CN108289942A - 用生产免疫调节剂的免疫-分离的细胞接种疫苗 - Google Patents

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Abstract

本文提供含有至少一个可取回的生物相容性大胶囊和抗原组分(例如自体肿瘤细胞或传染因子)的疫苗组合物，所述大胶囊含有分泌免疫调节剂例如GM‑CSF(粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子)的免疫‑分离的同种异体细胞。本文还提供含有疫苗组合物的药剂盒和药用组合物以及用于针对肿瘤或传染因子的治疗性或预防性接种疫苗的方法的所述产品。

Description

用生产免疫调节剂的免疫-分离的细胞接种疫苗
相关申请
本申请要求2015年9月25日提交的美国申请号62/232,940和2016年9月7日提交的美国申请号62/384,416的优先权，其各自的内容通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本发明总体上涉及免疫学领域，特别是针对肿瘤的基于细胞的免疫和针对传染因子的接种疫苗。
发明背景
在接种疫苗的领域中，第一代疫苗仅含有免疫反应所需针对的抗原。然而，因为抗原单独存在在大多数情况下只有弱的有效性，所以开发了第二代疫苗，其中接种疫苗组合物包含一种或多种佐剂作为免疫调节剂(即，单独或与其它佐剂组合的GM-CSF)，以增强这种免疫反应。为了是有效的，佐剂在接种疫苗部位必须稳定地释放数天。
在接种疫苗部位提供佐剂的几种不同的技术已有报道，且技术的选择取决于免疫的情况。
例如，在基于抗原的疫苗的情况中(与基于细胞的疫苗截然不同)，广泛适用的技术只不过是在接种疫苗组合物中使抗原与佐剂合并。生成的组合物被直接给予受试者，从而以同时和共同定位的方式供应抗原和佐剂。
然而，这种简单的方法不能用于所有的接种疫苗情况。例如，在大多数癌症(例如，肺癌、结肠癌、胃癌、淋巴瘤和脑癌)中，对于接种疫苗的有用的抗原往往是未知的。因此，对于这些类型的癌症，需要针对肿瘤的基于细胞的免疫策略。对于涉及基于细胞的疫苗的免疫策略，抗原通过植入受试者中的全细胞产生。这样的策略需要使用更复杂的技术，以确保佐剂的有效递送。
在一个实例中，免疫调节剂在接种疫苗部位，以“裸体”形式或者以使用聚乙二醇化的脂质体微球的缓释制剂直接注射。然而，这种策略往往被技术和生化困难限制，因为全身给予佐剂不是有效的并且可能是有毒的，并且作为佐剂使用的重组蛋白(即，GM-CSF)的局部释放是不可靠的，因为GM-CSF是不稳定的蛋白，其在人体内仅有几小时的半衰期。因此，为了是有效的，GM-CSF必须连续原位产生以便为治疗有效的。
用来规避由直接注射技术产生的问题的另一个实例是使用“旁观者细胞(bystander cells)”，以局部产生免疫调节剂。在这些方法中，产生需要的佐剂的细胞被植入抗原来源附近，从而提供佐剂在疫苗部位的有效局部释放。
然而，这种方法也有一些缺点。对于人类免疫，多次免疫是需要的，并且因为同源的旁观者细胞不容易获得，同种异体细胞是最常使用的。因此，在第一次注射后，旁观者细胞被宿主的免疫系统识别(同种异体识别)并被排斥，从而阻止免疫调节剂的进一步稳定和持续产生，并危害针对疫苗的抗原物质所需的免疫反应。
为了克服这种同种异体识别问题，Borrello等(Human Gene Therapy, 1999, 10(12), 1983-1991)描述了一种策略，其中供应GM-CSF的细胞是细胞系K-562 (ATCC保藏号CCL-243)，其在它们的表面上不表达MCH分子并且不能表达HLA I或II类抗原，从而潜在地减少重复免疫生成的同种异体反应的强度。然而，这些细胞是人类癌细胞且对不涉及HLA I或II类蛋白发生的有效排斥机制是高度敏感的，HLA I或II类蛋白是较少特异性的，但对于细胞破坏是非常快速的和有效的。例如，K-562细胞已知对NK细胞并且也对导致同种异体细胞的快速消除的γδ T细胞是非常敏感的。
因此，有可能在疫苗部位注射的K-562旁观者细胞会被非-MHC依赖性细胞毒性机制有效地和快速地破坏，这可显著地减少免疫调节剂的释放。
此外，除了对被NK细胞的快速破坏非常敏感外，K-562细胞在干扰素γ暴露时也可表达MHC I类。因为在第一次免疫期间或重复免疫后，干扰素γ可能在接种疫苗部位存在或释放，这样的MHC I类上调也将经由典型的细胞免疫，导致快速的细胞破坏。
因为这些理由，在接种疫苗中使用细胞例如K-562与许多缺点有关。
广泛用于基于细胞的疫苗情况的另一个解决方案是，通过工程改造作为抗原来源的细胞以便还供应免疫调节剂，来结合抗原的产生和免疫调节剂的释放。例如，在癌症疫苗中，抗原的来源通常是全肿瘤细胞，其可例如通过转染来工程改造，以同时产生必要的佐剂。
鉴于在小鼠模型中获得的有利结果，最初的人类试验使用相同的策略。然而，该技术证明是非常劳动密集且费时的，因为患者手术收获的细胞需要体外扩增用于逆转录病毒感染，从而阻止了该方法的广泛使用。
也已提出使用其它病毒载体以感染肿瘤细胞来规避使用逆转录病毒载体时观察到的困难。
然而，与测试的新病毒有关的主要问题是，在大多数情况下，一些病毒蛋白在感染后将从肿瘤细胞表达，而这些病毒蛋白被免疫系统强烈地识别为外来的传染因子。因此，增加针对弱肿瘤抗原的免疫反应的初始目标向病毒蛋白倾斜或转移，其导致屏蔽抗-肿瘤免疫反应并针对随后的免疫引发接受者，这将进一步增加注射的细胞的破坏并将可能减少抗-肿瘤免疫方案的功效。
因此，虽然使用自体工程改造的肿瘤细胞作为抗原和佐剂的合并来源推断使不需要的免疫反应的风险最小化，但病毒感染步骤本身引起严重的问题。
为了限制由自体细胞的病毒感染产生的问题，已经开发了不需要患者的细胞的新策略。在这些技术中，抗原来源由源自患有类似类型癌症的其它患者的细胞系提供，并且患者用重复注射辐照的、分泌GM-CSF的同种异体(来自另一个人)的肿瘤细胞免疫。在使用这些技术的研究中，显示免疫反应的患者的百分率已低于期望值。
因此，本领域仍有开发疫苗组合物的需求，所述疫苗组合物提供免疫调节剂的稳定来源和基本上没有与天然或适应性免疫系统的不需要的相互作用的抗原组分。
发明概述
开发良好的抗原-驱动的癌症免疫疗法需要适当的位置、适当的抗原材料(即，自体肿瘤细胞)、适当的免疫刺激信号(例如，GM-CSF (单独或与其它佐剂组合)、必要的佐剂的持续递送、佐剂和抗原组分的稳定的和可重复的递送、临床级材料的可用性以及放大生产的能力。有效的抗癌免疫需要肿瘤-特异性抗原和强佐剂。免疫调节剂例如GM-CSF在免疫部位随着天数推移的局部、稳定的释放是最强佐剂之一。它在测试的所有鼠科动物癌症类型中诱导有效的、持久的、特异性抗-肿瘤免疫力。然而，GM-CSF的全身递送不是良好的佐剂，因为它募集MSDC且不加强癌症免疫力。
使用包囊化细胞疗法(ECT)，皮下临床级平台生成。本发明涉及利用双组分疫苗组合物的临床级免疫策略。疫苗组合物的一个组分是抗原组分(即，致死辐照的自体肿瘤细胞或一种或多种传染因子)，而另一个组分是至少一个可取回的生物相容性大胶囊，其含有分泌或已经基因工程改造以分泌有效量的免疫调节剂(即，GM-CSF)至少1周时期的免疫-分离的同种异体细胞。这些免疫-分离的同种异体细胞在抗原组分的紧邻处，以连续和非-免疫原性方式分泌活性形式的免疫调节剂。
本发明提供一种克服与先前的免疫策略有关的缺点且基于在WO 2003/105895(其通过引用以其整体结合到本文中)中描述的组合物和方法的新方法。
在此描述的接种疫苗策略不需要任何定制的基因疗法方案且不包括使用任何病毒载体。而是，标准化佐剂(即，GM-CSF)在紧邻抗原组分处从大胶囊皮下释放。这种基于细胞的免疫疗法合并了GM-CSF和肿瘤特异性抗原的持续的、稳定的、标准化局部释放。
在此描述的任何疫苗组合物可用于治疗性或预防性接种疫苗，用于癌症疗法或治疗(在此也可互换称为Onco-Maxi-Vax或MVX-ONCO-1)或用于传染因子治疗或预防(在此也可互换称为Immuno-Maxi-Vax或IA-Maxi-Vax)。因为所述抗-癌治疗基于引发患者自身的天然免疫反应机制以消除癌细胞，因此它可被用于所有类型的癌症，包括实体瘤和血液相关的癌症二者。
本文提供疫苗组合物，其含有：(a) 至少一个可取回的生物相容性大胶囊，其含有分泌至少20 ng/24小时的GM-CSF的约1x105-约1x106个免疫-分离的同种异体细胞(例如，约8x105个免疫-分离的同种异体细胞)和(b) 抗原组分，其中至少一个生物相容性大胶囊具有包含同种异体细胞和内部线圈的芯，其中同种异体细胞被分布在内部线圈上；和允许GM-CSF扩散通过的围绕芯的半渗透膜。在生物相容性大胶囊内的几个不同浓度的同种异体细胞被测试(例如，5、8、10和15x105个细胞)。在一个非限制性实施方案中，选择8x105个细胞，因为它以最小的可变性提供了适合长期释放的最好的长期稳定性。
半渗透膜由选自聚醚砜(PES)和热塑性聚氨酯的材料制得和/或内部线圈由铝或钛制得。具有几种不同孔径的几个膜厚度被测试(例如，PES 5、UltraPES 0.8、Ultra PES0.7)。在一些实施方案中，内部线圈上的螺旋线之间的距离是约1mm ± 0.1mm。内部线圈可从铝、钛等制得。
各个生物相容性胶囊可呈现圆柱体的形状。在一些实施方案中，各个生物相容性大胶囊的长度是在5和25 mm之间(即，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25 mm的长度)。12 mm被选择为用于植入、处理、制备和细胞加载程序的最适尺寸。
大胶囊还可含有取回管，其可从任何合适的材料，包括但不限于聚氨酯制得。至少一个大胶囊的膜可固定于取回管。例如，连接器(例如，不锈钢连接器)可被用来将取回管固定到至少一个生物相容性大胶囊的膜。插入膜的连接器的末端优选地具有截短的锥形形状。
取回管还可包含取回钩以方便至少一个大胶囊在植入后的取回。例如，所述钩可被用来在植入期间固定大胶囊并被用来在限定的时间段后除去大胶囊。
在一些实施方案中，取回钩含有孔眼和至少两条腿以促进对取回管的附着。
取回钩可从任何合适的材料制得，包括但不限于不锈钢，且它可使用紫外线固化胶固定于取回管。
缝线可通过孔眼放置以在植入后固定取回钩。
至少一个生物相容性大胶囊还含有加载中心以促进细胞的加载。在一些实施方案中，加载中心具有截短的锥形末端。加载中心可经摩擦安装到膜中。
在其它实施方案中，至少一个生物相容性大胶囊被包含在具有管体和管帽的传输管内，所述管体和管帽可包含一个或多个孔。此外，管帽还可含有经摩擦安装到帽中的鲁尔锁(luer lock)。加载中心可被匹配地啮合到帽内的鲁尔锁中。
在一些实施方案中，疫苗组合物含有两个生物相容性大胶囊。
在每个大胶囊内的免疫-分离的同种异体细胞分泌至少20 ng/24h的GM-CSF至少1周的时期。
在一些实施方案中，抗原组分是可任选地被辐照的自体肿瘤细胞。在这些实施方案中，抗原组分是约1x106-约1x107个自体肿瘤细胞(例如，约4x106个自体肿瘤细胞)。致死辐照的肿瘤细胞可冷冻贮存至多12个月(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)的长期贮存。
在其它实施方案中，抗原组分来自传染因子(例如，病毒、细菌、寄生虫病原体或真菌)。例如，合适的抗原组分包括灭活的病原体、传染因子溶解产物、蛋白提取物、重组蛋白、肽或DNA。作为非-限制性实例，病毒选自HIV、CMV、复发性疱疹感染、乙型肝炎、厄泼斯坦巴尔病毒、丙型肝炎和人乳头瘤病毒(HPV)；细菌选自分枝杆菌感染、幽门螺杆菌和脑膜炎球菌感染；寄生虫病原体选自疟疾、弓形体、肺孢子虫和包虫病；和/或真菌选自假丝酵母和曲霉菌。
在此描述的任何疫苗组合物中，免疫-分离的同种异体细胞还分泌至少一种另外的免疫调节剂(例如，IL-12、IL-15、IL-4、干扰素γ、趋化因子或树突细胞生长因子、IL-3、IL-9、IL-1、IL-2、IL-7、IFNγ的跨膜受体、可溶性或膜性干细胞因子(SCF)、FL (Flt3配体)、G-CSF、TLR7激动剂、T细胞免疫球蛋白粘液素-3 (TIM-3)、糖皮质激素-诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、淋巴细胞-激活基因3 (LAG-3)、Vista、B-和T-淋巴细胞弱化子(也称为CD272) (BTLA)、诱导型T-细胞辅助刺激因子(ICOS) (也称为CD278)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4 (OX40) (也称为CD134或TNFRSF4)、CD40、CD137 (也称为41BB)、CD27及其组合)。
围绕大胶囊芯内的免疫-分离的同种异体细胞的膜是选择性渗透的。例如，膜的截留分子量(MWCO)是大约280 kDa。
在一些实施方案中，免疫-分离的同种异体细胞经遗传修饰以表达GM-CSF，例如通过质粒转染或病毒感染。
免疫-分离的同种异体细胞是建立的人细胞系(例如，非-粘附细胞系例如造血来源的细胞)。在一些实施方案中，免疫-分离的同种异体细胞是永生的或永生化的和/或是非肿瘤的。免疫-分离的同种异体细胞具有哺乳动物来源(例如，人或非-人类哺乳动物)。在一些实施方案中，免疫-分离的同种异体细胞被辐照。
免疫-分离的同种异体细胞分泌约80-约960x10-15g/24hr的GM-CSF，超过10x10- 15g/24hr的GM-CSF，或超过100x10-15g/24hr的GM-CSF。
在某些实施方案中，至少一个生物相容性大胶囊分泌50和150 ng/天之间(例如，50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150ng/天)的GM-CSF。
在此描述的任何疫苗组合物还可包含一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是免疫检查点调节剂。例如，免疫检查点调节剂可以是靶向一种或多种免疫调节分子的产品或试剂(例如，蛋白、抗体、化合物等)，所述免疫调节分子例如，细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)、程序性细胞死亡蛋白1配体(PD-L1)、TIM-3、GITR、LAG-3、Vista、BTLA、ICOS、OX40、CD40、CD137 (也称为41BB)、CD27、吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)及其组合。
因此，包囊化细胞可经工程改造以产生具有抑制或者增强活性的分子，这取决于靶是具有抑制(即，拮抗)还是增强(即，激动)能力的免疫检查点。
基于细胞的免疫和CTLA-4/PD-1阻断之间的协同作用在临床前模型中已得到证实。优选地，CTLA-4的局部产生是需要的。
至少一个生物相容性大胶囊和/或抗原组分可被冷却，贮存，并且在使用之前解冻。
在此描述的任何疫苗组合物中，至少一个生物相容性大胶囊还可包含以下的一个或多个：i) 取回管；ii) 固定于取回管的取回钩，其中取回钩方便至少一个生物相容性大胶囊在植入后的取回；iii) 连接器，其中连接器将至少一个生物相容性大胶囊的膜固定于取回管；iv) 加载中心，其中加载中心促进细胞加载；和/或v) 传输管，其中传输管具有管体和管帽。
还提供了含有描述的任何疫苗组合物和一种或多种生理学上可接受的载体的药用组合物。
还提供了含有疫苗组合物和/或药用组合物和使用说明书的药剂盒。例如，在这样的药剂盒中，抗原组分可包含产生或释放一种或多种抗原的细胞，例如任选被辐照的肿瘤细胞。或者，抗原组分可从传染因子(例如，病毒、细菌、寄生虫病原体或真菌)获得。
在此描述的任何药剂盒中，至少一个生物相容性大胶囊被灭菌(例如，在使用前)。在灭菌后，至少一个生物相容性大胶囊可被单独包装在无菌袋中，用于贮存、运输和/或递送。
还提供了在此描述的疫苗组合物、药用组合物和/或药剂盒用于治疗性或预防性接种疫苗(例如，癌症治疗或接种疫苗)的用途。作为非-限制性实例，癌症可选自肺癌、黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、急性白血病、慢性白血病、成胶质细胞瘤、低度恶性淋巴瘤、高度恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、骨癌、脑瘤、胃癌、食道癌、头颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、脊索瘤和宫颈癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌；胰腺癌；卵巢癌；或头颈癌。
在其它实施方案中，治疗性或预防性接种疫苗是传染因子治疗或接种疫苗。例如，传染因子选自病毒(例如，HIV、CMV、复发性疱疹感染、乙型肝炎、厄泼斯坦巴尔病毒、丙型肝炎或人乳头瘤病毒(HPV))、细菌(例如，分枝杆菌感染、幽门螺杆菌或脑膜炎球菌感染)、寄生虫(例如，疟疾、弓形体、肺孢子虫或包虫病)和真菌(例如，假丝酵母或曲霉菌)。
在任何这些用途中，至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分被植入，和所述至少一个生物相容性大胶囊随后被除去。例如，至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分在皮肤下极为贴近或接触地被顺序给予。抗原负载(即，辐照的癌细胞或传染因子的部分)未被除去。而是，它们被免疫系统降解。
至少一个生物相容性大胶囊在抗原组分之前被植入。
至少一个生物相容性大胶囊被植入少于12天；4和10天之间；或5和7天之间。
在任何这些用途中，预防性或治疗性接种疫苗包括多次注射，例如，以有规律间隔发生的多次注射。当预防性或治疗性接种疫苗是癌症治疗或接种疫苗时，有规律间隔包括每周注射，持续4周，接着每两周两次额外的免疫接种。当预防性或治疗性接种疫苗是传染因子治疗或接种疫苗时，有规律间隔包括每周注射，持续至少2周。优选地，多次注射是皮下注射。
还提供了通过给予有需要的患者有效量的任何在此描述的疫苗组合物、药用组合物或药剂盒用于治疗性或预防性接种疫苗的方法。例如，治疗性或预防性接种疫苗是癌症治疗或接种疫苗。作为非-限制性实例，癌症可选自肺癌、黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、急性白血病、慢性白血病、成胶质细胞瘤、低度恶性淋巴瘤、高度恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、骨癌、脑瘤、胃癌、食道癌、头颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、脊索瘤和宫颈癌。在一些实施方案中，癌症是肺癌；胰腺癌；卵巢癌；或头颈癌。
在其它实施方案中，治疗性或预防性接种疫苗是传染因子治疗或接种疫苗。例如，传染因子选自病毒(例如，HIV、CMV、复发性疱疹感染、乙型肝炎、厄泼斯坦巴尔病毒、丙型肝炎或人乳头瘤病毒(HPV))、细菌(例如，分枝杆菌感染、幽门螺杆菌或脑膜炎球菌感染)、寄生虫(例如，疟疾、弓形体、肺孢子虫或包虫病)和真菌(例如，假丝酵母或曲霉菌)。
在任何这些方法中，至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分被植入，和所述至少一个生物相容性大胶囊随后被除去。例如，至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分在皮肤下极为贴近或接触地被顺序给予。
至少一个生物相容性大胶囊在抗原组分之前被植入。
至少一个生物相容性大胶囊被植入少于12天；4和10天之间；或5和7天之间。
在任何这些方法中，预防性或治疗性接种疫苗包括多次注射，例如，以有规律间隔发生的多次注射。当预防性或治疗性接种疫苗是癌症治疗或接种疫苗时，有规律间隔包括每周注射，持续4周，接着每两周两次额外的免疫接种。当预防性或治疗性接种疫苗是传染因子治疗或接种疫苗时，有规律间隔包括每周注射，持续至少2周。优选地，多次注射是皮下注射。
最后，还提供制备用于任何在此描述的疫苗组合物的至少一个生物相容性大胶囊的方法。例如，这样的方法可包括以下步骤：(a) 培养同种异体细胞至少两代以确保细胞分泌GM-CSF；(b) 将培养的细胞重悬浮于细胞培养基中；(c) 将细胞加载到至少一个生物相容性大胶囊中(例如，使用无菌空气压力)；和/或(d) 切下取回管以除去加载中心。这样的方法还可包括密封取回管的切断端和/或洗涤和冷冻保存(例如，使用液氮的蒸气相)至少一个生物相容性大胶囊的进一步的步骤。
还提供了用于治疗性或预防性接种疫苗的在此描述的疫苗组合物、药用组合物和/或药剂盒。
例如，治疗性或预防性接种疫苗是癌症治疗或接种疫苗，任选地其中癌症选自肺癌、黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、急性白血病、成胶质细胞瘤、低度恶性淋巴瘤、高度恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、骨癌、脑瘤、胃癌、食道癌、头颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、脊索瘤和宫颈癌。
在其它实施方案中，治疗性或预防性接种疫苗是传染因子治疗或接种疫苗，任选地其中传染因子选自病毒、细菌、寄生虫和真菌。作为非-限制性实例，病毒可选自HIV、CMV、复发性疱疹感染、乙型肝炎、厄泼斯坦巴尔病毒、丙型肝炎和人乳头瘤病毒(HPV)，细菌选自分枝杆菌感染、幽门螺杆菌和脑膜炎球菌感染，寄生虫病原体选自疟疾、弓形体、肺孢子虫和包虫病，或真菌选自假丝酵母和曲霉菌。
在依据在此描述使用的任何疫苗组合物、药用组合物或药剂盒中，至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分被植入，和所述至少一个大胶囊随后被除去，任选地至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分在皮肤下极为贴近或接触地被顺序给予，或至少一个生物相容性大胶囊在抗原组分之前被植入。例如，在使用的疫苗组合物、药用组合物或药剂盒中，至少一个生物相容性大胶囊被植入少于12天，4和10天之间，或5和7天之间。
在使用的这些疫苗组合物、药用组合物或药剂盒中，预防性或治疗性接种疫苗包括多次注射，任选地其中多次注射以有规律间隔发生，任选地其中多次注射是皮下注射。
还提供了在此描述使用的疫苗组合物、药用组合物或药剂盒，其中(i) 当预防性或治疗性接种疫苗是癌症治疗或接种疫苗时，有规律间隔是每周注射，持续4周，接着每两周两次额外的免疫接种，或(ii) 当预防性或治疗性接种疫苗是传染因子治疗或接种疫苗时，有规律间隔是每周。
除非另外限定，在此使用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意义。虽然类似于或相当于在此描述的那些的方法和材料可用于本发明的实施或测试，但下文描述了合适的方法和材料。在此提及的所有的出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用以其整体结合到本文中。在有抵触的情况下，以本申请，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是示例性的并不打算作为限制。
本发明的其它特征和优点将从下面的详细描述和权利要求书而变得显而易见。
附图简述
图1A-1E是用于疫苗组合物的生物相容性大胶囊的一系列示意图。图1A是整个生物相容性大胶囊的示意图，其包含同种异体细胞分布于其上的内部线圈(详图J)，连接器(详图H)，和用于取回的钩(详图I)。图1B是内部线圈的详细示意图。图1C是连接器的详细示意图。图1D显示在植入后用来将生物相容性大胶囊保持在合适的位置的缝线。图1E是加载中心/传输管的详细示意图。
图2是显示在此描述的双组分癌症疫苗策略(Onco-Maxi-Vax)的示意图。
图3是显示在此描述的癌症治疗性接种疫苗策略的示意图。在这个方案中，自体肿瘤细胞的单细胞悬浮液在皮下注射之前被处理、辐照和冷冻。同样，含有免疫-分离的分泌GM-CSF的同种异体细胞的生物相容性大胶囊在植入之前被冷冻。在治疗时，辐照的自体肿瘤细胞被皮下注射，且在类似的位置植入大胶囊。皮下植入的胶囊在7天后除去，而辐照的肿瘤细胞被患者的免疫系统破坏。这个方案包括多次注射并导致在治疗的患者中诱导抗-肿瘤免疫反应和潜在的肿瘤消退。
图4是显示MVX-ONCO-1治疗对肺转移的影响的一系列照片。
图5是显示在MVX-ONCO-1治疗后，晚期难治性卵巢癌中Ca 125血清标记减少的图。
图6显示在治疗患有难治性、复发性脊索瘤的患者之前、期间和之后的MRI结果。部分反应被记录并继续超过12个月。
图7显示为测定由MVX-1细胞系产生的GM-CSF的生物学活性而进行的功能性基于细胞测定法的结果。
详细描述
定义
术语“宿主”、“受试者”、“患者”等在此可互换使用，指接受免疫的受试者。
在本申请的上下文中，以下术语用以下方式定义：
如在此使用的，术语“免疫调节剂(immunomodulator)”或者“免疫调节剂(immunomodulatory agent)”等指可增强、放大或减少对抗原或免疫原的免疫反应的化合物或组合物。免疫调节剂的一个非-限制性实例是粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)。本领域技术人员将认识到，本领域已知的任何其它合适的免疫调节剂可用于在此描述的疫苗组合物中。
“免疫刺激剂”或“免疫-激活剂”等是特异性地增强或放大对抗原或免疫原的免疫反应的免疫调节剂。术语“免疫刺激剂”或“免疫-激活剂”在此与术语“佐剂”同义使用。
如果当引入宿主中时，细胞在物理上避免宿主的免疫反应，即，如果在细胞和免疫系统的效应子之间没有物理接触，针对任何细胞组分(包括细胞-表面抗原、分泌的蛋白等)没有明显的获得性或天然免疫反应，细胞被认为是“免疫-分离的”。结果，在宿主生物体内未发现对细胞有明显的抗体或细胞-介导的免疫反应。
免疫-分离的同种异体细胞不被宿主的免疫反应攻击或破坏，因为它们不能被免疫系统发觉(这防止了针对它们的任何免疫反应)并且因为它们在物理上避免任何免疫反应。
如在此使用的，术语“囊封(encapsulation)”或“包囊化(encapsulated)”等指免疫-分离的细胞在含有材料(例如塑料，其对于宿主生物体是非-免疫原性的)的胶囊的生物相容性装置(即，大胶囊或包囊化细胞疗法(ECT)装置)中的特殊手段。将细胞或细胞群包封在屏障装置例如生物相容性大胶囊中的行动被称为大囊化(macroencapsulation)。术语“胶囊”、“装置”、“大胶囊”等在此可互换使用，指构成在此描述的疫苗组合物的组分之一的大胶囊。
疫苗组合物
在此描述的疫苗组合物包含两种组分：抗原组分和至少一种可取回的生物相容性大胶囊，后者含有分泌免疫调节剂(即，GM-CSF)的同种异体细胞，用于治疗和/或预防性接种疫苗。优选地，包囊化细胞被工程改造以产生免疫调节剂，虽然使用天然产生免疫调节剂的细胞和细胞系也涵盖在内。
还提供了可用于这种情况的药用组合物和药剂盒。在此描述的任何疫苗组合物、药用组合物或药剂盒都适用于治疗性和/或预防性接种疫苗。同样，在此描述的任何疫苗组合物、药用组合物或药剂盒可用于治疗性和/或预防性接种疫苗的方法中。
例如，治疗性或预防性接种疫苗可以是肿瘤或癌症治疗性或预防性接种疫苗，或针对一种或多种传染因子的治疗性或预防性接种疫苗。
产生的免疫调节剂可以是由大囊化同种异体细胞合成的蛋白，但它也可以是例如细胞-组分，例如脂质，或被细胞进一步转化的外源性分子，例如由抗原呈递细胞加工的抗原，或代谢物。在一个实施方案中，免疫调节剂是huGM-CSF。因为在基于细胞的癌症免疫方案中，抗原经常太弱以致不能引发明显的免疫反应，并且已知参与这种反应的一些分子增强或放大它，免疫调节剂优选地是可通过吸引抗原呈递细胞(例如，树突细胞)发挥功能和还可刺激CD4或CD8 T-细胞的活性的免疫刺激剂。
特别有效的免疫刺激剂属于细胞因子家族。合适的细胞因子包括，但不限于，GM-CSF (粒细胞和粒细胞-巨噬细胞刺激因子)、IL-3、IL-4、IL-9、IL-1、IL-2、IL-7 (白介素)、IFNγ的跨膜受体、可溶性或膜性SCF (干细胞因子)、FL (Flt3配体)、G-CSF，及其任何组合。优选的免疫刺激剂是GM-CSF (例如，人GM-CSF)和FL。
在癌症治疗的情况中，GM-CSF被特别推荐为免疫刺激剂，因为它已被鉴定为激活全身抗肿瘤免疫力的最有效的细胞因子(见Dranoff et al, 1993, Proc Natl Acad SciUSA, 90(8): 3539-43)。然而，GM-CSF作为在传染因子接种疫苗和疗法中的免疫刺激剂也是有效的。
为了诱导充分的免疫反应，合并几种可刺激不同的途径的免疫调节剂，可能是非常有利的。例如，一个优选的组合是GM-CSF和FL。然而，两种或更多种免疫调节剂的任何其它组合也可采用。合适的组合的确定在本领域技术人员的常规水平内。
免疫-分离(Immuno-isolation)克服了与使用HLA-阴性细胞例如K-562细胞系有关的明显缺点。因为包囊化细胞完全避开了免疫系统，与参与先天免疫排斥的非-包囊化K-562细胞相反，它们不被先天或细胞免疫破坏。大囊化细胞长时间存活、分泌蛋白，并允许多次免疫的能力与大胶囊的物理屏障直接相关。此外，在胶囊植入后，GM-CSF释放到患者中的量和持续时间不太可能根据他或她的先天免疫力或免疫抑制而在个体之间不同。相比之下，当使用非免疫-分离的细胞(即，分泌GM-CSF的K-562细胞)时，GM-CSF释放的稳定性可能在任何给定的患者中在第一次和随后的免疫之间，并且也在患者之间显著地变化。
免疫-分离细胞的一种优选方式是提供从一般免疫系统“隐藏”它们的物理屏障，这可通过具有被半渗透膜围绕的包含细胞和内部线圈(细胞分布于其上)的芯的屏障装置例如生物相容性大胶囊实现。
分泌免疫调节剂的细胞的免疫-分离克服与植入游离细胞有关的明显缺点，后者一般需要免疫-抑制药以保护它们对抗宿主的免疫系统。通过机械地阻断免疫攻击，使用屏障装置例如大胶囊消除对免疫抑制治疗的需求。此外，如果所需，细胞在限定的时间段之后容易取回，这允许免疫调节剂的可切换释放。通过取回植入的装置，停止药剂的释放，这阻止了分子在免疫过程结束后的不必要的存在。
用于在此描述的疫苗组合物的屏障装置例如生物相容性大胶囊通过合成的、选择性可渗透的非-免疫原性膜，使活细胞与宿主的免疫系统隔离。使用半渗透膜允许营养素、蛋白、氧和生物治疗性物质内外之间的自由交换。小分子(例如，对细胞存活必需的分子)可经由大胶囊的膜中的孔转运，而高分子量物质例如免疫细胞或抗体被排除。所述膜也排除炎性细胞，由此保护包囊化细胞避免组织排斥。
相反地，由细胞产生的免疫调节剂可通过孔递送到外部介质中。孔的直径优选地在一定范围内选择，使得允许小分子或蛋白和免疫调节剂越过屏障，而较大的分子像免疫球蛋白不能越过屏障，以使装置保留其免疫-保护特性。
胶囊可具有各种形状和大小。特别地，胶囊可以是适合保持生物活性并提供产品或功能的递送通路的任何构造，包括例如，圆柱形、长方形、圆盘形、碎片形、卵圆形、星形或球形。如果胶囊在其植入后取回，倾向于导致胶囊从植入部位迁移的构造，例如小到足以在接受者宿主的血管中移动的球形胶囊，不是优选的。某些形状，例如长方形、碎片形、圆盘形、圆柱形和平板形提供更大的结构完整性且在需要取回时是优选的。在一个实施方案中，大胶囊的形状是圆柱形。
在此描述的装置的半渗透膜从选择性渗透的、免疫保护性膜或从超滤膜或微滤膜制得。本领域技术人员将认识到，半渗透膜通常具有约100 nm的中值孔径。在还有的其它实施方案中，半渗透膜可从无孔膜材料(例如，水凝胶或聚氨酯)制得。
各种聚合物和聚合物混合物可被用来制备围绕的半渗透膜，包括聚砜(包括聚醚砜(PES))、聚丙烯酸酯(包括丙烯酸共聚物)、聚偏乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚氨酯(包括热塑性聚氨酯)、聚苯乙烯、聚酰胺、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚磷腈、聚丙烯腈、(丙烯腈/氯乙烯)共聚物，及其衍生物、共聚物和混合物。作为非-限制性实例，用于胶囊的聚合物是热塑性聚醚砜(PES)中空纤维(OD:720µm; ID:524µm, 分子量截止值：32和80 kDa; Akzo NobelFaster AG, Wupperthal, 德国)和AN-69聚合物(丙烯腈和金属磺酸钠(sodiummetallysulphonate)阴离子共聚物, Hospal R&D Int, Meyzieu, 法国)。
在此描述的任何大胶囊中，半渗透膜的名义分子量截止值(MWCO)是500 kD。在一些实施方案中，MWCO是大约280 kD。
具有几种孔隙尺寸的几个不同的膜厚度被测试(例如，PES5、UltraPES 0.8和UltraPES 0.7)。最后，UltraPES0.7 (Membrana GmbH, Wuppertal, 德国)被选择用于临床试验。类似地，各种胶囊长度也被测试且12 mm被选择作为用于植入、处理、制备和细胞加载程序的最适尺寸。
优选地，半渗透膜的厚度是在约90-120 um之间。在此描述的任何装置可成形为圆柱形、中空纤维或平板。装置的长度可以是在约4 mm-15 mm之间。在一些实施方案中，装置具有在约0.9 mm 1-1.2 mm之间的内径。装置的末端可使用连接器或甲基丙烯酸甲酯密封。
在一些实施方案中，大囊化(macrocapsulation)利用从被设计以在皮下植入的膜形成的预成形大胶囊。这些大胶囊还含有位于真皮和皮下层之间的取回管。在一些实施方案中，取回管由医用级聚合物(包括热塑性聚氨酯、低和高密度聚乙烯、PEEK、聚碳酸酯尿烷和/或热塑性弹性体)制得。
在离医师的近端(即，离膜的远端)，取回管具有系线钩(也称为取回钩)，其可被用来方便取回植入后的胶囊。优选地，取回钩在一端具有孔眼而在另一端具有两条腿以便于取回管内侧的附着。作为非-限制性实例，取回钩由医用级不锈钢(即，不锈钢合金316LVM、316L、302和/或304)制得。取回钩可使用本领域已知的任何合适的方法固定。作为非-限制性实例，它可使用紫外(UV)光固化胶固定和/或缝线可通过孔眼放置于取回钩中，其在大胶囊植入后保持在皮肤外面。
连接器可被用来促成大胶囊的膜与取回管的连接。作为非-限制性实例，不锈钢连接器可被粘合于膜。在一些实施方案中，插入膜的连接器的末端具有锥形末端(例如，截短的锥形形状)。
大胶囊包含从医用级金属(例如，铝或钛)制得的内部线圈，其可插入连接器的截短的锥形末端。这种内部线圈确保了胶囊内细胞的良好顺序，特别是均匀分布，并防止凝集在壁上。内部线圈也可防止细胞聚集并改善细胞在装置内的分布(见PCT公布号WO 96/02646)。
合适的内部线圈将具有限定数目的螺旋线/厘米。例如，线圈可从原材料(HefaeusMaterials)形成，所述原材料经拉伸形成在螺旋线之间具有特定距离(例如，1 mm ± 0.1mm)的强化弹簧(见图1B)。
一旦形成合适的内部线圈，膜在强化弹簧(即，内部线圈)上滑过并使用UV固化胶密封取回管。在一个实施方案中，膜放置于聚氨酯芯内大约2mm并刚好在连接器的截短的锥形末端前粘合。在其它实施方案中，整个取回管用胶填充以固定膜。
空的大胶囊可例如，使用已经环氧乙烷(EO)灭菌的加载中心(例如，BD VasculonTM或BD Insyte-WTM 0.9 mm x 25 mm)，用内部线圈加载。这种加载中心例如，使用UV光固化胶固定于膜。在一些实施方案中，加载中心具有经摩擦安装到连接器的膜端的截短的锥形末端。
传输管可通过在管体和在工具帽上钻一个或多个孔从Falcon 14mL管改进。本领域技术人员将认识到，当插入以确保良好的EO灭菌时，这些孔应与膜对齐。鲁尔锁可被插入并经摩擦安装到帽中。加载中心然后可被匹配地啮合到鲁尔锁帽中。然后将完全的传输管灭菌并返回到单独包装的无菌袋中。
大胶囊可具有范围从数微米到3-4厘米的各种尺寸。取决于胶囊的尺寸和细胞的尺寸，多达200,000个细胞可加载到1 cm装置中。在一些实施方案中，装置的形状是圆柱形且长度是约12 mm。本领域技术人员将能够确定用于在此描述的疫苗组合物的大胶囊的最佳构造(即，形状、尺寸、长度、细胞数量等)，无需任何过度的实验。
用于在此描述的大胶囊的合适同种异体细胞可从工作细胞库获得，其含有在液化气中贮存的5x106个细胞/等分液。这些细胞在使用前被解冻并在含10% FBS、青霉素/链霉素和G418 (一种选择性抗生素)的完全培养基RPMI 1640中培养2-3代，以确保细胞分泌GMCSF。然后使大约800,000个细胞重悬浮于30 µl完全培养基中，然后使用无菌空气压力，将整个30 µl加载到每个胶囊中。然后切下取回管以除去加载中心，并用UV胶密封取回管的末端。
然后胶囊在完全培养基(无菌的)中洗涤并在含无菌完全培养基(大约3-5 ml培养基)的6孔皿中孵育。
大胶囊可包含1x105个同种异体细胞-1x106个同种异体细胞(例如，8x105个细胞)/胶囊。这些细胞包含在大胶囊的芯内，被分布在大胶囊内的内部线圈上，并由半渗透膜围绕。
培养前，安全性/质量控制(QC)步骤可以形成。这种安全性QC步骤的目的是评估细胞的微生物学、支原体和LAL/内毒素“状态”。微生物学和支原体评估通过对上清液采样并在选择性琼脂中培养它来执行。LAL/内毒素也在上清液的样品中定量，但通过与细菌内毒素和/或脂多糖反应。
7天培养后，测量上清液的GM-CSF分泌。优选地，装置分泌至少20 ng/胶囊/天。通常，分泌约50-150 ng/胶囊/天。因此，要求的大胶囊适合于持续递送低剂量的免疫刺激剂(即，GM-CSF)。
大胶囊内的几个浓度的细胞被测试(例如，5、8、10和15 x105个细胞)。8x105个细胞是选择的浓度，因为它提供了用于长期释放的最好的长期稳定性，伴有最小的可变性。
一旦制备，大胶囊装置可在使用前使用本领域已知的任何方法冷冻保存。例如，在一些实施方案中，冷冻保存在液氮的蒸气相中执行。
用于在此描述的疫苗组合物的免疫-分离的同种异体细胞是活的且优选地在长期的基础上(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天)提供选择的免疫调节剂。在一个实施方案中，免疫-分离的细胞分泌免疫调节剂至少7天的时段。
免疫-分离的同种异体细胞可天然地产生免疫调节剂，或者它们可经基因工程改造以表达免疫调节剂。通过基因工程改造通常不产生免疫调节剂的细胞，疫苗组合物不限于天然产生它的那些细胞。合适的免疫调节剂不限于天然存在的那些，因为已知突变的蛋白有时发挥改进的活性。因此，免疫调节剂可以是蛋白的修饰版本，而不是野生型蛋白。在一些情况下，细胞经基因工程改造以分泌可溶性版本的膜性蛋白以实现其分泌。
此外，通过遗传修饰细胞，也可能控制免疫调节剂的表达水平。一个特别有吸引力的情况是通过在已知在所用细胞中是非常强的启动子的控制下克隆其序列来过度表达该试剂。用这种方法，修饰的细胞成为产生高水平的免疫调节剂的工程改造的工厂。启动子可依据其活性选择以具有控制水平的免疫调节剂表达。在另一个实施方案中，可使用天然包含免疫调节剂的基因的细胞，其中基因在该特定的细胞中是转录沉默的。在这种情形下，转录可通过插入适当的调节序列，例如通过同源重组激活。对特异性刺激物例如物质、光等有反应的诱导型调节序列也可使用。
在一些实施方案中，分泌免疫调节剂的细胞可分泌超过10ng/106个细胞/24hr的免疫调节剂(例如，GM-CSF)。例如，所述细胞可分泌等于或大于100ng/106个细胞/24hr，或超过500ng/106个细胞/24hr的量的免疫调节剂。分泌超过10x10-15g的免疫调节剂/24hr或超过100x10-15g/24hr的免疫调节剂的同种异体细胞可以使用。例如，分泌在80和960x10- 15g/24hr之间或超过500x10-15g/24hr的免疫调节剂的细胞可以使用。在此描述的装置可分泌至少20 ng/胶囊/天。例如，所述装置可分泌50-150 ng/胶囊/天(例如，50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150 ng/胶囊/天)。
如果需要，几个胶囊(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)可同时植入以达到所需分泌水平。
本领域已知的遗传修饰的任何方法可被用来遗传修饰免疫-分离的同种异体细胞。例如，通过转染引入的工程改造质粒和通过感染引入的病毒可以使用。逆转录病毒可以使用，因为它们可经工程改造以将编码免疫调节剂的基因引入宿主细胞的基因组。
合适的同种异体细胞不限于天然产生感兴趣的免疫调节剂的细胞。而是可使用多种细胞。优选地，所述细胞容易转导或转染，培养，和繁殖。在此描述的任何疫苗组合物中，使用肿瘤细胞作为旁观者免疫调节剂生产者不是必需的。本领域技术人员将能够利用不同的细胞类型，例如，永生化的非-肿瘤成纤维细胞、成肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、成纤维细胞，或造血来源的细胞。适宜的细胞类型的确定在本领域技术人员的常规水平内。
为了制备原因，可使用非-粘附细胞(排除成纤维细胞或上皮细胞)，其可容易冷冻贮存。为了安全原因，仅测试了生物安全水平1细胞。对5个不同的细胞系测试了它们经受包囊化的能力：CCL243、CCL246、CCL246.1、TIB202和CRL1582。CCL243 (一种造血来源的细胞)被最终选择并随后经遗传修饰以表达huGM-CSF。MVX-1是从遗传修饰的CCL243细胞系的单细胞克隆获得的细胞系。选择用MVX-1细胞加载的胶囊，因为其有效地冷冻以供长期贮存至多18个月(即，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个月)的能力。由MVX-1细胞系产生的GM-CSF已被认为在功能性基于细胞的测定中相当于商业可获得的GM-CSF (见实施例6，下文)。
在一些实施方案中，同种异体细胞是永生或永生化细胞系，其可经遗传修饰1次并用于在此描述的所有组合物和方法中。因为细胞在生物相容性大胶囊内是免疫-分离的，它们没有遭受宿主的免疫系统的危险，且永生化细胞的使用不危害它们邻近的其它细胞。
重要的是，因为细胞被大囊化，同种异体或异种细胞可以使用。因此，没有必要使用自体细胞。用于疫苗组合物的细胞优选地是人细胞。
本领域技术人员将认识到，生物相容性大胶囊内的细胞的免疫-分离是有利的，因为免疫调节剂的来源不限于独特的个体。
因为在大胶囊内的同种异体细胞是活的，免疫调节剂被连续产生至少几天(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天)。
植入
解冻冷冻保存的胶囊并在植入前培养至少7天。对于第1-4天，培养在完全培养基中发生，而对于第5-7天，培养在缺乏青霉素和链霉素的简化培养基中发生。然后在第7天测定胶囊的GM-CSF分泌。在植入前，将胶囊维持在培养箱中并放入含简化培养基的Falcon 15 mL管中并传输至操作室或植入室。
适当的植入方案的确定在本领域技术人员的常规水平内。
作为非-限制性实例，患者在植入之前可给予局部麻醉。医生可系上取回缝线环(例如，聚酰胺缝线环)至取回环并用14号针以引入导管(例如，B Braun 14号Vasofit导管)。然后将胶囊插入导管，插件工具被用来沿导管筒使胶囊下移。然后移去导管，但插件工具被用来确保在移出期间胶囊保持在皮下的合适位置。
免疫-分离的同种异体细胞被植入几天，例如，少于12天(例如，少于11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天)，例如在4和10天之间，例如在5至7天之间。植入免疫-分离的同种异体细胞这样短的时间不会导致由免疫调节剂的释放诱导的显著纤维化。此外，接种疫苗部位和/或大胶囊周围的炎症不会诱导胶囊内细胞成活力的降低，因此，在该时间范围内它不会阻止免疫调节剂的产生和释放。
大胶囊在植入前可例如通过X-射线辐照。辐照确保，即使胶囊出现破坏，包封的细胞也不能够繁殖。此外，辐照确保免疫调节剂的分泌将在约10天后，由于辐照-诱导的细胞死亡而停止。如果分泌的免疫调节剂产生强烈的炎性反应，这进而可能是有利的。特别地，如果植入的时间超过15天至1个月，皮下植入大囊化的分泌GM-CSF的免疫-分离的同种异体细胞可能诱导皮肤坏死。在植入前辐照胶囊或细胞不会阻止胶囊的随后取回。
在某些实施方案中，两个胶囊被植入患者中，相隔大约5-15 mm (即，相隔5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15 mm)。重要的是，由于在此描述的治疗方法的内在作用机制，植入不应发生在肿瘤附近。胶囊的适当位置和分开距离的选择在本领域技术人员的常规水平内。
当胶囊被植入患者中时，它们可用贴片例如steristrips固定以防止它们从植入部位移动。带有伸出在患者的皮肤外的缝线的植入胶囊，用透明的贴片覆盖以监测接种疫苗部位。
MVX-ONCO-1
在此描述的任何疫苗组合物、药用组合物或药剂盒可被用于癌症治疗情况或用于治疗癌症的方法中。这种产品已被称为“MVX-ONCO-1”，其是由在免疫期间物理上紧邻的两种组分制得的治疗性产品(治疗性疫苗)。
MVX-ONCO-1系统的一种组分是肿瘤抗原的来源(即，抗原组分)，其从待治疗的患者收获的经辐照的自体细胞制得并对每个患者都是特异性的。优选地，患者组织从非-辐照的患者取得。在使用前，病理学家可证实切离的肿瘤或癌细胞被切离。对于实体瘤，切下大约5-10 g (例如，5、6、7、8、9或10 g)组织。
在一个实施方案中，一个组分包含约1x106-约1x107个自体肿瘤细胞(例如，约4x106个自体肿瘤细胞)。为了确保最大的抗原暴露，抗原来源由每个患者的自身肿瘤细胞制得，其可从活组织检查、手术或抽取获得。
对于胸腔积液(或其它液体样品)，收集大约1升，并离心液体样品，在缓冲液(即，Hank平衡盐溶液)中洗涤，并对细胞计数。
对于固体样品，GMP级胶原酶IV可被用来消化组织。用解剖刀的机械消化可交替或另外使用，以将组织切成小片。生成的组织碎片然后置于塑料袋内并用实验室桨式或叶片混合器进一步机械压力消化。
接着，消化的组织碎片被分发到50 mL Falcon管中并离心。弃去上清液并用缺乏Ca2+和Mg2+的缓冲液洗涤沉淀以灭活胶原酶，其活性需要二价阳离子的存在。然后使沉淀再悬浮并通过70 µm筛孔过滤，其允许单一细胞通过。然后，使细胞再次沉淀并对细胞计数。本领域技术人员将认识到，对于细胞成活力，也可进行台盼蓝试验。
从液体或者实体瘤样品获得的细胞被消化，以获得细胞-悬浮液，然后在等分试样贮存于液氮中之前，以10000拉德(即，15-150戈瑞(Gy))辐照。辐照作为一项安全措施执行以防止再注射到患者中的肿瘤细胞的任何生长。致死辐照的肿瘤细胞可被冷冻以供长期贮存至多12个月(即，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。
当接种疫苗过程被用于癌症领域时，抗原组分是整个肿瘤细胞。因为一些抗原存在于来自相同谱系的许多肿瘤上，肿瘤细胞可以是同种异体细胞。然而，肿瘤细胞相对于患者而言是自体的。
辐照的自体细胞可被等分为合适的剂量用于单次接种疫苗。优选地，储备上清液以供真菌生物学、支原体和/或内毒素筛选。然后各等分试样可被冷冻保存在二甲亚砜(DMSO)中。在植入之前，DMSO可被洗掉，可以制备小体积的悬浮液。作为非-限制性实例，可制备4x106个细胞在500 µl HBSS中的溶液。
MVX-ONCO-1的其它组分，其是所有患者共有的，是免疫调节剂提供者。这种组分包含至少一个可取回的生物相容性大胶囊，其含有分泌免疫调节剂的免疫-分离的同种异体细胞。在一个实施方案中，大胶囊包含约1x105-约1x106个免疫-分离的同种异体细胞(例如，约8x105个细胞)，它们分泌至少20 ng/24小时的GM-CSF (例如，20-500 ng/24小时)。在各个实施方案中，免疫-分离的同种异体细胞分泌20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或更多ng/24小时的GM-CSF。
在MVX-ONCO-1疫苗组合物中，包囊化细胞经基因工程改造以分泌免疫刺激分子(例如，GM-CSF)并作为在接种疫苗的部位产生和分泌强烈的免疫-刺激信号的免疫-分离的生物-反应器发挥功能。目前，GM-CSF是用于生成抗-肿瘤免疫反应的最有效的免疫刺激分子。因此，包囊化细胞可经基因工程改造以仅分泌GM-CSF。然而，取决于协同作用的研究，其它免疫调节分子可被加入GM-CSF或取代GM-CSF，而毫无困难。例如，其它细胞因子例如IL-12、IL-15、IL-4、干扰素γ、趋化因子或树突生长因子、IL-3、IL-9、IL-1、IL-2、IL-7、IFNγ的跨膜受体、可溶性或膜性干细胞因子(SCF)、FL (Flt3配体)、G-CSF、TLR7激动剂、TIM-3、GITR、TIM-3 GITR、LAG-3、Vista、BTLA、ICOS、OX40、CD40、CD137 (也称为41BB)、CD27及其任何组合可被加入GM-CSF或取代GM-CSF。
在此描述的癌症疫苗组合物的两种组分紧邻或接触地被放置在患者的皮肤下。例如，含有辐照的自体细胞的溶液可被植入在两个大胶囊之间。在一些实施方案中，组分被植入远离原发性肿瘤或转移的部位，以在免疫学上未干扰的位置执行接种疫苗。然而，在一些实施方案中，也可能在肿瘤附近给予疫苗组合物。
植入后5-7天，胶囊例如使用附着于其的钩、系链或线移去。抗原组分未被除去。当然，它由患者的免疫系统经由天然存在的机制逐渐处理和除去。
用Onco-Maxi-Vax的接种疫苗治疗包括重复免疫。重要的是维持灵活的接种疫苗进度表。例如，疫苗组合物可皮下给予4周，接着每两周两次额外的免疫接种。重复免疫可在患者身体上的相同或类似的位置进行。在一个方案中，4个不同的植入部位被采用(例如，两个手臂和两个大腿)，且疫苗植入在治疗过程中在遍及每个部位轮转。
当用于癌症治疗时，自体肿瘤细胞的剂量可根据从患者收获的细胞的量调节。推荐具有每次免疫约106-107个细胞，加测试需要的细胞(即，28x106)。自体肿瘤细胞的剂量的测定和/或调节在本领域技术人员的常规水平内。
在一些实施方案中，肿瘤细胞(其为抗原组分的来源)和免疫-分离的同种异体细胞(其为免疫调节组分的来源)是不同的，这比先前的接种疫苗策略有利，因为除了收获和/或辐照外，肿瘤细胞不需要处理。
对于广泛范围的肿瘤类型，可执行这种抗-肿瘤免疫。如上所讨论的，包囊化免疫-分离的同种异体细胞对于每一个患者都是相同的。然而，抗原组分对所述患者是独特的并且可从肿瘤细胞获得，所述肿瘤细胞可从原发性实体瘤、从转移和/或从含有肿瘤细胞的液体(胸膜液、腹膜液、骨髓或血液)收获。
在临床肿瘤学中，大多数患者存在原发性肿瘤或转移病灶。然而，不是所有的肿瘤或转移都是同样容易处理的。因此测试的肿瘤类型需要满足关于可行性的各种标准。可能具有可收获的原发性肿瘤的癌症包括，但不限于：中枢神经系统肿瘤，例如成胶质细胞瘤；肺肿瘤(非-小细胞肺癌)；前列腺肿瘤；胃癌；乳腺癌；淋巴瘤；胰腺癌；肝癌(肝肿瘤)；结肠癌；肾细胞癌；卵巢癌；子宫癌；肉瘤(软组织)；白血病(淋巴结或血液)；和/或多发性骨髓瘤(血液、骨髓、淋巴结、软组织)。
可能具有可收获的转移的癌症依赖于转移的位置。出于技术原因，收获骨转移比其它位置更难。这些癌症可包括，但不限于：头颈癌(淋巴结转移)；肺癌(肺、肝、软组织、脑、肾上腺转移)；前列腺癌(非-骨转移)；乳腺癌(肺、肝、软组织、胸膜液)；胃癌(肝)；胰腺癌(肝)；结肠癌(肝)；黑素瘤(肺、淋巴结、软组织、肝、脑)；肾细胞癌(肺、肝)；卵巢癌(腹膜或胸膜液、肝)；生殖肿瘤(肺)；和/或膀胱癌(肝、淋巴结)。
在此描述的任何疫苗组合物、药用组合物和药剂盒可被用于针对癌症的治疗性免疫或用于治疗癌症的方法中。作为非-限制性实例，被治疗的癌症可包括，但不限于：肺癌、黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、急性白血病、慢性白血病、成胶质细胞瘤、低度恶性淋巴瘤、高度恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、骨癌、脑瘤、胃癌、食道癌、头颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、脊索瘤和宫颈癌。
接种疫苗后，肿瘤进展可采用本领域已知的任何方法监测。例如，基于验证工具例如实体瘤的反应评估标准(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors)标准或免疫相关的反应标准(irRC)，成像例如CT扫描可被用来记录肿瘤体积的任何变化。同样，可监测血清学肿瘤标记(包括，但不限于CA 153、CA19-9、CEA、AFP、NSE、CA 125)。
只要可能，尝试手术切除转移，以记录肿瘤结构的任何变化。已充分描述通过二维测量的典型肿瘤评估可能不是评估免疫治疗的潜在疗效的最好的评估方法。肿瘤细胞的破坏可能是非常有效的并用在放射学检查时没有可检测的大小变化的纤维性或炎性细胞替代。通过PET扫描评估的代谢活性可具有在此设置中的相关性。免疫后肿瘤病变的分析对于免疫学分析例如通过治疗靶向的潜在肿瘤抗原的表征具有很大的意义。
IA-Maxi-Vax
在另一个实施方案中，在此描述的任何疫苗组合物被用于针对各种感染性疾病的治疗性或预防性免疫的情况。这种产品被称为“IA- Maxi Vax” (传染因子)。
正如MVX-ONCO-1，“IA-Maxi-Vax”可用作由物理上紧邻的两种组分制得的治疗性或预防性产品(疫苗)。
至于IA-Maxi-Vax，抗原组分含有一个或多个来自传染因子的组分。因此患有或处于发展特定感染的风险的所有患者将用相同的产品治疗。许多已知的抗原组分已在由病毒、细菌、寄生虫或真菌病原体引起的感染性疾病中描述且目前用于免疫策略。任何这些抗原可作为灭活的病原体、传染因子的溶解产物、蛋白提取物、重组蛋白、肽、DNA或其它形式使用。在一些条件下，取决于传染因子或宿主医学状况，免疫是弱的或非-保护性的，导致严重的发病率或死亡率。
在IA-Maxi-Vax疫苗组合物中，疫苗的一种组分含有对于给定的传染因子的抗原或抗原库的组合。正如MVX-ONCO-1，IA-Maxi-Vax的其它组分是至少一个含有免疫-分离的分泌GM-CSF的同种异体细胞的生物相容性大胶囊。
用"IA-Maxi-Vax"的接种疫苗治疗包括在不同的皮下部位的重复免疫。接种疫苗的总数依赖于方案和剂量且必须在每个特定的例子中调整。例如，接种疫苗可能需要每周注射，至少2周(例如，2、3、4、5、6、7或更多周)。剂量的测定和/或调节在本领域技术人员的常规水平内。
可使用“IA-Maxi-Vax"预防或治疗的病症的实例包括，但不限于：
• 病毒感染：
靶标：在其疾病的各个阶段的HIV患者(早期阶段可能是更好的候选者，具有更强的免疫系统)
靶标：特定病症的CMV感染(器官移植前后)
靶标：复发性疱疹感染
乙型肝炎或厄泼斯坦巴尔病毒
丙型肝炎
人乳头瘤病毒(HPV)
• 细菌感染：
靶标：分枝杆菌感染是特异性群体例如HIV患者
靶标：幽门螺杆菌(H. pylori)是大多数胃溃疡或胃炎的病原体。
• 寄生虫感染：
疟疾、弓形体、肺孢子虫、棘球绦虫(Echinoccus)
• 真菌感染：
假丝酵母、曲霉菌
迟发型超敏反应(DTH)
迟发型超敏(DTH)反应是由单核白细胞引发的炎性反应。术语迟发被用来区分次级细胞反应(其在抗原暴露后48-72小时出现)与即时超敏反应(其一般在抗原攻击12分钟内出现)。这些反应由T细胞和单核细胞/巨噬细胞而不是由抗体介导。它们也被称为IV型超敏反应。
在肿瘤免疫疗法的情况下，DTH测试用辐照的自体肿瘤细胞，在不受影响的皮肤中以皮内注射的方式执行。在24和48小时，局部炎性反应的存在和幅度通过评估增厚表皮的尺寸记录。DTH在MVX-ONCO-1治疗之前、期间和之后执行。
通常，使用在此描述的疫苗组合物，治疗前DTH阴性在治疗期间和/或之后转化为DTH阳性的患者倾向于显示更好的结果。因此，在接种疫苗前测试患者的DTH+反应是有用的。DTH+反应测试需要至少3x106个细胞：在接种疫苗前1x106个细胞；在第5-6周1x106个细胞；和在第12周接种疫苗后1x106个细胞。
优选地，DTH反应在胶囊植入部位的身体对侧部分上测试。
适当的剂量时间表和/或植入部位的确定在本领域技术人员的常规水平内。剂量时间表的一个非-限制性实例显示于下表：
需要至少28 x 106个细胞或更多以供完全的接种疫苗和测试方案：
6 x 4x106个细胞用于接种疫苗；
3 x 1x106个细胞用于DTH测试；和
0.5x106个辐照的细胞和0.5x106个非-辐照的细胞，其被培养10天并计数。在辐照的等分试样中必须有< 0.5x106个细胞。执行该试验以确保细胞已被适当地辐照。
药用组合物和药剂盒
本文还提供含有在此描述的疫苗组合物的药用组合物和药剂盒。所有这些产品尤其完全适合于工业生产，因为它们由于设备的“通用”特征而容易大量生产。由于同种异体细胞是免疫-分离的，相同的包囊化细胞适合于所有的患者。这个“通用”特征对于癌症治疗是特别重要的，其中疫苗或药用组合物的多次注射是需要的。
依据本发明的药用组合物含有与生理学和/或药学上可接受的载体组合的药用组合物。本领域已知的任何合适的生理学或药学上可接受的载体可以使用。这样的组合物还可包含细胞存活和成功给予或植入必需的任何药用添加剂。
本文提供包含在此描述的疫苗组合物以及使用说明书的药剂盒。
还提供任何疫苗组合物、药用组合物和药剂盒在用于治疗性和/或预防性接种疫苗中的用途，以及使用在此描述的任何疫苗组合物、药用组合物和/或药剂盒的治疗性和/或预防性接种疫苗的方法。例如，接种疫苗可以是癌症治疗性接种疫苗或针对传染因子的治疗性或预防性接种疫苗。对于癌症免疫，患者通常在治疗前患有该疾病。对于传染因子免疫，患者正患有或处于发展该疾病或障碍的风险中。
受试者优选地为人类患者，但动物也被考虑。受试者可为了不同的理由需要接种疫苗，因为预防性免疫是优选的(像对于良性疾病)，或例如在严重的流行病的情况下是必要的。
传染因子免疫可以是预防性的，因为患者将或迟或早与抗原组分接触。同样，传染因子免疫也可以是治疗性的，因为患者已经接触抗原组分，但其自身不能产生足够的免疫反应。
不同的接种疫苗方案可根据所需接种疫苗的性质使用。两种组分的给予可同时、分开或顺序地进行。时间上分开给予可能是有利的。事实上，因为同种异体细胞在生物相容性大胶囊中是免疫分离的，它们通常具有持久的效果。相反，抗原组分可能被被宿主的免疫系统非常快速地处理并消除。在这样一种情况下，当组分的给予分开时，抗原组分的给予可以重复，而单次给予免疫-分离的同种异体细胞。
抗原和免疫调节剂应被共同定位以产生最佳效果。
为了最佳的免疫过程，以有规律间隔重复几次给予。例如，当预防性或治疗性接种疫苗是癌症治疗或接种疫苗时，有规律间隔是每周注射，持续4周，接着每两周两次额外的免疫接种。同样，当预防性或治疗性接种疫苗是传染因子治疗或接种疫苗时，有规律间隔是每周注射，持续2周。
在一些实施方案中，在皮下位置给予疫苗组合物，因为该区域富含树突细胞。然而，本领域技术人员将认识到，给予可在皮内或在可能有利于期望的免疫反应的任何其它位置进行。例如，给予的组合物可经注射、摄取、移植、涂覆或任何其它给予方式。
本发明已被描述，以下实施例通过举例说明而不是限制的方式提供。
实施例
实施例1：评估MVX-ONCO-1在不顺从或不再顺从任何标准治疗的实体瘤患者中的安全性和耐受性的开放I期临床研究(临床试验NCT02193503)
目的：
研究的目的是评估皮下给予(注射和胶囊植入)的6个疫苗剂量的MVX-ONCO-1 (一种临床级包囊化细胞疗法(ECT)产品)在进展的晚期转移性实体瘤患者中的安全性和耐受性，所述患者不顺从或不再顺从其肿瘤疾病的任何标准治疗。
终点：
研究的主要终点是评估安全性和可行性参数，包括不良和严重不良事件(发生率、起因、严重性)、对给予的研究治疗的局部和全身耐受性、实验室数值的变化和实体瘤患者的生命体征。研究的次要终点是评估临床活动和免疫监测(例如，使用成像技术、血清学肿瘤标记和代谢监测，测量一些肿瘤反应)。
研究设计：
这是一项开放标签的I期研究，其包括患有难治性或不顺从标准化学疗法的进行性实体瘤的15个患者。
出于伦理方面的原因，在获得肿瘤材料用于本研究的唯一目的中执行外科手术不是可接受的。因此，肿瘤材料只能从经受胸膜或腹水抽取用于移出包含恶性细胞的液体的患者或经受与临床方案无关的医疗原因需要的手术的患者获得。
肿瘤组织获得：术前和手术
患者签署术前和临床知情同意书，其授予使用和操作额外的肿瘤组织的许可，以供生产自体肿瘤细胞疫苗。
手术和组织病理学文档
患者的自体细胞在手术室收获或通过接近肿瘤细胞的无菌程序(腹水抽取、胸膜液、骨髓、CT-引导的活检)收获。用于细胞收获的手术报告包括手术结果的描述，伴有对疾病程度的特定提及，和是否任何邻近器官随着标本被移出。
离解和自体肿瘤细胞疫苗制备
用于疫苗制备的肿瘤细胞的处理在从每个个体患者获得的组织上进行。离解和疫苗剂量制备根据现行良好生产规范(cGMP)条件，在严格遵守无菌技术下，根据LTC标准操作程序(SOP)进行。一旦处理完成，冷冻细胞并贮存于专用罐的液氮蒸气相中。
治疗和短期随访
免疫在远离肿瘤沉积的健康皮肤中执行。患者用6次皮下sc免疫(第1-2-3-4-6-8周)治疗，所述免疫合并了4x106个辐照的自体肿瘤细胞和各自含有经基因工程改造以在7天内产生>20ng/24h的huGM-CSF的8x105个MVX-1细胞的2个大胶囊。
符合条件的患者每周接受疫苗治疗，在研究第1天(SD1)开始，持续4周，接着2次另外的注射，分隔2周。安全性和功效分析在研究W18结束时(完全接种疫苗周期的9周+随访的9周)执行。在基线和在W6、W12和W18评价肿瘤大小。
大胶囊在7天后除去并分析huGM-CSF产生。
长期随访
对患者的安全性进行随访直至死亡或在SD1后5年，以先到为准。此外，患者因重大协议违反、不受控制的严重并发疾病或严重不良事件、未遵守协议或管理原因而从研究退出。
研究群体：
研究群体包括患有进展的晚期转移性实体瘤的患者，其不顺从或不再顺从它们的肿瘤类型的任何标准治疗。
准入标准：
• 患有各个部位的进展的晚期转移性癌症[肺(小细胞或非小细胞)、结肠、乳腺、胰腺(外分泌或内分泌)、胃、食管、头和颈、甲状腺、肾、膀胱、前列腺、卵巢、子宫(子宫颈或子宫体)的癌症；软组织、骨、子宫、黑素瘤的肉瘤；原发性脑瘤]的年龄18岁及更大的男性或女性患者，其中所有公认的治疗用尽或不可行
• 预期寿命：估计至少4个月
• 体力状态等级0-2 (WHO分级)
• 没有肝功能的重大受损(ALT < 正常范围的上限的2.5倍，胆红素在正常范围内(例外：肝转移：ALT < 5倍ULN；胆红素 < 3倍ULN)
• 没有肾功能的重大受损(肌酐 ≤ 正常范围的上限的1.5倍)
• 没有骨髓功能的重大受损(血红蛋白 > 9.0 g/dl WBC > 2.5 x 109/L，中性粒细胞≥ 1.5 x109/l，血小板 ≥ 50 x109/l)
• 原发性肿瘤和/或转移顺从部分/全部手术或抽取和随后的细胞收获估计> 27x106个细胞
• 理解临床试验的概念的能力
• 能够理解患者信息形式和通知同意书
• 已提供书面的知情同意书
排除标准：
• 已参与任何其它调查研究或在先前的4周内接受被认为干扰研究的实验治疗性程序
• 在先前的4周中已接受任何化学疗法治疗
• 严重的伴随疾病
• 治疗第二种癌症的历史(具有治愈意图和完全缓解< 5年)
• 患有并非癌症的全身疾病的患者，所述疾病不受通常的药物控制
• 未治疗的脑转移(甚至对无症状患者强制筛查CT或MRI)。筛查在手术/放射疗法后没有脑复发证据的有脑转移史的患者可参加
• 慢性免疫抑制治疗，包括类固醇 > 30mg可的松或等量/天
• 用香豆素或连续iv肝素的治疗性抗凝作用。低分子量肝素(LMWH)是允许的，只要治疗可在皮下植入前数小时被阻止
• 阳性HIV-1、HIV-2、HTLV-1、乙型肝炎表面抗原或丙型肝炎抗体
• 怀孕或泌乳或者没有采用足够的避孕(手术、激素或双屏障，即避孕套和子宫帽)的有生育潜力的女性
• 已知对研究产品(MVX-ONCO-1)中的试剂像青霉素、链霉素过敏
调查的医药产品(IMP)：
出于制备理由，可使用容易地冷冻贮存的非-粘附细胞(排除成纤维细胞或上皮细胞)。出于安全性理由，仅测试了生物安全水平1细胞。对5个不同的细胞系测试它们经受包囊化的能力：CCL243、CCL246、CCL246.1、TIB202和CRL1582。CCL243 (造血来源的细胞)被最终选择且随后经遗传修饰以表达huGM-CSF。MVX-1是从遗传修饰的CCL243细胞系的单细胞克隆获得的细胞系。
MVX-ONCO-1是活性特异性免疫疗法(ASI)的形式，患者对肿瘤细胞的免疫反应由此被刺激和/或增强的一个过程。
MVX-ONCO-1是患者特异性、基于细胞的免疫疗法，其包含：
a. 从免疫-保护的、大囊化、同种异体、遗传修饰的细胞系(MVX-1)释放的免疫调节剂(GM-CSF：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)，和
b. 作为抗原来源的辐照的、自体肿瘤细胞。
因为它们有效冷冻以供长期贮存至多18个月(即，至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个月)的能力而选择用MVX-1细胞加载的胶囊。用MVX-1细胞加载的大胶囊经处理并冷冻贮存。
疫苗剂量：
一次植入由两个含有经基因工程改造以在7天内释放稳定量的GM-CSF (>20 ng/24小时)的MVX-1细胞系的大胶囊和最少4x106个致死辐照的自体肿瘤细胞组成。
所有的治疗性产品在良好生产(GMP)条件下进行。
给予：
在局部麻醉下，两个大胶囊以平行方式经皮下植入，相隔1 cm。辐照的自体细胞在两个胶囊之间经皮下注射。只有可获得最少27x106个辐照的自体肿瘤细胞时，患者才被治疗(6次用4x106个细胞的疫苗+3次用1x106个细胞的迟发型皮肤超敏反应测试)。
剂量和进度：
关于最适量的加载抗原，没有数据存在于文献中。因此在该第一次临床试验中，肿瘤细胞数目没有升高。对于试验中显示稳定的疾病或者部分/完全反应的患者，如果自体细胞在第一个6次注射后仍然可以获得的话，一个月1次提供延长的免疫。
每周给予各自装载有产生人GM-CSF的8x105个MVX-1细胞的两个生物相容性大胶囊和皮下注射4x106个辐照的自体肿瘤细胞，持续4周。每2周给予两次另外的给药。植入后7天(即，在植入后第8天)，移出大胶囊。
数据分析和统计学：
一旦最后入选的患者完成18W的评估，则进行数据管理和统计分析。所有疗效参数被描述性地分析。根据患者存活曲线，有规律间隔进行补充分析。
在筛选阶段评估的患者特征被制成表格以供视觉比较。对于定量变量，给出以下描述性统计：N、平均值、标准偏差、最小值、中位值和最大值；对于定性变量，提供患者的频率和百分率。
在基线描述以下参数：
• 患者人口统计学
• 基线疾病特征，包括诊断、疾病活动状况、先前的治疗
• 继发性病况，包括疗法
• 医疗史
• 先前和伴随的药物
估计的增加名额：
出于安全性理由，第二个患者仅在第一个患者已经经受第一个4次疫苗后才接受接种疫苗。对于第三个患者观察相同的等待期/观察期，其仅在第二个患者已经经受他/她的第一个4次疫苗后才接受接种疫苗。随后，增加名额平均为每2周一个参与者(另外24周，12个患者)。
患者的研究持续时间：
筛查+细胞收获+疫苗剂量制备(2周)+1次完全接种疫苗治疗(9周)+随访(9周)：约6个月。
研究流程图的概述提供于下表中：
访问 访问概述
基线 筛查
第-2周 细胞收获(从手术、活检或抽吸)。最少27x106个细胞必须被收获以纳入研究。
第-5天 执行迟发型超敏反应。
第1天 在第一个部位皮下植入两个大胶囊加皮下自体辐照细胞注射。
第8天 除去先前植入的胶囊和植入新胶囊。
第15天 除去先前植入的胶囊和植入新胶囊。
第22天 除去先前植入的胶囊和植入新胶囊。
第5周 除去先前植入的胶囊。
第6周 植入新胶囊。
第7周 除去先前植入的胶囊。
第8周 植入新胶囊。
第9周 治疗期结束。除去先前植入的胶囊。
第10周 随访(血清学肿瘤标记、肿瘤疼痛、血液学和血清化学、电泳和免疫球蛋白、安全性尿样)
第12周 随访(评估肿瘤大小、成像、肿瘤疼痛、血液学和血清化学、电泳和免疫球蛋白、安全性尿样)
第14周 随访(血清学肿瘤标记、免疫监测、肿瘤疼痛、血液学和血清化学、电泳和免疫球蛋白、安全性尿样)
第18周 随访(评估肿瘤大小、成像、血清学肿瘤标记、肿瘤疼痛、血液学和血清化学、电泳和免疫球蛋白、安全性尿样)
治疗后随访 第19周后，每3个月随访患者的安全性，直至死亡或第5年，以先到为准。
结果：
包括在治疗性试验中的所有15个患者已被治疗。对于每个患者的MVX-ONCO-1依据GMP和临床试验的SOP成功地制备，并且在MVX-ONCO-1上对内毒素和/或支原体的所有细菌测试均为阴性。
由于质量考虑，没有制备的治疗性疫苗组合物必须弃去。
用MVX-ONCO-1治疗的癌症类型包括卵巢癌、头颈癌、胰腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌。到目前为止，已给予77次疫苗。
在皮下植入前，从装载的胶囊分泌的GM-CSF水平在所有病例中在指定的限度内。此外，所有皮下植入的大胶囊在植入后7天成功地除去。一旦除去，对所有的大胶囊测试随后的GM-CSF释放，并且全部证实稳定的、高水平的分泌。一个胶囊在除去后破裂。
未观察到疑似的意想不到的严重不良反应(SUSAR)与本试验有关。此外，未报道严重不良事件(SAE)或全身不良事件(AE)与MVX-ONCO-1产品相关。而是，所有的SAE都与疾病进展相关。报告了22例相关的AE，但无一是严重的。6例归因于大胶囊的次要缺陷，其导致1例2级和5例1级植入部位损伤。在16例报告的非-严重的药物相关不良药物反应中，12例是1级植入部位血肿，3例是1级轻度发烧，和1例是3级血管迷走神经反应。在接种疫苗部位的1-2级局部AE包括植入期间的疼痛、局部不适和/或有限的炎症。
可行性结果的概述在下文提供：
可行性 N (%)
筛查/入选 24 / 15个患者
入选/治疗 15 / 15个患者
成功处理的肿瘤 15 (100)
成功的胶囊制备和植入 144 (100)
GMP质量IMP (胶囊和辐照的肿瘤细胞) 220/221 (99.5)
GM-CSF分泌 >20ng/24 hrs，植入前/植入后 144(100) / 143(99.3)
因此，本研究的结果表明，MVX-ONCO-1产品是安全的和非常良好耐受的，且这些结果表明制备临床级IMP并用这种创新策略治疗患者是可行的。此外，MVX-ONCO-1产品作为99.5%GMP级IMP也是稳健的。
在短期随访(第18周)结束时，6个患者(40%)存活而9个已经死亡(60%)。在长期随访中，4个患者死亡，而2个患者存活。总存活(OS)范围从46天至441天(平均值：199天(SD：121天)，中位值134天)。按照RECIST 1.1.标准，15个患者中的2个(13.33%)显示出部分反应，而6个(40.00%)显示稳定的疾病，作为在任何时间点的最好的总体反应。
功效结果的概述在下文提供：
癌症 患者数 临床结果
头颈 3 延长存活，对肺转移反应(即，鳞状细胞癌的肺转移减少(见图4)。脊索瘤大小减少(见图6)。
卵巢 6 1例减少肿瘤标记(即，Ca125的血清水平减少接近50% (见图5))，1例延长存活，3例疾病进展(PD)，1例在6W疾病稳定(SD)
胰腺 3 1例在6周SD，1例在第12周SD，1例PD
前列腺 1 PD
结肠 2 1例SD和1例PD
结论：
这首次在男性试验中证实该新型患者特异性的基于细胞的免疫疗法的非常良好的安全性概况以及可行性。此外，次要终点对相当一部分患有晚期、进行性、难治性实体恶性肿瘤的患者显示出临床益处。免疫监测参数的早期分析显示，在用MVX-ONCO-1免疫时，能够对其自身的肿瘤细胞诱导迟发型超敏反应的患者倾向于具有更好的存活。此外，在一个具有延长的部分反应的患者中在用MVX-ONCO-1免疫之前、期间和之后的淋巴细胞亚群的初步分析显示抗原特异性免疫反应。
计划在几个肿瘤类型(例如，晚期胰腺癌、卵巢癌和/或头颈鳞状细胞癌)以及与免疫检查点调节剂的组合疗法中用MVX-ONCO-1的2期试验。例如，构思了以下的IIa期临床试验(没有对照组)：
-MVX-ONCO-1在头颈癌中
-MVX-ONCO-1作为单一药剂在肺癌中
-MVX-ONCO-1与化学疗法组合，作为佐剂以改善在紫杉醇和卡铂的标准一线治疗后复发后的卵巢癌中的功效
-MVX-ONCO-1作为单一药剂在胰腺癌中
涉及头颈癌的临床试验被构思，因为：
-细胞可从这些肿瘤容易地获取，
-所述癌症通常具有差的预后(<6个月)，
-它们是频繁出现的癌症，
-这些肿瘤是PD1/PDL-1反应性的，并且同样地，它们是免疫原性肿瘤。
这些研究的终点将是在6个月的总存活率。
实施例2：收获自体肿瘤细胞(抗原加载)
来自待治疗的患者的肿瘤块(原发性病灶或转移)经手术收获。标准病理检查在部分肿瘤块上执行，以证实收获的材料的恶性性质。然后处理以获得单细胞悬浮液。这通过机械和酶促两种方法执行。
首先使用解剖显微镜将肿瘤块切成小块，然后肿瘤被放入含有各种酶(胶原酶)的无菌溶液的无菌袋中。所述袋被插入将产品加工成细胞悬浮液的细胞混合器(StomacherLab System)中。酶促和机械活动的组合于37℃几小时允许有效离解肿瘤的细胞外基质并将其转化成单细胞悬浮液。这在无血清溶液中执行。
使用冷冻离心机(Sorvall) (4℃，5分钟，700 rpm)，用HBSS洗涤细胞3次，并再悬浮于HBSS中。然后使用台盼蓝(Fluka)溶液和Neubauer室对细胞计数。
细胞以选择的浓度再悬浮，在专门为临床应用的辐照器中以10000拉德辐照，等分试样并在含有10% DMSO的冷冻介质中冷冻。
实施例3：免疫-分离的细胞因子提供者
a) 产生GM-CSF的细胞的生成
要导入胶囊的细胞是同种异体的(从人细胞系获得)。为了防止未能预测的毒性，使用已在临床方案中被批准的细胞系，例如永生化成纤维细胞或成肌细胞。这些细胞首先用人GM-CSF cDNA稳定地转染。
使用两种转染方法：逆转录病毒和电穿孔。对于逆转录病毒转染，hGM-CSF cDNA以框内(in-frame)插入MFG逆转录病毒载体并通过病毒的LTR驱动转录。质粒不包含任何选择标记或抗生素抗性基因。
对于通过电穿孔转染，hGM-CSF cDNA在CMV启动子下，和质粒含有选择性标记(例如抗生素抗性基因)。
也可使用不同类型的转染用细胞和不同的GM-CSF质粒，这对于地方卫生部门规定留下更大的灵活性。
于37℃、5% CO2下，使用标准技术，使产生细胞因子的细胞在无血清的培养基中培养。收获如下执行：移出在10cm培养板中的汇合粘附细胞的上清液并于37℃用5ml的高压灭菌的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞1次5分钟。然后除去PBS并加入2ml胰蛋白酶-EDTA0.5% (Life Technologies N°25300054)，于37℃孵育细胞4分钟。胰蛋白酶/EDTA允许粘附肿瘤细胞分离。然后细胞用2 ml移液管收获并稀释至5 ml的Hank平衡盐溶液(HBSS LifeTechnologies N°24020091)中。使用冷冻离心机(Sorvall) (4℃，5分钟，700 rpm)，用HBSS洗涤细胞3次并再悬浮于HBSS中。然后使用台盼蓝(Fluka)溶液和Neubauer室对细胞计数。
用Elisa (R&D system and Pharmingen试剂盒)对过滤的细胞上清液评价由细胞产生和分泌的hGM-CSF的量。这种分析允许选择最好的产生细胞因子的细胞系。
b) 产生细胞因子的细胞的免疫-分离
为了确保细胞因子由同种异体细胞持续释放并允许重复免疫，从接受者的免疫系统免疫-分离产生细胞因子的细胞成为必要。这由任一大囊化执行。
将产生细胞因子的细胞加载到大胶囊中。在此描述的任何大胶囊可以利用。以10.5ul/min的速率，将细胞悬浮液装载到胶囊中。胶囊的密封通过聚合物胶获得，但也可能通过加热或手术钳进行。来自含有GM-CSF分泌细胞的包囊化细胞的上清液的分析显示，在加载后，GM-CSF的稳定的、连续释放被实现至少15天，细胞因子水平是约70ng/105个细胞/24小时。
实施例4：免疫
用Onco-Maxi-Vax免疫需要在疫苗组合物的两个组分的密切接触下进行皮下注射。
在局部麻醉下，使用皮肤小切口，将含有产生细胞因子的细胞的胶囊置于皮下组织内。皮肤用手术胶带闭合。
来自患者的辐照的肿瘤细胞(=抗原加载)被解冻，用0.9% NaCl无菌溶液洗涤2次，然后在非常紧靠胶囊附近，使用24号针皮下注射。
以有规律间隔重复接种疫苗。接种疫苗的部位在每次免疫时是不同的(腹壁、上手臂、大腿、胸等)。
实施例5：比较性数据
通过对现有技术(例如，WO 2003/105895)描述的胶囊进行各种改进和/或改变，尽力优化在此描述的疫苗组合物的“通用”组分。
例如，在此描述的疫苗组合物优选地利用大胶囊内的非-粘附细胞类型。此外，MVX-1细胞系是造血来源，与以前的装置相反，其考虑使用成纤维细胞或上皮来源的细胞。
此外，在此描述的疫苗组合物、用途和方法利用WO2003/105895中描述的组合物中未使用的新的冷冻方法和不同的GMP条件方案。
实施例6：GM-CSF生物学活性测定法
进行功能性的基于细胞的测定法，以测定由MVX-1细胞系产生的GM-CSF的生物学活性。含有产生的GM-CSF的细胞上清液的两份样品使用LanthaScreenTM细胞测定法(ThermoFisher Scientific)，按一式两份测试，LanthaScreenTM细胞测定法利用铽-标记的磷酸化作用-位点特异性抗体(PSSA)和绿色荧光蛋白(特定的激酶底物的GFP融合物)之间的时间解析共振能量转移(TR-FRET)，以提供测定读出，其为比率计量的，稳健的和适合高通量筛选(HTS)应用。使用靶标的GFP融合物连同单一检测抗体，简化了测定方案，消除了对珠或另外的试剂的需要，并简化了测定(相对于其它两种抗体的“夹心”方法)。
测定条件
试验化合物
所有试验化合物初始以1000X浓度在100% DMSO中制备。系列稀释(½ log)的试验化合物在DMSO中制备。已知的抑制剂以这种相同的方式制备。
测定板
Corning 384-孔白色平底、聚苯乙烯、组织-培养处理的测定板(Corning #3570)。
测定培养基
LanthaScreen细胞测定通常在低-血清(或无血清培养基)中进行，以降低途径激活并为后续的分析提供基线。
溶胞缓冲液
完全LanthaScreen细胞测定溶胞缓冲液由20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、5 mM EDTA、5mM NaF、150 mM NaCl、1% NP-40 (或等同物)、蛋白酶抑制剂合剂(Sigma #P8340)、磷酸酶抑制剂合剂(Sigma #P2850)和2-5 nM适当的Tb-PSSA组成。
激动剂测定方案(通用)
1. 将在测定培养基中稀释至适当的细胞密度的32 μL细胞加入到测定板中。如果需要，在加入化合物之前，于37℃/5% CO2中孵育细胞0-24小时(取决于细胞系特异性)。
2. 将40 nL的1000X化合物或已知的激活剂滴定液加入到在测定板中的细胞中。将8 μL测定培养基加入到这些孔中。
3. 将8 μL测定培养基加入到剩余的对照孔中以使体积至40 μL。
4. 于37℃/5% CO2，在湿润的孵育器中孵育测定板预定的时间长度(细胞系/测定特异性)。
5. 通过加入含预定浓度的Tb-标记的Ab (测定特异性)的溶胞缓冲液溶解细胞。
6. 在暗处，于室温下孵育测定板预定的时间长度(测定特异性)。
7. 在荧光板读出仪上读板。
拮抗剂测定方案(通用)
1. 将在测定培养基中稀释至适当的细胞密度的32 μL细胞加入到测定板中。如果需要，在加入化合物之前，于37℃/5% CO2中孵育细胞0-24小时(取决于细胞系特异性)。
2. 将40 nL的1000X化合物或已知的抑制剂滴定液加4 μL测定培养基加入到在测定板中的细胞中并于37℃/5% CO2，在湿润的孵育器中孵育30分钟。
3. 将4 μL的EC80浓度的激活剂(如在激活剂测定中测定的)，加入到含有试验化合物和已知的抑制剂的所有孔中以使最终测定体积至40 μL。
4. 将4 μL测定培养基加入到剩余的对照孔中以使体积至40 μL。
5. 于37℃/5% CO2，在湿润的孵育器中孵育测定板预定的时间长度(细胞系/测定特异性)。
6. 通过加入含预定浓度的Tb-标记的Ab (测定特异性)的溶胞缓冲液溶解细胞。
7. 在暗处，于室温下孵育测定板预定的时间长度(测定特异性)。
8. 在荧光板读出仪上读板。
测定法对照
对于每个单独的测定在每一个测定板上制得以下对照：
MAX STIM对照(如果适用)
最大TR-FRET信号(发射比；520 nm/490 nm)由MAX STIM对照(或0%抑制对照)建立。这些对照孔包含在0.1% DMSO的存在下用EC100浓度的激动剂刺激的GFP+细胞。
UNSTIM对照
最小TR-FRET信号通过UNSTIM对照建立。这些对照孔包含在0.1% DMSO的存在下未刺激的细胞。
EC80对照(仅抑制剂模式)
EC80对照是已通过激活剂实验测定的已知激活剂在测定培养基中的浓度。在抑制剂模式中，EC80对照被用来测定激活的实际基线或0%抑制。
0%抑制
TR-FRET信号在0.1% DMSO的存在下(无化合物存在)，从含有用EC80浓度的激动剂刺激的细胞的孔获得。
已知的抑制剂滴定液(如果适用)
已知的抑制剂对照标准曲线(10点滴定)在每个测定板上运行，以确保测定在期望的IC50范围内被抑制。
筛查可利用的相关LanthaScreen细胞系在下面提供：
*EC50和IC50值是代表性的
STAT5 A/B [pTyr694/699]-LanthaScreen STAT5 TF-1 -激活剂筛选, GM-CSF刺激
解冻细胞并再悬浮于测定培养基(OPTI-MEM、0.5% csFBS、0.1 mM NEAA、1 mM丙酮酸钠、100 U/mL/100 μg/mL Pen/Strep)中，达到3,125,000个细胞/mL的浓度。将32 μL细胞悬浮液加入到白色TC-处理的测定板的各孔中(100,000个细胞/孔)并于37℃/5% CO2，在湿润的孵育器中孵育16-24小时。将40 nL对照激活剂GM-CSF或试验化合物加入到适当的测定孔中，接着加入8 μL测定培养基。于37℃/5% CO2中，在湿润的孵育器中孵育测定板30分钟。将30 μL的LanthaScreen细胞测定溶胞缓冲液(含有5 nM LanthaScreen抗-STAT5 A/B[pTyr694/699]抗体和10 nM Tb-抗-小鼠抗体)加入到孔中。于室温下孵育测定板120分钟。用荧光板读出仪对测定板读数。
STAT5 A/B [pTyr694/699]-LanthaScreen STAT5 TF-1-抑制剂筛选, GM-CSF刺激
解冻细胞并再悬浮于测定培养基(OPTI-MEM、0.5% csFBS、0.1 mM NEAA、1 mM丙酮酸钠、100 U/mL/100 μg/mL Pen/Strep)中，达到3,125,000个细胞/mL的浓度。将32 μL细胞悬浮液加入到白色TC-处理的测定板的各孔中(100,000个细胞/孔)并于37℃/5% CO2，在湿润的孵育器中孵育16-24小时。将40 nL对照抑制剂JAK抑制剂I或试验化合物加入到适当的测定孔中，接着加入4 μL测定培养基。于37℃/5% CO2中，在湿润的孵育器中孵育测定板30-60分钟。将4 μL 10X对照激活剂GM-CSF以预定的EC80浓度加入到含有对照抑制剂或化合物的孔中。于37℃/5% CO2中，在湿润的孵育器中孵育测定板30分钟。将30 μL LanthaScreen细胞测定溶胞缓冲液(含有5 nM LanthaScreen抗-STAT5 A/B [pTyr694/699]抗体和10 nMTb-抗-小鼠抗体)加入到孔中。于室温下孵育测定板120分钟。用荧光板读出仪对测定板读数。
这种测定的结果都是阳性的(见图7)。由MVX-1细胞系产生的GM-CSF在测定的限度内被认为相当于商业可获得的GM-CSF。
等同方案
本发明的一个或多个实施方案的细节在上面伴随的描述中阐明。虽然类似或相当于在此描述的那些的任何方法和材料可被用于本发明的实施或测试，但目前描述了优选的方法和材料。本发明的其它特征、目的和优点将从说明书和从权利要求书而变得显而易见。在说明书和所附权利要求书中，单数形式包括复数指代，除非在上下文中另外清楚地规定。除非另外限定，在此使用的技术和科学术语，具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意义。在本说明书中引用的所有专利和出版物通过参考结合到本文中。
前文的描述仅仅是为了举例说明的目的而提出，不是打算限制本发明至公开的精确形式，而是受所附权利要求书的限制。

Claims (131)

1. 一种疫苗组合物，其包含：
(a) 至少一个可取回的生物相容性大胶囊，其包含分泌至少20 ng/24小时的GM-CSF的约1x105-约1x106个免疫-分离的同种异体细胞，和
(b) 抗原组分，
其中至少一个生物相容性大胶囊包含：
包含同种异体细胞和内部线圈的芯，其中同种异体细胞被分布在内部线圈上；和
围绕芯的允许GM-CSF扩散通过的半渗透膜。
2.依据权利要求1的疫苗组合物，其中半渗透膜由选自聚醚砜(PES)和热塑性聚氨酯的材料构成。
3.依据权利要求1的疫苗组合物，其中内部线圈由铝或钛构成。
4. 依据权利要求1的疫苗组合物，其中内部线圈上的螺旋线之间的距离是约1mm ±0.1mm。
5.依据权利要求1的疫苗组合物，其中至少一个生物相容性大胶囊具有圆柱形。
6. 依据权利要求5的疫苗组合物，其中至少一个生物相容性大胶囊的长度是约12 mm。
7.依据权利要求1的疫苗组合物，其中至少一个生物相容性大胶囊还包含取回管。
8.依据权利要求7的疫苗组合物，其中取回管由聚氨酯构成。
9.依据权利要求7的疫苗组合物，其中至少一个生物相容性大胶囊的膜被固定于取回管。
10.依据权利要求7的疫苗组合物，其中取回管还包含方便将至少一个生物相容性大胶囊在植入后取回的取回钩。
11.依据权利要求10的疫苗组合物，其中取回钩包含孔眼和至少两条腿以有助于对取回管的附着。
12.依据权利要求11的疫苗组合物，其中取回钩是不锈钢。
13.依据权利要求11的疫苗组合物，其中取回钩使用紫外线固化胶固定于取回管。
14.依据权利要求11的疫苗组合物，其中缝线通过孔眼放置以在植入后固定取回钩。
15.依据权利要求7的疫苗组合物，其中取回管用连接器固定于至少一个生物相容性大胶囊的膜。
16.依据权利要求15的疫苗组合物，其中连接器是不锈钢。
17.依据权利要求15的疫苗组合物，其中插入膜的连接器的末端具有截短的锥形形状。
18.依据权利要求7的疫苗组合物，其中至少一个生物相容性大胶囊还包含促进细胞加载的加载中心。
19.依据权利要求18的疫苗组合物，其中加载中心具有截短的锥形末端。
20.依据权利要求19的疫苗组合物，其中加载中心经摩擦安装到膜中。
21.依据权利要求1的疫苗组合物，其中至少一个生物相容性大胶囊被包含在传输管内，所述传输管包含管体和管帽。
22.依据权利要求21的疫苗组合物，其中管体和管帽包含一个或多个孔。
23. 依据权利要求22的疫苗组合物，其中管帽包含鲁尔锁(luer lock)，其中鲁尔锁经摩擦安装到帽中。
24.依据权利要求23的疫苗组合物，其中加载中心被匹配地啮合到帽内的鲁尔锁中。
25.依据权利要求1的疫苗组合物，其中至少一个生物相容性大胶囊包含约8x105个免疫-分离的同种异体细胞。
26.依据权利要求1的疫苗组合物，其中疫苗组合物包含两个生物相容性大胶囊。
27. 依据权利要求26的疫苗组合物，其中在每个大胶囊内的免疫-分离的同种异体细胞分泌至少20 ng/24h的GM-CSF至少1周的时期。
28.依据权利要求1的疫苗组合物，其中所述抗原组分包含自体肿瘤细胞。
29.依据权利要求28的疫苗组合物，其中所述肿瘤细胞被辐照。
30.依据权利要求29的疫苗组合物，其中抗原组分包含约1x106-约1x107个自体肿瘤细胞。
31.依据权利要求30的疫苗组合物，其中抗原组分包含约4x106个自体肿瘤细胞。
32.依据权利要求1的疫苗组合物，其中所述抗原组分来自传染因子。
33.依据权利要求32的疫苗组合物，其中所述传染因子来自病毒、细菌、寄生虫病原体或真菌。
34.依据权利要求33的疫苗组合物，其中抗原组分是灭活的病原体、传染因子溶解产物、蛋白提取物、重组蛋白、肽或DNA。
35.依据权利要求33的疫苗组合物，其中所述病毒选自HIV、CMV、复发性疱疹感染、乙型肝炎、厄泼斯坦巴尔病毒、丙型肝炎和人乳头瘤病毒(HPV)。
36.依据权利要求33的疫苗组合物，其中所述细菌选自分枝杆菌感染、幽门螺杆菌和脑膜炎球菌感染。
37.依据权利要求33的疫苗组合物，其中所述寄生虫病原体选自疟疾、弓形体、肺孢子虫和包虫病。
38.依据权利要求33的疫苗组合物，其中所述真菌选自假丝酵母和曲霉菌。
39.依据权利要求1的疫苗组合物，其中免疫-分离的同种异体细胞还分泌至少一种另外的免疫调节剂。
40. 依据权利要求39的疫苗组合物，其中至少一种另外的免疫调节剂选自IL-12、IL-15、IL-4、干扰素γ、趋化因子或树突细胞生长因子、IL-3、IL-9、IL-1、IL-2、IL-7、IFNγ的跨膜受体、可溶性或膜性干细胞因子(SCF)、FL (Flt3配体)、G-CSF、TLR7激动剂、T细胞免疫球蛋白粘液素-3 (TIM-3)、糖皮质激素-诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、淋巴细胞-激活基因3 (LAG-3)、Vista、B-和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、诱导型T-细胞辅助刺激因子(ICOS)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4 (OX40)、CD40、CD137 (41BB)、CD27、吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)及其组合。
41.依据权利要求1的疫苗组合物，其中围绕大胶囊的芯内免疫-分离的同种异体细胞的膜是选择性渗透的。
42. 依据权利要求41的疫苗组合物，其中所述膜的截留分子量(MWCO)是大约280 kDa。
43.依据权利要求1的疫苗组合物，其中所述免疫-分离的同种异体细胞经遗传修饰以表达GM-CSF。
44.依据权利要求43的疫苗组合物，其中遗传修饰通过质粒转染或病毒感染实现。
45.依据权利要求1的疫苗组合物，其中所述免疫-分离的同种异体细胞是建立的人细胞系。
46.依据权利要求45的疫苗组合物，其中建立的人细胞系是非-粘附细胞系。
47.依据权利要求46的疫苗组合物，其中非-粘附细胞系具有造血来源。
48.依据权利要求1的疫苗组合物，其中所述免疫-分离的同种异体细胞是永生的或永生化的。
49.依据权利要求1的疫苗组合物，其中所述免疫-分离的同种异体细胞是非肿瘤的。
50.依据权利要求1的疫苗组合物，其中所述免疫-分离的同种异体细胞具有哺乳动物来源。
51.依据权利要求50的疫苗组合物，其中所述免疫-分离的同种异体细胞是人的。
52.依据权利要求51的疫苗组合物，其中所述免疫-分离的同种异体细胞被辐照。
53.依据权利要求1的疫苗组合物，其中所述免疫-分离的同种异体细胞分泌约80-约960x10-15g/24hr的GM-CSF。
54.依据权利要求1的疫苗组合物，其中所述免疫-分离的同种异体细胞分泌超过10x10-15g/24hr的GM-CSF。
55.依据权利要求54的疫苗组合物，其中所述免疫-分离的同种异体细胞分泌超过100x10-15g/24hr的GM-CSF。
56. 依据权利要求1的疫苗组合物，其中至少一个生物相容性大胶囊分泌50-150 ng/天的GM-CSF。
57.依据权利要求1的疫苗组合物，其中疫苗组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。
58.依据权利要求57的疫苗组合物，其中一种或多种另外的治疗剂是免疫检查点调节剂。
59. 依据权利要求58的疫苗组合物，其中免疫检查点调节剂靶向一种或多种选自以下的免疫调节分子：细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)、程序性细胞死亡蛋白1配体(PD-L1)、T细胞免疫球蛋白粘液素-3 (TIM-3)、糖皮质激素-诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、淋巴细胞-激活基因3 (LAG-3)、Vista、B-和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、诱导型T-细胞辅助刺激因子(ICOS)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4 (OX40)、CD40、CD137 (也称为41BB)、CD27、吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)及其组合。
60.依据权利要求1的疫苗组合物，其中至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分被冷冻。
61.依据权利要求60的疫苗组合物，其中至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分在使用之前被解冻。
62.依据权利要求1的疫苗组合物，其中至少一个生物相容性大胶囊还包含以下的一个或多个：
(i) 取回管；
(ii) 固定于取回管的取回钩，其中取回钩方便至少一个生物相容性大胶囊在植入后的取回；
(iii) 连接器，其中连接器将至少一个生物相容性大胶囊的膜固定于取回管；
(iv) 加载中心，其中加载中心促进细胞加载；和
(v) 传输管，其中传输管包含管体和管帽。
63.一种药用组合物，其包含依据权利要求1的疫苗组合物和生理学上可接受的载体。
64.一种药剂盒，其包含依据权利要求1的疫苗组合物或依据权利要求63的药用组合物和使用说明书。
65.依据权利要求64的药剂盒，其中至少一个生物相容性大胶囊是无菌的。
66.依据权利要求65的药剂盒，其中，在灭菌后，至少一个生物相容性大胶囊被单独包装在无菌袋中。
67.依据权利要求64的药剂盒，其中抗原组分包含产生或释放一种或数种抗原的细胞。
68.依据权利要求67的药剂盒，其中所述产生或释放一种或数种抗原的细胞是肿瘤细胞。
69.依据权利要求68的药剂盒，其中所述肿瘤细胞被辐照。
70.依据权利要求64的药剂盒，其中抗原组分从传染因子获得。
71.依据权利要求70的药剂盒，其中所述传染因子来自病毒、细菌、寄生虫病原体或真菌。
72.依据权利要求1的疫苗组合物、依据权利要求63的药用组合物或依据权利要求64的药剂盒用于治疗性或预防性接种疫苗的用途。
73.依据权利要求72的用途，其中治疗性或预防性接种疫苗是癌症治疗或接种疫苗。
74.依据权利要求73的用途，其中癌症选自肺癌、黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、急性白血病、慢性白血病、成胶质细胞瘤、低度恶性淋巴瘤、高度恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、骨癌、脑瘤、胃癌、食道癌、头颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、脊索瘤和宫颈癌。
75.依据权利要求74的用途，其中癌症是肺癌。
76.依据权利要求74的用途，其中癌症是胰腺癌。
77.依据权利要求74的用途，其中癌症是卵巢癌。
78.依据权利要求74的用途，其中癌症是头颈癌。
79.依据权利要求72的用途，其中治疗性或预防性接种疫苗是传染因子治疗或接种疫苗。
80.依据权利要求79的用途，其中传染因子选自病毒、细菌、寄生虫和真菌。
81.依据权利要求80的用途，其中所述病毒选自HIV、CMV、复发性疱疹感染、乙型肝炎、厄泼斯坦巴尔病毒、丙型肝炎和人乳头瘤病毒(HPV)。
82.依据权利要求80的用途，其中所述细菌选自分枝杆菌感染、幽门螺杆菌和脑膜炎球菌感染。
83.依据权利要求80的用途，其中所述寄生虫病原体选自疟疾、弓形体、肺孢子虫和包虫病。
84.依据权利要求80的用途，其中所述真菌选自假丝酵母和曲霉菌。
85.依据权利要求72的用途，其中至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分被植入，和所述至少一个生物相容性大胶囊随后被除去。
86.依据权利要求85的用途，其中至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分在皮肤下极为贴近或接触地被顺序给予。
87.依据权利要求86的用途，其中至少一个生物相容性大胶囊在抗原组分之前被植入。
88.依据权利要求87的用途，其中至少一个生物相容性大胶囊被植入少于12天。
89.依据权利要求88的用途，其中至少一个生物相容性大胶囊被植入4和10天之间。
90.依据权利要求89的用途，其中至少一个生物相容性大胶囊被植入5和7天之间。
91.依据权利要求72的用途，其中预防性或治疗性接种疫苗包括多次注射。
92.依据权利要求91的用途，其中多次注射以有规律间隔发生。
93.依据权利要求92的用途，其中，当预防性或治疗性接种疫苗包括癌症治疗或接种疫苗时，有规律间隔包括每周注射，持续4周，接着每两周两次额外的免疫接种。
94.依据权利要求92的用途，其中，当预防性或治疗性接种疫苗包括传染因子治疗或接种疫苗时，有规律间隔包括每周注射，持续至少2周。
95.依据权利要求92的用途，其中多次注射是皮下注射。
96.一种治疗性或预防性接种疫苗的方法，其包括给予有需要的患者有效量的依据权利要求1的疫苗组合物、依据权利要求63的药用组合物或依据权利要求64的药剂盒。
97.依据权利要求96的方法，其中治疗性或预防性接种疫苗是癌症治疗或接种疫苗。
98.依据权利要求97的方法，其中癌症选自肺癌、黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、急性白血病、慢性白血病、成胶质细胞瘤、低度恶性淋巴瘤、高度恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、骨癌、脑瘤、胃癌、食道癌、头颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、脊索瘤和宫颈癌。
99.依据权利要求98的方法，其中癌症是肺癌。
100.依据权利要求98的方法，其中癌症是胰腺癌。
101.依据权利要求98的方法，其中癌症是卵巢癌。
102.依据权利要求98的方法，其中癌症是头颈癌。
103.依据权利要求98的方法，其中治疗性或预防性接种疫苗是传染因子治疗或接种疫苗。
104.依据权利要求103的方法，其中传染因子选自病毒、细菌、寄生虫和真菌。
105.依据权利要求104的方法，其中所述病毒选自HIV、CMV、复发性疱疹感染、乙型肝炎、厄泼斯坦巴尔病毒、丙型肝炎和人乳头瘤病毒(HPV)。
106.依据权利要求104的方法，其中所述细菌选自分枝杆菌感染、幽门螺杆菌和脑膜炎球菌感染。
107.依据权利要求104的方法，其中所述寄生虫病原体选自疟疾、弓形体、肺孢子虫和包虫病。
108.依据权利要求104的方法，其中所述真菌选自假丝酵母和曲霉菌。
109.依据权利要求96的方法，其中至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分被植入，和所述至少一个生物相容性大胶囊随后被除去。
110.依据权利要求109的方法，其中至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分在皮肤下极为贴近或接触地被顺序给予。
111.依据权利要求110的方法，其中至少一个生物相容性大胶囊在抗原组分之前被植入。
112.依据权利要求109的方法，其中至少一个生物相容性大胶囊被植入少于12天。
113.依据权利要求111的方法，其中至少一个生物相容性大胶囊被植入4和10天之间。
114.依据权利要求113的方法，其中至少一个生物相容性大胶囊被植入5和7天之间。
115.依据权利要求96的方法，其中预防性或治疗性接种疫苗包括多次注射。
116.依据权利要求115的方法，其中多次注射以有规律间隔发生。
117.依据权利要求116的方法，其中，当预防性或治疗性接种疫苗包括癌症治疗或接种疫苗时，有规律间隔包括每周注射，持续4周，接着每两周两次额外的免疫接种。
118.依据权利要求116的方法，其中，当预防性或治疗性接种疫苗包括传染因子治疗或接种疫苗时，有规律间隔包括每周注射，持续至少2周。
119.依据权利要求116的方法，其中多次注射是皮下注射。
120.一种制备用于依据权利要求18的疫苗组合物的至少一个生物相容性大胶囊的方法，该方法包括：
(a) 培养同种异体细胞至少两代以确保细胞分泌GM-CSF；
(b) 使培养的细胞重悬浮于细胞培养基中；
(c) 将细胞加载到至少一个生物相容性大胶囊中；和
(d) 切下取回管以除去加载中心。
121.权利要求120的方法，其中细胞使用无菌空气压力加载到至少一个生物相容性大胶囊中。
122.权利要求120的方法，其中该方法还包括密封取回管的切断端的步骤。
123.权利要求122的方法，其中该方法还包括洗涤和冷冻保存至少一个生物相容性大胶囊的步骤。
124.依据权利要求1-62的任一项的疫苗组合物、权利要求63的药用组合物或权利要求64-71的任一项的药剂盒，用于治疗性或预防性接种疫苗。
125.依据权利要求124的用途要求的疫苗组合物、药用组合物或药剂盒，其中治疗性或预防性接种疫苗是癌症治疗或接种疫苗，任选地其中癌症选自肺癌、黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、急性白血病、成胶质细胞瘤、低度恶性淋巴瘤、高度恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、骨癌、脑瘤、胃癌、食道癌、头颈癌、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、脊索瘤和宫颈癌。
126.依据权利要求124使用的疫苗组合物、药用组合物或药剂盒，其中治疗性或预防性接种疫苗是传染因子治疗或接种疫苗，任选地其中传染因子选自病毒、细菌、寄生虫和真菌。
127.依据权利要求126使用的疫苗组合物、药用组合物或药剂盒，其中病毒选自HIV、CMV、复发性疱疹感染、乙型肝炎、厄泼斯坦巴尔病毒、丙型肝炎和人乳头瘤病毒(HPV)，细菌选自分枝杆菌感染、幽门螺杆菌和脑膜炎球菌感染，寄生虫病原体选自疟疾、弓形体、肺孢子虫和包虫病，或真菌选自假丝酵母和曲霉菌。
128.依据权利要求124-127的任一项使用的疫苗组合物、药用组合物或药剂盒，其中至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分被植入和所述至少一个大胶囊随后被除去，任选地至少一个生物相容性大胶囊和抗原组分在皮肤下极为贴近或接触地被顺序给予，或至少一个生物相容性大胶囊在抗原组分之前被植入。
129.依据权利要求128使用的疫苗组合物、药用组合物或药剂盒，其中至少一个生物相容性大胶囊被植入少于12天，4和10天之间，或5和7天之间。
130.依据权利要求124-129的任一项使用的疫苗组合物、药用组合物或药剂盒，其中预防性或治疗性接种疫苗包括多次注射，任选地其中多次注射以有规律间隔发生，任选地其中多次注射是皮下注射。
131. 依据权利要求130使用的疫苗组合物、药用组合物或药剂盒，其中(i) 当预防性或治疗性接种疫苗包括癌症治疗或接种疫苗时，有规律间隔包括每周注射，持续4周，接着每两周两次额外的免疫接种，或(ii) 当预防性或治疗性接种疫苗包括传染因子治疗或接种疫苗时，有规律间隔包括每周。
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