。
实施例10 PEI-PEG-TA载pEGFP报告基因纳米复合物体内外转染实验。
(1)将处于对数生长期的HUVEC用胰酶消化，细胞计数，调整细胞密度为2×105/mL， 将其接种于6孔细胞板中，每孔2mL，37℃，5％CO2培养箱过夜培养使其贴壁。用表达绿色荧光蛋白的pEGFP质粒作为报告基因，按照实施例8方法制备PEI/pEGFP、 PEI-PEG-TAT/pEGFP、PEI-PEG-AT7/pEGFP、PEI-PEG-TA/pEGFP纳米复合物。将6孔板取 出，吸弃上清液，每孔用无菌PBS润洗3遍，加入纳米复合物，使每孔pEGFP质粒量为4μg， 37℃，5％CO2培养箱培养4h，吸弃上清液，用无菌PBS润洗3遍，继续培养48h。通过 荧光显微镜和流式细胞术观察并检测绿色荧光蛋白表达情况。
(2)体内转染：按照实施例6方法构建脑原位胶质瘤U87-Luc-mCherry荷瘤裸鼠动物模 型，同样按照实施例8方法制备PEI/pEGFP、PEI-PEG-TAT/pEGFP、PEI-PEG-AT7/pEGFP、PEI-PEG-TA/pEGFP纳米复合物，分别在造模成功的第6天，第8天，第10天，第12天， 第14天和第16天经过尾静脉注射进裸鼠体内，每只裸鼠给药剂量为40μg，给药结束后处死 裸鼠，用多聚甲醛进行心脏灌注，取脑组织用4％多聚甲醛固定过夜，制作石蜡切片，进行 GFP免疫组化实验，拍照观察GFP蛋白在脑组织内的表达及分布。操作步骤为：①石蜡切片 脱蜡至水。②抗原修复：组织切片用柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)进行抗原修复。③画 圈自发荧光淬灭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内加入自 发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。④血清封闭：在圈内滴加BSA孵育30min。⑤孵育一 抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加1:100稀释比例的GFP抗体，切片平放于湿盒内4℃孵 育过夜。⑥孵育二抗：玻片用PBS洗3次，每次5min。甩干后在圈内滴加1:400稀释比例的 FITC标记山羊抗小鼠二抗覆盖组织，避光室温孵育1h。⑦DAPI染细胞核：玻片玻片用PBS 洗3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。⑧封片： 玻片玻片用PBS洗3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。⑨切片于荧 光显微镜下观察并拍照。实验结果如图14、15中所示。由不同组的绿色荧光蛋白pEGFP质 粒的表达水平可以看出，PEI-PEG-TA(即PPT)显著提高了pEGFP基因在体外细胞水平及 裸鼠脑胶质瘤内的转染效率。
实施例11 PEI-PEG-TA载Endostatin基因纳米复合物体内药效学评价。按照实施例6 方法构建脑原位胶质瘤U87-Luc-mCherry荷瘤裸鼠动物模型，第4天腹腔注射150mg/Kg的 荧光素钠底物，异氟烷麻醉裸鼠，用活体成像仪进行裸鼠脑部胶质瘤生物发光检测并且将造 模成功的裸鼠按照生物发光强度随机分为6组：空白对照组、PEI/Endostatin基因组、PEI-PEG-TAT/Endostatin基因组、PEI-PEG-AT7/Endostatin基因组、PEI-PEG-TA/Endostatin 基因组和阳性药替莫唑胺组(每组10只)。基因药物分别于第6，8，10，12，14，16天经 过尾静脉注射进裸鼠体内，每只裸鼠给药量为40μg。替莫唑胺组按照灌胃给药方式每隔一天 给一次药，给药剂量为50mg/kg。分别于第4，9，14，20天用活体成像仪观察不同组裸鼠脑 部胶质瘤生物发光强度变化，进而反映不同组药物的抑瘤效果。结果如图16所示，PEI-PEG-TA/Endostatin基因组相比于PEI/Endostatin基因组、PEI-PEG-TAT/Endostatin基因组 和PEI-PEG-AT7/Endostatin基因组能够显著的抑制裸鼠脑胶质瘤的生长，表现出良好的体内 抑瘤效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例 对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所 记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<212> PRT
<213> TA
<400> 3
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Cys Ala Thr Trp Leu Pro Pro
1 5 10 15
Arg
<210> 4
<211> 641
<212> PRT
<213> Endostatin
<400> 4
Thr Thr Ala Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Gly
1 5 10 15
Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr
20 25 30
Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Ala Cys Thr Cys
35 40 45
Thr Gly Gly Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala
50 55 60
Cys Cys Gly Gly Ala Cys Ala Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly
65 70 75 80
Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly
85 90 95
Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Gly Gly Thr Thr Gly Cys Gly Cys
100 105 110
Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys
115 120 125
Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Thr Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys
130 135 140
Ala Thr Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr
145 150 155 160
Thr Cys Cys Ala Gly Thr Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala
165 170 175
Gly Gly Cys Gly Cys Gly Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Gly Gly Gly
180 185 190
Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Cys
195 200 205
Gly Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Cys
210 215 220
Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly
225 230 235 240
Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala Thr Cys Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys
245 250 255
Gly Thr Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Gly Cys Ala Gly Cys
260 265 270
Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala Thr Cys Gly Thr Cys Ala Ala Cys
275 280 285
Cys Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys
290 295 300
Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Gly Ala
305 310 315 320
Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly Thr Thr Cys Thr Cys Ala Gly Gly Cys
325 330 335
Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Cys Thr Gly Ala
340 345 350
Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Ala Cys Gly Cys Ala Thr
355 360 365
Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Thr Thr Thr Gly Ala Cys Gly Gly Cys
370 375 380
Ala Ala Gly Gly Ala Cys Gly Thr Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Cys
385 390 395 400
Ala Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala
405 410 415
Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly Cys Ala Thr
420 425 430
Gly Gly Cys Thr Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Ala Ala Cys Gly
435 440 445
Gly Gly Cys Gly Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Ala
450 455 460
Gly Ala Gly Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Gly Ala Gly Ala Cys Gly
465 470 475 480
Thr Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Cys
485 490 495
Cys Cys Thr Cys Gly Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala
500 505 510
Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly
515 520 525
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly
530 535 540
Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Gly Ala Gly
545 550 555 560
Cys Thr Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys
565 570 575
Ala Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Thr Gly
580 585 590
Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Ala Thr Gly Ala Cys
595 600 605
Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala
610 615 620
Ala Thr Thr Cys Cys Thr Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Gly Thr
625 630 635 640
Cys

Claims (9)

1.TA多肽，其氨基酸序列为RKKRRQRRRCATWLPPR。
2.权利要求1所述的TA多肽修饰的聚合物材料，其具有式(I)所示结构：
Figure FDA0003512879540000011
其分子量为6-160KD。
3.权利要求2所述的TA多肽修饰的聚合物材料的制备方法，其以马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯作为连接臂与TA反应，再与聚乙烯亚胺缩合；
其中，马来酰亚胺聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯具有式(II)所示结构：
Figure FDA0003512879540000012
其分子量为1-20KD；聚乙烯亚胺具有式(III)所示结构：
Figure FDA0003512879540000013
其分子量为1-70KD；
所述方法包括TA的半胱氨酸的巯基与连接臂MAL-PEG-NHS的马来酰亚胺MAL端发生加成反应，再通过琥珀酰亚胺乙酸酯NHS端与PEI的伯氨基发生缩合反应，合成TA修饰的PEI-PEG-TA材料。
4.载药纳米复合物，其包含权利要求2所述的TA多肽修饰的聚合物材料和至少一种药物；所述药物为可分泌表达内皮抑素Endostatin的质粒。
5.权利要求4所述的载药纳米复合物的制备方法，其包括将药物溶液逐滴加入权利要求2所述的TA多肽修饰的聚合物材料中、涡旋、静置。
6.一种靶向递送系统，其包括权利要求2所述的TA多肽修饰的聚合物材料。
7.一种载药靶向递送系统，其包括权利要求4所述的载药纳米复合物。
8.一种造影物质，其包括权利要求2所述的TA多肽修饰的聚合物材料、权利要求4所述的载药纳米复合物、权利要求6所述的靶向递送系统或权利要求7所述的载药靶向递送系统中的一种或多种和一个或多个可检测标记，所述可检测标记为表达绿色荧光蛋白的pEGFP质粒。
9.权利要求1所述的TA多肽、权利要求2所述的TA多肽修饰的聚合物材料、权利要求4所述的载药纳米复合物、权利要求6所述的靶向递送系统或权利要求7所述的载药靶向递送系统或权利要求8所述的造影物质在下述(1)至(2)中至少一项所列事项中的应用：
(1)在制备特异性靶向结合VEGFR-2和/或NRP-1受体的药物或制剂或试剂盒中的应用；
(2)在制备与VEGF165竞争性结合VEGFR-2和/或NRP-1受体的药物或制剂或试剂盒中的应用。
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