CN113773394B - 一种融合肽及在制备抗肿瘤制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种融合肽及在制备抗肿瘤制剂中的应用。本发明提供了一种具有穿透血脑屏障能力和抗肿瘤血管生成的双功能融合肽Tat‑C‑RP7,及其用于脑胶质瘤的抗血管生成治疗方面的应用。该多肽包含氨基酸序列RKKRRQRRR和氨基酸序列RPARPAR,并以半胱氨酸作为两部分的连接臂。具备血脑屏障穿透能力,并且能够通过靶向结合血管内皮细胞NRP1受体抑制新生血管的增殖,促进内皮细胞发生凋亡等活性。该发明为今后细胞穿膜肽和NRP1靶向肽的应用提供了新方向,更为脑胶质瘤的靶向治疗和抗血管生成策略提供了一定依据。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种具有穿透血脑屏障能力和抗肿瘤血管生成作用的融合肽Tat-C-RP7,及所述融合肽制备抗肿瘤制剂中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
随着人类医学技术的飞速发展,许多行之有效的肿瘤治疗策略被探索和开发,但一些恶性肿瘤仍然难以彻底根治,人恶性胶质瘤就是其中一大类。一直以来,人脑胶质瘤的临床治疗是一个世界性难题,目前传统的治疗策略包括手术治疗、放射治疗、化学治疗及联合治疗。胶质瘤大部分呈恶性表现,具有高度的迁移性、侵袭性和增殖能力,因此手术一般难以彻底切除。此外,由于血脑屏障(Blood–Brain Barrier,BBB)的天然存在,许多化疗药物很难到达颅内肿瘤部位继而无法发挥有效的治疗功效。在强调联合治疗的前提下,脑胶质瘤手术切除后的辅助疗法在不断发展和进步中,抗血管生成疗法即是其中之一。
自从1971年Folkman提出“肿瘤的生长必须依赖血管”这一观点以来,越来越多的科研人员将肿瘤领域的研究目标转为通过抗肿瘤血管生成来抑制肿瘤的发生和发展。大多数肿瘤的快速生长和恶性转移都离不开血管生成,通过这些新生的血管,肿瘤细胞可以获取生长所必需的氧气、大量营养物质和生长因子。与其他实体瘤相比,人脑胶质瘤具有更高更强的血管生成效应,胶质瘤间质的血管参与组建肿瘤微环境,并为胶质瘤细胞的生长、繁殖、浸润等提供充足的营养物质。由于其高度依赖新生血管的特点,抗血管生成的靶向治疗已成为针对脑胶质瘤的新型治疗策略之一,具有广泛发展前景。
发明内容
基于上述背景技术中记载的缺陷,本发明目的在于提供一种抑制肿瘤组织中血管生成、并且能够克服血脑屏障问题的药物。
基于上述技术目的,本发明提供以下技术方案:
本发明第一方面,提供具有SEQ ID NO.1所示序列的多肽作为抗血管生成活性成分的应用。
现有研究表明,神经纤毛蛋白1(Neuropilin-1,NRP-1)具有肿瘤良好的肿瘤靶向性,作为多种肿瘤的相关膜蛋白的共受体,参与肿瘤的起源、生长、侵袭和转移过程。本发明首选设计筛选一种具有抗血管生成作用的NRP-1靶向肽,经筛选,一种7个氨基酸组成的短肽RP7可以抑制HUVEC细胞的微管形成,具有良好的抑制血管生成作用。
本发明经筛选得到的NRP-1靶向肽RP7同时具有肿瘤靶向特性和抑制血管生长作用,应用于抗肿瘤药物及抗糖尿病眼部血管新生药物具有良好的应用价值。由于抗脑胶质瘤药物通常面临脑血屏障的问题,进一步的,本发明设计采用穿膜肽提高上述NRP-1靶向肽RP7的穿膜特性。
基于该设计思路,本发明第二方面,提供一种融合肽,所述融合肽包括第一方面所述SEQ ID NO.1所示序列,还具有穿膜肽序列。
通过穿膜肽的透膜效果提高第一方面所述多肽进入患处的效率,进一步的,本发明包括通过连接臂将第一方面所述多肽与穿膜肽连接的方式。
所述融合肽包括Tat穿膜肽序列RKKRRQRRR、NRP-1靶向肽RP7RPARPAR,并采用半胱氨酸作为连接臂,得到一种融合肽Tat-C-RP7。经验证,所述融合肽Tat-C-RP7具有良好的透过血脑屏障的能力及抗血管生成活性,能够通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡实现对脑胶质瘤的抑制作用,可用于抗肿瘤药物的开发。
本发明第三方面,提供第二方面所述融合肽在制备抗肿瘤制剂中的应用。
本发明第四方面,提供第二方面所述融合肽在作为NPR1蛋白指示剂的应用。
另外,本发明研究还发现,所述融合肽对于NPR1蛋白具有良好的亲和性,基于该特性,本领域技术人员有望针对该融合肽进行改造,如连接染料或标记物的方式将所述融合肽作为NPR1蛋白的指示剂。
本发明第五方面,提供第二方面所述融合肽作为VEGFR2-PLCγ-ERK1/2信号通路抑制剂的应用。
以上一个或多个技术方案的有益效果是:
本发明提供了Tat-C-RP7的制备方法及其应用。本发明通过研究,首次设计和筛选出了一个具有抑制肿瘤血管生成和穿透血脑屏障双功能的穿膜靶向肽Tat-C-RP7,该融合肽与NRP1靶向肽RP7和细胞穿膜肽Tat相比,对NRP1蛋白的亲和力更强。进一步阐明其分子机制,融合肽Tat-C-RP7的体外抗血管生成活性可能是通过下调HUVEC细胞内VEGFR2相关信号通路中VEGFR2及下游PLCγ、ERK1/2,AKT蛋白的磷酸化水平实现的。这为今后细胞穿膜肽和NRP1靶向肽的应用提供了新思路,更为脑胶质瘤的抗血管生成疗法提供了研究基础。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中的六个候选NRP1靶向肽的体外抗血管生成活性筛选相关图;其中,(A)使用六个候选NRP1靶向肽(320 μM)处理HUVEC细胞48小时后,使用MTT法检测各组细胞生长抑制率;
(B)使用六个候选NRP1靶向肽(320 μM)处理HUVEC细胞4小时后,检测微管形成情况。
图2为实施例3中的融合肽最佳连接臂的筛选;
(A)用两个候选融合肽处理HUVEC细胞48小时后,使用MTT法检测各组细胞生长抑制率;
(B)用两个候选融合肽(320 μM)处理HUVEC细胞4小时后,检测微管形成情况;
(C)用两个候选融合肽(80 μM)处理HUVEC细胞24小时和48小时后,使用划痕实验检测对细胞迁移能力的影响。
图3为实施例3中的RP7、Tat和Tat-C-RP7对NRP1蛋白的亲和动力学分析;
(A)最佳偶联缓冲液pH的筛选;
(B)NRP1在CM5传感器芯片上的偶联;
(C)RP7,Tat和Tat-C-RP7对NRP1蛋白的亲和力检测。
图4为实施例3中脑微血管内皮细胞bEnd.3对FITC标记多肽FITC-RP7、FITC-Tat、FITC-Tat+FITC-RP7和FITC-Tat-C-RP7的摄取情况;
(A)将细胞与不同的FITC标记肽(16 μM)在37℃孵育1小时,使用Hoechst进行核染色,然后用磷酸盐缓冲液漂洗。用荧光显微镜拍照记录;
(B)将细胞与不同的FITC标记肽(16 μM)在37℃孵育1小时,利用流式细胞仪定量荧光强度。
图5为实施例3中FITC标记多肽FITC-RP7、FITC-Tat、FITC-Tat+FITC-RP7和FITC-Tat-C-RP7在原位脑胶质瘤裸鼠脑部的积累情况。
图6为实施例3中融合肽Tat-C-RP7的体外抗血管生成活性评价;
(A)用RP7、Tat、Tat+RP7或融合肽Tat-C-RP7处理HUVEC细胞48小时后,使用MTT法检测各组细胞生长抑制率;
(B)用RP7、Tat、Tat+RP7或融合肽Tat-C-RP7(320 μM)处理HUVEC细胞4小时后,荧光显微镜明场检测微管形成情况;
(C)用RP7、Tat、Tat+RP7或融合肽Tat-C-RP7(80 μM)处理HUVEC细胞24小时和48小时后,使用划痕实验检测对细胞迁移能力的影响;
(D)用RP7、Tat、Tat+RP7或融合肽Tat-C-RP7(80 μM)处理HUVEC细胞24小时后,通过Transwell小室实验检测对细胞迁移能力的影响。
图7为实施例7中融合肽Tat-C-RP7诱导内皮细胞凋亡的情况;
(A)用RP7、Tat、Tat+RP7或融合肽Tat-C-RP7处理HUVEC细胞24小时后,通过Hoechst核染色观察对细胞凋亡的影响;白色箭头所指示的是凋亡细胞;
(B)用RP7、Tat、Tat+RP7或融合肽Tat-C-RP7处理HUVEC细胞24小时后,通过Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。
图8为实施例3中融合肽Tat-C-RP7对VEGFR2相关信号通路的影响。
图9为实施例3中融合肽Tat-C-RP7抑制原位脑胶质瘤裸鼠的肿瘤生长情况;
(A)使用小动物活体成像系统来监测每个多肽治疗组小鼠的颅内肿瘤体积变化;
(B)给药期间每个多肽治疗组小鼠的平均生物发光信号强度变化情况;
(C)给药期间每个多肽治疗组小鼠的体重变化;
(D)使用苏木精和依红染色的全脑切片;
(E)使用抗CD31抗体进行免疫组织化学染色以观察肿瘤血管。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的,针对现有技术中存在的不足,为了解决如上的技术问题,本发明提供了
本发明第一方面,提供具有SEQ ID NO.1所示序列的多肽作为抗血管生成活性成分的应用。
优选的,所述应用方式包括应用于制备抗血管生成药物,所述抗血管生成药物包括但不限于抗肿瘤药物、抗糖尿病眼部并发症药物;另外,所述抗血管生成药物中包括所述多肽,还包括用于维持多肽活性的溶剂体系及药学上所必需的辅料。
优选的,所述应用方式包括与其他药物联合应用;所述其他药物包括但不限于抗肿瘤药物、抗糖尿病药物、靶向制剂中的一种或几种。
进一步优选的,所述多肽与抗肿瘤活性成分或辅助抗肿瘤活性成分联合用于制备抗肿瘤药物;所述抗肿瘤活性成分包括但不限于具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的活性成分;所述辅助抗肿瘤活性成分包括镇痛药物、止吐药物、5-HT3受体拮抗剂、升白药物、抑制破骨细胞药物及叶酸类似物等。
进一步优选的,所述多肽与具有靶向病灶活性的成分联合用于制备抗肿瘤或抗糖尿病药物。依据本领域技术人员的研究思路,本发明提供的多肽序列具有抑制血管生成活性,将其与具有靶向病灶或透膜活性的成分联合使用,有望获得一种具有良好靶向抑制病灶血管生成效果的药物。
本发明第二方面,提供一种融合肽,所述融合肽包括第一方面所述SEQ ID NO.1所示序列,还具有穿膜肽序列。
优选的,所述穿膜肽为天然蛋白、嵌合肽及人工合成肽中的任意一种;进一步优选的,为包括但不限于Tat、R9、MPG、MPGΔNLS、Stearyl-R8、Transportan、Pep-1中的任意一种。
进一步优选的,所述穿膜肽与SEQ ID NO.1所示序列多肽的连接方式为包裹、静电相互作用或共价键连接中的一种。
在上述优选技术方案的一些效果较好的实施方式中,所述穿膜肽与第一方面所述序列的多肽通过共价键连接。
优选的,所述融合肽还包括连接臂,所述连接臂用于连接穿膜肽及第一方面所述序列的多肽。
进一步优选的,所述连接臂为氨基酸数目为1~6个的短肽。
现有研究表明,连接臂的选择对于融合肽的穿膜效率具有影响,经本发明研究验证,在上述技术方案一些效果较好的实施方式中,所述连接臂为半胱氨酸,不仅可以提高融合肽的穿膜效率,对于融合多肽抑制血管生成的能力也具有很好的提升效果。
在效果较好的具体实施方式中,所述穿膜肽为TAT,所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明第三方面,提供第二方面所述融合肽在制备抗肿瘤制剂中的应用。
优选的,所述抗肿瘤制剂包括抗肿瘤药物及抗肿瘤模型药物。
优选的,所述抗肿瘤制剂中包括第二方面所述融合肽还包括用于维持所述融合肽活性的溶剂体系及药学上所必需的辅料。
优选的,所述抗肿瘤制剂包括但不限于抗脑肿瘤、抗口腔肿瘤、抗肺癌、抗胃癌、抗肝癌、抗肠道癌症、抗子宫肿瘤或抗骨肉瘤的制剂;进一步优选的,所述抗脑部肿瘤包括抗脑胶质瘤药物。
上述优选方案的一些实施方式中,所述融合肽应用于抗脑胶质瘤药物的制备,所述融合肽作为脑胶质瘤细胞的增殖抑制剂及凋亡诱导剂。
经本发明验证,所述融合肽在体外实验中,能够被脑胶质瘤大量摄取,并且通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的机制抑制肿瘤细胞的生长。
又一些的实施方式中,所述融合肽与其他具有抗脑胶质瘤活性的成分联合使用,具体的,所述抗脑胶质瘤活性成分为化学小分子药物,或可通过化学键与所述融合肽连接的成分。
经本发明验证,所述融合肽具有良好的透过血脑屏障的作用,将其他具有抑制脑胶质瘤活性的成分与所述融合肽连接,提高该活性成分透过血脑屏障的概率,提高生物利用度。
本发明第四方面,提供第二方面所述融合肽在作为NPR1蛋白指示剂的应用。
优选的,所述融合肽具有标记物用于指示NPR1蛋白。
进一步优选的,所述标记物包括荧光标记物、同位素标记物等。
本发明第五方面,提供第二方面所述融合肽作为VEGFR2-PLCγ-ERK1/2信号通路抑制剂的应用。
优选的,所述融合肽作为VEGFR2、 PLCγ、ERK1/2,AKT蛋白磷酸化抑制剂。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
以下实施例所述所涉及的序列信息如表1所示:
表1
实施例1体外筛选具有较强抗血管生成活性的NRP1靶向肽
(1)MTT实验检测候选NRP1靶向肽对HUVEC细胞增殖的影响。
①铺板。取处于对数生长期的HUVEC细胞,消化分散制作单细胞悬液,细胞计数调整细胞密度为2 ~ 3 × 104/mL;将100 μL细胞悬液接种于96孔板中,置于37℃,5% CO2细胞培养箱中培养过夜。
②给药。待细胞完全贴壁后,加入候选多肽药液100 μL,使各组终浓度均为320 μM,同时设计溶媒对照组,继续培养48 h。所述候选多肽如图1A所示。
③检测。从培养箱取出96孔板,每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液,放置于细胞培养箱的最底层,孵育4 h。用5 mL注射器将孔中液体小心吸出,每孔加入150 μL DMSO,随后置于酶标仪中检测吸光度OD值(波长参数:570 nm)。结果如图1(A)所示,六个候选NRP1靶向肽对HUVEC细胞的增殖没有显著抑制作用,可能是由于氨基酸序列较短易被降解或本身亲和力不强导致。
(2)小管形成实验检测候选NRP1靶向肽对HUVEC细胞微管形成能力的影响。
①实验前准备。提前一天将储存于-20℃冰箱的Matrigel基质胶转移至4℃冰箱融化,并将96孔板和灭菌过的黄枪头盒置于-20℃预冷。
②铺胶。用预冷过的黄枪头吸取50 μL Matrigel基质胶迅速加入到96孔板中,使基质胶平铺于板底,随后放置于CO2细胞培养箱中活化1 h。
③处理细胞及加药。取处于对数生长期的HUVEC细胞,消化分散制作单细胞悬液,每孔加入50 μL细胞悬液(2 ~ 3 ×104/孔)和50 μL六种多肽药液,使各组终浓度均为320μM,同时设立溶媒对照组。在CO2细胞培养箱中继续孵育4 h,使用荧光显微镜明场观察并拍照。使用Image J软件进行统计分析。结果如图1(B)所示,在促血管生成因子VEGFA-165存在的情况下,与溶媒对照组相比,NRP1靶向肽RP7将HUVEC细胞的微管形成数量减少了25%,而其他NRP1靶向肽没有明显的抑制活性。以上结果表明并非所有的NRP1靶向肽都具有抗血管生成活性,但本实施例筛选后确定,一种7个氨基酸组成的短肽RP7可以抑制HUVEC细胞的微管形成。
实施例2融合肽Tat-RP7
本实施例中提供一种融合肽Tat-RP7,所述融合肽Tat-RP7由SEQ ID NO.2所述穿膜肽Tat与实施例1中所述RP7通过共价键连接。
实施例3融合肽Tat-C-RP7的筛选及性能
1. 融合肽最佳连接臂的筛选。
(1)MTT实验检测两种融合肽对HUVEC细胞增殖的影响。
①铺板步骤同上。
②给药。待细胞完全贴壁后,加入不同浓度的两种融合多肽药液100 μL,同时设计溶媒对照组,继续培养48 h。
③检测步骤同上。结果如图2(A)所示,两个融合肽对HUVEC细胞的增殖表现出接近的抑制作用。
(2)小管形成实验检测两种融合肽对HUVEC细胞微管形成能力的影响。
①实验前准备和铺胶步骤同上。
②处理细胞及加药。取处于对数生长期的HUVEC细胞,消化分散制作单细胞悬液,每孔加入50 μL细胞悬液(2 ~ 3 × 104/孔)和50 μL两种融合多肽药液,使终浓度为320 μM,同时设立溶媒对照组。在CO2细胞培养箱中继续孵育4 h,使用荧光显微镜明场观察并拍照。使用Image J软件进行统计分析。结果如图2(B)所示,在促血管生成因子VEGFA-165存在的情况下,与溶媒对照组相比,两种融合多肽均能明显抑制HUVEC细胞的微管形成,连接臂为半胱氨酸的融合肽抑制能力更强。
(3)划痕实验检测两种融合肽对HUVEC细胞迁移能力的影响。
①实验前准备。在超净台中用马克笔在6孔板的背面画3条均匀且平行的横线,备用。
②处理细胞。取处于对数生长期的HUVEC细胞,消化分散制作单细胞悬液,接种于6孔板中(4 ~ 5 × 105/孔),置于37℃,5% CO2细胞培养箱中培养。待细胞接近完全融合时,用灭过菌的白枪头在每个孔中快速且平行的划三条痕(垂直于背后马克笔横线),加入1 mLPBS缓冲液轻轻洗涤细胞。每个孔中加入2 mL用1%血清F12K培养基配制的两种融合多肽药液,使终浓度为80 μM,置于37℃,5% CO2细胞培养箱中培养,在0、12,24 h用荧光显微镜明场拍照,并详细记录拍照位置。使用Image J软件进行统计并计算迁移率。结果如图2(C)所示,以两个甘氨酸为连接臂的融合肽没有表现出抑制细胞迁移的活性,而以一个半胱氨酸为连接臂的融合肽Tat-C-RP7能显著抑制HUVEC细胞迁移。
2. RP7、Tat和Tat-C-RP7对NRP1蛋白的亲和动力学分析。
(1)利用表面等离子共振(SPR)技术。
①蛋白偶联缓冲液的筛选。首先将NRP1蛋白50 μg冻干粉末溶解于超纯水中,配制成500 μg/mL的蛋白母液。蛋白偶联缓冲液的pH值原则上一般介于3.5和蛋白配体等电点(pI)之间,NRP1蛋白的等电点值为5.28,故选用pH(4.0和4.5)的10 mM醋酸钠缓冲液稀释NRP1蛋白进行筛选,使蛋白终浓度为50 μg/mL。将空白CM5芯片装入机器,设置参数,手动进样NRP1蛋白20 μL,流速为10 μL/min,观察响应值(RU)。待蛋白进样结束后,手动进样50 mMNaOH溶液5 μL,用于清除CM5芯片表面的非特异性结合蛋白。结果如图3(A)所示,SPR传感图显示NRP1蛋白于pH = 4.5的醋酸钠缓冲液中有最佳的偶联活性。
②蛋白偶联。选择Surface Preparation程序,使用氨基偶联试剂盒将NRP1蛋白偶联至CM5芯片上,具体步骤如下:取EDC和NHS溶液各200 μL混合均匀,活化芯片;使用最佳醋酸钠缓冲液稀释NRP1蛋白,浓度为25 μg/mL,脉冲进样;待CM5芯片达到合适偶联水平后,用乙醇胺溶液封闭芯片。结果如图3(B)所示,最终的NRP1蛋白偶联量大约为8000 RU。
③NRP1蛋白与不同多肽的亲和动力学分析。将一系列不同浓度的RP7,Tat和融合肽Tat-C-RP7稀释液依次进样,用以检测NRP1蛋白与不同多肽的结合能力。在25℃、pH 7.4,流速为30 μL/min的条件下,将不同浓度的多肽稀释液同时循环参比通道和NRP1蛋白通道。为了减少容积差效应,分析物的实际响应值应为总响应值扣除参比通道的响应值。最后用Biacore 3000的Evaluation software软件进行拟合,计算不同多肽的解离平衡常数KD。结果如图3(C)所示,融合肽Tat-C-RP7对NRP1蛋白表现出最强的结合能力,KD值为69.7 nM (ka= 7.89 × 104M-1s-1,kd= 5.5 × 10-3s-1)。RP7的KD值仅为0.14 mM(ka= 3.24 × 103M-1s-1,kd= 0.454 s-1),说明与NRP1蛋白快速结合并且快速解离。Tat的KD值为192 nM(ka= 2 ×105M-1s-1,kd= 0.0384 s-1),介于RP7和融合肽Tat-C-RP7之间,表示与NRP1蛋白具有中等强度的结合能力。以上SPR结果表明,当细胞穿膜肽Tat与NRP1靶向肽RP7通过连接臂半胱氨酸共价连接后,所得到的融合肽Tat-C-RP7对NRP1蛋白的结合能力显著提高。
3. 脑微血管内皮细胞bEnd.3对FITC标记融合肽Tat-C-RP7的摄取检测。
(1)荧光显微镜拍照观察细胞摄取情况。
①处理细胞。取处于对数生长期的bEnd.3细胞,消化分散制作单细胞悬液,接种于6孔板中(2 ~ 3 × 105/孔),置于37℃,5% CO2细胞培养箱中培养24 h。
②加药。弃去上清,PBS缓冲液洗涤细胞1遍,加入用DMEM基础培养基配制的不同FITC多肽药液,使终浓度为16 μM,随后将6孔板置于37℃,5% CO2细胞培养箱中继续培养1h。
③染色和拍照。全程避光操作,弃去上清,用Hoechst染色试剂盒进行细胞核染色,染色结束后用荧光显微镜拍照。结果如图4(A)所示,经过1 h的孵育,除FITC-RP7组以外,其它组均能观察到绿色荧光,说明这些多肽均能被bEnd.3细胞摄取,并且FITC-Tat-C-RP7组的荧光强度最强,提示bEnd.3细胞对其摄取最强。
(2)流式细胞仪检测摄取率。
①细胞接种和加药操作同上。
②处理细胞。全程避光操作,弃去上清,用PBS洗涤1遍,每孔加入200 μL胰酶室温消化细胞,于显微镜下观察消化情况,直至细胞开始脱落;加入1 mL完全培养基终止消化并收集细胞至离心管中,在1700 r/min条件下离心7 min;弃去上清,加入1 mL PBS重悬,在1700 r/min条件下再离心7 min;弃去上清,用200 μL轻轻重悬,细胞过200目细胞筛并转移至流式管中,在1 h内上机检测。结果如图4(B)所示,bEnd.3细胞与不同多肽孵育1 h后,除FITC-RP7组以外,其它组别的阳性细胞比例均接近100%,说明细胞穿膜肽Tat具有极强的细胞穿透性。与定性摄取实验一致,融合肽FITC-Tat-C-RP7组的平均荧光强度高于FITC-Tat和FITC-Tat+FITC-RP7组,说明融合肽FITC-Tat-C-RP7的细胞穿透性最强。
4. FITC标记融合肽Tat-C-RP7在原位脑胶质瘤裸鼠脑部的积累检测。
①裸鼠原位胶质瘤模型的建立。取处于对数生长期的U87-luc-mCherry细胞,配制成单细胞悬液,置于冰上备用,每只裸鼠接种约2.5 × 105个细胞。裸鼠接种细胞前用小动物麻醉机麻醉,将裸鼠小心放置在脑立体定位仪上。用棉棒蘸取碘伏,消毒裸鼠头部皮肤,用手术剪刀切开约1 cm的皮肤开口,用镊子和棉棒破坏头骨表面粘膜,定位于中线旁右侧3mm,卤门前1 mm处钻孔。将微量注射器固定在脑定位仪上,垂直进针穿刺进入脑组织,进针深度为2.5 mm(进3 mm,退0.5 mm),约用3 min平稳缓慢的注入细胞,用可吸收外科缝线缝合伤口。为了确认模型的成功,使用小动物成像仪检测裸鼠头部肿瘤细胞的生物发光情况。
②体内脑分布实验。裸鼠脑胶质瘤模型建立的第14天,模型鼠通过尾静脉注射不同FITC标记的多肽药液,剂量为20 mg/kg。在给药1 h后麻醉处死裸鼠,剥取脑组织,用生理盐水洗涤2遍,转移至4%多聚甲醛中固定48 h,依次置于15%和30%蔗糖溶液中脱水,经过OCT包埋和-20℃冷冻后,制作脑组织的冰冻切片,切片厚度为20 μm。将脑组织切片与DAPI染料室温孵育30 min进行染核,随后用PBS缓冲液洗涤2遍,使用全景数字切片扫描显微镜进行拍照,观察FITC标记多肽在脑组织中的分布情况。结果如图5所示,生理盐水、FITC-RP7、FITC-Tat和FITC-Tat+FITC-PR7组在肿瘤组织部位的绿色荧光强度较低,这可能是由于靶向效率差所致。相比之下,融合肽Tat-C-RP7组在肿瘤组织部位的绿色荧光最亮,说明累积量最高,与体外脑微血管内皮细胞对不同多肽的摄取效率一致。
5. 融合肽Tat-C-RP7的体外抗血管生成活性评价。
(1)MTT实验检测融合肽Tat-C-RP7对HUVEC细胞增殖的影响。
①铺板步骤同上。
②给药。待细胞完全贴壁后,加入不同浓度的多肽药液100 μL,同时设计溶媒对照组,继续培养48 h。
③检测步骤同上。结果如图6(A)所示,用融合肽Tat-C-RP7处理48 h后,HUVEC细胞的增殖被明显抑制,抑制率约40%。单独的RP7组、单独的Tat组,甚至是等摩尔浓度的Tat+RP7物理混合组的抗HUVEC细胞增殖效果均远低于融合肽组,未表现出明显的抑制HUVEC细胞增殖的能力。
(2)小管形成实验检测融合肽Tat-C-RP7对HUVEC细胞微管形成能力的影响。
①实验前准备和铺胶步骤同上。
②处理细胞及加药。取处于对数生长期的HUVEC细胞,消化分散制作单细胞悬液,细胞计数,每孔加入50 μL细胞悬液(2 ~ 3 × 104/孔)和50 μL不同多肽药液,使终浓度为320 μM,同时设立溶媒对照组。在CO2细胞培养箱中继续孵育4 h,使用荧光显微镜明场观察并拍照。使用Image J软件进行统计分析。结果如图6(B)所示,即使在促血管生成因子VEGFA-165存在的情况下,融合肽Tat-C-RP7对HUVEC细胞管结构的形成有接近60%的抑制效果,而其它组的抑制率仅为20%左右,说明融合肽Tat-C-RP7可以竞争性的抑制VEGFA-165与NRP1的结合,从而抑制微管形成。
(3)划痕实验检测两种融合肽对HUVEC细胞迁移能力的影响。
①实验前准备和处理细胞步骤同上。
②加药。每个孔中加入2 mL用1%血清F12K培养基配制的不同多肽药液,使终浓度为80 μM,置于37℃,5% CO2细胞培养箱中培养,在0、12,24 h用荧光显微镜明场拍照,并详细记录拍照位置。使用Image J软件进行统计并计算迁移率。结果如图6(C)所示,与溶媒组相比,融合肽Tat-C-RP7在处理细胞24 h后,对HUVEC细胞的迁移抑制率约40%,而处理48 h后的迁移抑制率同样接近40%,Tat+RP7组对HUVEC细胞迁移的抑制作用与Tat组和RP7组相似,但作用均不明显。
(4)Transwell实验检测两种融合肽对HUVEC细胞迁移能力的影响。
①处理细胞和加药。取处于对数生长期的HUVEC细胞,消化分散制作单细胞悬液,在Transwell上室中加入50 μL细胞悬液(3 ~ 4 × 104/孔)和50 μL用F12K基础培养基配制的不同多肽药液,在Transwell下室中加入500 μL完全培养基作为细胞迁移的趋化因子,设置溶媒对照组,将24孔板置于37℃,5% CO2细胞培养箱中培养24 h。
②染色和拍照。取出Transwell上室,用预冷的PBS缓冲液洗涤3次,将小室方置于一个洁净的24孔中,加入600 μL细胞固定液,固定30 min。PBS缓冲液洗涤3次,加入600 μL结晶紫染料室温染色30 min,再用PBS缓冲液洗涤3次,用棉棒小心擦去小室内膜表面未发生迁移的细胞,荧光显微镜明场拍照。细胞计数,计算细胞迁移率。结果如图6(D)所示,结果与划痕实验结果基本一致,融合肽Tat-C-RP7组可明显减少穿过小室的细胞数量,迁移抑制率接近40%
6. 融合肽Tat-C-RP7诱导内皮细胞凋亡的情况。
(1)Hoechst核染色。
①处理细胞。取处于对数生长期的HUVEC细胞,消化分散制作单细胞悬液,接种于6孔板(2 ~ 3 × 105/孔),置于37℃,5% CO2细胞培养箱中培养24 h。
②加药。弃去培养基,用1 mL PBS缓冲液清洗细胞一遍,每个孔中加入2 mL用完全培养基配制的不同多肽药液,设置溶媒对照组,将6孔板置于37℃,5% CO2细胞培养箱中继续培养24 h。
③染色和拍照。细胞核染色使用碧云天Hoechst染色试剂盒,染色并洗涤结束后,使用荧光显微镜UV激发光通道拍照,拍照条件需保持一致。结果如图7(A)所示,凋亡细胞用白色箭头标出。溶媒对照组细胞核形态饱满,未出现明显皱缩和破碎的现象,并且染色质染色均匀,表现为均匀的蓝色荧光。然而经过Tat-C-RP7处理24 h后,较多细胞出现染色质皱缩呈致密浓染,表现出强蓝色荧光,发生凋亡的细胞数目比溶媒对照组和其它对照肽组明显增多。
(2)Annexin V-FITC/PI双染法。
①处理细胞和加药。步骤同Hoechst细胞核染色实验。
②染色和流式检测。细胞染色使用碧云天Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒,染色结束后,细胞过200目细胞筛并转移至流式管中,在1 h内上机检测。结果如图7(B)所示,溶媒对照组,RP7组,Tat组和RP7+Tat组的总凋亡率分别为2%,10%,10%和8%,而Tat-C-RP7组的总凋亡率增加至15%。与Hoechst核染色结果一致,证实了融合肽Tat-C-RP7可以有效地诱导HUVEC细胞发生凋亡。
7. 融合肽Tat-C-RP7对VEGFR2相关信号通路的影响。
(1)利用Western blotting实验。
①细胞蛋白提取。取处于对数生长期的HUVEC细胞,消化分散制作单细胞悬液,接种于6孔板中(2 ~ 3 × 105/孔),置于37℃,5% CO2细胞培养箱中培养24 h。弃去上清,PBS缓冲液洗涤一次,加入不同浓度用F12K基础培养基配制的融合肽药液,设置溶媒对照组,处理90 min后加入VEGFA-165刺激因子,10 min后进行蛋白提取操作。使用总蛋白提取试剂盒提取HUVEC细胞总蛋白。
②SDS-PAGE凝胶电泳。按照配方配制8% SDS-PAGE凝胶,蛋白上样量(25 μg ~ 35μg)。冰水浴条件下开始恒压电泳,使不同分子量的蛋白分开;将所需目的蛋白凝胶小心切下,覆盖上预先用甲醇活化过的PVDF膜,开始恒流转膜;将PVDF膜转移至配制好的5%脱脂奶粉中封闭;封闭结束后,用TBST洗涤PVDF膜3次,每次10 min;根据PVDF膜的标记,转移至配制好的不同一抗稀释液中,4℃摇床孵育过夜;一抗孵育结束后,用TBST洗涤PVDF膜3次,每次10 min,转移至二抗稀释液中,室温摇床孵育1 h;用TBST洗涤PVDF膜3次,每次10 min,将PVDF膜平铺于化学发光成像仪中,滴加ECL显影液,用Image Lab软件检测蛋白并进行灰度分析和统计。结果如图8所示,在有无VEGFA-165的情况下,融合肽Tat-C-RP7都能减弱PLCγ上Tyr783的磷酸化,但不会引起总蛋白变化,还能够以浓度依赖的方式显著抑制ERK1/2的磷酸化,并且在40 μM时即可检测到磷酸化水平的降低,在浓度为80 μM和160 μM时具有最大作用,说明融合肽的确是通过衰减VEGFR2-PLCγ-ERK1/2信号通路的活性抑制细胞增殖。此外,还检测了融合肽Tat-C-RP7抑制AKT活化的能力,发现融合肽Tat-C-RP7在有无VEGFA-165诱导的情况下均能抑制AKT的磷酸化水平,说明融合肽是通过抑制VEGFR2-AKT信号通路的磷酸化活性促进HUVEC细胞发生凋亡。但是,结果显示融合肽Tat-C-RP7对其它与细胞迁移密切关联的VEGFR2下游蛋白,如SRC,FAK和P38 MAPK磷酸化无明显抑制作用,说明融合肽Tat-C-RP7的主要功能并不是抑制细胞迁移,而是抑制细胞增殖和促进细胞发生凋亡。
8. 融合肽Tat-C-RP7抑制原位脑胶质瘤裸鼠的肿瘤生长情况。
(1)体内抑制胶质瘤生长实验。
在造模第4天(造模当天为第1天)进行分组。将胶质瘤模型裸鼠随机分为5个组(n= 6),开始每天通过尾静脉分别注射不同多肽药液(PR7,Tat,Tat+PR7或Tat-C-PR7)和生理盐水,剂量为15 mg/kg,每隔3天进行小动物成像检测,记录裸鼠脑胶质瘤生物发光强度的变化,并且每日称量裸鼠的体重。结果如图9(A)(B)(C)所示,在给药第10天,融合肽Tat-C-RP7组胶质瘤的生物发光强度和发光面积明显小于其它实验组,表明颅内肿瘤尺寸较小。与生理盐水组相比,RP7组、Tat组和Tat+PR7组在一定程度上也减缓了肿瘤的生长,尤其是在最初的7天中具有一定治疗效果,但7天之后脑胶质瘤的生长将不受控制,生长速率甚至高于生理盐水组。在治疗的早期阶段,所有多肽组的裸鼠体重均未见明显降低。在给药结束时,生理盐水组裸鼠的体重下降最为严重,这表明动物的体重与肿瘤大小呈负相关,而并非给予多肽造成的影响。
(2)CD31免疫荧光染色和HE染色实验。
裸鼠麻醉处死后,每组剥取3只脑组织分别进行CD31免疫荧光染色和HE组织染色实验。用生理盐水洗涤2遍后转移至4%多聚甲醛中固定,并用石蜡包埋。脑组织切成4 μm厚的切片进行染色。使用全景数字切片扫描显微镜进行拍照,观察脑组织中血管标志物CD31的表达情况和胶质瘤块的大小。结果如图9(D)(E)所示,融合肽Tat-C-RP7组肿瘤明显小于其它组,与小动物活体成像系统检测获得的结果一致,并且融合肽Tat-C-RP7组的血管大小和数量都少于其它组别。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种融合肽及在制备抗肿瘤制剂中的应用
<130> 2010
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Arg Pro Ala Arg Pro Ala Arg
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Arg Pro Ala Arg Pro
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Cys Arg Pro Ala Arg Pro Ala
1 5 10 15
Arg
Claims (5)
1. 一种融合肽,其特征在于,所述融合肽包括SEQ ID NO.1所示序列,还包括穿膜肽序列;
所述融合肽还包括连接臂,所述连接臂用于连接穿膜肽及所述SEQ ID NO.1所示序列的多肽;
所述连接臂为半胱氨酸,所述穿膜肽为Tat,所述融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述融合肽在制备抗脑胶质瘤制剂的应用。
3.权利要求1所述融合肽用于制备NPR1蛋白指示剂的应用;
所述融合肽具有标记物用于指示NPR1蛋白。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述标记物包括荧光标记物、同位素标记物。
5.权利要求1所述融合肽在制备抗血管生成药物中的应用。
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