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Technisches Gebiet der
Erfindung
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Die Erfindung betrifft verbesserte
Immunisierungsverfahren für
Säuger
zum Erreichen zellvermittelter und humoraler Immunreaktionen.
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Stand der Technik
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Nach Immunisierung kann Plasmid-DNA,
die für
Gene für
virale und bakterielle Antigene kodiert, die Synthese der Antigene
in einer nativen Form steuern und sie dem Immunsystem effizient
präsentieren.
Beispielsweise wurden durch Impfung mit HIV-1-DNA starke humorale
und zellvermittelte Immunreaktionen in Nagern und nicht-humanen Primaten
induziert [1, 2]. Die Plasmide werden üblicherweise als Bolusinjektionen
in den Muskel oder mittels einer Genkanone verabreicht.
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Jüngere
Entdeckungen bei Nagermodellen, daß Immunisierung mit DNA Immunreaktionen
gegen virale Proteine auslösen
und protektive Immunität
gegen Infektion durch das Virus vermitteln kann, haben zu einem
starken Interesse geführt,
diese Strategie zur Entwicklung von HIV-Impfstoffen zu optimieren [3–5]. Frühere Generationen
von HIV-Impfstoffen, die auf rekombinanten Antigenen oder Antigenen
abgetöteter
Viren beruhen, die mit einem Adjuvans formuliert wurden, konnten
keine effizienten CTL-Reaktionen hervorrufen. Eine Immunisierung mit
DNA bietet den Vorteil, daß das
Antigen in seiner nativen Form exprimiert wird, die zu einer optimalen Prozessierung
und Präsentation
für die
antigen-präsentierenden
Zellen zur Induktion sowohl humoraler als auch zellulärer Immunreaktionen
führen
kann.
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Obwohl Vacciniavektoren effiziente
Mittel sind, um fremde Gene in vivo zu applizieren, bleiben Bedenken
hinsichtlich der Sicherheit dieser Vektoren bestehen. Obwohl umfangreiche
und elegante Untersuchungen durchgeführt werden, um sicherere Virusvektoren
zu konstruieren, werden zunehmend nicht-virale Vektoren als Alternative
vorgeschlagen. An erster Stelle für die HIV-Impfung stehen hierbei die direkte Injektion
der Plasmid-DNA
in das Muskel- oder Hautgewebe und der Beschuß mit DNA-beschichteten Goldpartikeln
unter hohem Druck mit einer Genkanone. Leider ist die Transfektionseffizienz üblicherweise
gering. Es besteht daher auf diesem Gebiet ein Bedarf an Verfahren
zur Applikation von DNA, die zu einer besseren Immunreaktion führen.
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Die Verwendung von Zytokinen zur
Förderung
einer Immunreaktion auf Impfstoffe hat große Aufmerksamkeit erregt, insbesondere
auf dem Gebiet der Immuntherapie von Krebs. Ein Ansatz besteht darin,
Zytokingene direkt in die Tumorzellen einzubringen [6–23]. Die
Zytokine fördern
entweder die Präsentation
von Antigenen für
T-Zellen oder sie liefern zusätzliche
co-stimulierende Signale für
die Aktivierung von T-Zellen. In vielen Fällen lösen die lokal sekretierten
Zytokine eine entzündliche
Reaktion aus, die zur Abstoßung
der injizierten Tumorzellen führt.
In einigen Fällen
können
diese genetisch veränderten
Tumorzellen eine systemische Immunität gegen eine nachfolgende Challenge
parentaler Tumorzellen und gelegentlich sogar gegen etablierte Mikrometastasen
erzeugen.
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Es wurde gefunden, daß GM-CSF
und TNF-α mit
IL-12 synergistisch wirken, indem sie die Induktion von zytotoxischen
T-Lymphozyten gegen HIV-I-MN-Impfstoff-Konstrukte fördern [1]. Bei einer getrennten
Untersuchung führte
eine gemeinsame Applikation von IL-12 mit HIV-1-Impfstoffen bei Mäusen zu Splenomegalie und verminderter humoraler Reaktion,
während
GM-CSF die gegenteilige Wirkung hat [24]. Beide Zytokine stimulierten
antigenspezifische T-Zellreaktionen, wobei bei der gemeinsamen Applikation
mit IL-12 eine dramatische Zunahme der CTL-Reaktion beobachtet wurde.
Es besteht auf diesem Gebiet ein Bedarf an weiteren Verfahren, mit
denen Säugern
Zytokine appliziert werden können,
um Immunreaktionen zu stimulieren.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Eine Aufgabe der Erfindung ist es,
feste Mikrokügelchen
zur Immunisierung von Säugern
bereitzustellen.
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Eine weitere Aufgabe der Erfindung
ist es, ein Verfahren zur Herstellung fester Mikrokügelchen zur
Immunisierung von Säugern
bereitzustellen.
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Eine Aufgabe der Erfindung ist es,
ein Medikament zur Immunisierung von Säugern mit festen Mikrokügelchen
bereitzustellen.
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Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden
gelöst,
indem ein festes Mikrokügelchen
zur Verwendung im Zusammenhang mit einer genetischen Immunisierung
eines Säugers
bereitgestellt wird. Das Mikrokügelchen
umfaßt
ein Koazervat aus einem polymeren Kation und einem Polyanion; das polymere
Kation kann beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend
aus Gelatine und Chitosan. Das Zytokin ist in dem Mikrokügelchen
eingebettet.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
Erfindung wird ein Medikament zur Immunisierung eines Säugers bereitgestellt,
um eine Immunreaktion gegen ein Antigen auszulösen. Das Medikament umfaßt:
eine
Nukleinsäure,
die für
ein Antigen kodiert, und ein festes Mikrokügelchen. Das Mikrokügelchen
umfaßt üblicherweise
ein Koazervat aus einem polymeren Kation, wie Gelatine oder Chitosan,
und einem Polyanion. Das Mikrokügelchen
bettet das Zytokin ein.
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In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren zur Bildung fester Mikrokügelchen
zur Immunisierung eines Säugers
bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt den Schritt:
Bilden
fester Mikrokügelchen
durch Koazervation eines Polyanions und eines polymeren Kations,
wobei das polymere Kation ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Chitosan und Gelatine, wobei die
Koazervation in Gegenwart eines Zytokins erfolgt, wodurch das Zytokin
in die festen Mikrokügelchen
eingebettet wird.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1.
Proliferation von CT-4S-Zellen als Reaktion auf mittels Mikrokügelchen
appliziertes IL-4. DNA-Gelatine-Mikrokügelchen
wurden mit verschiedenen Beladungsmengen von murinem IL-4 (bezeichnet
mit 0, 100 und 1000 U, die der Koazervationsreaktion zugegeben wurden)
hergestellt, wurden anschließend
gereinigt und mit CT-4S-Zellen inkubiert. 30 Stunden nach der Zugabe
der Mikrokügelchen
wurden die Zellen mit 3H-Thymidin markiert, dann
wurde 18 Stunden später
die mit den Zellen assoziierte Radioaktivität gemessen. Die Dosis an Mikrokügelchen
ist als Gesamtmenge DNA angegeben. Datenpunkte sind Mittelwerte
von drei Versuchen ± SD.
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3.
Anti-βGal-Antikörper-Reaktion
in Mäusen,
denen IL-4 eingebettet in Mikrokügelchen oder
in freier Form injiziert wurde. Gruppen von 4 Mäusen wurden i.m. Mikrokügelchen,
die mit 20 U freiem IL-4 vermischt waren, Mikrokügelchen, in die 20 U IL-4 pro
1 mg p43-clacZ-DNA eingebettet waren, DNA oder mit 20 U freiem IL-4
vermischte DNA injiziert. Jede Gruppe wurde zweimal in Abständen von
vier Wochen mit insgesamt 1 mg DNA geimpft. In Woche 8 wurden die
Seren der einzelnen Gruppen gepoolt und dann auf die Gesamtmenge
an Anti-βGal-IgG-Antikörpern getestet.
Die Daten sind Mittelwerte von drei Versuchen ± SD.
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4.
Potenzierung von CTL-Reaktionen bei Verwendung von in Mikrokügelchen
eingebettetem IL-2 und γ-IFN.
Gruppen von 4 Mäusen
wurden einmal i.m. 2 mg Gesamtmenge p43-clacZ-DNA entweder in Form
von Mikrokügelchen,
Mikrokügelchen, in
die IL-2 (20 U pro 1 mg p43-clacZ-DNA) eingebettet war, Mikrokügelchen,
in die IL-2 und γ-IFN
(100 U pro 1 mg p43-clacZ-DNA) eingebettet waren, oder "nackte" DNA injiziert. Standard-CTL-Assays
wurden in Woche 4 durchgeführt.
Die Daten sind Mittelwerte ± SD.
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5.
Antigenspezifische zytosolische Reaktion, wenn nackte DNA zur Immunisierung
der Tiere mit oder ohne Mikrokügelchen,
in die GM-CSF eingebettet war, verwendet wurde.
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6.
Das für
p815A kodierende Gen wurde intradermal mit oder ohne GM-CSF in Mäuse injiziert. Es
wird die antigenspezifische CTL jeder einzelnen Maus gezeigt. In 6a wurden nicht gleichzeitig Zytokin-Mikrokügelchen
verabreicht.
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Ausführliche
Beschreibung
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Die Offenbarung der früheren US-Patentanmeldungen
mit den Seriennumern 08/265 966 und 08/657 913.
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Die Erfinder haben gefunden, daß Mikrokügelchen-Formulierungen mit
kontrollierter Freisetzung von Zytokinen tagelang einen hohen lokalen
Zytokinspiegel an der Impfstelle aufrechterhalten können, was
co-stimulierende
Signale für
infiltrierende Lymphozyten liefert. Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung
umfaßt
daher eine DNA, die für
ein Antigen kodiert, und ein in Mikrokügelchen eingebettetes Zytokin.
Die beiden Komponenten können
zusammen in einer einzigen Formulierung oder getrennt verabreicht
werden. Die DNA kann in jeder beliebigen Form vorliegen, eingebettet
oder nackt, komplexiert oder frei. Die DNA kann sich in den Mikrokügelchen befinden,
die die Zytokine liefern.
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Gemäß einer Ausführungsform
der Erfindung können
Mikrokügelchen
durch salzinduzierte komplexe Koazervation eines Polyanions, wie
Chondroitinsulfat oder Nukleinsäuren,
mit einem Polykation, wie Gelatine oder Chitosan, hergestellt werden. Auch
andere Zusammensetzungen für
die Mikrokügelchen
sind möglich,
solange eine kontrollierte Freisetzung erfolgt. Zytokine werden
in die Mikrokügelchen
eingebettet, um die Effizienz der genetischen Impfung zu verbessern
und eine gewünschte
Immunreaktion zu erzeugen. Die grundlegende durch den Impfstoff
ausgelöste
Immunreaktion wird durch die Wechselwirkung zwischen den spezifischen
und unspezifischen Immunmechanismen beeinflußt. Der Typ von Immunzellen,
der zur Impfstelle gezogen wird, kann beispielsweise die letztendliche
Antitumor-Immunität
bestimmen, die durch ein tumor-assoziiertes Antigen induziert wird.
Das Repertoire dieser Zellen wird umgekehrt durch die zeitliche
und räumliche
Verteilung von Zytokinen bestimmt. Durch Einbetten der Zytokingene
in die Mikrokügelchen
kann die zeitliche und räumliche
Verteilung der Zytokine weiter verändert werden. Dies kann die
Immunreaktion in Richtung eines spezifischen Immunarms lenken, beispielsweie
den Th1- oder den Th2-Weg.
Diese Strategie kann beispielsweise verwendet werden, um die Immunreaktion
gegen HIV-Infektion durch Betonen des humoralen oder des zellulären Arms
zu modulieren.
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Obwohl man jedes Zytokin verwenden
kann, das sich auf humorale oder zellvermittelte Immunreaktionen
auswirkt, ist GM-CSF ein besonders bevorzugt verwendetes Zytokin.
GM-CSF wurde als ein kritischer Faktor bei der Induktion der Differenzierung primitiver
hämatopoetischer
Vorläufer
zu Dendritenzellen identifiziert. In vitro benötigt diese Differenzierung
wenigstens sechs Tage Kultivierung in Gegenwart von GM-CSF. Bei
Verabreichung als Bolusinjektion in den Muskel haben jedoch frühere Untersuchungen
an Tumorimpfstoffen gezeigt daß die
Zytokine innerhalb von Stunden von der Injektionsstelle verschwinden.
Eine kontrolliert freisetzende Formulierung mit Mikrokügelchen
kann tagelang einen hohen lokalen Zytokinspiegel an der Impfstelle
aufrechterhalten, was co-stimulierende Signale für infiltrierende Lymphozyten
liefert. Es wurde gefunden, daß GM-CSF
und TNF-α mit
IL-12 synergistisch wirken, indem sie die Induktion von zytotoxischen T-Lymphozyten
gegen HIV-I-MN-Impfstoff-Konstrukte
verbessern. Bei einer getrennten Untersuchung führte eine gemeinsame Applikation
von IL-12 mit HIV-1-Impfstoffen
bei Mäusen
zu Splenomegalie und verminderter humoraler Reaktion, während GM-CSF die
gegenteilige Wirkung hat. Beide Zytokine stimulierten antigenspezifische
T-Zellreaktionen, wobei bei der gemeinsamen Applikation mit IL-12
eine Zunahme der CTL-Reaktion
beobachtet wurde.
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Um die rezeptorvermittelte Endozytose
zu stimulieren und um möglicherweise
zielgerichtet eine Zelle/ein Gewebe anzusteuern (Targeting), können Liganden
mit den Mikrokügelchen
konjugiert werden. Lysosomolytische Mittel können inkorporiert werden, um
das Entweichen von Zytokinen oder von DNA in das Zytoplasma zu fördern. Andere
bioaktive Agenzien wie RNA, Oligonukleotide, Proteine oder zahlreiche
Plasmide können
gleichzeitig eingebettet werden. Wichtig für die Applikation des Impfstoffs
ist, daß das
Proteinantigen auch in das Mikrokügelchen eingebettet sein kann,
um die Immunreaktion durch Klasse II-Präsentation und, wie durch neuere
Entdeckungen nahegelegt wird, auch durch Klasse I-Präsentation,
wenn das Mikrokügelchen
durch Antigenpräsentierende
Zellen internalisiert wird, potentiell zu verstärken.
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Die Bioverfügbarkeit der verabreichten
Nukleinsäuren
läßt sich
durch Targeting der Nukleinsäuren
zum endolysosomalen Weg verbessern. Dies kann beispielsweise durch
LAMP-Targeting erfolgen. Das prälysosomale/lysosomale
Lokalisierungssignal der LAMP (Lysosome-Associated Membrane Proteins)-Familie
lysosomaler Membranproteine kann die Immunreaktion gegenüber dem
Antigen deutlich verbessern. Die LAMP-Moleküle sind Typ 1-Transmembranproteine,
die eine Transmembrandomäne
von 24 Aminosäuren
und einen zytoplasmatischen Schwanz mit 11 Aminosäuren mit
einer carboxyterminalen YQTI-Sequenz enthalten, die notwendig und
ausreichend ist, um rekombinante Proteine auf einem vesikulären Weg
gezielt zu Lysosomen zu steuern. Mehrere Untersuchungen haben gezeigt,
daß LAMP-Proteine
gemeinsam mit MHC-Molekülen
der Klasse II in prälysosomalen
Kompartimenten lokalisiert sind. Eine chimäre DNA, die für ein Antigenprotein
mit einem Targeting-Signal für
den MHC II-Prozessierungsweg kodiert, kann dazu verwendet werden,
die Präsentation
des Antigens für
CD4+-T-Helferzellen zu
verbessern.
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Die erfindungsgemäßen Mikrokügelchen sind in Plasmaelektrolyten
stabil und können
ohne Verlust an Bioaktivität
lyophilisiert werden. Daher können
die Mikrokügelchen,
was Herstellung, Reproduzierbarkeit und Aufbewahrung betrifft, eher
wie herkömmliche pharmazeutische
Formulierungen gehandhabt werden. Die Geschwindigkeit und die Dauer
der Zytokinapplikation lassen sich variieren, indem man die Eigenschaften
der Mikrokügelchen
verändert.
Zahlreiche Zytokine lassen sich ohne weiteres verwenden, und das
Verhältnis
von Tumorantigen zu Zytokin kann leicht verändert werden.
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Komplexe Koazervation ist ein Prozess spontaner
Phasentrennung, der auftritt, wenn zwei entgegengesetzt geladene
Polyelektrolyten in wäßriger Lösung gemischt
werden. Die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den beiden
Makromolekülspezien
führt zur
Trennung eines Koazervats (polymerreiche Phase) vom Überstand
(polymerarme Phase). Dieses Phänomen
kann zur Bildung von Mikrokügelchen
und zur Einbettung zahlreicher verschiedenartiger Verbindungen verwendet
werden. Der Einbettungsprozess kann vollständig in wäßriger Lösung und bei niedrigen Temperaturen
erfolgen, und daher bestehen gute Aussichten, daß die Bioaktivität der eingebetteten
Substanz erhalten bleibt.
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Erfindungsgemäß wird Gelatine oder ein anderes
polymeres Kation mit einer ähnlichen
Ladungsdichte wie Gelatine verwendet, um mit einem Polyanion unter
Bildung von Mikrokügelchen
zu komplexieren. Solche polymeren Kationen umfassen, ohne darauf
beschränkt
zu sein, Gelatine und Chitosan. Die Quelle der Gelatine wird für unkritisch
gehalten; sie kann von Rind, Schwein, Mensch oder aus einer anderen
tierischen Quelle stammen. Üblicherweise besitzt
das polymere Kation ein Molekulargewicht von 19000-30000. Poly-L-Lysin
oder Chitosan eignen sich besonders als polymeres Kation der vorliegenden
Erfindung. Polyaminosäuren,
synthetisch oder natürlich
vorkommend, wie Polylysin, Polylysin-Polyarginin, Polyarginin, Protamin,
Spermin, Spermidin etc., können
ebenfalls verwendet werden. Auch Polysaccharide können verwendet
werden. Zweckmäßig wird
Natriumsulfat verwendet, um die Koazervation von polymerem Kation
und Nukleinsäuren
zu induzieren. Ethanol in einer Konzentration von etwa 40 bis 60%
kann ebenfalls zur Induktion der Koazervation verwendet werden.
Auch Chondroitinsulfat kann in die Mikrokügelchen inkorporiert werden,
was besonders vorteilhaft ist, wenn andere Substanzen wie Arzneimittel
und lysosomolytische Mittel in das Mikrokügelchen inkorporiert werden
sollen. Üblicherweise liegt
die Konzentration an Chondroitinsulfat zwischen etwa 0,005% und
0,1%.
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Die Größe der Mikrokügelchen
beträgt
weniger als 5 Mikrometer. Besonders bevorzugt sind Mikrokügelchen
mit weniger als 3 Mikrometer und ganz besonders bevorzugt sind Mikrokügelchen
mit weniger als 2, 1, 0,5 und 0,1 Mikrometer. Obwohl die Größe durch
die Koazervationsbedingungen und die Größe des einzelnen Polyanions
und Polykations beeinflußt
werden kann, können
Mikrokügelchen
der gewünschten
Größe auch
durch Größenselektion
mit einer Methode erhalten werden, bei der die Mikrokügelchen
auf Basis ihrer Größe aufgetrennt
werden.
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Targeting-Liganden können, falls
gewünscht, direkt
an die Oberfläche
des Mikrokügelchens
gebunden werden, oder sie können
mittels einer "Brücke" oder eines "Spacers" indirekt angehängt werden.
Wegen der Aminogruppen, die von den Lysingruppen der Gelatine stammen,
kann die Oberfläche der
Mikrokügelchen
zur direkten Kupplung von Targeting-Gruppen leicht derivatisiert
werden. Beispielsweise können
Carbodiimide als Derivatisierungsmittel verwendet werden. Alternativ
können
Spacer (Linkermoleküle
und derivatisierende Gruppen an Targeting-liganden), beispielsweise
Avidin-Biotin, zur
indirekten Kupplung von Targeting-Liganden an die Mikrokügelchen
verwendet werden. Biotinylierte Antikörper und/oder andere biotinylierte
Liganden können wegen
der hohen Affinität
von Biotin (ka ≈ 1015 M–1)
für Avidin
(Hazuda et al., 1990, Processing of precursor interleukin 1 Beta
and inflammatory diseaese, J. Biol. Chem., 265: 6318-22, Wilchek
et al., 1990, Introduction to avidin-biotin technology, Methods
In Enzymology, 184: 5-13)
effizient an die Avidin-beschichtete Oberfläche der Mikrokügelchen
gekuppelt werden. Orientierungsselektives Anhängen von IgGs läßt sich
durch Biotinylierung des Antikörpers
an den Oligosaccharidgruppen erreichen, die sich am Fc-Teil
finden (O'Shannessy
et al., 1984, A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation
to oligosaccharide moieties, Immunol. Lett., 8: 273–277). Diese
Anordnung hilft, die Gesamtzahl verfügbarer Bindungsstellen zu erhalten, und
sorgt dafür,
daß die
angehängten
Antikörper
weniger immunogen für
Zellen wie Makrophagen sind, die den Fc-Rezeptor
tragen. Andere Sparer als die Biotin-Avidin-Brücke, wie sie im Stand der Technik
bekannt sind, können
ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise kann Staphylococcus-Protein
A auf die Mikrokügelchen
aufgebracht werden, um die Fc-Teile von
Immunglobulinmolekülen
an die Mikrokügelchen zu
binden.
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Die Vernetzung von Linkermolekülen oder Targeting-Liganden mit dem
Mikrokügelchen
wird dazu benutzt, um die Stabilität des Mikrokügelchens zu
verbessern und das Linkermolekül
oder den Targeting-Liganden kovalent an das Mikrokügelchen
zu binden. Der Vernetzungsgrad wirkt sich unmittelbar auf die Geschwindigkeit
aus, mit der die Nukleinsäuren
aus den Mikrokügelchen
freigesetzt werden. Die Vernetzung kann mit Glutaraldehyd, Carbodiimiden wie
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid), DCC (N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide),
Carboxylverbrückung
(Peptidbindung), Bis(sulfosuccinimidyl)suberat, Dimethylsuberimidate
etc. erfolgen.
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Erfindungsgemäße Targeting-Liganden sind alle
Moleküle,
die an spezifische Typen von Zellen im Körper binden.
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Dies können alle Arten von Molekülen sein, für die ein
zellulärer
Rezeptor existiert. Vorzugsweise werden die zellulären Rezeptoren
nur auf bestimmten Zelltypen exprimiert. Beispiele für Targeting-Liganden,
die verwendet werden können,
sind Hormone, Antikörper,
Zelladhäsionsmoleküle, Saccharide, Arzneimittel,
die an Zellrezeptoren binden, und Neurotransmitter.
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Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung
haben gute Beladungseigenschaften.
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Die erfindungsgemäße Koazervation beinhaltet üblicherweise
die Wechselwirkung von polymeren Kationen und Polyanionen. Weil
dieser Prozess von der Wechselwirkung zwischen den positiv geladenen
polymeren Kationen und den negativ geladenen Polyanionen, beispielsweise
Nukleinsäuren, abhängt, kann
er als ein komplexer Koazervationsprozess betrachtet werden. Natriumsulfat
(oder Ethanol) induzieren jedoch die Koazervationsreaktion, indem
sie einen Phasenübergang
induzieren, und daher könnte
er auch als einfache Koazervationsreaktion betrachtet werden. Nukleinsäuren können in
der Koazervationsmischung in einer Konzentration von 1 ng/ml bis
500 μg/ml
vorliegen. Zweckmäßig haben die
Nukleinsäuren
eine Länge
von wenigstens 2–3 kb.
Natriumsulfat kann zwischen 7 und 43 mM vorliegen. Gelatine oder
andere polymere Kationen können
zwischen etwa 2 und 7% in der Koazervationsmischung vorhanden sein.
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Ein attraktives Mikrokügelchen-Applikationssystem
erfordert ein feines Gleichgewicht zwischen Faktoren wie Einfachheit
der Herstellung, Kosteneffizienz, Grad der Nukleinsäurebeladung,
Fähigkeit
zur kontrollierten Freisetzung, Lagerstabilität und Immunogenität der Komponenten.
Die hier beschriebenen Mikrokügelchen
bieten Vorteile im Vergleich mit anderen partikulären Applikationssystemen,
einschließlich
dem Liposomensystem. Die Probleme von Instabilität, geringem Beladungsgrad und
Fähigkeit
zur kontrollierten Freisetzung werden mit dem polymeren Mikrokügelchensystem
besser gelöst.
Gelatine hat zunehmend biologische Verwendung erlangt, die wegen
der Biokompatibilität
und enzymatischen Abbaubarken in vivo vom chirurgischen Gewebekleber (Weinschelbaum
et al., 1992, Surgical treatment of acute type A dissecting aneurysm
with preservation of the native aortic valve and use of biologic
glue. Follow-up to 6 years, J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 130: 369-74) über quantitative
immunhistochemische Assays (Izumi et al., 1990, Novel gelatin particle
agglutination test for serodiagnosis of leprosy in the field, J.
Clinical Microbiol., 28: 525-9) bis zum Träger für die Arzneimittelapplikation
reicht (Tabata et al., 1991, Effects of recombinant alphainterferon-gelatin
conjugate on in vivo murine tumor cell growth, Cancer Res., 51:
5532-8). Verglichen mit anderen synthetischen Polymersystemen, wie
den ausgiebig untersuchten Polylactat/Polyglycol-Copolymeren, sind
die milden Bedingungen für
die Formulierung der Mikrokügelchen
reizvoll. Anders als bei der Lösungsmittelverdampfung
und den Heißschmelzmethoden,
die zur Formulierung synthetischer polymerer Mikrokügelchen
verwendet wurden, erfordert die komplexe Koazervation weder Kontakt
mit organischen Lösungsmitteln
noch Hitze. Sie eignet sich auch besonders, um Biomakromoleküle wie Zytokine
und Nukleinsäuren
nicht nur durch passives Einfangen aus Lösungsmitteln (Solvent-Capturing),
sondern auch durch direkte Ladungs-Ladungs-Wechselwirkung einzubetten.
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Anders als virale Vektoren, mit denen
sich keine Gene applizieren lassen, die größer als 10 kb sind, hat das
Applikationssystem auf Basis der Mikrokügelchen keine solchen Größenbeschränkungen. Es
können
Nukleinsäuremoleküle größer als
etwa 2 kb verwendet werden, und sogar Nukleinsäuremoleküle größer 10 kb können verwendet werden. Üblicherweise
ist die Nukleinsäure
größer als
300 Basen und üblicherweise
größer als
0,5, 1, 2, 5 oder 10 kb. Üblicherweise
ist das Nukleinsäuremolekül kleiner als
200, 100 oder 50 kb.
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Im allgemeinen hängt das Spektrum möglicher
Targets vom Injektionsweg ab, z.B. intravenös oder intraarteriell, subkutan,
intraperitoneal, intrathekal etc. Bei systemischen Injektionen wird
die Spezifität
dieses Applikationssystems durch die Zugänglichkeit des Targets für die im
Blut befindlichen Mikrokügelchen
beeinflußt,
was wiederum durch den Größenbereich
der Teilchen beeinflußt
wird. Die Größe der Teilchen
wird durch die Temperatur, die Konzentration der einzelnen Komponenten
und den pH der Koazervationsmischung beeinflußt. Die Teilchen können auch
größenfraktioniert
werden, z.B. durch Ultrazentrifugation über einen Sucrosegradienten.
Teilchen mit einer Größe von weniger
als 150 nm können in
den interstitiellen Raum gelangen, indem sie durch die Fensterungen
hindurchtreten, die die Wände
der meisten Blutgefäße auskleiden.
Unter solchen Umständen
gibt es ein umfangreiches Spektrum von Zellen, die als Target dienen
können.
Eine verkürzte
Liste von Zellen, die als Target dienen können, umfaßt die Parenchymalzellen des
Lebersinusoids, die Fibroblasten der Bindegewebe, die Zellen der
Langerhans'schen
Inseln im Pankreas, die Herzmyozyten, die Haupt- und Belegzellen
des Darms, die Osteozyten und Chondrozyten des Knochens, Keratinozyten, Nervenzellen
des peripheren Nervensystems, Epithelzellen der Niere und der Lunge,
Sertolizellen der Hoden etc. Die Targets für Teilchen mit einer Größe über 0,2
Mikrometer befinden sich hauptsächlich
im vaskulären
Kompartiment. Hier umfassen die als Targets geeigneten Zellen Erythrozyten,
Leukozyten (d.h. Monozyten, Makrophagen, Bund T-Lymphozyten, Neutrophile,
natürliche
Killerzellen, Nachkommenzellen, Mastzellen, Eosinophile), Thrombozyten und
Endothelzellen. Es ist jedoch nicht erforderlich, daß die Zytokin
enthaltenden Mikrokügelchen
von den Zellen aufgenommen werden. Sie können ihre vorteilhafte Wirkung
auch extrazellulär
ausüben.
Die Größe der Teilchen
ist also für
die Zytokinapplikation unkritisch.
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Das Zytokin und die DNA müssen nicht
genau zur selben Zeit oder im selben Träger verabreicht werden. Sie
können
getrennt formuliert und hintereinander, d.h. innerhalb weniger Sekunden
oder Minuten, verabreicht werden. Alternativ kann es zweckmäßig sein,
daß die
Verabreichungen zeitlich Stunden oder sogar Tage getrennt voneinander
erfolgen. Wenn die Verabreichungen innerhalb von weniger als 72
Stunden an dasselbe Individuum erfolgen, hat erfindungsgemäß eine gleichzeitige
Verabreichung stattgefunden.
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Die obige Offenbarung beschreibt
die vorliegende Erfindung in allgemeiner Form. Ein vollständigeres
Verständnis
läßt sich
unter Bezug auf die folgenden spezifischen Beispiele erlangen, die
lediglich der Veranschaulichung dienen und den Umfang der Erfindung
nicht einschränken
sollen.
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BEISPIEL 1
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Immunologische Reaktionen
von pCI-clacZ-Plasmid-DNA-Vektoren.
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Die Anti-βGal-Immunreaktionen, die durch zwei
lacZ-Expressionsvektoren
ausgelöst
wurden, die sich hauptsächlich
in der Anwesenheit der adeno-assoziierten viralen terminalen "Inverted Repeats" (AAV-ITR) unterscheiden,
wurden ausgewertet. Die Insertion der CMV-IntronA-lacZ (CMV/lacZ)-Kassette von
p43-clacZ in einen Expressionsvektor, dem die AAV-ITR fehlten (pCI-neo),
führte
bei Mäusen,
die i.m. mit "nackter" DNA immunisiert waren,
zu deutlich verminderten Anti-βGal-Antikörpern und
CTL-Reaktionen. Bei hoher DNA-Dosis (100 mg) übertraf der p43-clacZ-Vektor
den pCI-clacZ-Vektor ebenfalls noch, obwohl der Unterschied in den
Reaktionen im Vergleich zu dem, der bei der niedrigen Dosis (1 mg)
beobachtet wurde, signifikant geringer war. Mit Ausnahme des Gens
für die
Neomycinresistenz ("neo") auf pCI-clacZ besteht der
einzige Unterschied zwischen pCI-clacZ und p43-clacZ in den AAV-ITR,
die die CMV/lacZ-Kassette flankieren. Da das neo-Gen nicht zur Genexpression
von LacZ beiträgt
und es bei Untersuchungen, bei denen es eingesetzt wurde, keine
bekannten immunologischen Folgen hat, lassen diese Ergebnisse vermuten,
daß die
bei den Anti-βGal-Immunreaktionen beobachteten
Unterschiede auf die Anwesenheit der AAV-ITR zurückzuführen sind. In vitro-Transfektionsstudien
mit Lipofectamin-Reagenzien, die an 293-Zellen durchgeführt wurden,
zeigten für
diese beiden Vektoren keine Unterschiede in der Stärke der Genexpression
(Daten nicht gezeigt), was vermuten läßt, daß die Unterschiede in der Immunreaktion nicht
mit der Stärke
der Genexpression zusammenhingen.
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BEISPIEL 2
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Immunologische Reaktionen
von pCI-clacZ-Plasmid-DNA-Vektoren.
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Die Anti-βGal-Immunreaktionen, die durch zwei
lacZ-Expressionsvektoren
ausgelöst
wurden, die sich hauptsächlich
in der Anwesenheit der adeno-assoziierten viralen terminalen "Inverted Repeats" (AAV-ITR) unterscheiden,
wurden ausgewertet. Die Insertion der CMV-IntronA-lacZ (CMV/lacZ)-Kassette von
p43-clacZ in einen Expressionsvektor, dem die AAV-ITR fehlten (pCI-neo),
führte
bei Mäusen,
die i.m. mit "nackter" DNA immunisiert waren,
zu deutlich verminderten Anti-βGal-Antikörpern und
CTL-Reaktionen. Bei hoher DNA-Dosis (100 mg) übertraf der p43-clacZ-Vektor
den pCI-clacZ-Vektor ebenfalls noch, obwohl der Unterschied in den
Reaktionen im Vergleich zu dem, der bei der niedrigen Dosis (1 mg)
beobachtet wurde, signifikant geringer war. Mit Ausnahme des Gens
für die
Neomycinresistenz ("neo") auf pCI-clacZ besteht der
einzige Unterschied zwischen pCI-clacZ und p43-clacZ in den AAV-ITR,
die die CMV/lacZ-Kassette flankieren. Da das neo-Gen nicht zur Genexpression
von LacZ beiträgt
und es bei Untersuchungen, bei denen es eingesetzt wurde, keine
bekannten immunologischen Folgen hat, lassen diese Ergebnisse vermuten,
daß die
bei den Anti-βGal-Immunreaktionen beobachteten
Unterschiede auf die Anwesenheit der AAV-ITR zurückzuführen sind. In vitro-Transfektionsstudien
mit Lipofectamin-Reagenzien, die an 293-Zellen durchgeführt wurden,
zeigten für
diese beiden Vektoren keine Unterschiede in der Stärke der Genexpression
(Daten nicht gezeigt), was vermuten läßt, daß die Unterschiede in der Immunreaktion nicht
mit der Stärke
der Genexpression zusammenhingen.
-
BEISPIEL 3
-
Zytokinproduktion von
Lymphozyten aus mit Mikrokügelchen
geimpften Mäusen.
-
Um die immunologische Reaktion von
Mäusen,
die mit Mikrokügelchen
geimpft waren, die verschiedene Dosen von IL-4 enthielten, genauer
zu charakterisieren, wurden die Lymphozyten geerntet, mit βGal-Protein
stimuliert und anschließend
auf Il-4- und γ-INF-Produktion
getestet. Übliche
ELISA-Assays, die mit drei Tage lang kultiviertem Serum durchgeführt wurden,
ergaben, daß Mäuse, die
mit Mikrokügelchen
mit zunehmendem IL-4-Gehalt immunisiert worden waren, nach erneuter
Stimulierung mit Antigenen proportional mehr IL-4 produzierten.
Bei diesen Seren wurde eine dosisbezogene Abnahme der γ-INF-Produktion
beobachtet. Da die Produktion von IL-4 mit aktiv proliferierenden
Th
2-Helferzellen
assoziiert ist, während
die γ-INF-Produktion
mit Th
1-Helferzellen
assoziiert ist, wird gefolgert, daß die Reaktion der Th
2-Helferzellen bei
Mäusen,
die mit IL-4-Mikrokügelchen
geimpft waren, potenziert wurde, während die Reaktion der Th
1-Helferzellen gesenkt
wurde. Dieses Ergebnis, in Kombination mit einer dosisbezogenen
Potenzierung von Anti-βGal-Antikörpern und
einer gleichzeitigen Hemmung von CTL-Reaktionen, steht in Einklang
mit einem IL-4-vermittelten
immunologischen Switch von einer Th
1-lastigen
Reaktion auf eine Th
2-lastige
Reaktion.
-
BEISPIEL 4
-
Die Wirkungen von IL-4
bei Gabe in in Mikrokügelchen
eingebetteter Form gegenüber
freier Form.
-
Die Effizienz von IL-4 bei der Potenzierung einer
Antikörperreaktion
wurde an Mäusen
untersucht, die mit Mikrokügelchen
geimpft waren, die Il-4 entweder in in Mikrokügelchen eingebetteter Form oder
in freier Form enthielten. ELISA-Assays, die in Woche 8 (nach zwei
Immunisierungen) an Mäuseserum
durchgeführt
wurden, zeigten, daß diejenigen, denen
Mikrokügelchen
injiziert worden waren, die mit freiem IL-4 vermischt waren, keine
stärkere
Anti-βGal-Antikörperreaktion
generieren konnten (3).
Im Gegensatz dazu generierten Mäuse,
die mit IL-4 geimpft waren, das in Mikrokügelchen eingebettet war, eine
deutlich stärkere
Antikörperreaktion. Außerdem konnten
Mäuse,
denen "nackte" DNA in Gegenwart
der gleichen IL-4-Dosis injiziert worden war, im Vergleich mit solchen,
die mit DNA allein geimpft waren, ebenfalls keine stärkere Immunreaktion hervorbringen.
Die Daten lassen vermuten, daß die bei
obigem Versuch eingesetzte IL-4-Dosis nur in der in Mikrokügelchen
eingebetteten Form eine Potenzierung der Antikörperreaktion bewirkt.
-
BEISPIEL 5
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Potenzierung der CTL-Reaktion
bei Verwendung von in Mikrokügelchen
eingebettetem IL-2 und γ-INF.
-
Die Möglichkeit einer Modulierung
der Immunreaktion durch gleichzeitig mit Mikrokügelchen applizierte Zytokine
wurde ferner durch die Untersuchung der Wirkungen von IL-2 und γ-INF, die
in Mikrokügelchen
eingebettet waren, auf die CTL-Reaktionen nachgewiesen. Mäuse, die
mit einer einzigen Injektion von Mikrokügelchen immunisiert waren,
die p43-clacZ-DNA allein (Gesamtmenge 2 mg DNA), zusammen mit IL-2
oder zusammen mit IL-2 und γ-INF
enthielten, wurden in Woche 4 auf die Ausbildung von Anti-βGal-CTL-Reaktionen untersucht. Mäuse, die
mit Mikrokügelchen
allein oder mit nackter DNA geimpft waren, bildeten eine schlechte CTL-Reaktion
aus (4). Dies stand
in Einklang mit unseren früheren
Untersuchungen, die zeigten, daß für starke
CTL-Reaktionen wenigstens zwei oder drei Immunisierungen notwendig
waren. Wenn IL-2 jedoch in den Mikrokügelchen enthalten war, wurde eine
verstärkte
CTL-Reaktion beobachtet. Die CTL-Reaktion wurde synergistisch potenziert,
wenn γ-INF
gleichzeitig mit IL-2 in den Mikrokügelchen appliziert wurde. Die
Inklusion sowohl von IL-2 als auch von γ-INF in die Mikrokügelchen
verbesserte die Anti-βGal-CTL-Reaktion
bei nur einer einzigen Immunisierung von 25% Lyse (bei einem E :
T-Verhältnis
von 64 : 1) auf wenigstens 65%.
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BEISPIEL 6
-
Zum Vergleich des LAMP-Targetingeffekts testeten
wir t-PA LSS/HIVgagINS/LAMP gegenüber HIVgagINS (nackte DNA)
mit und ohne 1 g GM-CSF in Mikrokügelchen. Wie in 5 gezeigt, zeigten Tiere,
die mit dem Chimären
Gen immunisiert waren, bei einem E : T-Verhältnis von 10 eine HIV-1 gag-spezifische
CTL-Reaktion von 38,2 Lyse im Vergleich mit 21,4% für das Gen
ohne LAMP-Targeting. Wenn auch 1 g in Mikrokügelchen eingebettetes GM-CSF im
Impfstoff enthalten war, waren die entsprechenden CTL-Reaktionen bei gleichem
E : T-Verhältnis auf
100% bzw. 75,6 Lyse erhöht.
Für das
Gen ohne LAMP-Targeting konnte die gleichzeitige Applikation von
in Mikrokügelchen
eingebettetem GM-CSF bei einem E : T-Verhältnis von 10 die HIV gag-spezifische
CTL-Reaktion von 21% Lyse auf 75,6 Lyse verbessern, wohingegen mit
dem LAMP-Targeting-Gen eine Verbesserung von 38,2 auf 100 erfolgte.
Dies zeigt eindeutig den Vorteil, der bei Co-Applikation von Zytokin,
das in Mikrokügelchen
mit verzögerter
Freisetzung eingebettet ist, erhalten wird.
-
Klonierungsverfahren
-
Die Leadersignal-Sequenz (LSS) von
humanem Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) aus der genomischen DNA von humanen 293-Zellen amplifiziert, wobei
die Primer t-PA-Sense (5' AAG
CTGGCTAGCC CACCATGGATGC AATGAAGA GAGGG CTC 3') und t-PA & c-myc-Antisense (5' CGGCC GCTCGAG CAGATC
CTCTTCTGA GATGAGTTTTTGTTCGAGGGGCGGGACACAGGGATC 3') verwendet wurden. Das c-myc-Epitop
wurde zu dem Antisense-Primer gegeben. Das resultierende PCR-Produkt wurde
mit NheI und XhoI verdaut und in pCDNA3.1(–) kloniert. Das HIV-1 gag
INS-Gen wurde aus Plasmid HIV-1 gag INS neo pCDNR3.1 mit den Primern
gagINS-Sense (5' TCTAGACTCGAG ATGGGTGCGAGAGCGTCA
3') und gagINS-Antisense (5'GTGGTGGAATTCCTGTGACGAGGGGTCGTT
3') amplifiziert
und nach Verdau mit XhoI und EcoRI in t-PA LSS & c-myc neo pCDNA3.1(–) kloniert.
-
Die Transmembrandomäne und der
C-terminale Schwanz (Tmct) des Lysosom-assoziierten Membranproteins
(LAMP-1) der Maus wurde mittels PCR aus dem Plasmid LAMP-1 neo pCDNA3.1,
das das LRMP-1-Gen enthält,
mit den Primern LAMP Tmct-Sense (5' TCTGCAGAATTCCTGATCCCCATCGC TGTG 3') und LAMP Tmct-Antisense
(5' AAGCTTGGTACCCTAGATAG
TCTGGTAGCC 3') amplifiziert.
Das PCR-Produkt wurde nach Verdau mit EcoRI und KpnI in t-PA LSS & c-myc/HIV-1 gag INS
neo pCDNA3.1(–)
kloniert, was zu unserem t-PA LSS/HIV-1 gag INS/LRMP neo pCDNA3.1
(–)-Konstrukt
führte,
das den "immediate
early" Promotor
des Cytomegalovirus (CMV) enthält,
um die Expression unseres Chimären
Gens zu verstärken.
-
Immunisierung
von Mäusen
und CTL-Assay
-
Verwendeter Mäusestamm: Der Mäusestamm
Balb/c(H2d) wurde von Charles Rivers erhalten. DNA wurde durch CsCl/Ethidiumbromid-Gleichgewichtszentrifugation
gereinigt. Balb/c-Mäuse
wurden zweimal intramuskulär
in Abständen
von zwei Wochen mit 10 g Plasmid immunisiert. Die DNA wurde in einer
Konzentration von 0,2 mg/ml in PBS gelöst und 25 l (5 g) wurden mit
oder ohne 1 g GM-CSF in Mikropartikeln mit einer 28er-Nadel in jeden
Tibialis anterior Muskel injiziert. Drei Wochen nach Immunisierung
wurden die Mäuse
getötet
und ihre Milzen und Lymphknoten wurden geerntet. Splenozyten wurden
durch Homogenisieren der Milzen und Lymphknoten und anschließendes Passieren
der Suspension durch ein Nylonsieb und nachfolgende Ficoll-Gradientenzentrifugation
isoliert.
-
Splenozyten aus naiven Mäusen wurden
mit HIV-1 gag-spezifischem
Klasse I-MHC-Peptid markiert und durch Behandlung mit Psoralen und
W-Exposition für
APC-Zellen inaktiviert. T-Zellen wurden durch Nicht-Adhärenz an
Nylonwolle-Säulen
angereichert und dann in Gegenwart von IL-2 und APC-Zellen sieben
Tage lang inkubiert. Die stimulierten Splenozyten wurden dann in
einem üblichen 51Cr-Freisetzungsassay
für CTL-Aktivität als Effektoren
verwendet.
-
Zytokin-Mikrokügelchen: Mikrokügelchen, die
GM-CSF enthielten, wurden wie zuvor beschrieben hergestellt.
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BEISPIEL 7
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Das für p815A, ein für Mastozytoma-Zellen spezifisches
Antigen, kodierende Gen wurde intradermal mit oder ohne GM-CSF-Mikrokügelchen
mit kontrollierter Freisetzung in DAB/2-Mäuse injiziert. 6A zeigt die antigenspezifische CTL jeder
einzelnen Maus (10 in einer Gruppe). Es wurde keine signifikante
CTL beobachtet, was mit den in der Literatur typischen Ergebnissen übereinstimmte,
wenn der DNA-Impfstoff ohne Booster-Shots verabreicht wird. Eine
signifikante CTL konnte in 10 von 10 Tieren beobachtet werden, wenn
die DNA mit kontrollierter Applikation von GM-CSF in Mikrokügelchen
verabreicht wurde.
-
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