JPH09506866A - 医薬として活性のある物質の免疫療法のための放出制御 - Google Patents

医薬として活性のある物質の免疫療法のための放出制御

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JPH09506866A JP51700694A JP51700694A JPH09506866A JP H09506866 A JPH09506866 A JP H09506866A JP 51700694 A JP51700694 A JP 51700694A JP 51700694 A JP51700694 A JP 51700694A JP H09506866 A JPH09506866 A JP H09506866A
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ダブリュ. レング,カム
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ジャフィー,エリザベス
レヴィツキー,ヤム
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ジョーンズ ホプキンス ユニバーシティー スクール オブ メディシン
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Abstract

(57)【要約】 免疫増強剤と抗原を含む放出制御ビヒクルの混合物を投与することにより、腫瘍細胞または病原体関連抗原に対する、全身性免疫反応を剌激する方法を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】 医薬として活性のある物質の免疫療法のための放出制御 発明の背景 1.発明の分野 本発明は、概して、癌と感染症の免疫療法の分野に関する。より厳密にいえば 、腫瘍および腫瘍細胞、または腫瘍もしくは病原体に由来する特定の抗原に対す る免疫反応を増強させる薬剤を含む、放出制御ビヒクルの混合物に関する。本発 明は、免疫増強混合物を用いた免疫化による癌の治療方法を含む。 2.関連分野の説明 能動免疫療法は、ヒトの癌の治療と、特に再発防止のための有望なアプローチ であると考えられている。研究されている中で最も有望なアプローチの一つであ る特異的能動免疫療法は、たとえば細胞溶解性のTリンパ球のような、その免疫 系に特異的なエフェクター細胞を活性化するために腫瘍細胞で免疫すること(突 然変異誘発やハプテンを用いる治療、あるいは異種蛋白の発現に代えてもよい) により、腫瘍に対する宿主の免疫反応を活性化することを含む。非特異的能動免 疫療法は、免疫を調節する微生物または化学物質を利用して、ナチュラルキラー (NK)細胞、マクロファージ、またはリンフォカイン活性化キラー(LAK) 細胞を活性化できる。残念ながら、これらのアプローチの多くは、まだ裏付けさ れていない。 癌免疫学において最も重要な疑問の一つは、なぜ免疫系が腫瘍を除去できない か、である。1970年代に、ヒュウィット(Hewitt)は、ほとんどの腫 瘍が、腫瘍特異性あるいは腫瘍抗原をなんら発現せず、よって免疫系が”異種” であることを認識できないのであるという概念を表明した。実際、事実上、抗体 が認識できる腫瘍細胞表面の腫瘍特異的な抗原は発見されておらず、そしてさら に、同遺伝子型の宿主に移入したときに除去されなかったことから明らかなよう に、マウスの自発性腫瘍のほとんどは”免疫原不在(poorly immunogenic)”と考 えられていた(Hewitt,et al.,Br.J.Cancer,33:241-259,1976)。しかし、 これらと同じ腫瘍が、新しい抗原が癌細胞の表面に発現したとき、突然変異誘発 により”免疫原”になりえたのである(Van Pel and Boon,Proc.Natl.Acad.S ci.USA,79:4718-4722,1982)。 免疫系が腫瘍を除去できないのは、腫瘍抗原が不在だからではなく、これらの 腫瘍抗原の反応が不適切であるためという可能性もある。そのため、宿主のこれ ら腫瘍細胞に対する免疫反応を増強させるように、腫瘍細胞の免疫原性を高める 方法は、免疫療法に重要な進歩をもたらすだろう。 腫瘍抗原に反応できないのは、少なくともその一部は、T細胞がうまく働かな いことによるだろう。Th機能は、インターロイキン2(IL−2)のようなリ ンフォカインの局部的分泌を分子的基礎とする。このインターロイキン2は、T 細胞レセプターが初めから適当な抗原−MHC複合体でふさがっているようなC TLsに作用する(Moller,Immunol Rev.51,1980 で再検討されている)。N K細胞とLAK細胞の潜在的な細胞毒性もまた、IL−2によって高められる( Grimm,et al,J.Molecular and Applied Genetics,2:101-109,1982;Philli ps and Lanier,J.Exp.Med.,164:814-825,1986;Ortaldo,et al.,J.Exp .Med,164:1193-1205,1986)。インターロイキン2を全身に注入することによ る腫瘍免疫の増強が試みられてきたが、それらの研究は全身に投与されたIL− 2の毒性により妨げられてきた。それゆえ、腫瘍局部に補助的なT細胞の働きを 与えることにより、腫瘍に対する免疫を強化させる方法は、さらに魅力のある選 択であり、これまで長く癌の治療に必要とされてきたことである。 免疫療法におけるもう一つの困難は、患者に生きた腫瘍細胞を投与することに おける生来の問題に起因する。従来、免疫化に用いられた腫瘍細胞には、免疫化 に先立ち、たとえば放射線照射あるいはマイトマイシンCによる処理のような、 増殖能力を弱める処理が行われてきた。残念ながら、複製を阻害するこれらの方 法のどちらもが、細胞の免疫原性をもかなり減少させる。たとえば、8−10、 000ラドの放射線が照射された突然変異原誘発変異株には、もはや免疫原性が ないことが分かっている(Sella,et al.,Clin.Exo.Metastasis,7:97-105, 1989)。同様に、IL−2またはIFN−γを分泌するマウスの腫瘍細胞は、放 射線照射後、免疫能力を失う。さらに、腫瘍細胞の膜組織標本を用いる試みでも 、 説得力のある免疫反応の証拠を得られていない。それゆえ、生育可能な細胞を使 って腫瘍に免疫反応を起こす方法を開発することは好都合なことである。 生体内において生物学的活性物質(たとえば、薬剤)を生物学的液体(たとえ ば、胃腸管の液体)あるいは体組織へ確実に放出する制御送達系は、今も捉えど ころのない目標である。サイトカイン、ホルモン、酵素、そして抗体のような生 物学的に活性な内因性物質は、通常、生理学的環境において、従来の合成薬物よ りも不安定である。このように制御送達系は、これら内因性の物質を宿主へ投与 するに適した方法を提供する。 ある活性物質の放出制御を提供する一般的なアプローチは、その活性物質をポ リマーマトリックス(たとえば、親水性ポリマーで出来ているもの)の中へ封入 することである。ある薬物と特定のポリマーの組合せは、適当な薬物放出の側面 をもつ一方で、体内へ送達させるために比較的大量の合成原料を要する。これは 、このような原料またはその代謝物が生体内において生体適合性でなかったり、 あるいは細胞毒性または突然変異誘発性といった毒性さえもつこともあるので好 ましくない。さらに、封入には有機溶剤および/または加熱を用いるが、この両 方が、上に述べた内因性物質にはいうまでもなく、ペプチドまたは蛋白様薬物に も悪影響を与えかねない。 複合体コアセルベーションは、コロイド溶液を2層あるいはもっと多くの不混 和性の液層へ分離する工程である。反対に荷電した高分子電解質を水性媒体中で 接触させると、自発的に相が分離して、コアセルベートを形成する結果となる。 このコアセルベートはコロイド(たとえば、ポリマー)が濃縮された一つの相で ある。コアセルベーションは、水に不溶な生物学的活性物質を封入するのに用い られてきた。たとえば、米国特許第4,794,000号は、活性成分としてエ リスロマイシンを含む2相のコアセルベート系をベースとする、経口投与のため の医薬組成物を製造する方法を開示している。米国特許第5,051,304号 は、ゼラチンと化学的に脱重合させた多糖との間のコアセルベーションにより形 成された、様々な水に混和しない物質を含有させることが出来るマイクロカプセ ルを開示している。 これらの参考文献そして他の参考文献は、概して、コアセルベートの形態の伝 達系にコアセルベーション技術を適用できることを教示しているが、関心のある 特定の物質を封入するコアセルベートの形成は、適する高分子電解質、pH、そ して温度を選択しそれに専心するといった、相の分離条件を慎重に制御すること によってのみ達成できるのである。 生物分解性のポリマーは、一般的な生体内での持続性薬物放出伝達系になって きた。それゆえ、生物分解性ポリマーの概念は、腫瘍ワクチンにおけるパラクリ ンサイトカイン生産を達成するための技術的により容易な戦略を開発するために 、改変されてもよい。全身の抗腫瘍免疫反応の誘発において、局所的なGM−C SFの生産が優れていることを示している先の研究に基づくと、(Dranoff,et a l.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.,USA,90:3539,1993)、細胞大のゼラチン−コン ドロイチン硫酸ミクロスフェア内に取り込まれたGM−CSFが、免疫化の前に 放射線を照射した腫瘍細胞と混合されるとき、アジュバントとして作用できる可 能性がある。 治療用の化合物の持続性放出のためのビヒクルが多く知られているが、動物内 で、宿主の免疫系を適正に剌激して、局部腫瘍だけでなく、転移腫瘍をも改善さ せる方法論は開発されていない。本発明は、このニーズに応える技術を提供する 。 発明の概要 本発明は、被験体における、腫瘍細胞または特定の病原体関連抗原に対する全 身免疫反応を剌激する方法であって、その被験体へ、免疫増強剤と腫瘍細胞、ま たは特定の腫瘍または病原体の抗原を含む制御放出ビヒクルを含む組成物を投与 することを含む前記方法を提供する。免疫増強剤は、典型的には、腫瘍壊死因子 、GM−CSF、インターロイキン、そしてインターフェロンのようなサイトカ インである。 図面の簡単な説明 図1は、本発明の実施の際に製造したミクロスフェアの光学顕微鏡写真である 。 図2は、ゼラチン/コンドロイチン硫酸ビーズと混合したB16F10黒色腫 で免疫した部位の組織構造を示している。C57BL6マウスには、1×106 のゼラチン/コンドロイチン硫酸ミクロスフェアを混合した、1×106の放射 線照射B16F10黒色腫細胞で皮下免疫を行った。このミクロスフェアは、中 に何も含まないもの(コントロール)(A,B)と、γ−IFN(C,D)また はGM−CSF(E,F)を含むものである。図2Gと図2Hは、それぞれ7日 目、12日目の、GM−CSFトランスフェクタントを示している。免疫部位に は、免疫化後7日(A,C,E)あるいは12日(B,D,F)に生検を実施し 、ヘマトキシリンとエオシンで染色した(倍率、×400)。 図3Aは、左側腹部に皮下免疫した,あるいはしないC57BL6マウスを示 している。皮下免疫に用いたのは、1×106の放射線照射B16F10黒色腫 細胞のみ(■)、1×106放射線照射B16FT黒色腫細胞+GM−CSFを 含む1×106のゼラチン/コンドロイチン硫酸ミクロスフェア(□)、1×1 06の放射線照射B16WT黒色腫細胞+GM−CSFを含まない1×106のゼ ラチン/コンドロイチン硫酸ミクロスフェア(●)、GM−CSFを含む1×1 06のゼラチン/コンドロイチン硫酸ミクロスフェア(B16−F10細胞は含 まない)(○)、またはマウスのGM−CSF遺伝子を形質導入した1×106 の放射線照射B16−F10黒色腫細胞(△)のいずれかである。2週間後、マ ウスの右側腹部に1×106の生のB16WT細胞を投与し、腫瘍の増殖を一週 間に2回評価した。 図3Bは、図3Aと同様の実験を示しているが、さらに次の免疫化群を用いて いる。1×106の放射線照射B16WT黒色腫細胞+γ−IFNを含む1×1 06のゼラチン/コンドロイチン硫酸ミクロスフェア(○)と、1mgの遊離GM −CSF(ミクロスフェアに取り込まれていない)と混合した1×106の放射 線照射B16WT黒色腫細胞(■)で、腫瘍細胞の注入の前に免疫している。そ れぞれのグループには10匹のマウスが含まれる。腫瘍の増殖を一週間に2回、 触診により評価した。 発明の詳細な説明 第1の一般的な態様として、本発明は、腫瘍抗原または特に病原体に関連する 抗原に対する、ヒトや他のほ乳類のような被験体の免疫反応を増強させる方法を 提供する。被験体の免疫反応の増強は、好ましくは、その被験体から得られた、 腫瘍細胞由来のような、抗原と、少なくとも一つの免疫増強剤とを放出制御ビヒ クル中に含む組成物を被験体へ投与することで行われる。代わりに、抗原はウィ ルスやウィルス断片のように、ウィルス由来であってもよい。好ましくは、免疫 増強剤はサイトカインである。出願人は理論に拘束されるわけではないが、サイ トカインはたとえば、おそらく主にTリンパ球が介在する、特定の免疫反応を誘 発する能力を腫瘍細胞に与える。好ましい態様として、ビヒクルは生物分解性で あり、抗原は放射線照射した、治療すべき被験体に由来する腫瘍細胞全体である 。 本発明の実施には必要でないが、種々のサイトカインの組合せは、腫瘍に対す る免疫の増強に非常に有利な、あるいは相乗的な効果を奏するかもしれない。そ れゆえ本発明はまた、放出制御ビヒクルが一つ以上の免疫増強剤を含みうること を規定する。たとえば、ビヒクルはインターロイキンあるいはインターフェロン のいずれかあるいはこれらの両方を含んでも良い。 免疫増強剤は、被験体に存在する、腫瘍またはウィルスのような病原体生物に 対する、被験体の免疫系の反応性を高める薬剤である。適当な免疫増強剤として は、宿主にとっては免疫原ではなくても、免疫系の細胞の活性を活性化させ、あ るいは高めることにより、免疫を増強させうる薬剤で、Tリンパ球、ナチュラル キラー細胞、リンフォカイン活性化キラー(LAK)細胞を挙げることができる 。”インターロイキン”として分類されるいくつかのサイトカインをコードする ものが、この免疫増強剤の範疇に含まれる。たとえば、インターロイキン1から インターロイキン12までが含まれる。必ずしも同じメカニズムで作用するわけ ではないがこの範疇に含まれるものに、インターフェロンがあり、また特にγイ ンターフェロン(γ−IFN)、腫瘍壊死因子(TNF)、そして顆粒球−マク ロファージ−コロニー剌激因子(GM−CSF)がある。 本発明の方法は、ここに記述される腫瘍細胞または病原体抗原の調製物を被験 体に導入することにより、腫瘍または病原体に対する被験体の免疫反応を増強す ることを含む。好ましい態様として、腫瘍の治療には、たとえば外科的切除、放 射線照射、化学療法、または他の適当な技術により腫瘍負荷を軽減した後に腫瘍 細胞が投与される。 免疫増強剤の標的伝達系として有用な放出制御ビヒクルは、コロイド分散系を 含む。コロイド分散系は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビー ズ、水中油型乳剤を含む脂質をベースとする系、ミセル、混合ミセル、およびリ ポソームを含む。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソー ムは、試験管内および生体内における伝達ビヒクルとして有用な人工膜小胞であ る。大きさに0.2−4.0μm の幅がある大きな単ラメラ小胞(LUV)は、 大きな高分子を含む緩衝水溶液を高率で封入できることが示されている。 リポソームの組成物は、通常、リン脂質、特に高温相転移リン脂質の組合せで あり、通常、ステロイド、とりわけコレステロールと組み合わせる。他のリン脂 質、あるいは他の脂質も利用できるかもしれない。リポソームの物理的性質はp H、イオン強度、2価の陽イオンの存在に左右される。 リポソーム生成において有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロー ル、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノール アミンといったホスファチジル化合物、スフィンゴリピド、セレブロシド、そし てガングリオシドが挙げられる。特に有用なのは、脂質部分が14−18個の炭 素原子、特に16−18個の炭素原子を含み、飽和されている、ジアシルホスフ ァチジルグリセロールである。例示的なリン脂質としては、卵のホスファチジル コリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファ チジルコリンが挙げられる。 リポソームの標的化は、解剖学的および機械論的要因に基づいて分類されてき た。解剖学的分類は、たとえば器官に特異的、細胞に特異的、および細胞小器官 に特異的、といった選択性のレベルに基づく。機械論的標的化は、受動的か能動 的かによって識別される。受動的標的化は、洞様毛細血管を含む器官における網 内細胞系(RES)の細胞へ分布するリポソームの生来の傾向を利用している。 一方、能動的標的化は、モノクローナル抗体、糖、グリコリピド、またはタンパ クといった特定のリガンドにリポソームを結合させることにより、あるいは自然 に起こる局在化の部位以外の器官や細胞タイプの標的に到達させるため、リポソ ームの組成や大きさを変えることにより、リポソームを変化させることを含む。 標的伝達系の表面は、様々な方法で修飾されうる。リポソームの標的伝達系の 場合、リポソーム二分子層と安定に会合している標的リガンドを維持するため、 脂質群をリポソームの脂質二分子層に取り込ませることができる。様々な結合基 が脂質鎖を標的リガンドに結合させるのに用いられる。 一般に、標的伝達系の表面に結合している化合物はリガンドとレセプターであ り、これにより標的伝達系は所望の細胞を発見し、そこに向かうであろう。リガ ンドは、レセプターのような他の化合物に結合する関心のある化合物のいずれで あってもよい。 一般に、特定のエフェクター分子に結合する表面膜タンパク質が、レセプター と呼ばれている。本発明においては、抗体は好ましいレセプターである。抗体は 、リポソームが、特定の細胞表面のリガンドを標的とするのに用いられる。たと えば、腫瘍細胞上に特異的に表現され、腫瘍関連抗原(TAA)と呼ばれるある 種の抗原は、リポソーム内に免疫増強剤を含む腫瘍細胞が、直接悪性腫瘍を標的 にする目的に利用できるだろう。標的伝達系は、非特異的リポソームの無作為的 注入よりも顕著な改良を提供する。いくつかの方法が、ポリクローナル抗体また はモノクローナル抗体のいずれかをリポソーム二分子層に共有結合させるのに用 いることができる。抗体標的リポソームは、モノクローナル抗体、またはポリク ローナル抗体、あるいはFabもしくはF(ab')2といったそれらの断片を、標的細 胞において抗原エピトープに効果的に結合する限り、包含することができる。リ ポソームはまた、ホルモンまたは他の血清因子のレセプターを表現している細胞 を標的にし得る。 本発明の組成物は、免疫増強剤と腫瘍細胞または他の抗原を含有する放出制御 ビヒクルを含み、注射または時間をかけた緩やかなかん流により、非経口投与す ることができる。腫瘍細胞は、単独またはエフェクター細胞と組み合わせて、静 脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮的に投与することができる。皮内また は皮下投与が好ましい。 非経口投与のための製剤は、”製剤学的に許容できる担体”内に含まれる。そ のような担体は、無菌の水性、あるいは非水性溶液、サスペンジョン、およびエ マルジョンを含む。非水性溶剤の例としては、プロピレングリコール、ポリエチ レングリコール、オリーブオイルなどのベジタブルオイル、およびオレイン酸エ チルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。水性担体は、水、アルコー ル性/水性溶液、エマルジョンまたはサスペンジョンを含み、塩類液と緩衝媒体 が挙げられる。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロ ース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液、あるいは固定油を 含む。静脈内ビヒクルは、液体と栄養補液、リンガーのデキストロースをベース とするような、電解質補液などを含む。たとえば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤 、そして不活性ガスなどの、保存剤および他の添加剤も含むことができる。 ビヒクル/抗原の投与の部位と様式に依り、この混合物は特定のサイトカイン を含むことができる。たとえば、ビヒクル/腫瘍細胞を腫瘍部位へ直接投与する 場合、TNFのような細胞を直接殺すサイトカインが最も効果的だろう。代わっ て、遠い部位に投与する場合、GM−CSFのようなサイトカイン、あるいは、 T細胞、顆粒球およびマクロファージのような一般に免疫細胞を増やすことがで きる他の分子が最も効果的だろう。当業者は、どの生物学的機能が求められてい るかによって、どのサイトカインを使うべきか確かめることが可能である。 好ましい態様として、本発明の放出制御ビヒクルは、本明細書で述べたように 生物分解性のミクロスフェアである。”マイクロカプセル”という用語は、コア セルベートのコーティングによって医薬として活性のある物質を封入したミクロ スフェアを意味する。本発明において特に有用なのは、コア−シェル型よりもむ しろマトリックス型である固体ミクロスフェアである。医薬として活性のある物 質が、タンパクのような荷電分子なら、その分子は、複合体コアセルベート工程 に参加して、その物質がミクロスフェアマトリックスに絡まるミクロスフェアを 形成する可能性がある。 本発明で使用されているとおり、”医薬として活性のある物質”という用語は 、ヒトと動物の両方を含む宿主に投与したとき、治療上有益で薬理学的な反応を 生ぜしめるどんな物質も包含する。所望であれば、一つ以上の医薬として活性の ある物質が、本発明の方法で用いられる医薬組成物に含まれるだろう。 医薬として活性のある物質は、分子複合体または医薬的に許容できる塩のよう な、様々な形態で本発明に用いることができる。そのような塩の代表的な例とし ては、コハク酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、ホウ酸 塩、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、サリチル酸塩、金属塩(たとえば、アル カリまたはアルカリ土類)、アンモニウム塩もしくはアミン塩(たとえば、第四 アンモニウム化合物)などが挙げられる。さらに、望ましい保持と放出の特性を 持つが、生体内においては容易に生理学的pHあるいは酵素により加水分解され る、エステル、アミド、エーテルといった活性物質の誘導体もまた、用いること ができる。 本明細書で用いられているとおり、”治療上効果的な量”という用語は、医薬 として活性のある物質の量が、所望の薬理学的効果を引き起こすのに十分な量と 活性があることを意味し、この薬理学的効果とは、本発明においては、腫瘍細胞 、ウィルス、または他の抗原に対する免疫反応の免疫増強のことである。この物 質の量は、特定の活性物質の効果、個々の宿主の年齢、体重、そして反応ならび に宿主の症状の性質および程度に応じても大きく変化する。それゆえ、この活性 物質の量には決定的な上限や下限はない。本発明において使用されるべき必要量 は、当業者によりたやすく決定される。 本明細書で医薬として活性のある物質に関して用いられているとおり、”放出 制御”という用語は、本組成物が活性物質の大部分を周囲の媒体へ放出するのに 、少なくとも1時間、たとえば、約1−24時間あるいはもっと長い時間が必要 であることを意味する。 本発明によれば、医薬として活性のある物質は、好ましくは架橋により強化さ れたコアセルベートに封入することができる。コアセルベートを形成するのに使 用してもよい成分は、陰イオン分子や陽イオン分子を含む。”陽イオン”分子ま たは”陰イオン”分子は、コアセルベーションの条件下で、正味の陽電荷または 陰電荷を帯びた分子を意味する。多くのこれらの分子は両性で酸性基と塩基性基 の両方を含む。一般のpH条件下で、これらの分子は陽イオンと陰イオンのどち らかになることができる。陽イオン分子は、アルブミン、コラーゲン、エラスチ ン、ゼラチン、およびグロブリンを含む。陰イオン分子は、コンドロイチン硫酸 、 デルマタン硫酸、ヘパリン、硫酸ヘパリン、ヒアルロン酸、硫酸ケラタン、ポリ ガラクツロン酸、およびポリグルクロン酸を含む。陽イオン分子と陰イオン分子 の選択は、本組成物の最終的または意図する用途に依存し、これらは高水準の生 体適合性をもつことが期待される。好ましくは、ゼラチンは、本発明において陽 イオン分子として用いられる。コラーゲンもまた、陽イオン分子として好ましい 。コンドロイチン硫酸は、好ましくは、陰イオン分子として用いられる。コンド ロイチン硫酸は、骨格および軟結合組織中に見られるムコ多糖類である。架橋は 、好ましくはグルタルアルデヒドのようなゼラチン硬膜剤を用いてなされる。エ ピクロロヒドリンとアクロレインもまた、架橋剤として用いられる。 典型的には、本発明のコアセルベートを製造するには、両タイプの成分を、あ らかじめ決められた混合条件の下で、水性媒体内で接触させる。この混合は、等 容量のゼラチン水溶液とコンドロイチン硫酸水溶液を用いると都合よく実行でき る。好ましくは、ゼラチンは約1%から約10%(w/vol)の濃度の水溶液に存在 する。コンドロイチン硫酸は、約0.05%から約2%(w/vol)の濃度の第二の 水溶液に存在する。これらの濃度範囲を外れると、コアセルベートの形成に悪影 響がでるようである。 コアセルベート形成で用いられるべき温度は、用いた特定の方法によりいくら か変化しうる。たとえば、周囲温度から約50℃までの温度が通常用いられる。 しかし、コアセルベートの大きさは、混合時の二つの成分の温度に影響を受けや すい。ゼラチン溶液の温度が高いほど、形成されるコアセルベートは小さくなる 。コアセルベート形成で用いられるべきpHもまた、かなり広い幅で変化しうる 。コアセルベートの収率と大きさはpHに影響を受ける。好ましくは、約3.5 から約6.5(後者の値はゼラチンの等電点に相当する)のpHが用いられる。 この二つの混合物のpHを決定する際には、ゼラチン溶液のpHが、コンドロイ チン溶液のそれに優先する。大きさと収率の両方に関して、最適の結果は約5. 0のpHで得られる。 所望の量の医薬として活性のある物質が、コアセルベートの形成に先立ってゼ ラチン溶液またはコンドロイチン硫酸溶液のいずれかに加えられる。もしその活 性物質が水溶性であれば、溶液になる。一方、その活性物質が水に不溶性であれ ば、エマルジョンかサスペンジョンになる。 ゼラチン溶液とコンドロイチン硫酸溶液を撹拌しながら混合するとき、反応媒 体内でコアセルベーションが起こり、ミクロスフェアのコアセルベートが生成す る。一般にコアセルベートミクロスフェアはあまりに壊れやすくて単離できない ので、コアセルベートの架橋が必要である。架橋は、好ましくは、コアセルベー トでコーティングし安定化させたミクロスフェアを含むサスペンジョンに、グル タルアルデヒドあるいは他のゼラチン硬化剤を加えることにより実行される。架 橋反応が完了した後、生じたミクロスフェアは、たとえばデカンテーション、濾 過、遠心分離といった慣用の手段により、反応媒体から回収される。このミクロ スフェアは洗浄され、たとえば凍結乾燥といった標準的な技術で乾燥される。 本発明の方法で用いられるコアセルベートでコーティングしたミクロスフェア は、好ましくは、球のサイズ(平均直径)が約0.5μmから約100μmで、医 薬として活性のある物質を約10%から40%(w/w)含む。言い換えると、乾 燥基準でミクロスフェア内の、コアセルベート(壁)に対する医薬として活性の ある物質の重量比は、好ましくは約1:9から約2:3である。コアセルベート でコーティングしたミクロスフェアをベースとする医薬組成物は、経口摂取、移 植、または皮膚もしくは粘膜への外用に利用できる。移植が望ましい場合、皮下 に移植したり、プロテーゼの一部を構成したり、あるいはヒトの体内腔へ挿入し たりすることができる。シリンジを用いた皮下への移植は、典型的には、インプ ラントを皮下組織へ直接注射することから成り、特に効果的な制御薬物伝達法で ある。この方法は、いくらかの危険に遭遇するかもしれない外科的手術の代用と みられている。たとえば本発明で得られたマイクロカプセルは、生理学的緩衝液 に懸濁させ、所望の部位へシリンジにより導入される。たとえば、サイトカイン を組み込んだ本組成物は、腫瘍領域へ注射できる。 体内の所望の部位へ所望のやり方で適用するとき、本発明の医薬組成物は、ミ クロスフェアのコアセルベート壁を通して医薬活性物質を拡散させることにより 、あるいは生体内で体液との接触によりコアセルベートを分解させることにより 、医薬として活性のある物質の放出を制御する。コアセルベートがその組成物が 伝達された部位(たとえば、組織)で分解できるなら、その分解の程度(すなわ ち、 活性物質の放出率)は、コアセルベートの架橋の程度により制御できる。 本発明で用いられるマイクロカプセル医薬組成物は、それが天然のものであれ 合成品であれ、人体に内在することがわかっている成分を主に前提としている。 したがって本発明は、一般に放出の制御された医薬組成物を製造する際に用いら れる量よりもかなり少ない量の非生物学的材料の使用ですむことを可能にしてい る。高い生体適合性の水準が、細胞毒性と免疫原性の不在下で反映している。 生物分解性の高分子ビーズ戦法を用いる事には、いくつかの潜在的利益がある 。第一に最も重要な事として、このアプローチは、サイトカインの個別化された 遺伝子移入の必要性を減ずる。個々の腫瘍細胞は、潜在的に放射線照射されてい て、注入の前にサイトカインビーズ製剤に混合させることができるので、その結 果、腫瘍細胞の培養と形質導入の必要性を未然に回避している。そしてまた、サ イトカインビーズ製剤の組成と大きさを変化させることにより、最大の生物学的 効果が達成されるよう、サイトカインの局所分泌の薬物速度論を調節することが できる。特に本研究に例示されているGM−CSFビーズの場合、明らかにGM −CSFそのものによって引き起こされた局所コラゲナーゼ活性の増加により、 生体内ではビーズがかなり速く分解した。ビーズ製剤の組成や大きさを変えれば 、より持続的にGM−薬物を放出させ、結果的に更に効果的に免疫化することに なるだろう。 特定の病原体関連抗原または腫瘍関連抗原のような精製された抗原を、完全な 分子として、あるいは、免疫原性ペプチドの形で、これらのポリマーに取り込ま せることも可能である。そのようなアプローチは、その関連抗原の固有の身元が 分かっていると高められる。たとえば、乳頭腫ウィルスまたはこのウィルス由来 の免疫原性抗原は、乳頭腫関連頚部癌の治療に有用であろう。このウィルスとウ ィルス性抗原は、単独または組合せで、本明細書で述べた伝達ビヒクルへ、単独 またはサイトカインと組み合わせて挿入されるだろう。 本発明の方法にしたがって用いられる、ビヒクル/抗原混合治療薬は、高分子 複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、またはビーズの形態をとって、合成ま たは天然のポリマーのような伝達系により、また、水中油型乳剤、ミセル、混合 ミセル、合成膜小胞、および再閉赤血球を含む、脂質をベースとする系により、 被験体へ投与できる。これらの系は、まとめて分散系として知られる。典型的に 、この系を含む粒子は、直径約20nm−50μm である。この粒子サイズでは、 粒子を製剤上の緩衝液に懸濁し、シリンジを用いて被験体へ導入することができ る。 分散系の製造に用いられる、アルブミン、エチルセルロース、カゼイン、ゼラ チン、レシチン、リン脂質、および大豆油のような材料は、典型的に、濾過滅菌 により滅菌されており、無毒性および生物分解性である。ポリマー分散系は、マ イクロカプセル化のコアセルベーションに似た工程で製造できる。所望であれば 、この分散系の密度は、比重を変えることにより変化させ、この分散を高圧また は低圧にすることができる。たとえば分散材料は、イオヘキソール、イオジキサ ノール、メトリザミド、スクロース、トレハロース、グルコース、あるいは他の 比重の高い生体適合性分子を加えると、より高圧になる。 本発明にしたがって用いることができる分散系の一つの型は、ポリマーマトリ ックス中でのサイトカインの分散からなる。この治療薬は、ポリマーマトリック スが、体から排出される可溶性産物へ分解され、あるいは生分解されるときに放 出される。いくつかの種類の合成ポリマーがこの目的のために研究されてきた。 それには次の物質が含まれる。ポリエステル(Pitt,et al.,生理活性物質の放 出制御、R.Baker 編集、Academic Press,New York,1980);ポリアミド(Sid man,et al.,Journal of Membrane Science,7:227,1979);ポリウレタン(M aser,et al.,Journal of Polymer Science,Polymer Symposium,66:259,197 9);ポリオルトエステル(Heller,et al.,Polymer Engineering Science,21 ;727,1981);そしてポリアンヒドライド(Leong,et al.,Biomaterials,7;3 64,1986)。PLAやPLA/PGAのポリエステルについて重要な研究がなさ れてきた。これらのポリマーは容易に入手できる。なぜなら、それらは生物分解 性の縫合糸として利用されてきたし、非毒性の乳酸とグリコール酸に分解するか らである(米国特許第4,578,384号、米国特許第4,765,973号 参照;参考のために組み入れる)。 塊重合、界面重合、溶液重合、開環重合(Odian,G.,重合の原理、第2版、J ohn Wiley & Sons,New York,1981)のような重合方法を用いて、固体ポリマー 分散系を合成できる。これらのどの方法を用いても、広範囲の機械的、化学的、 生物分解的性質を持つたくさんの異なった合成ポリマーが得られる。性質や特徴 の違いは、反応温度、反応物濃度、溶媒のタイプ、反応時間というパラメーター を変化させて制御される。所望であれば、固体ポリマー分散系をはじめに大きな 塊として生産し、それから小さく砕くことができる。あるいはそうでなく、適当 な生理学的緩衝液の中での分散を維持するのに十分な小さな粒子に加工すること もできる(たとえば、米国特許第 4,452,025号;米国特許第 4,389,330号;米国 特許第 4,696,258号参照。)。 生物分解性のスラブ、シリンダー、球体からの治療薬の放出機構は、Hopfenbe rg(放出が制御されているポリマー配合物,pp.26-32、Paul,D.R.and Harris ,F.W.,Eds.,American Chemical Society,Washington D.C.,1976)に記述 されている。主にマトリックスの分解により放出が制御されるこれらのデバイス からの、追加の放出を記述する簡単な表現は以下の通りである。 Mt/M=1−[1−k0t/C0a]n 式中、球体の場合n=3、シリンダーの場合n=2、スラブの場合n=1である 。記号aは、球体あるいはシリンダーの半径あるいはスラブの半分の厚みを表し ている。MtとMは、それぞれ、時間tと無限大における薬物放出量である。 本発明にしたがって用いることができるもう一つの分散系は、合成膜小胞であ る。”合成膜小胞”という用語は、単一の二分子層膜に結合した多数の非同心性 小室を持つ構造と同様、一般にリポソームとして知られている、一つかそれ以上 の同心小室を持つ構造を意味する。 リン脂質が水性媒体に分散したとき、それは膨張し、水和し、自然に、脂質二 分子層を分ける水性媒体の層を持つ、多層同心二分子層小胞を形成する。通常そ のような系は、多層リポソームまたは多層小胞(MLV)と呼ばれ、約100nm から約4μmの範囲にわたる直径を持つ。MLVが音波処理されると、約20nm から約50nmの範囲の直径を持つ、小さな単層小胞(SUV)が形成されるが、 これはこのSUVのコアーに水溶液を含む。 合成膜小胞の組成は、通常リン脂質の、特に相転移温度が高いリン脂質の組合 せであり、通常、ステロイド、特にコレストロールと組み合わせる。他のリン脂 質あるいは他の脂質もまた用いられる。 合成膜小胞の製造において有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロ ール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノー ルアミン、スフィンゴリピド、セレブロシド、ガングリオシドのような、ホスフ ァチジル化合物が挙げられる。特に有用なのは、脂質部分が14−18個の炭素 原子、とりわけ16−19個の炭素原子を含み、飽和されている、ジアシルホス ファチジルグリセロールである。例示的なリン脂質は、卵のホスファチジルコリ ン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジ ルコリンを含む。 治療薬を含む小胞を製造するに当たっては、薬物封入の高率、薬物の不安定性 、得られた小胞集団の均質性と大きさ、薬物対脂質の比率、製剤の透過性の不安 定性、その配合の製剤学的許容性、といった可変性を考慮すべきである。(Szoka ,et al.,Annual Reviews of Biophysics and Bioengineering,9:467,1980; Deamer,et al.,in Liposomes,Marcel Dekker,New York,1983,27; Hope,et al.,Chem.Phys.Lipids,40:89,1986)。 所望であれば、様々な程度の標的特異性を持つ、合成膜小胞を製造することが できる。小胞の標的化は、解剖学的そして機械論的な要因に基づいて分類されて きた。解剖学的分類は、たとえば、器官特異性、細胞特異性、そして細胞小器官 特異性のような選択性のレベルに基づいている。機械論的標的化はさらに、受動 的か能動的かにより区別される。受動的な標的化は、洞様毛細血管を含む器官に おいて、細網内皮系(RES)の細胞へ分布する小胞の生来の傾向を利用する。 一方、能動的な標的化は、モノクローナル抗体、糖、グリコリピド、またはタン パク質のような特異的なリガンドにその小胞を結合させることにより、あるいは 、自然に起こる局在化の部位以外の器官や細胞タイプの標的に到達させるために 小胞の組成や大きさを変えることにより、小胞を変化させることを含む。あるい はまた、小胞は、毛細血管床に物理的に局在化できる。 本発明にしたがって用いることができるもう一つの分散系は、再閉赤血球であ る。赤血球が低張媒体に懸濁されると、膨潤が起こり、細胞膜が破裂する。結果 として、細胞内と細胞外の環境を平衡化させる、直径約200−500Åの細孔 が形成される。この周囲媒体のイオン強度を等張状態に調整し、細胞を37℃で インキュベートすると、細孔は閉じ、赤血球は再閉する。この技術は、再閉赤血 球内へ治療薬を捉え込むのに利用できる。 以下の非限定的な例により、本発明をさらに説明する。 例1 GM−CSFの封入 この例において、以下の試薬と溶媒を用いた:ゼラチン(タイプA、60ブル ーム(bloom);Sigma,St.Louis,MO)、コンドロイチン4−硫酸(Sigma)、 グルタルアルデヒド(Sigma)、コラゲナーゼ(タイプVII;Sigma)、フルオレ セインイソチオシアネート(FITC;Sigma)、2,2'-アジノ-ジ-[3-エチルベンズ チオアゾリン-6-スルホン酸](ABTS; Bio-Rad,Hercules,CA)、および、羊赤 血球(Thomas D.Morris,Inc.,Philadelphia,PA)。 γ−IFNまたはGM−CSFミクロスフェアの形成:ゼラチン(ブタ、type A、60ブルーム)、コンドロイチン4−硫酸、アルブミン(ウシ)、およびグ ルタルアルデヒドをSigmaから購入した。ブルーム(bloom)数は、ゲルの 強度の表示である。ブルーム数が高いほど、ゲルは強い。タイプAは、酸で硬化 した組織から得られる。用いた試薬はすべて、分析グレードである。セントリコ ン(Centricon)10フィルターは、Amikon,USAから購入し た。5%ゼラチン溶液と蒸留水を調製し、37℃に保持した。凍結乾燥したγ− IFN1mgを、0.2%コンドロイチン硫酸の蒸留水溶液5mlに、室温にて溶解 させた。コアセルベーションは、ゼラチン溶液5mlを撹拌したコンドロイチン硫 酸溶液5mlにすばやく加えてなされた。ミクロスフェアの架橋は、25%グルタ ルアルデヒド溶液50μlをミクロスフェア懸濁液に加えてなされた。30分後 、6mlのエタノールアミン−HCl,pH8.0を添加して、架橋化反応を停止 し、ミクロスフェア上の余分なアルデヒド基を消失させた。次にミクロスフェア をPBSで洗浄し、遠心分離法で単離した。GM−CSFを入れたミクロスフェ アも、コンドロイチン硫酸溶液中のGM−CSF濃度を600μg/mlにするほか は同様の方法で調製した。ブランクミクロスフェアはサイトカインが不在であっ た他は、同じように調製した。 ミクロスフェアに封入されたGM−CSFの量は、封入化の前後で溶液を分析 することにより決定された。この分析は、ELISA(Genzyme)にしたがって 行われた。 例2 サイトカインを封入したミクロスフェアを用いた 生体内における腫瘍細胞の処理 γ−IFNあるいはGM−CSFを含む本発明のミクロスフェアが調製された 。これらのミクロスフェアは腫瘍細胞と組み合わせて、腫瘍ワクチンを接種した 動物に投与した。そしてこれらの動物の腫瘍の進行を検討した。このワクチン接 種計画は、GM−CSF遺伝子導入腫瘍ワクチンに匹敵する全身の抗腫瘍反応を 引き起こした。 腫瘍モデル; B16−F10黒色腫細胞を、10%ウシ胎児血清とペニシリ ン/ストレプトマイシンを含む、ダルベッコの改変イーグル培地に保持した。用 いた動物は、ジャクソン研究所(Jackson Laboratories)から得た、生後6−1 2週のC57BL6メスである。B16細胞には、MFGレトロウィルスのベク ターを用いて、GM−CSF遺伝子を導入した(Dranoff,st al.,supra)。マ ウスのGM−CSFの量は、FDCP−1(ATCC、Rockville、MD)細胞を 用いて生物検定で試験した。 ワクチン接種; 単層の培養腫瘍はトリプシン処理し、注射の前に、血清を含 む培地中で一回洗浄し、HBSS中で二回洗浄した。腫瘍細胞には、毎分132 ラドを放出する137Cs線源から5000ラドの放射線を照射した。 組織構造; 組織学的実験のための腫瘍は、10%エチル緩衝ホルマリン中に 固定し、パラフィンで包埋し、そしてヘモトキシリンとエオシンで染色した。 マウスの腫瘍モデルを用いた実験の検討から、遺伝子導入によってある種のサ イトカインを分泌させるように作られた腫瘍ワクチンを用いて、強い全身性の免 疫を引き起こすことができることが示された。これらの戦略の背景にある根元的 な生理学的原理は、腫瘍部位における高い投与量のサイトカインの持続的な放出 を含む。いくつかのケースにおいて、このパラクリンアプローチが、腫瘍抗原提 示力を高め、全身性のサイトカイン毒性を回避できることがわかっている。サイ トカイン遺伝子を形質導入した自己由来の腫瘍ワクチンを、広く一般に臨床的に 使用することは、個別的に扱われる遺伝子導入の、技術的な困難性と労働の強さ により、制約されるだろう。ここに述べた例においては、細胞の大きさのゼラチ ン−コンドロイチン硫酸ミクロスフェア内に封入された高い投与量のGM−CS Fを、皮下注射の前に放射線照射腫瘍細胞と混合した。このワクチン接種計画は 、GM−CSF遺伝子を形質導入した腫瘍ワクチンに匹敵する全身性の抗腫瘍免 疫反応を引き起こした。 検討のため、3つの異なるタイプのミクロスフェアを調製した:1)サイトカ インを含まない対照ミクロスフェア;2)GM−CSFを含むミクロスフェア; そして3)γ−インターフェロンを含むミクロスフェア。ワクチン接種は、1ml のHBSS内で、1×106のビーズを1×106の腫瘍細胞と混合することによ りなされ、混合後直ちに注射した。B16−F10マウス黒色腫モデルを用いた 。これは、C57BL6マウス系に発生し進行することができる、マウス黒色腫 である。このモデルは、放射線照射した野生型の細胞をワクチン接種しても、離 れた部位に注入した生の野生型腫瘍細胞での抗原投与に対し保護的免疫性が比較 的わずかしか起こらなかった、不十分な免疫原性腫瘍を説明する。このモデルを 用いた先の分析によると、GM−CSFをコードする遺伝子を形質導入したB1 6−F10細胞は、野生型の腫瘍細胞での抗原投与に対し、強い全身性の免疫性 を引き起こすことが示されている。これに対し、γ−IFNのような、他のほと んどのサイトカイン遺伝子を形質導入したB16−F10細胞は、野生型の腫瘍 での抗原投与に対し、高い全身性の免疫反応を引き起こさない(Dranoff,et al .,Proc.Natl',Acad.Sci.U.S.A.90:3539,1993)。 図2は、ゼラチン/コンドロイチン硫酸ビーズと混合したB16F10黒色腫 による免疫化部位の組織構造を示している。C57BL6マウスには、1×106 のゼラチン/コンドロイチン硫酸ミクロスフェアと混合した、1×106の放射 線照射したB16−F10黒色腫細胞で、皮下免疫した。このミクロスフェアは 、サイトカインを含まないもの(対照)(A、B)、γ−IFNを含むもの(C ,D)、あるいはGM−CSFを含むもの(E,F)である。図2Gおよび図2 Hは、それぞれ7日目、12日目のGM−CSFトランスフェクタントを示して いる。免疫化後7日目(A,C,E)、あるいは12日目(B,D,F)におい てその部位に生検を実施し、ヘモトキシリンとエオシンで染色した(倍率×40 0)。 ワクチン部位の組織学的分析は、異なるビーズ製剤間に著しい違いがある事を 明らかにし、これは放出されたサイトカインの生体内における生物活性が異なる ことを示している(図2)。対照ビーズ(取り込まれたサイトカインを含んでい ないもの)を用いたとき、注入後7日目に非常に多くの腫瘍細胞が存在し、有り 余るほどの数のミクロスフェアをまき散らしていた。このミクロスフェアは、大 きさが様々で、好酸球様の球体であり、組織の中で遊離しているようである。腫 瘍とミクロスフェアがまき散らされ、炎症性浸潤が見られ、これは主としてリン パ球から成るが、非常に多くの好酸球と単球/マクロファージをも含む。注入後 12日目には、非常に多くのミクロスフェアが依然として存在し、腫瘍細胞はほ とんど無い(図2B)。炎症性浸潤は存続しているが、炎症反応はリンパ球の数 の減少に伴いいくらか低下した。 γ−インターフェロンのミクロスフェアをワクチン部位に用いたとき、注入後 7日目に、腫瘍細胞とビーズの両方が非常に多かった(図2C)。ミクロスフェ アのほとんどが組織内で遊離しているようであるが、一方、まき散らされたミク ロスフェアがマクロファージの細胞質内に存在した。炎症性浸潤が存在したが、 それはGM−CSFビーズ製剤で見られるよりも弱く、まだらなものだった(下 文参照)。炎症性浸潤の中で優勢な細胞型は、好酸球だった。注入後12日目に は、非常に多くのミクロスフェアが存続しており、腫瘍細胞の数はほとんど無く 、炎症性浸潤はゆるやかであった(図2D)。 GM−CSFミクロスフェアについては、注入後7日目には、腫瘍細胞は存在 したが、まれに小さなミクロスフェアの残片が見られるだけだった(図2E)。 強い炎症性浸潤は腫瘍細胞と混ざっており、いくらか数の少ないリンパ球と共に 、非常に多くの好酸球と単球/マクロファージから成っていた。注入後12日目 には、ミクロスフェアは全く見当たらず、腫瘍細胞もほとんど無かった(図2F )。中程度の適度な炎症性浸潤は存続していた。GM−CSFが取り込まれたと き生体内で見られる、ミクロスフェア分解のかなり速い速度は、初めにビーズか ら放出されたGM−CSFが、炎症細胞(おそらく顆粒球と単球/マクロファー ジ)を剌激し活性化するフィードフォワードプロセスを示している。この炎症細 胞は、ひいては、コラーゲン/コンドロイチン硫酸ミクロスフェアマトリックス をより 早く分解することができる細胞外酵素を生産する。このより早い分解は、局部的 GM−CSF伝達率を高め、それゆえこの過程を増幅させる結果となる可能性が 高い。 このミクロスフェア製剤によるGM−CSFの局部的放出が、全身性の抗腫瘍 免疫を高める結果になるかどうかを決定するために、ワクチン接種した動物の反 対の側腹部に、接種後2週間後に、1×106の生の野生型B16黒色腫細胞を 投与した。図3Aは、左側腹部に皮下免疫していない、あるいは以下のもので皮 下免疫した、C57BL6マウスを示している。1×106の放射線照射したB 16−F10黒色腫細胞のみ(■)、1×106の放射線照射したB16−F1 0黒色腫細胞+GM−CSFを含む1×106のゼラチン/コンドロイチン硫酸 ミクロスフェア(□)、1×106の放射線照射したB16WT黒色腫細胞+G M−CSFを含まない1×106のゼラチン/コンドロイチン硫酸ミクロスフェ ア(●)、GM−CSFを含む1×106のゼラチン/コンドロイチン硫酸ミク ロスフェア(B16−F10細胞は含まない)(○)、あるいは、1×106の 放射線照射したB16−F10黒色腫細胞でマウスのGM−CSF遺伝子を形質 導入したもの(△)。マウスの右側腹部に、接種後2週間後に、1×106の生 のB16WT細胞を投与し、腫瘍の増殖を1週間に2回評価した。 図3Bは、図3Aと同様の実験を示しているが、さらに次の免疫化群を用いて いる。1×106の放射線照射B16WT黒色腫細胞+γ−IFNを含む1×1 06のゼラチン/コンドロイチン硫酸ミクロスフェア(○)と、1mgの遊離GM −CSF(ミクロスフェアに取り込まれていない)と混合した1×106の放射 線照射B16WT黒色腫細胞(■)で、腫瘍細胞注入の前に免疫している。それ ぞれのグループには10匹のマウスが含まれる。腫瘍の増殖を一週間に2回、触 診により評価した。 図3は、B16−F10腫瘍細胞に混合したGM−CSFミクロスフェア製剤 が、野生型腫瘍細胞での抗原投与に対し比較できる全身性の免疫を引き起こすこ とを示している。この効果には、GM−CSFを含むミクロスフェアと腫瘍細胞 の両方の存在が必要であった。腫瘍細胞が不在の(図3A;○)、あるいは腫瘍 細胞とは異なる部位での、GM−CSFを含むミクロスフェアによる免疫化では 、 抗腫瘍免疫反応を引き起こさなかった。さらに、γ−インターフェロンを含むミ クロスフェアに混合した腫瘍細胞による免疫化では(図3B;○)、有意な全身 性保護反応を引き起こすことができなかった。それゆえ、サイトカイン効果の特 異性は、ミクロスフェア放出製剤と直接形質導入した腫瘍細胞とで似ていること が分かる。興味深いことに、放射線照射した腫瘍細胞とブランクミクロスフェア (サイトカインが取り込まれていない)の混合物は、一定の全身性抗腫瘍反応を 引き起こし、それはGM−CSFが取り込まれているときよりも有意に小さいが 、バックグラウンドより大きかった。最後に、放射線照射した腫瘍細胞を高い投 与量の遊離GM−CSF(ミクロスフェアに取り込まれていない)に混合すると 、有意な全身性保護反応は見られなかった(図3B;■)。これらの結果は、生 物分解性のミクロスフェアに取り込まれることで供給される、局部での持続的な GM−CSFの放出の重要性を示している。 これらの結果は、封入されたサイトカインを含む生物分解性のミクロスフェア が、腫瘍ワクチンの開発において、パラクリンなサイトカイン伝達の戦法として 利用できることを証明している。 本発明は十分に記述されているが、当業者の一人にとって、本発明の精神と範 囲から離れることなく、本発明の多数の変更と修正が可能であることは明らかで あろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI A61K 47/44 9051−4C A61K 37/02 ABD 51/00 ABH 9051−4C 37/66 AEDG (72)発明者 アザリ,ローザ イスラエル国 20142 グラッシュ セゲ ヴ,ユヴァリウム ディー.エヌ.ミスガ フ (番地なし) (72)発明者 レング,カム ダブリュ. アメリカ合衆国 21042 メリーランド州 エリコット シティー,ブレコンシャー ロード 10242番地 (72)発明者 ゴランベック,ポール アメリカ合衆国 21218 メリーランド州 バルチモア,エラースリー アベニュー 3728番地 (72)発明者 ジャフィー,エリザベス アメリカ合衆国 21093 メリーランド州 ルサーヴィル,サマー フィールズ コ ート 20番地 (72)発明者 レヴィツキー,ヤム アメリカ合衆国 21117 メリーランド州 オーイングズ ミルズ,ウォーターズポ ート コート 12624番地 (72)発明者 ラゼンビー,オードリー アメリカ合衆国 21218 メリーランド州 バルチモア,サウスビュー ロード 1212番地

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. 被験体における抗原に対する全身性免疫反応を剌激する方法であって、次 の工程: a) 免疫増強剤と抗原を含む放出制御ビヒクルを含む組成物を製造 し、そして b) 工程a)による組成物を被験体へ投与する を含む前記の方法。 2. 抗原が腫瘍抗原または腫瘍細胞である、請求項1記載の方法。 3. 腫瘍抗原または腫瘍細胞が被験体に由来する、請求項1記載の方法。 4. 放出制御ビヒクルが生物分解性である、請求項1記載の方法。 5. 被験体が哺乳動物である、請求項1記載の方法。 6. 哺乳動物がヒトである、請求項5記載の方法。 7. 免疫増強剤がサイトカインである、請求項1の方法。 8. サイトカインが、腫瘍壊死因子、GM−CSF,インターロイキン、およ びインターフェロンから成る群から選択される、請求項7記載の方法。 9. インターフェロンがガンマインターフェロンである、請求項8記載の方法 。 10.腫瘍細胞が、黒色腫、腺癌、白血病、リンパ腫、および肉腫から成る群か ら選択される、請求項2記載の方法。 11.被験体における腫瘍細胞の数を、組成物をその被験体へ投与する前に減ら す、請求項3記載の方法。 12.腫瘍細胞の減少法が、化学療法、放射線照射、および外科的切除から成る 群から選択される、請求項11記載の方法。 13.ビヒクルが、アルブミン、エチルセルロース、カゼイン、ゼラチン、レシ チン、リン脂質、および大豆油、およびこれらの混合物から成る群から選択され る生物分解性の物質を含む、請求項4記載の方法。 14.抗原がウィルスまたはウィルス抗原である、請求項1記載の方法。 15.ウィルスが乳頭腫ウィルスである、請求項14記載の方法。 16.製剤学的に許容できる担体中に免疫増強剤と抗原を含む放出制御ビヒクル を含む医薬組成物。 17.抗原が腫瘍抗原または腫瘍細胞である、請求項16記載の医薬組成物。 18.腫瘍抗原または腫瘍細胞が、その組成物で治療される被験体に由来する、 請求項17記載の医薬組成物。 19.免疫増強剤がサイトカインである、請求項16記載の医薬組成物。 20.サイトカインが、腫瘍壊死因子、GM−CSF、インターロイキン、およ びインターフェロンから成る群から選択される、請求項19記載の医薬組成物。 21.腫瘍細胞が、黒色腫、腺癌、白血病、リンパ腫、および肉腫から成る群か ら選択される、請求項17記載の医薬組成物。 22.ビヒクルが生物分解性である、請求項16記載の医薬組成物。 23.ビヒクルが、アルブミン、エチルセルロース、カゼイン、ゼラチン、レシ チン、リン脂質、および大豆油、およびこれらの混合物から成る群から選択され る生物分解性の物質を含む、請求項22記載の医薬組成物。 24.抗原がウィルスまたはウィルス抗原である、請求項16記載の医薬組成物 。 25.ウィルスが乳頭腫ウィルスである、請求項24記載の医薬組成物。
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