DE69828414T2

DE69828414T2 - Mukosale zytotoxische t-lymphozytenantwort

Info

Publication number: DE69828414T2
Application number: DE69828414T
Authority: DE
Inventors: A. Jay BERZOFSKY; Igor M. Belyakov; A. Michael DERBY; L. Brian KELSALL; Warren Strober
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1997-09-11
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-09-12
Also published as: AU757310B2; DE69828414D1; PT1011720E; WO1999012563A3; ES2236941T3; JP2001515869A; ATE285789T1; CA2303410A1; EP1011720B1; WO1999012563A2; EP1011720A2; AU9386298A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen zum Stimulieren von Immunantworten bei Säugetieren. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen zum Stimulieren von mukosaler Immunität.
Hinterrund der Erfindung
Viele infektiöse Pathogene, z.B. HIV-1, dringen in ihre Säugetierwirte über ein mukosales Gewebe ein, bevor eine systemische Infektion begründet wird (Veazey et al., Science 280: 427-431, 1998). Dementsprechend sollten Vakzine, die in der Lage sind, gegen HIV zu schützen, in der Lage sein, langfristige mukosale Immunantworten zu induzieren. Etliche neueste Studien haben gezeigt, daß derartige Immunantworten eine direkte Stimulation mukosaler Gewebe erfordern, und durch ein lebendes, abgeschwächtes Virus (Cranage et al., Virology 229: 143-154, 1997), eine Untereinheit der SIV-Hülle (Lehrer et al., Nature Medicine 2: 767-775, 1996), HIV-rekombinante Viren, einschließlich dem rekombinanten MVA 89.6 env (Belyakov et al., unveröffentlicht) oder HIV-Peptidkonstrukte (Belyakov et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 1709-1714, 1998 erreicht werden können (siehe auch Gallichan, et al., J.Ext. Med. 184:1879-1890, 1996; Cranage, et al., Virology 229:143-154, 1997; und Rosenthal, et al., Semin. Immunol. 9: 303-314, 1997).
Zahlreiche Fragen bleiben allerdings im Hinblick darauf bestehen, welche Vakzin-Kandidaten den wirksamsten Schutz gegen einen mukosaler „Angriff" oder eine mukosale „Herausforderung" („challenge") durch ein Virus bieten und welche Mechanismen am Vermitteln einer protektiven Immunität beteiligt sein können. Während etliche Studien eine Rolle von CTL beim Schutz gegen Infektionen, wie etwa Influenza, die eine mukosale Komponente aufweisen (Taylor und Askonas, Immunology 58: 417-420, 1986; Epstein et al., J. Immunol. 160: 322-327, 1998; Kulkarni et al., J. Virol. 69:1261-1264, 1995), gezeigt haben, haben diese Berichte nicht festgestellt, ob sich die CTL an einem lokalen Ort der Mukosa befinden müssen, um zu schützen. Während umgekehrt andere Studien die Induktion von CTL in der Mukosa gezeigt haben, haben sie nicht festsgestellt, daß diesen Zellen eine Rolle beim Schutz zukommt (Gallichan and Rosenthal, J. Exp. Med. 184: 1879-1890, 1996; Bennink et al., Immunology 35: 503-509, 1978; Lohman et al., J. Immunol. 155: 5855-5860, 1995; und Klavinskis, et al., J. Immunol. 157: 2521-2527, 1996 J. Immunol. 155: 5855-5860, 1995). Noch weitere Studien haben die Induktion einer protektiven Immunität in der Mukosa durch Vakzine gezeigt, waren jedoch angesichts der Vielfalt von Immunantworten nicht in der Lage, auszusortieren, welche Antworten an dem Schutz beteiligt sind (Lehrer et al., Nature Medicine 2: 767-775, 1996; Putkonen et al., J. Virol. 71: 4981-4984, 1997; Miller et al., J. Virol. 71: 1911-1921, 1997; Quesada-Rolander et al., AIDS Res Hwn Retroviruses 12: 993-999, 1996; Bender et al., J. Virol. 70: 6418-6424, 1996; Wang et al., Vaccine 15: 821-825, 1997).
Obwohl demnach die Rolle von CTL beim Schutz gegen mukosale Infektionen über Jahrzehnte von Interesse gewesen ist, insbesondere im Fall des Influenzaviruses, haben frühere Untersuchungen darin versagt, grundlegende Mechanismen, die Immunantworten mit dem Schutz verknüpfen, zu identifizieren. Da eine mukosale Infektion durch ein Virus eine lokale IgA-Anwort induziert, ist in dieser Hinsicht zu leicht angenommen worden, daß diese Antwort und nicht etwa eine begleitende CTL-Antwort für den Schutz vor einer viralen Infektion über den mukosalen Weg verantwortlich war. Allerdings ist die Rolle von sekretorischem IgA beim Neutralisieren und Schützen gegen einen mukosalen HIV-Angriff ebenfalls nicht klar.
CTL sind entscheidende Mediatoren einer Immunität gegen intrazelluläre Mikroorganismen, wie etwa Viren ebenso wie bestimmte Bakterien und parasitäre Protozoa. CTL erkennen spezifisch artigene "Nicht-Selbst"-Peptide, die an Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC)-Klasse I-Moleküle auf der Oberfläche von "Zielzellen" gebunden sind, und töten dann die Zielzellen, welche die artigenen Nicht-Selbst-Peptide exprimieren, ab. Nicht-Selbst-Polypeptide, von denen sich die Nicht-Selbst-Peptide ableiten sind, können folgende sein; (a) Proteine, die durch intrazelluläre Mikroben kodiert werden, (b) wirtskodierte Proteine, deren Expression durch eine Mikrobe induziert wird, oder (c) mutierte wirtskodierte Proteine, die beispielsweise von Tumorzellen exprimiert werden.
Demnach kann eine Erzeugung von CTL-Antworten in dem induktiven und effektorischen mukosalen Immunsystem wichtig sein, um eine wirksame protektive Immunität gegenüber intrazellulären mikrobiellen Pathogenen, die eine Infektion über die mukosalen Barrieren begründen, zu begründen. In einigen Fällen versagt eine Verabreichung von Antigenen auf parenteralen Wegen (z. B. subkutan, intramuskulär, intravenös oder intraperitoneal), eine mukosale Immunität zu induzieren, entweder oder tut dies extrem unwirksam.
Wie oben angemerkt, haben frühere Berichte von mukosalen Immunantworten, die durch einen mukosalen Angriff mit Viren ausgelöst wurden, offengelegt, daß letzterer antivirale Antikörperantworten, und in einigen Fällen CTL-Antworten, in den intraepithelialen lymphoiden Populationen induziert (Chen et al., J. Virol. 71: 3431-3436, 1997; Sydora, et al., Cell Immunol. 167: 161-169, 1996). Allerdings ist nicht klar, ob jede derartige Antwort für einen Schutz gegen eine virale Infektion im allgemeinen oder eine HIV-Infektion im besonderen von Bedeutung ist. Zusätzliche Studien haben eine Rolle von CTL beim Schutz gegen Infektionen, an denen die Mukosa beteiligt ist, wie etwa durch das Influenzavirus oder das respiratory syncytial-Virus nahegelegt (Taylor et al., Immunology 58: 417-420, 1986; Epstein et al., J. Immunol. 160: 322-327, 1998; Kulkarni et al., J. Virol. 69: 1261-1264, 1995). Allerdings haben diese Studien sich nicht mit der Frage beschäftigt, ob CTL am mukosalen Ort der Infektion präsent sein müssen, oder ob ihre prinzipielle Aktivität systemisch auftritt. Der Bericht im Journal of Immunological Methods, 158(8), 1997, 3947-3958, offenbart chimäre Peptide, die zu systemischen Antworten führen.
Demnach besteht ein Bedarf im Stand der Technik, die Rollen und Mechanismen von CTL beim Vermitteln einer Immunität besser zu definieren und neue Werkzeuge zum Vermitteln eines Immunschutzes gegen HIV und andere Pathogene zu entwickeln, insbesondere, indem ein Immunschutz an mukosalen Orten, an denen derartige Pathogene anfänglich proliferieren, verliehen wird.
Kurzfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen zum Induzieren einer protektiven mukosalen CTL-Antwort in einem Versuchsobjekt in Übereinstimmung mit den Patentansprüchen. Die Zusammensetzungen können entweder als ein lösliches Antigen selbst oder ein Polynukleotid, welches das lösliche Antigen kodiert, an eine mukosale Oberfläche verabreicht werden. Die löslichen Antigene können natürlich vorkommende Vollänge-Polypeptide oder Fragmente (d.h. Peptide), die sich davon ableiten, sein. Zu verabreichende Peptide können jede Länge, die weniger als die der natürlich vorkommenden Polypeptide beträgt, aufweisen. Sie können beispielsweise 5 bis 100 Aminosäurenreste lang, vorzugsweise 20 bis 75 Aminosäurenreste lang, stärker bevorzugt 25 bis 60 Aminosäurenreste lang und am stärksten bevorzugt 30 bis 50 Aminosäurenreste lang sein.
Das lösliche- Antigen wird mit einem Adjuvanz an dem mukosalen Ort oder ohne ein Adjuvanz verabreicht. Adjuvanzien können beispielsweise Choleratoxin (CT), mutiertes CT (MCT), hitzelabiles E. coli-Enterotoxin (LT) oder mutiertes LT (MLT) sein. Mit dem löslichen Antigen können IL-12 und/oder IFNγ entweder in Gegenwart eines Adjuvanzes oder ohne ein Adjuvanz verabreicht werden. Alternativ können die beiden Cytokine (IL-12 und/oder IFNγ) systemisch und getrennt von dem löslichen Antigen, das über die Mukosa verabreicht wird, verabreicht werden, wahlweise mit einem Adjuvanz. Mukosale Verabreichungswege schließen IR, intranasale (IN), intragastrale (IG), intravaginale (IVG) oder intratracheale (IT) Wege ein.
Lösliche Antigene können sich von pathogenen Viren (z.B. HIV-1, Influenzavirus oder Hepatitis-A-Virus), Bakterien (z.B. Listeria monocytogenes), Protozoa (z.B. Giardia lamblia) abgeleitet sein. Alternativ kann das lösliche Antigen ein Tumor-assoziiertes Antigen sein, z.B. das Prostata spezifische Antigen, das durch Prostatatumorzellen produziert wird oder eine Tyrosinase, die durch Melanomzellen produziert wird. Peptidantigene können Cluster-Peptid-Vakzin-Konstukte (cluster peptide vaccine constructs, CLUVAC) sein.
Beispielsweise kann ein HIV-1-CLUVAC eine oder mehrere der folgenden Sequenzen einschließen:
Vorzugsweise schließt das CLUVAC die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:9 oder SEQ ID NO:12 ein. Antigene Peptide können länger sein als es der Länge, die durch die hier aufgeführten SEQ ID NOs festgelegt wurde, entspricht, d.h. die Peptide können durch Hinzufügen einer Aminosäure oder mehrerer (z.B. 5, 10, 15, 20) Aminosäuren an die Amino- und/oder Carboxytermini des Peptids mit jeder vorgegebenen SEQ ID NO verlängert sein.
Die Offenbarung umfaßt auch Verfahren zum Induzieren einer protektiven mukosalen CTL-Antwort in einem Versuchsobjekt, bei dem das lösliche Antigen IR verabreicht wird. Vorzugsweise beträgt das Ausmaß der CTL-Aktivität, die durch eine IR Immunisierung induziert wird, mindestens 10% mehr als die, die auf anderen Wegen einer mukosalen Verabreichung (z.B. IN) induziert wird. Stärker bevorzugt ist eine mukosale CTL-Aktivität, die durch eine IR Immunisierung induziert wird, mindestens 2-fach, stärker bevorzugt mindestens 5-fach und am stärksten bevorzugt mindestens 10-fach größer als die, die auf anderen Wegen einer mukosalen Immunisierung (z.B. IN oder IG) induziert wird.
Versuchsobjekte, an denen die Erfindung angewendet wird, sind Säugetiere, z.B. Menschen, nicht-menschliche Primaten, Katzen oder Mäuse.
Mit der Erfindung ebenfalls verfügbar gemacht werden immunogene Zusammensetzungen zum Induzieren einer protektiven mukosalen CTL-Antwort in einem Versuchsobjekt, die an eine intrarektale Verabreichung angepaßt sind. Die Zusammensetzungen schließen ein gereinigtes lösliches Antigen, das zur intrarektalen Abgabe an das Rektum, Kolon, sigmoidale Kolon oder distale Kolon formuliert ist, ein. Sie können als ein rektales Klistier, ein Schaum, Zäpfchen oder topisches Gel formuliert sein und umfassen im allgemeinen eine Grundlage, einen Träger oder einen absorptionsfördernden Wirkstoff, der an eine intrarektale Verabreichung angepaßt ist.
Unter genaueren Aspekten können die immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung eine rektale Emulsion oder Gel-Präparation einschließen, worin das lösliche Antigen vorzugsweise mit einem homogenen Emulsions- oder Gelträger, z.B. einem Polyoxyethylen-Gel, zusammengemischt ist. Alternativ kann das lösliche Antigen mit einem rektal kompatiblen Schaum zusammengemischt sein.
Unter anderen bevorzugten Aspekten sind die imunogenen Zusammensetzungen der Erfindung in einem Zäpfchen formuliert. Das Zäpfchen umfaßt eine Grundlage oder einen Träger, die speziell an eine intrarektale Abgabe des Antigens angepaßt sind. Bevorzugte Grundlagen können ausgewählt sein aus einem Polyethylenglycol, wie Witepsol H15, Witepsol W35, Witepsol E85, Polyethylenglycoldicaprylat (Sefsol 228), Miglyol 810, Hydroxypropylcellulose-H (HPC) oder Carbopol-934P (CP). Stärker bevorzugt umfaßt das Zäpfchen mindestens zwei Grundlagenmaterialien, um die Leistungsfähigkeit in bezug auf Struktur und Verabreichung zu optimieren. Unter anderen Aspekten schließt das Zäpfchen einen stabilisierenden Wirkstoff ein, um den intrarektalen Abbau des löslichen Antigens zu minimieren.
Um die intrarektale Abgabe zu optimieren, schließen die immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung vorzugsweise auch einen absorptionsfördernden Wirkstoff, beispielsweise ein oberflächenaktives Agens, eine gemischte Mizelle, ein Enamin, einen Stickoxid-Donor, Natriumsalicylat, einen Glycerinester der Acetoessigsäure, Cyclodextrin oder ein beta-Cyclodextrin-Derivat oder eine mittelkettige Fettsäure ein.
Unter noch weiteren Aspekten der Erfindung werden immunogene Zusammensetzungen verfügbar gemacht, die ein Adjuvanz einschließen, welches die CTL-Antwort verstärkt. Geeignete Adjuvanzien sind entgiftete Bakterientoxine, beispielsweise Choleratoxin (CT), mutiertes Choleratoxin (MCT), mutiertes hitzelabiles E. coli-Enterotoxin und Pertussistoxin. Vorzugsweise ist das Adjuvanz mit einem Mukosagewebe- oder T-Zell-bindenden Wirkstoff, wie etwa Protein A, einem Antikörper, der an ein Mukosagewebe- oder T-Zell-spezifisches Protein bindet, oder einem Liganden oder Peptid, die an ein Mukosagewebe- oder 7-Zellspezifisches Protein binden, konjugiert. Unter stärker bevorzugten Aspekten ist das Adjuvanz ein rekombinantes Choleratoxin (CT) mit einer B-Kette von CT, substituiert durch Protein A, konjugiert mit einer CT-A-Kette, welches eine reduzierte Toxizität aufweist und eine durch Protein A vermittelte Mukosagewebebindung verstärkt. Alternativ kann das Adjuvanz mit einem Protein oder Peptid, das spezifisch an T-Zellen bindet, beispielsweise durch Bindung von CD4 oder CD8, konjugiert sein (z.B. die HIV-V3-Schleife oder ein T-Zell-bindendes Peptidfragment der HIV-V3-Schleife).
Wenn nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie gewöhnlich durch einen Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet, zu dem die Erfindung gehört, verstanden wird. Obwohl Verfahren und Materialien, die den hier beschriebenen ähnlich sind, beim Ausführen oder Ausprobieren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden geeignete Verfahren und Materialien unten beschrieben. Im Fall eines Konflikts wird die vorliegende Anmeldung einschließlich der Definitionen maßgeblich sein. Weiterhin sind die hier beschriebenen Materialien, Verfahren und Beispiele nur zur Veranschaulichung gedacht und beabsichtigen nicht, zu beschränken.
Weitere Merkmale und Eigenschaften der Erfindung, z.B. eine Verhütung viraler oder anderer Infektionserkrankungen werden aus der folgenden genauen Beschreibung, aus den Zeichnungen und den Patentansprüchen offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine Folge von Liniendiagrammen, welche die Ergebnisse eines CTL-Tests zeigen. Eine IR Immunisierung mit HIV-1-Peptid induzierte eine langfristige mukosale und systemische CTL-Aktivität.
2 zeigt eine Folge von Liniendiagrammen, welche die Ergebnisse eines CTL-Tests zeigen. CT verstärkt (was jedoch nicht wesentlich war) zur Induktion von CTL durch IR Verabreichung eines antigenen Peptids.
3 zeigt eine Folge von Liniendiagrammen, welche die Ergebnisse eines CTL-Tests zeigen. CTL, induziert durch IR-Immunisierung mit einem HIV-1 gp160-Peptid, lysierte spezifisch Zielzellen, die mit einem HIV-1-gp160-Gen transfiziert waren und das entsprechende Protein exprimierten.
4 zeigt eine Folge von Liniendiagrammen, welche die Ergebnisse eines CTL-Tests zeigen, der zeigte, daß eine IR-Induktion der CTL von IL-12 abhängig war.
5 zeigt ein Balkendiagramm, welches zeigt, daß eine IR Immunisierung vor einem IR Angriff durch ein HIV-1 gp160 exprimierendes rekombinantes Vacciniavirus schützt.
6A zeigt ein Liniendiagramm, welches die Ergebnisse eines CTL-Tests unter Verwendung von SP-Zellen, die aus Tieren sechs Monate nach IR Immunisierung mit einem antigenen Peptid erhalten wurden, zeigt.
6B zeigt ein Liniendiagramm, welches die Ergebnisse eines CTL-Tests unter Verwendung von SP-Zellen, die von Tieren sechs Monate nach intranasaler (IN) Immunisierung mit einem antigenen Peptid erhalten wurden, zeigt.
7A zeigt ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse eines Tests unter Verwendung von PP als Effektorzellen zeigt.
7B zeigt ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse eines CTL-Tests unter Verwendung von SP-Zellen als Effektorzellen zeigt. PP- und SP-Zellen wurden aus Tieren 35 Tage nach mukosaler (IR, IN, IG) oder systemischer (subkutaner, SC) Immunisierung mit einem antigenen Peptid erhalten.
8A zeigt ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse eines CTL-Tests unter Verwendung von Effektorzellen aus Wildtyp-BALB/c-Mäusen zeigt.
8B zeigt ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse eines CTL-Tests unter Verwendung von Effektorzellen aus BALB/c-Mäusen, denen die Fähigkeit, funktionelles IFNγ zu produzieren, fehlt, zeigt Diese Experimente zeigen die Abhängigkeit einer IR Induktion der CTL von IFNγ.
9A zeigt ein Liniendiagramm, welches die Ergebnisse eines CTL-Tests unter Verwendung von PP als Effektorzellen zeigt.
9B zeigt ein Liniendiagramm, welches die Ergebnisse eines CTL-Tests unter Verwendung von SP-Zellen als Effektorzellen zeigt. PP- und SP-Zellen wurden aus BALB/c-Mäusen 35 Tage nach IR Immunisierung mit entweder einem antigenen Peptid, CT und IL-12 (Zusammensetzung A) oder einem antigenen Peptid und CT (ohne IL-12; Zusammensetzung B) erhalten.
10A und 10B zeigen, daß eine IR Immunisierung mit PCLUS3-18IIIB oder PCLUS3-18MN eine langfristige Immunität sowohl der Peyer-Plaques (Tafel A) als auch der Milz (Tafel B) induziert. Allerdings ist das Ausmaß der Induktion von CTL unterschiedlich. Das Abtöten von mit P18IIIB-I10- (geschlossene Quadrate) oder P18MN-T10-Peptid gepulsten Zielen (geschlossene Kreise) wird mit dem Abtöten von ungepulsten Zielen (offene Quadrate oder Kreise) verglichen. Sowohl in Tafel A als auch in Tafel B betrugen alle Werte für den SEM von Dreifachbestimmungen < 5% des Mittelwerts.
11 zeigt, daß ein Schutz, induziert durch eine mukosale Immunisierung mit einem HIV-1-Peptid-Vakzin, spezifisch ist. Am Tag 35 wurden die Mäuse intrarektal mit 2,5 × 10⁷ Plaque-bildenden Einheiten (plaque forming units, pfu) eines Vacciniaviruses, der gp160IIB (vPE16) exprimiert, oder mit 2,5 × 10⁷ pfu eines Vacciniaviruses, der β-Galactosidase (vSC8) exprimiert, „herausgefordert" („to challenge"). Balken = SEM von 5 Mäusen pro Gruppe. Der Unterschied ist signifikant bei p < 0,01, ermittelt durch den Student-T-Test.
12 zeigt, daß ein Schutz, induziert durch eine mukosale Immunisierung mit einem HIV-1-Peptid-Vakzin langfristig ist. Am Tag 35 oder sechs Monate nach Beginn der Immunisierung wurden die Mäuse intrarektal mit 2,5 × 10⁷ pfu des Vacciniaviruses, der gp 160IIIB exprimiert, „herausgefordert". Balken = SEM von 5 Mäusen pro Gruppe. Der Unterschied ist signifikant bei p < 0,01, ermittelt durch den Student T-Test.
13 zeigt, daß ein Schutz, induziert durch eine mukosale Immunisierung mit einem HIV-1-Peptid, von den CD8-positiven T-Zellen abhängig ist. BALB/c-Mäuse wurden IP mit 0,5 mg monoklonalem anti-CD8-Antikörper (Klon 2.43, NIH Frederick, MD) einen Tag vor und nach jeder Immunisierung behandelt und ebenfalls zwei Tage vor und drei Tage nach dem Angriff durch vPE16. Die Mäuse wurden intrarektal mit 2 × 10⁷ pfu vPE16-Vacciniavirus, das gp 160IIIB exprimiert, „herausgefordert".
14A und 14B zeigen, daß eine mukosale Immunisierung mit einem HIV-1-Peptid mukosale CTL-Antworten induziert und eine protektive Immunität gegen einen intrarektalen Angriff mit rekombinantem HIV-1-Vakzin stimuliert. 14A stellt eine Induktion der mukosalen und systemischen CTL-Antworten auf verschiedenen Immunisierungswegen mit synthetischem HIV-Peptid-Vakzin dar. Ein Abtöten der Peptidgepulsten Ziele (geschlossene Balken) wird mit dem Abtöten von ungepulsten Zielen (offene Balken) bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 50:1 verglichen. Tafel A stellt die Ergebnisse einer Immunisierung am Tag 35 (IR oder SC, Balken 1, kein Immunogen; Balken 2, SC; Balken 3, IR) von BALB/c-Mäusen dar, die intrarektal mit 2,5 × 10⁷ Plaque-bildenden Einheiten (pfu) eines Vacciniaviruses, das gp 160IIIB exprimiert, herausgefordert wurden.
15A und 15B zeigen die Verstärkung der mukosalen (Figur A) und systemischen (Figur B) CTL-Anworten auf ein HIV-1-Peptid durch die mukosale (nicht systemische) Behandlung mit rmIL-12. BALB/c-Mäuse wurden auf dem IP Weg (rechte Tafeln) oder dem IR Weg (linke Tafeln) mit 1 μg rmIL-12 an jedem Tag der IR-Immunisierung mit PCLUS3-18IIIB (50μg/Maus) behandelt. Am Tag 35 wurden die HIV-spezifischen CTL der Peyer-Plaques (15A) und die Milz-CTL (15B) untersucht.
16 zeigt, daß eine mukosale Behandlung mit rmIL-12 in DOTAP gemeinsam mit einem HIV-Peptid-Vakzin den Schutz gegen einen mukosalen Angriff durch ein Vacciniavirus, das gp160IIIB (vPE16) exprimiert, verstärkt. Fünf Mäuse pro Gruppe wurden am Tag 0, 7, 14 und 21 ohne Immunogen (Balken 1), mit 50μg PCLUS3-18IIIB allein (Balken 2) oder mit Peptid plus 1μg rmIL-12 in DOTAP (Balken 3) IT immunisiert und am Tag 35 intrarektal mit 5 × 10⁷ pfu eines Vacciniaviruses, das gp160IIIB exprimiert, herausgefordert. Die viralen pfu in den Ovarien wurden sechs Tage später bestimmt.
17A und 17B zeigen, daß IL-12 nicht direkt auf die Induktion von mukosalen CD8+-CTL in Abwesenheit von IFNγ wirken kann. IFNγ^-/-Mäuse (BALB/c-Hintergrund) wurden mit dem rmIL-12 (1 μg/Maus) + DOTAP zusammen mit dem Peptid IR immunisiert. Am Tag 35 wurden die HIV-spezifischen CTL der Peyer-Plaques (17A) und die Milz-CTL (17B) untersucht. Das Abtöten von mit P18IIIB-I10 gepulsten Zielen durch Effektorzellen aus immunisierten IFNγ^-/--Mäusen (geschlossene Quadrate) oder gewöhnlichen BALB/c-Mäusen (geschlossene Kreise) wird mit den Abtöten von ungepulsten Zielen (offene Quadrate oder Kreise) verglichen.
Genaue Beschreibung
A. Induktion von mukosalen Immunität
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß eine IR Verabreichung eines Peptids, z.B. eines synthetischen multideterminanten HIV-1-gp160-Hüll-Glycoprotein-Peptids an eine mukosale Oberfläche eine antigenspezifische protektive CTL-Antwort im mukosalen Immunsystem sogar in Abwesenheit eines mukosalen Adjuvanzes induzieren kann.
Die beispielhaften synthetischen multideterminanten Peptide (CLUVAC) sind zusammengesetzt aus Subregionen, welche Epitope enthalten, die einige der oder alle folgenden Antworten hervorrufen: (a) eine T-Helferzell-Antwort, (b) eine CTL-Antwort und (c) einen hohen Titer von neutralisierenden Antikörpern in einer Vielzahl von Wirten einer vorgegebenen Spezies, die einen breiten Bereich von MHC-Haplotypen exprimiert. Eine IR-Immunisierung mit dem HIV-1-CLUVAC-PCLUS318IIIB (SEQ ID NO:2) und dem mukosalen Adjuvanz CT induzierte peptidspezifische CTL sowohl an den induktiven (PP) als auch den effektorischen (LP) Orten des mukosalen Immunsystems, ebenso wie in systemischen lymphoiden Geweben, d.h. der Milz. Im Gegensatz dazu erzeugte eine systemische Immunisierung mit einem Peptid-Vakzin HIV-1-Peptid-spezifische CTL nur in der Milz.
Eine IR Immunisierung induzierte langfristige protektive Immunantworten. Beispielsweise wurden antigenspezifische CTL sowohl an mukosalen als auch systemischen Orten sechs Monate nach der Immunisierung gefunden. Eine IR Immunisierung mit dem antigenen Peptid löste signifikant stärkere CTL-Antworten aus als eine IN Immunisierung mit dem selben Peptid. Während eine IR Verabreichung mit PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO:2) eine signifikante Antwort induzierte, wenn das Peptid allein verabreicht wurde, war die Antwort durch die Einbeziehung von CT gesteigert. Die CTL waren CDB+ T-Lymphozyten, beschränkt durch MHC-Klasse-I-Moleküle, welche MHC-Klasse-I-positive Zielzellen, die entweder HIV-1 gp160 endogen exprimierten oder mit einem geeigneten gp160-Peptid gepulst waren, erkannten. Eine Induktion einer sowohl mukosalen als auch systemischen CTL-Antwort durch IR Immunisierung war IL-12-abhängig, wie durch die Hemmung der Induktion von CTL in Mäusen, die i.p. mit anti-IL-12-Antikörper behandelt wurden, gezeigt. Weiterhin führte die Einbeziehung von IL-12 in die Zusammensetzung mit antigenem Peptid und CT, die zur IR Immunisierung verwendet wurde, zu gesteigerten mukosalen und systemischen CTL-Anworten im Verhältnis zu den Antworten, die durch ein antigenes Peptid und CP ohne IL-12 ausgelöst wurden. Die Abhängigkeit von IFNγ von einer mukosalen und systemischen CTL-Bildung nach IR Immunisierung wurde durch das Fehlen derartiger Anworten bei Mäusen, denen die Fähigkeit, funktionelles IFNγ zu produzieren, fehlt, z.B. als Ergebnis eines unreifen Stopcodons im IFNγ kodierenden Gen, gezeigt. Die Mutation des Stopcodons veranlaßte das Gen, ein trunkiertes Protein zu kodieren, welchem die Aktivität von IFNγ fehlt.
Eine IR Immunisierung mit PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO:2) schützte Mäuse vor einen IR Angriff mit einem rekombinanten Vacciniavirus, das HIV-1 IIIB gp160 exprimierte. Demnach induzierte ein HIV-1-Peptid CTL-Antworten in den mukosalen und systemischen Immunsystemen nach IR Immunisierung und schützte gegen einen mukosalen Angriff mit einem Virus, das HIV-1 gp160 exprimierte.
Das Immunisierungsverfahren ist nützlich, um eine mukosale CTL-Antwort auf jedes lösliche Antigen zu induzieren. Demnach macht die Erfindung ein neues Verfahren zur Verabreichung eines Vakzins verfügbar, um einen immunologischen Schutz gegen Viren, einschließlich HIV-1, auszulösen, die über mukosale Barrieren eindringen. Das Verfahren kann auch angewendet werden, um einen Schutz vor einer Infektion mit bestimmten Bakterien (z.B. L. monocytogenes) und Protozoa (z.B. G. lamblia) zu erreichen, die eine Infektion über Schleimhäute begründen. Da zusätzlich eine mukosale Immunisierung zu einer systemischen Bildung von CTL-Aktivität führt, kann das Protokoll auch zur Verhütung einer Infektion durch Mikroorganismen, die über nicht-mukosale Wege eindringen, nützlich sein. Das Verfahren ist auch zur Immuntherapie von Infektionen, die mukosomal oder nicht-mukosomal begründet sind, nützlich. Schließlich können die Verfahren zur Immuntherapie von Krebs verwendet werden, sowohl im Bereich einer mukosalen Oberfläche als auch davon entfernt.
B. Immunisierungsverfahren
Die Erfindung betrifft das Schützen von Versuchsobjekten vor einer Infektion durch intrazelluläre Mikroorganismen, wie etwa Viren ebenso wie intrazellulären Bakterien und Protozoa. Das Verfahren umfaßt eine Induktion von CTL-Anworten, die spezifisch sind für antigene Peptide, die sich von Proteinen ableiten, welche durch Gene relevanter Mikroben kodiert werden und gemeinsam mit MHC-Klasse-I-Molekülen auf der Oberfläche infizierter Zellen exprimiert werden. Dies wird erreicht durch die Abgabe eines geeigneten löslichen Antigens an eine mukosale Oberfläche, z.B. rektale, vaginale, nasopharyngeale, gastrale oder tracheale Mukosae. Relevante Mikroorganismen schließen jene ein, die in ihre Wirte über mukosale Barrieren, z.B. HIV-1, Influenzavirus, enterische Viren, wie etwa Rotaviren, Hepatitis-A-Virus, Papillomavirus, feline immunodeficiency virus, feline leukemia virus, simian immunodeficiency virus, intrazelluläre bakterielle Pathogene, z.B. L. monocytogenes und Mykobakterien, wie etwa M. tuberkulosis und M. leprae, ohne darauf beschränkt zu sein. Da die Antworten, die durch eine mukosale Immunisierung ausgelöst werden, in dem systemischen ebenso wie dem mukosalen Immunsystem auftreten, können die Verfahren auch zum Schutz vor einer Infektion durch intrazelluläre Pathogene angewendet werden, die in ihre Wirte auf nicht-mukosalen (z.B. HIV-1 in manchen Szenarien, wie etwa einem „Stich" durch eine kontaminierte Spritzennadel, Rabiesvirus und Malaria-Protozoa) ebenso wie auf mukosalen Wegen eindringen. Angesichts der oben dargestellten Überlegungen kann eine Immunisierung über Schleimhäute auch zur Immuntherapie intrazellulärer Infektionen verwendet werden.
Schließlich kann die mukosale Immuntherapie angewendet werden bei Versuchsobjekten mit Krebs, insbesondere solchen mit soliden Tumoren im Bereich der relevanten Mukosa, z.B. Kolon-, Rektal-, Blasen-, Ovarial-, Uterus-, Vaginal-, Prostata-, Nasopharyngeal-, Lungen- oder bestimmte Melanomtumoren, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Tumorimmunität wird im wesentlichen vermittelt durch CTL mit einer Spezifität für Tumor-assoziierte Peptide (z.B. Prostata-spezifische Antigen-Peptide bei Prostatakrebs, karzinoembryonale Antigen-Peptide bei Kolonkrebs, menschliches Papillomavirus-Peptide bei Blasenkrebs und MART1, gp100 und Tyronsinase-Peptide bei Melanomen; Rosenberg et al. (1994) J.N.C.I. 76: 1159; Kawakami et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 3515), die an MHC-Klasse-I-Moleküle auf der Oberfläche von Tumorzellen gebunden sind.
B.1 Antigene Polypeptide
Ein lösliches Antigen, das gemäß der Erfindung verabreicht werden soll, kann jedes lösliche Kohlenwasserstoff- oder Peptidantigen sein, z.B. eines, das alle Aminosäuresequenzen oder einen Teil eines Peptids enthält, das natürlicherweise im Zusammenhang mit einem MHC-Klasse-I-Molekül auf der Oberfläche einer Zelle, die mit einer relevanten Mikrobe infiziert ist, exprimiert wird oder auf einer Tumorzelle exprimiert wird. Im Fall von infizierten Zellen leitet sich das auf der Zelloberfläche exprimierte Peptid von einem Protein ab, das entweder durch Gene des infektiösen Agens kodiert oder dessen Expression durch das infektiöse Agens induziert wird. Deshalb kann das lösliche Antigen ein natürlich vorkommendes Vollänge-Polypeptid, z.B. Vollänge-HIV-1 gp160 oder gp120 oder ein antigenes Fragment davon, sein.
Eine antigenspezifische Erkennung durch CTL umfaßt Wechselwirkungen zwischen Bestandteilen des antigenspezifischen T-Zell-Rezeptors auf der Oberfläche der CTL und Resten an sowohl dem antigenen Peptid als auch dem MHC-Klasse I-Molekül, an welches das Peptid gebunden ist. Folglich kann das lösliche Antigen auch ein Fragment (d.h. ein Peptid) des natürlich vorkommenden Polypeptids sein, das entweder (a) selbst in der Lage ist, an MHC-Klasse-I-Moleküle einer Vielzahl von Haplotypen auf der Oberfläche von Antigenpräsentierenden Zellen (antigen presenting cells, APC) zu binden und CD8+-T-Zell-Antworten bei Versuchsobjekten, die diese MHC-Klasse-I-Haplotypen exprimieren, zu stimulieren oder (b) welches proteolytisch durch APC zu Fragmenten mit diesen Eigenschaften prozessiert werden kann. Wege, diese Fähigkeit eines Peptid-Kandidaten, eine CTL-Antwort im Zusammenhang mit einer Vielzahl von MHC-Klasse-I-Haplotypen zu stimulieren, zu begründen, sind einem Durchschnittsfachmann gut bekannt und werden ausführlich in der PCT-Patentanmeldung WO 94/26785 beschrieben.
Antigene Peptide können konstruiert werden, um an MHC-Klasse-II-Moleküle einer Vielzahl von Haplotypen zu binden und werden durch CD4+-T-Helferzell-Vorläuferzellen von Versuchsobjekten, die eine Vielzahl von MHC-Klasse-II-Haplotypen exprimieren, erkannt. Wege, die Fähigkeit eines Peptid-Kandidaten, eine T-Helferzell-Antwort im Zusammenhang mit einer Vielzahl von MHC-Klasse II-Haplotypen zu stimulieren, zu begründen, sind einem Durchschittsfachmann gut bekannt und werden ausführlich in der PCT-Patentanmeldung WO 94/26785 beschrieben.
Zusätzlich können antigene Peptide Epitope enthalten, die neutralisierende Antikörper auslösen, d.h. solche, die an die relevante Mikrobe oder eine Zelle, die mit der Mikrobe infiziert ist, binden und diese neutralisieren oder abtöten. Wege, die Eigenschaften eines Peptid-Kandidaten zu begründen, sind einem Durchschittsfachmann gut bekannt und werden ausführlich in der PCT-Patentanmeldung WO 94/26785 beschrieben.
Antigene Peptide können auch Antikörper auslösen, die eine Antikörper-abhängige Zellzytolyse (antibody-dependent cellular cytolysis, ADCC) von Zellen, die mit der entsprechenden Mikrobe infiziert sind, oder von Tumorzellen, die auf ihrer Oberfläche das Protein, von dem sich das antigene Peptid ableitete, exprimieren, induzieren. ADCC ist ein protektiver Mechanismus, durch den spezialisierte Zellen des Immunsystems (K-Zellen) den Fc-Teil von IgG-Antikörpermolekülen, die auf der Oberfläche einer Zielzelle gebunden sind und die relevante Zielzelle lysieren, erkennen. Seren oder andere Körperflüssigkeiten, wie etwa rektale Spülungen, von Versuchsobjekten, die mukosal mit einem Kandidatenpeptid immunisiert wurden, können auf ihre Fähigkeit, ADCC zu vermitteln, durch Verfahren überprüft werden, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Zum Überprüfen einer zellvermittelten Lympholyse (cell mediated lympholysis, CML) wird ein Standardtest verwendet. Kurz, eine Quelle von lymphoiden ADCC-Effektorzellen (z.B. periphere mononukleäre Blutzellen, peripheral blond mononuclear cells, PBMC, oder Milzzellen) wird in vitro mit Zielzellen inkubiert, die das oben beschriebene Zelloberflächenprotein in Gegenwart verschiedener Verdünnungen von Testseren exprimieren. Eine Lyse der Zielzellen, die durch die Freisetzung einer nachweisbaren Markierung (z.B. ⁵¹Cr) aus vormarkierten Zielzellen gemessen werden kann, ist ein Hinweis auf das Vorhandensein von ADCC-induzierenden Antikörpern in dem Testserum.
Peptide der Erfindung können Cluster-Peptid-Vakzin-Konstrukte (CLUVAK) sein. Ein CLUVAK ist ein chimäres Peptid, das folgendes enthält: (a) eine Subregion mit einer Vielzahl von überlappenden, T-Helferzell-aktivierenden-Epitopen, die durch eine Vielzahl von MHC-Klasse II-Molekülen präsentiert sein können (ein Clusterpeptid), (b) eine Subregion mit einem CTL-aktivierenden Epitop und (c) eine Subregion, welche die Produktion eines neutralisierenden Antikörpers auslöst. Die Peptidsequenzen, die diese Epitope enthalten, können von verschiedenen Teilen eines mikrobiellen oder Tumorassoziierten Polypeptids abgeleitet werden. Alternativ können die CTL-induzierenden und Antikörper-neutralisierenden Epitope in einer Subregion eines Antigens lokalisiert sein und das/die Helferepitop(e) können sich in einer zweiten Subregion befinden. CLUVAK und deren Entwurf werden ausführlich in der PCT-Patentanmeldung WO 94/26785 beschrieben.
Ein HIV-I-CLUVAK kann die folgenden Sequenzen einschließen:
Es ist beispielsweise möglich, ein spezielles Clusterpeptid mit jedem Peptid, das ein CTL- und/oder neutralisierendes Antikörper-Epitop enthält, zu verknüpfen. Beispiele von Clusterpeptiden schließen folgende ein: Clusterpeptid 1, dessen Aminosäuresequenz (EQMHEDIISLWDQSLKPCVK) (SEQ ID NO: 17) die ersten 20 Aminosäuren des HIV-1-CLUVAC mit Sequenz ID NO: 1 darstellt; Clusterpeptid 3, dessen Aminosäuresequenz (KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIR) (SEQ ID NO: 18) die ersten 24 Aminosäuren des HIV-1-CLUVAC mit Sequenz ID NO: 2 darstellt; Clusterpeptid 4, dessen Aminosäuresequenz (RDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPT) (SEQ ID NO: 19) die ersten 24 Aminosäuren des HIV-1-CLUVAC mit SEQ ID NO: 3 darstellt; und Clusterpeptid 6, dessen Aminosäuresequenz (AVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLER) (SEQ ID NO: 20) die ersten 33 Aminosäuren des HIV-1-CLUVAC mit SEQ ID NO: 4 darstellt.
Von besonderen Interesse sind Peptide, welche die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 12 enthalten. Mukosale Antworten auf das erste (PCLUS3-18IIIB) werden ausführlich in den unten dargestellten Beispielen charakterisiert. PCLUS3-18MN (SEQ ID NO: 9) und PCLUS6.1-18MN (SEQ ID NO: 12) sind in klinischen Studien am Menschen untersucht worden. Das CTL-Epitop innerhalb von PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO: 2) ist die Aminosäuresequenz RIQRGPGRAFVTIGK (SEQ ID NO: 15).
In einigen Beispielen werden mukosale Adjuvanzien am Mukosagewebeort gemeinsam mit den löslichen Antigenen verabreicht. Derartige Adjuvanzien schließen entgiftete bakterielle Toxine, beispielsweise entgiftetes Choleratoxin (CT), hitzelabiles E. coli-Toxin (LT), mutiertes CT (MCT) (Yamamoto et al. J. Exp. Med. 185: 1203 (1997); Yamamoto et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 58: 5267 (1997); Douce et al. Infect. Immunity 65: 2821 (1997)), mutiertes hitzelabiles E. coli-Toxin (MLT) (Di Tommaso et al. Infect. Immunity 64: 974 (1996); Partidos et al. Immunology 89: 83 (1996)) und Pertussistoxin ein, ohne darauf beschränkt zu sein. MCT und MLT enthalten Punktmutationen, welche eine wesentliche Ablation der Toxizität bedingen, ohne die Adjuvanzaktivität im Verhältnis zu der der elterlichen Moleküle wesentlich zu beeinträchtigen. In anderen bevorzugten Ausführungen ist das Adjuvanz modifiziert für eine gesteigerte Bindung an mukosale Gewebe und/oder T-Zellen. Demnach sind unter einem Aspekt der Erfindung CT oder andere bakterielle Toxine mit einem Mukosagewebe-bindenden Agens, wie etwa Protein A, einem Antikörper, der an Mukosagewebe- oder T-Zell-spezifisches Protein (z.B. einen Rezeptor) bindet oder einem Liganden oder Peptid, der/das an Mukosagewebe- oder T-zellspezifisches Protein (z.B. CD4 oder CD8) bindet, konjugiert. Beispielsweise kann die B-Kette von CT durch Protein A substituiert sein, das mit der CT-A-Kette konjugiert ist, um eine Toxizität auszuschließen und die durch Protein A vermittelte Mukosagewebebindung zu verstärken. Alternativ kann die HIV-V3-Schleife, die CD4 auf T-Zellen bindet, mit dem Adjuvanz konjugiert sein, um eine Verabreichung an T-Zellen zu verstärken.
Die CTL-steigernden Cytokine, z.B. IL-12 und IFNγ, werden beispielsweise entweder systemisch oder vorzugsweise gemeinsam mit dem löslichen Antigen am Mukosagewebeort verabreicht.
Varianten von offenbarten antigenen Peptiden können Aminosäuren enthalten, die von den elterlichen Molekülen verschieden sind (vorzugsweise konservative Änderungen), behalten jedoch die biologische Aktivität der elterlichen Moleküle bei, z.B. die Fähigkeit, spezifische CTL-Antworten im Anschluß an eine mukosale Immunisierung zu induzieren, aufrecht. Derartige Varianten können durch Standardmittel synthetisiert werden und werden leicht in Tests nachgewiesen, die dem Fachmann bekannt sind. Antigene Polypeptide sind normalerweise länger als es der Länge der hier aufgeführten nominalen SEQ ID NOs entspricht, d.h. das Polypeptid kann durch Hinzufügen von Aminosäuren zu den Amino- oder Carboxytermini des Peptids, das durch eine vorgegebene SEQ ID NO: definiert ist, verlängert werden.
Peptide und Polypeptide der Erfindung werden auch jene einschließen, die oben beschrieben wurden, jedoch zur Anwendung in vivo modifiziert wurden durch:

(a) chemische oder rekombinante DNA-Verfahren, um Säugetier-Signalpeptide einzuschließen (Lin et al., J. Biol. Chem. 270: 14255 (1995)) oder das bakterielle Peptid Penetratin (Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864 (1991)), das dazu dienen soll, das Peptid über zelluläre und zytoplasmatische Membranen zu dirigieren und/oder es in das endoplasmatische Retikulum (ER) von Antigen-präsentierenden Zellen (APC), z.B. dendritischen Zellen, die wirksame CTL-Induktoren sind, zu schleusen;
(b) Hinzufügen eines Biotin-Rests, der dazu dient, die Polypeptide oder Peptide über Zellmembranen mittels ihrer Fähigkeit, spezifisch an einen Translokator, der in der Oberfläche von Zellen vorhanden ist, zu binden zu dirigieren (Chen et al., Analytical Biochem. 227:168 (1995));
(c) Hinzufügen an jeweils eines der beiden oder an beide amino- und carboxyterminalen Enden eines blockierenden Agens, um das Überleben des relevanten Polypeptids oder Peptids in vivo zu erleichtern. Dies kann in solchen Situationen nützlich sein, in denen die Termini dazu neigen, vor der zellulären oder ER-Aufnahme durch Proteasen abgebaut („angeknabbert") zu werden. Derartige blockierende Agenzien können ohne Einschränkung zusätzliche verwandte oder unverwandte Peptidsequenzen einschließen, die an die amino- und/oder carboxyterminalen Reste des Polypeptids oder Peptids, das verabreicht werden soll, angehängt werden. Dies kann entweder chemisch während der Synthese des Peptids oder durch rekombinante DNA-Technologie vorgenommen werden (siehe Abschnitt 3.3 unten). Alternativ können blockierende Agenzien, wie etwa Pyroglutaminsäure oder andere Moleküle, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, an die amino- und/oder carboxyterminalen Reste angehängt werden, oder die Aminogruppe am Aminoterminus oder die Carboxygruppe am Carboxyterminus können durch eine andere Gruppe ersetzt werden. Auf ähnliche Weise können die Polypeptide oder Peptide kovalent oder nicht kovalent an pharmazeutisch zulässige „Träger"-Proteine vor einer Verabreichung gekoppelt werden.

Ebenfalls von Interesse sind peptidomimetische Verbindungen, die auf der Aminosäuresequenz der Peptide der Erfindung beruhen. Peptidomimetische Verbindungen sind synthetische Verbindungen mit einer dreidimensionalen Struktur (d.h. einem „Peptidmotiv"), die auf der dreidimensionalen Struktur eines ausgewählten Peptids beruht. Das Peptidmotiv macht die peptidomimetische Verbindung mit der Bindungsaktivität an MHC-Moleküle von einer Vielzahl von Halplotypen und aktivierenden CD8⁺- und CD4⁺-T-Zellen aus Versuchsobjekten verfügbar, die MHC-Moleküle exprimieren, die gleich oder größer ist als die Aktivität des Peptids, von dem sich das Peptidomimetikum ableitete.
Peptidomimetische Verbindungen können zusätzliche Merkmale aufweisen, die ihre therapeutische Anwendung verstärken, wie etwa eine gesteigerte Zellpermeabilität, eine größere Affinität und/oder Avidität und eine verlängerte biologische Halbwertszeit. Die Peptidomimetika der Erfindung weisen normalerweise ein Rückgrat auf, das teilweise oder vollständig kein Peptid ist, jedoch Seitengruppen aufweist, die identisch sind mit den Seitengruppen der Aminosäurenreste, die in dem Peptid vorkommen, auf dem das Peptidomimetikum beruht. Verschiedene Typen chemischer Bindungen, z.B. Ester-, Thioester-, Thioamid-, Retroamid-, reduzierter Carbonyl-, Dimethylen- und Ketomethylen-Bindungen, sind auf dem Fachgebiet als allgemein nützliche Substitute für Peptidbindungen bei der Konstruktion von Protease-resistenten Peptidomimetika bekannt.
B.2 In vivo-Verfahren zur Abgabe löslicher Antigene an die Mukoaae eines Versuchsobjekts
Bei Verfahren, die mukosale CTL-Antworten induzieren, wird ein lösliches Antigen an Antigen-präsentierende Zellen des induktiven mukosalen Immunsystems (z.B. PP des Intestinums) abgegeben. Die Abgabe umfaßt die Verabreichung an ein Versuchsobjekt entweder des löslichen Antigens selbst, z.B. ein artigenes Peptid, ein Expressionsvektor, der das lösliche Antigen kodiert, oder von Zellen, die mit dem Vektor transfiziert oder transduziert sind.
B.2.1 Verabreichung von löslichem Antigen
Lösliches Antigene können an das mukosale Immunsystem eines Säugetiers unter Verwendung von Techniken abgegeben werden, die im wesentlichen die selben sind, wie jene, die unten zur Abgabe an menschliche Versuchspersonen beschrieben werden. Beispiele geeigneter Säugetiere schließen den Menschen, nicht-menschliche Primaten, Pferde, Rind, Schaf, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Hamster, Kaninchen und Ziegen ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Ein lösliches Antigen der Erfindung kann an das mukosale Immunsystem eines Menschen in seinem unmodifiziertem Zustand, gelöst, in einer geeigneten physiologischen Lösung, z.B. physiologische Salzlösung, abgegeben werden. Alternativ kann es modifiziert sein, wie in Abschnitt B.1 genau beschrieben, um einen Transport durch zelluläre und/oder intrazelluläre Membranen zu erleichtern und um einen extrazellulären oder intrazellulären Abbau zu verhüten. Ihr Transport über biologische Membranen kann auch verstärkt werden, indem es eingekapselt in Liposomen unter Verwendung bekannter Verfahren (Gabizon et al., Cancer Res. 50: 6371 (1990); Ranade, J. Clin. Pharmacol. 29: 685 (1989)) oder in einen geeigneten bioabbaubaren polymeren Mikropartikel (auch als eine "Mikrosphäre", "Nanosphäre", "Nanopartikel" oder "Mikrokapsel" bezeichnet) abgegeben wird. Natürlich ist es wünschenswert, daß die löslichen Antigene die Mukosae selektiv anzielen. Dies kann erreicht werden, indem die löslichen Antigene direkt mit der relevanten Mukosaoberfläche in Kontakt gebracht werden, z.B. durch IR, IVG, IN, intrapharyngeale (IPG) oder IT Infusion oder Implantation. Die CTL-Aktivität (systemisch oder mukosal), die durch IR Immunisierung induziert wird, kann zweifach, vorzugsweise fünffach, starker bevorzugt 20-fach, noch stärker bevorzugt 50-fach und am stärksten bevorzugt 200-fach größer sein als die durch IN Immunisierung induzierte.
Lösliche Antigene der Erfindung können in Liposomen, in die Liganden für Rezeptoren auf relevanten Zellen (z.B. dendritischen Zellen oder Makrophagen-APC) oder Antikörper für Zelloberflächenmarker, die durch diese Zellen exprimiert werden, eingeschlossen wurden, verabreicht werden. Demnach kann beispielsweise ein Antikörper, der spezifisch ist für einen dendritischen Zelloberflächenmarker, Liposomen, die sowohl den anti-dendritischen Zell-Antikörper als auch das relevante lösliche Antigen enthält, zu den dendritischen Zellen dirigieren.
Die löslichen Antigene können mukosal entweder alleine oder zusammen mit einem mukosalen Adjuvanz verabreicht werden. Geeignete Adjuvanzen schließen CT, MCT und MLT ein, ohne darauf beschränkt zu sein. IL-12 und/oder IFNγ können dem Versuchsobjekt ebenfalls verabreicht werden. Folglich kann ein lösliches Antigen mit einem Adjuvanz, mit IL-12 (in Abwesenheit eines Adjuvanzes), mit IFNγ ( in Abwesenheit eines Adjuvanzes, sowohl mit IL-12 als auch IFNγ (in Abwesenheit eines Adjuvanzes), mit einem Adjuvanz und IL-12 mit einem Adjuvanz und IFNγ oder mit einem Adjuvanz und sowohl IL-12 und IFNγ verabreicht werden. IL-12 und IFNγ können systemisch oder gemeinsam mit dem Peptid mukosal verabreicht werden. Wenn das lösliche Antigen eingekapselt in Liposomen oder Mikropartikel verabreicht wird, können IL-12 und/oder IFNγ gemeinsam in die gleichen Liposomen/Mikropartikel aufgenommen werden oder in getrennte Liposomen/Mikropartikel aufgenommen werden. Alternativ können die Cytokine in einer freien, löslichen Form verabreicht werden. Beispiele anderer Cytokine, die einzeln oder in Kombination verwendet werden können, sind granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-7 (IL-7), oder Tumornekrosefaktor a (TNFa). Diese und andere immunverstärkenden Cytokine werden verabreicht, wie oben für IL-12 und IFNγ diskutiert. Eine Verabreichung kann einfach oder vielfach (z.B. 2, 3, 4, 5, 6, 8 oder 12 Verabreichungen) erfolgen. Wenn vielfache Verabreichungen erfolgen, kann zwischen ihnen ein Abstand von einem Tag bis einem Jahr liegen. Wenn Peptide ohne ein T-Helferzell-Epitop verwendet werden, kann es notwendig sein, derartige vielfache Verabreichungen durchzuführen.
Bei der Erfindung werden Formulierungen eines löslichen Antigens zur intrarektalen Abgabe (d.h. Abgabe an das Rektum , Colon, sigmoidale Colon oder distale Colon, hergestellt, z.B. durch Formulierung des löslichen Antigens in einem rektalen Klistier, Schaum, Zäpfchen oder topischen Gels. Diese rektalen Abgabeformulierungen sind an eine verbesserte Abgabe, Stabilität und/oder Absorption im Rektum angepaßt, z.B. durch kombinieren des löslichen Antigens mit einer oder mehreren bekannten intrarektalen Verabreichungsgrundlagen oder Trägermaterialien, intrarektalen absorptionsfördernden Materialien und/oder Stabilisatoren. Bevorzugte Grundlagenformulierungen zur rektalen Verabreichung eines löslichen Antigens im Rahmen der Verfahren der Erfindung schließen hydrophile und hydrophobe Vehikel oder Träger, wie etwa jene, die gewöhnlich beim Formulieren von Zäpfchen und einer Rektalemulsion oder Gelpräparationen verwendet werden, ein. Folglich werden Emulsionsvehikel verwendet, die lösliches Antigen in einer Öl/Wasser-Emulsion einschließen, die für die intrarektale Verabreichung geeignet sind. Alternativ werden Gelformulierungen verfügbar gemacht, welche das lösliche Antigen in einem homogenen Gelträger, beispielsweise ein Polyoxiethylengel, wie etwa Polyoxyethylen (20) Cetylether (BC20TX) einschließen. Wenn das Antigen in einem rektal verträglichen Schaum formuliert ist, wird ein Schaum bevorzugt, der keinen Fluorchlorkohlenstoff als Treibmittel enthält.
Bevorzugte Träger oder Verabreichungsvehikel zur Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung sind herkömmliche Zäpfchengrundlagenmaterialien, die an die intrarektale Verwendung angepaßt sind, wie etwa Polyethylenglycole. Beispielhafte Polyethylenglycole, die im Stand der Technik bekannt und verfügbar sind, schließen PEG 400, PEG 1500, PEG 2000, PEG 4000 oder PEG 6000 ein. Bevorzugte Grundlagen in diesem Zusammenhang schließen Witepsol H15, Witepsol W35, Witepsol E85 ein. Diese werden nach ihren gewünschten lipophilen und/hydrophilen Eigenschaften ausgewählt und werden häufig ausgewählt, um ein Vielschicht-Zäpfchen mit sowohl lipophilen als auch hydrophilen Grundstoffschichten zu bilden. Bevorzugte lipophile Grundstoffmaterialien sind Makrogole mit niedrigem Molekulargewicht. Spezielle Beispiele geeigneter lipophiler Grundstoffe schließen Polypropyleneglycoldicaprylat (Sefsol 228) und Miglyol 810 ein. Ein bevorzugter hydrophiler Grundstoff ist PEG, z.B. PEG 400. In einer Formulierung, die im Zusammenhang mit der Erfindung nützlich ist, werden Hydroxypropylcellulose-H (HPC) und/oder Carbopol- 934P (CP) als Grundstoffe für eine innere Zäpfchenschicht und ein Witepsol-Grundstoff für die äußere Schicht verwendet.
Kristalline Zellulose oder andere gewöhnliche stabilisierende Agenzien können in ausgewählten Mengen, z.B. 30-60 Gew.-%) dem Grundstoff zugesetzt werden, um eine verzögerte Freisetzung zu fördern.
Die Auswahl von Grundstoffmaterialien, Stabilisatoren und absorptionsfördernden Agenzien zur Formulierung von intrarektalen Verabreichungszusammensetzungen, insbesondere Zäpfchen, wird nach herkömmlichen Verfahren bestimmt, z.B. auf der Grundlage von Schmelz- und Pfropfraten, Bruchhärte, Sprengung und speziellen Bruchzeiten, Teilungseigenschaften und Diffusionsraten. Bevorzugte Werte dieser verschiedenen Eigenschaften sind bekannt und können leicht bestimmt werden, um Antigenformulierungen entsprechend- einzustellen, damit sie zur intrarektalen Verwendung geeignet sind. Insbesondere sind geeignete Werte zur Formulierung eines Zäpfchens mit zeitabhängiger Freisetzung, das entsprechende strukturelle und chemische Eigenschaften zur rektalen Verabreichung besitzt, bekannt oder können leicht ermittelt werden. In diesem Zusammenhang sind herkömmliche Additive, z.B. Weichmacher wie etwa neutrale Öle, Estasan, etc., eingeschlossen sein, um die Konsistenz, die Abgaberate und andere Eigenschaften der Formulierung zu optimieren.
Beim Formulieren mukosaler Abgabezusammensetzungen ist auch gewünscht, absorptionsfördernde Agenzien einzuschließen, um die Abgabe des löslichen Antigens und wahlweise des CTL-stimulierenden Cytokins an die mukosale Oberfläche zu verstärken. Eine Vielzahl von absorptionsfördernden Agenzien (d.h. Agenzien, welche die Freisetzung oder Diffusion des Antigens und/oder CTL-stimulatorischen Cytokins aus dem Abgabevehikel oder der Grundlage verstärken oder die Abgabe des Antigens und/oder des CTL-stimulatorischen Cytokins an das Mukosagewebe oder an T-Zellen verstärken, beispielsweise durch Verstärken der Membranpenetration) sind im Stand der Technik bekannt und sind bei mukosalen Abgabeformulierungen der Erfindung nützlich, z.B. zum Einschließen in intrarektale Abgabeformulierungen, insbesondere Zäpfchen. Diese schließen oberflächenaktive Agenzien (z.B. Tween 80), gemischte Mizellen, Enamine, Stickoxid-Donoren (z.B. S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamin, NOR1, NOR4 die vorzugsweise mit einem No-Fänger, wie etwa Carboxy-PITO oder Natriumdoclofenac verwendet werden), Natriumsalicylat, Glycerinester von Acetoessigsäure (z.B. Glycerin-1,3-diacetoacetat oder 1,2-Isopropylidenglycerin-3-acetoacetat) und andere freisetzungs-diffusions-/absorptionsfördernde Agenzien, die an eine mukosale Abgabe angepaßt sind, ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Absorptionsfördernde Agenzien, die im Zusammenhang mit der Erfindung nützlich sind, schließen eine Vielfalt von Verwendung ein, die speziell an die intrarektale Verwendung angepaßt sind. In diesem Zusammenhang ist die Rate und das Ausmaß einer rektalen Wirkstoffabsorption häufig geringer als bei einer oralen Absorption, möglicherweise ein inhärenter Faktor, bedingt durch den relativ kleinen Oberflächenbereich, der für die Wirkstoffaufnahme zur Verfügung steht. Zusätzlich ist die Zusammensetzung von rektalen Formulierungen (fest gegen flüssig, Art der Zäpfchengrundlage) ein wichtiger Faktor bei dem Absorptionsvorgang. Die Beziehung zwischen der Formulierung und der Wirkstoffaufnahme ist eindeutig gezeigt worden. Folglich stellt eine gemeinsame Verabreichung von absorptionsfördernden Agenzien (z.B. oberflächenaktiven Agenzien Natriumsalycilat, Enamine) einen Schlüsselansatz zum Optimieren der rektalen Wirkstoffabsorption dar.
Die rektale Wirkstoffabgabe auf eine orts- und ratengesteuerte Weise unter Verwendung von Zäpfchen, Klistieren, osmotischen Pumpen oder Hydrogelformulierungen macht einen Bereich von Optionen zum Handhaben einer mukosalen Abgabe verfügbar, z.B. Steuern von Konzentrationen, zeitabhängige Freisetzung und Immunogen-Wirkstoff-Wirkungen. Eine Absorption aus wäßrigen und alkoholischen Lösungen kann sehr rasch erfolgen, eine Absorption aus Zäpfchen allerdings ist im allgemeinen langsamer und in sehr starkem Maß abhängig von der Art des Grundlage, der Verwendung von oberflächenaktiven Agenzien oder anderen Additiven, der Partikelgröße der aktiven Inhaltsstoffe etc.
Dementsprechend werden bevorzugte Formulierungen zur Verabreichung löslicher Antigene und CTL-stimulatorischer Cytokine im Zusammenhang mit dem Verfahren der Erfindung entworfen, um eine mukosale Abgabe zu optimieren. Diese Agenzien können folglich Cyclodextrine und beta-Cyclodextrin-Derivate (z.B. 2-Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin und Heptakis-(2,6-di-O-methyl-beta-cyclodextrin), einschließen. Für diese Verbindungen, die vorzugsweise mit einem oder mehreren der aktiven Inhaltsstoffe konjugiert und in einer fettigen Grundlage formuliert sind, ist gut dokumentiert, daß sie die Bioverfügbarkeit in intrarektalen Formulierungen verstärken. Andere absorptionssteigernde Agenzien, die an eine intrarektale Abgabe angepaßt sind, schließen mittelkettige Fettsäuren, einschließlich Mono- und Diglyceride (z.B. Natriumcaprat, Extrakte von Kokosnußöl, Capmul) und Triglyceride (z.B. Amylodextrin, Estaram 299, Miglyol 810) ein.
Auf dem Gebiet der Medizin ist gut bekannt, daß Dosierungen für irgendeine menschliche Versuchsperson von vielen Faktoren abhängen, ebenso wie von der besonderen Verbindung, die verabreicht werden soll, der Zeit und dem Weg der Verabreichung und weiteren Wirkstoffen, die gleichzeitig verabreicht werden sollen. Dosierungen für die löslichen Antigene der Erfindung werden variieren, können jedoch ungefähr 0,01 mg bis 100 mg pro Verabreichung betragen. Dosierungen für die mukosalen Adjuvanzien werden ungefähr 0,001 mg bis 100 mg pro Verabreichung betragen. Dosierungen für IL-12 werden ungefähr 25μg pro Kilogramm bis 500 μg/kg, und für IFNγ werden sie 300 KU bis 30.000 KU pro Verabreichung betragen, vergleichbare Dosierungen werden für andere Cytokine verwendet werden. Beispielsweise können 3.000 KU IFNγ an einen menschlichen Patienten einmal pro Woche verabreicht werden. Verfahren zum Bestimmen optimaler Dosen sind Pharmakologen und Ärzten als Durchschnittsfachleuten gut bekannt. Die Wege werden, wie oben aufgeführt, mukosal sein, z.B. IR, IG, IVG, IN, IPG oder IT.
B.2.2 Verabreichung löslicher Antigene unter Verwendung von Expressionsvektoren, welche die löslichen Antigene kodieren
Ein Expressionsvektor ist aufgebaut aus oder enthält eine Nukleinsäure, in welche eine Polynukleotidsequenz, die ein Peptid oder Polypeptid der Erfindung kodiert, funktionsfähig mit einem Promotor oder einer Enhancer-Promotor-Kombination verknüpft ist. Ein Promotor ist ein transkriptionsregulatorisches Element, aufgebaut aus einem Bereich eines DNA-Moleküls, normalerweise im Bereich von 100 Nukleotidpaaren stromaufwärts von dem Punkt, an dem die Transkription beginnt. Ein anderes transkriptionsregulatorisches Element ist ein Enhancer. Ein Enhancer macht eine Spezifität in bezug auf Zeit, Örtlichkeit und der Expressionsstärke verfügbar. Anders als ein Promotor kann ein Enhancer wirken, wenn er in verschiedenen Abständen vom Transkriptionsart lokalisiert ist, vorausgesetzt, ein Promotor ist vorhanden. Ein Enhancer kann auch stromabwärts vom Ort der Transkriptionsinitiation lokalisiert sein. Eine kodierende Sequenz eines Expressionsvektors ist funktionsfähig mit einer die Transkription beendenden Region verknüpft. Um eine kodierende Sequenz unter die Kontrolle eines Promotors zu bringen, ist es erforderlich, den Ort der Translationsinitiation des translationalen Leserasters des Peptids oder Polypeptids zwischen einem und ungefähr 50 Nukleotiden stromabwärts (3') des Promotors zu plazieren. Beispiele von besonderen Promotoren werden unten zur Verfügung gestellt. Expressionsvektoren und Verfahren für deren Konstruktion sind denen, die mit dem Fachgebiet vertraut sind, bekannt.
Geeignete Vektoren schließen unter anderen, Plasmide und virale Vektoren, wie etwa Herpesviren, Retroviren, Vacciniaviren, abgeschwächte Vacciniaviren, Canarien-Pockenviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren ein.
Die Anwendung von Antigen-kodierende Genen auf die mukosale Induktion von CTL beim Menschen kann entweder in vivo- oder ex vivo-basierte Ansätze nutzen.
Das ex vivo-Verfahren schließt die Schritte des Erntens von Zellen (z.B. dendritische Zellen) aus einem Versuchsobjekt, des Kultivierens der Zellen, ihr Transduzierens mit einem Expressionsvektor und des Haltens der Zellen unter Bedingungen, die zur Expression des löslichen Antigens geeignet sind, ein. Diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet der Molekularbiologie gut bekannt. Die Transduktionsschritte werden durch jedes Standartmittel erreicht, das für eine ex vivo-Gentherapie verwendet wird, einschließlich Kalziumphosphat, Lipofectin, Electroporation, virale Infektion und biolistischen Gentransfer. Zellen, die erfolgreich transduziert worden sind, werden dann beispielsweise im Hinblick auf die Expression eines Wirkstoffresistenzgens selektiert. Die Zellen werden dann letal bestrahlt (falls gewünscht) und in das Versuchsobjekt injiziert oder implantiert. IL-12 und IFNγ können entweder systemisch oder an die relevante Mukosaoberfläche verabreicht werden, wie oben diskutiert (Abschnitt B.2.1)
Der in vivo-Ansatz erfordert die Abgabe eines genetischen Konstrukts direkt in die Mukosa eines Versuchsobjekts, vorzugsweise indem es zielgerichtet zu den Zellen oder dem Gewebe von Interesse (z.B. dendritische Zellen in dem PP) geführt wird. Dies kann erreicht werden, indem es direkt an die relevante Mukosa (z.B. IR im Fall von PP) verabreicht wird. Gewebespezifisches Anzielen („targeting") kann auch durch die Verwendung eines molekularen Konjugats, das aus einem Plasmid oder einem anderen Vektor, der an Poly-L-Lysin durch elektrostatische oder kovalente Kräfte angehängt ist, aufgebaut ist, erreicht werden. Poly-L-Lysin bindet an einen Liganden, der an einen Rezeptor auf einer Zielzelle binden kann (Cristiano et al., J. Mol. Med. 73: 479 (1995)). Auf ähnliche Weise können zellspezifische Antikörper von dem Typ, der oben in Abschnitt B.2.1 beschrieben wurde, an Vektoren gebunden werden und dabei diese zielgerichtet zu den relevanten Zellen des mukosalen Immunsystems führen. Ein Promotor, der eine relative gewebe- oder zellspezische Expression induziert, kann verwendet werden, um ein weiteres Ausmaß eines Targetings zu erreichen. Geeignete gewebespezifische Promotoren schließen beispielsweise die induzierbaren IL-2 (Thompson et al., Mol. Cell. Biol. 12: 1043 (1992)), IL-4 (Todd et al., J.Exp. Med. 177:1663 (1993)) und IFNγ (Penix et al., J.Exit. Med. 178: 483 (1993)) T-Zellen anzielenden Promotoren ein. Diese Promotoren würden eine Produktion der löslichen Antigene in lymphoidem Gewebe, einschließlich mukosalem lymphoiden Gewebe, z.B. PP, erlauben. Natürlich wäre ein idealer Promotor ein für dendritische Zellen spezifischer Promotor.
Vektoren können auch durch Aufnahme in Liposomen oder andere Abgabevehikel entweder alleine oder gemeinsam mit zellspezifischen Antikörpern abgegeben werden, wie oben in Abschnitt B 2.1. beschrieben.
DNA oder transfizierte Zellen können in einem pharmazeutisch zulässigem Träger verabreicht werden. Pharmazeutisch zulässige Träger sind biologisch kompatible Vehikel, die zur Verabreichung an einen Menschen geeignet sind, z.B. physiologische Salzlösung. Eine therapeutisch wirksame Menge ist eine Menge an DNA der Erfindung, die in der Lage ist, ein medizinisch wünschenswertes Ergebnis in einem behandelten Tier hervorzurufen. Wie auf dem medizinischen Fachgebiet gut bekannt, hängt die Dosierung für jeden Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, der Fläche der Körperoberfläche, dem Alter, der besonderen Verbindung, die verabreicht werden soll, dem Geschlecht, der Zeit und dem Weg der Verabreichung, dem allgemeinen Gesundheitszustand und anderen Wirkstoffen, die gleichzeitig verabreicht werden. Die Dosierungen werden variieren, eine bevorzugte Dosierung zur Verabreichung von DNA beträgt jedoch ungefähr 10⁶ bis 10¹² Kopien des DNA-Moleküls. Diese Dosis kann wiederholt verabreicht werden, falls notwendig. Wege einer Verabreichung werden die oben im Abschnitt B.2.1. aufgeführten mukosalen Wege für lösliche Antigene sein. Die mukosalen Adjuvanzien, IL-12 und IFNγ können ebenfalls in den gleichen Kombinationen, über die auf den gleichen Wegen und in den selben Dosierungen verabreicht werden, wie in Abschnitt B.2.1. aufgeführt.
B.3 Quellen von Peptiden und Polypeptiden
Peptide und Polypeptide, die im Zusammenhang mit der Erfindung verwendet werden, können durch eine Vielfalt von Mitteln erhalten werden. Kleinere Peptide (mit einer Länge von weniger als 100 Aminosäuren) können auf herkömmliche Weise durch chemische Standardverfahren synthetisiert werden, die demjenigen, der sich auf dem Fachgebiet auskennt, vertraut sind, (z.B. siehe Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y. (1983)). Längere Peptide (mit einer Länge von mehr als 100 Aminosäuren) können durch eine Reihe von Verfahren, einschließlich rekombinanter DNA-Technologie, hergestellt werden (siehe oben). Einige Polypeptide (z.B. HIV-1, gp160, CT, LT, IL-12 oder IFNγ) können von kommerziellen Quellen bezogen werden.
Polypeptide, wie etwa HIV-1, gp160, CT, IL-12 oder IFNγ können aus biologischen Quellen durch Verfahren gereinigt werden, die den Fachleuten bekannt sind (Protein Purification, Principles and Practice, 2. Auflg. (1987) Scopes, Springer Verlag, N.Y.). Sie können auch in ihren natürlich vorkommenden, trunkierten, chimeren (wie beispielsweise in den CLUVAC) oder Fusionsprotein-Formen durch rekombinante DNA-Technologie unter Verwendung von Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt werden. Diese Verfahren schließen beispielsweise rekombinante DNA-Techniken in vitro, synthetische Techniken und genetische Rekombination in vivo ein. Siehe beispielsweise die Techniken, die in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; und Ausubel et al., Hrsg. (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., N.Y. beschrieben werden. Alternativ kann RNA, welche die Proteine kodiert, chemisch synthetisiert werden. Siehe beispielsweise die Techniken, die in Oligonukleotide Synthesis, (1984) Gait, M.J. Hrsg, IRL Press, Oxford, beschrieben werden.
Eine Vielfalt von Wirtsexpressionsvektorsystemen kann verwendet werden, um die Nukleotidsequenzen zu exprimieren. Wenn das Peptid oder das Polypeptid löslich ist, kann es wie folgt gewonnen werden aus: (a) der Kultur, d.h. aus der Wirtszelle in Fällen, in denen das Peptid oder Polypeptid nicht sezerniert wird; oder (b) aus dem Kulturmedium in Fällen, in denen das Peptid oder Polypeptid durch die Zellen sezerniert wird. Die Expressionssysteme umfassen auch konstruierte Wirtszellen, die das Polypeptid in situ exprimieren, d.h. verankert in der Zellmembran. Eine Reinigung oder Anreicherung des Polypeptids aus einem solchen Expressionsystem kann erreicht werden, indem geeignete Detergenzien und Lipidmizellen und Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden. Alternativ können derartig konstruierte Wirtszellen selbst in Situationen verwendet werden, in denen es wichtig ist, nicht nur die strukturellen und funktionellen Merkmale des Proteins zu erhalten, sondern auch die biologische Aktivität zu bestimmen.
Die Expressionssysteme, die zum Zwecke der Erfindung verwendet werden können, schließen Mikroorganismen, wie etwa Bakterien (z.B. E. coli und B. subtilis), die mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA transformiert sind, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren, welche die Nukleotidsequenzen enthalten, Hefe, die mit den rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren transformiert sind, Insektenzellen, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (Baculovirus) infiziert sind, Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, cauliflower mosaic virus, CAMV; Tabakmosaikvirus, TMV) infiziert sind oder mit rekombinanten Plasmidexpressionsvektoren transformiert sind oder Säugetierzellen (z.B. COS, CHO, BHK, 293, 3T3), welche rekombinante Expressionskonstrukte beherbergen, die Promotoren enthalten, die sich von dem Genom der Säugetierzellen (z.B. Metallothionein-Promoter) oder von Säugetierviren ableiten, ein.
In bakteriellen Systemen können eine Reihe von Expressionsvektoren vorteilhafterweise ausgewählt werden, was von der Verwendung, für die das Genprodukt, das exprimiert wird, vorgesehen ist, abhängt. Wenn beispielsweise eine große Menge eines solchen Proteins hergestellt werden soll, z.B. zur in vivo-Immunisierung, können Vektoren, welche die Expression großer Mengen von Fusionsproteinprodukten, die leicht gereinigt werden können, steuern, wünschenswert sein. Derartige Vektoren schließen den E.coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2: 1791 (1983)), in dem die kodierende Sequenz individuell in den Vektor im Leseraster mit der lacZ-kodierenden Region ligiert sein kann, damit ein Fusionsprotein produziert wird, pIN-Vektoren Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13: 3101 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503 (1989)) und derartiges ein, ohne darauf beschränkt zu sein. pGEX-Vektoren können auch verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) zu exprimieren. Im allgemeinen sind derartige Fusionsproteine löslich und können leicht aus lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen („beads"), gefolgt durch Elution in Gegenwart von freiem Glutathion gereinigt werden. Die pGEX werden so entworfen, daß sie Thrombin- oder Faktor-Xa-Protease-Spaltungsstellen einschließen, damit das klonierte Zielgenprodukt aus der GST-Gruppe freigesetzt werden kann.
Bei Säugetierwirtszellen können eine Anzahl von Expressionssystemen auf viraler Grundlage verwendet werden. In Fällen, in denen ein Adenovirus als ein Expressionsvektor verwendet wird kann die interessierende Nukleotidsequenz mit einem Adenovirus-Transkriptions/Translationskontrollkomplex, z.B. der späte Promotor und eine dreiteilige Leadersequenz, ligiert sein. Dieses chimere Gen kann dann in das Adenovirus-Genom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination eingefügt werden. Die Insertion in eine nicht-essentiellen Region des viralen Genoms (z.B. Region E1 oder E3) wird zu einem rekombinanten Virus führen, das lebensfähig und in der Lage ist, das Genprodukt in infizierten Wirten zu exprimieren (siehe z.B. Logan and Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655 (1984)). Spezifische Initiationssignale können auch zur wirksamen Translation von eingefügten Nukleotidsequenzen erforderlich sein. Diese Signale schließen das ATG-Initiationscodon und benachbarte Sequenzen ein. In Fällen, in denen ein ganzes Gen oder cDNA, einschließlich eines eigenen Initiationscodons und angrenzender Sequenzen, in den entsprechenden Expressionsvektor eingefügt werden, werden oft keine zusätzlichen translationalen Kontrollsignale benötigt. Allerdings müssen in Fällen, in denen nur ein Teil der kodierenden Sequenz eingefügt wird, exogene translationale Kontrollsignale, einschließlich vielleicht dem ATG-Initiationscodon, zur Verfügung gestellt werden. Weiterhin muß das Initiationscodon mit dem Leseraster der gewünschten kodierenden Sequenz in Phase sein, um eine Translation des gesamten Inserts sicherzustellen. Diese exogenen translationalen Kontrollsignale und Initiationscodons können aus einer Vielfalt von Ursprüngen stammen, sowohl natürlichen als auch synthetischen. Die Wirksamkeit der Expression kann durch die Einbeziehung entsprechender Transkriptionsenhancerelemente, Transkriptionsterminatoren etc. verstärkt werden (Bittner et al., Methods in Enzymol. 153: 516 (1987)).
Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm ausgewählt werden, welcher die Expression der eingefügten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt auf die spezielle gewünschte Weise modifiziert und prozessiert. Derartige Modifikationen (z.B. Glycosilierung) und eine Prozessierung (z.B. Spaltung) von Proteinprodukten kann für die Funktion des Proteins wichtig sein. Entsprechende Zellinien oder Wirtssysteme können ausgewählt werden, um die richtige Modifikation und das richtige Prozessieren des fremden exprimierten Proteins sicherzustellen. Säugetierwirtszellen schließen CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, und WI38 ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Für eine langfristige Produktion von rekombinanten Proteinen mit hoher Ausbeute wird eine stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zellinien, welche die oben beschriebenen Sequenzen stabil exprimieren, konstruiert werden. Eher als das Verwenden von Expressionsvektoren, welche virale Replikationsursprünge enthalten, können Wirtszellen mit DNA, welche durch entsprechende Expressionskontrollelemente (z.B. Promotor, Enhancer-Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen etc.) und einem selektierbaren Marker transformiert werden. Im Anschluß an das Einführen der Fremd-DNA werden die konstruierten Zellen 1 bis 2 Tage in einem angereichertem Medium wachsen gelassen, und werden dann in ein selektives Medium überführt. Der selektionsfähige Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht eine Resistenz gegenüber der Selektion und erlaubt den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und zu wachsen, um Foci zu bilden, die ihrerseits in Zellinien kloniert und expandiert werden können. Dieses Verfahren kann vorteilhafterweise verwendet werden, um Zellinien, welche das Genprodukt exprimieren, zu konstruieren. Derartige konstruierte Zellinien können insbesondere beim Durchmustern und bei der Evaluierung von Verbindungen nützlich sein, welche die endogene Aktivität des Genprodukts beeinflussen.
Ein Fusionsprotein kann leicht unter Verwendung eines Antikörpers oder eines Liganden, der spezifisch an das exprimierte Fusionsprotein bindet, gereinigt werden. Beispielsweise erlaubt ein System, beschrieben durch Liebknecht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972 (1991), die leichte Reinigung von nicht-denaturierten Fusionsproteinen, die in menschlichen Zellinien exprimiert werden. In diesem System wird das interessierende Gen in ein Vaccinia-Rekombinationsplasmid subkloniert, derart, daß das offene Leseraster des Gens mit einer aminoterminalen Markierung („tag"), bestehend aus 6 Histidin-Resten, translational fusioniert wird. Extrakte aus Zellen, die mit rekombinantem Vacciniavirus infiziert sind, werden auf Ni²⁺-Nitriloessigsäure-Agarose geladen, und Histidin-markierte Proteine werden selektiv mit Imidazol enthaltenden Puffern eluiert. Falls gewünscht, kann die Histidin-Markierung selektiv mit einem entsprechenden Enzym gespaltet werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht beschränken.
BEISPIELE
Material und Methoden
IR Immunisierung beim Menschen: Lösliche Antigene der Erfindung werden in einem pharmazeutisch zulässigen Träger, z.B. physiologische Salzlösung, gelöst und mit oder ohne Adjuvanz und mit oder ohne Cytokine, z.B. I1-12 und/oder IFNγ verabreicht. Letztere können systemisch oder gemeinsam mit dem Antigen verabreicht werden. Dosierungen des löslichen Antigens betragen ungefähr 0,001 mg bis 100 mg pro Verabreichung. Die Verabreichung kann einfach oder mehrfach erfolgen. Im Fall von vielfachen Immunisierungen können beispielsweise vier wöchentliche Verabreichungen erfolgen, gefolgt (falls gewünscht) durch eine erneute Immunisierung („booster") mehrere Monate (z.B. 2, 3, 4, 6, 8, oder 12) oder mehrere Jahre (z.B. 2, 3, 4, 5, 10, 20 oder 30) danach. Eine Verabreichung des Antigens (mit oder ohne Adjuvanz und mit oder ohne Cytokine) kann durch IR Einführung eines Zäpfchens, in welches die immunisierende Zusammensetzung aufgenommen worden ist, durch ein Klistier oder ein flexibles Sigmoidoskop erfolgen.
CTL-Aktivierungskulturen: Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung (bei jedem Experiment verschieden) wurde die CTL-Aktivität bestimmt. BALB/c-Mäuse wurden getötet und Därme und Milz wurden chirurgisch entfernt. Einzelzellsuspensionen wurden aus den Organen hergestellt durch Verfahren, mit denen der Durchschnittsfachmann vertraut ist. Im Fall von PP und LP, wurde die PP zunächst von der äußeren Oberfläche des Darms freipräpariert. Der übrige Darm wurde in kleine Abschnitte von 1 bis 3 mm Durchmesser geschnitten, die in Phosphat-gepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS) suspendiert wurden. Die Suspension mit den Gewebeabschnitten wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und unter den selben Bedingungen geschüttelt, um die intraepithelialen Lymphozyten (IEL) aus dem Gewebe freizusetzen. Die suspendierten IEL wurden verworfen und Gewebestücke wurden mit Collagenase Typ VIII (Sigma) (300 U/ml), gelöst in PBS, eine Stunde bei Raumtemperatur behandelt, um die LP-Zellen freizusetzen. PP-Zellen wurden aus den präparierten PP durch die selbe Collagenase-Behandlung extrahiert. Die Zellen (PP oder LP) wurden dann auf einen diskontinuierlichen Gradienten aufgegeben, der 75% und 40% Percoll enthielt, gefolgt durch Zentrifugation bei 2.000 Upm für 20 Minuten. Die Lymphozyten wurden aus der 75%/40%-Grenzschicht geerntet und zweimal gewaschen. Die Immunzellen aus Milz, PP, LP wurden mit 1μM P18IIIB-I10-Peptid mit einer Zelldichte von 5 × 10⁶/ml in 24-Well-Kulturplatten in komplettem T-Zell-Medium (complete T cell medium, CTM) kultiviert: RPMI 1640, das 10% fötales Rinderserum enthielt, zwei mM L-Glutamin, Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und 5 × 10^-5 M 2-Mercaptoethanol. P18IIIB-I10 ist ein Peptid, welches das minimal-essentielle CTL-Epitop von P18IIIB-I10 (SEQ ID NO:15) enthält und folgende Sequenz aufweist: RGPGRAFVTI (SEQ ID NO:16). Drei Tage später wurde ein 10%iger Überstand von mit Concanavalin A aktivierten Milzzellen als Quelle von Interleukin-2 (IL-2) zugesetzt. Nach sieben Tagen Kultivierung wurden LP-Lymphozyten (LPL) in einer zweiten siebentägigen Kultur mit 1 μM P18IIIB-I10-Peptid (SEQ ID NO:16) zusammen mit 4 × 10⁶ mit 3.300-rad bestrahlten, syngenen SP-Zellen stimuliert. Immune SP- und PP-Zellen wurden in ähnlicher Weise in vitro für zwei siebentägige Kulturzeiträume vor dem Test stimuliert. Die zytolytische Aktivität von CTL wurde durch einen vierstündigen Test mit ⁵¹Cr-markierten P815-Zielen unter Verwendung eines Verfahrens gemessen, mit dem der Durschnittsfachmann vertraut ist. Zum Überprüfen der Peptidspezifität von CTL wurden ⁵¹Cr-markierte P815-Ziele zwei Stunden mit Peptid zum Beginn des Tests gepulst. Die prozentuale spezifische ⁵¹Cr-Freisetzung wurde als 100x (experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung) berechnet. Die maximale Freisetzung wurde anhand von Überständen von Zellen bestimmt, die durch die Zugabe von 5% Triton-X 100 lysiert waren. Als eine Kontrolle wurde die spontane Freisetzung aus Zielzellen, die ohne Zugabe von Effektorzellen inkubiert wurden, bestimmt. Alle Werte für den Standardfehler des Mittelwerts aus dreifachbestimmten Kulturen betrugen < 5% des Mittelwerts.
Virus-Plaque-Test: Sechs Tage nach IR „Challenge" mit rekombinantem Vacciniavirus, das HIV-1 IIIB gp160 (vPE16) exprimiert, wurden die Mäuse getötet. Ihre Ovarien wurden entfernt, in Einzelzellsuspensionen dissoziiert und auf den vPE16-Titer untersucht, indem serielle 10-fach Verdünnungen auf einer Platte von BSC-2-Indikatorzellen ausplattiert, mit Kristallviolett gefärbt und die Plaques bei jeder Verdünnung gezählt wurden. Das minimal meßbare Maß an Virus waren 70 Plaque-bildende Einheiten (pfu).
Beispiel 1: Vergleich von mukosalen und systemischen CTL-Antworten nach mukosaler und systemischer Immunisierung
Mäuse wurden IR mit 4 Dosen (am Tag 0, 7, 14 und 21) des HIV-1-CLUVAC PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO:2) (50 μg/Maus) immunisiert. Fünf Wochen bis sechs Monate nach der ersten Dosis wurden antigenspezifische T-Zellen aus PP, LP und Milz isoliert und auf die Anwesenheit von HIV-1-P18IIIB-Peptid-spezifische CTL getestet (1), wie oben beschrieben. Geschlossene Quadrate zeigen das Abtöten von mit P18IIIB-I10 (SEQ ID NO:16) gepulsten Zielen, und offene Rauten zeigen das Abtöten von ungepulsten Zielen. Die IR Immunisierung induzierte langanhaltende protektive Immunantworten: antigenspezifische CTL wurden an mukosalen induktiven (PP) und effektorischen (LP) Orten und an einem syntemischen Ort (Milz) mindestens sechs Monate nach der Immunisierung nachgewiesen. Im Gegensatz dazu induzierte eine systemische Immunisierung (s.c. in unkomplettem Freund'schem Adjuvanz) CTL in der Milz, jedoch nicht im mukosalen Immunsystem (d.h. PP und LP).
Beispiel 2: Vergleich von CTL-Antworten mit und ohne mukosalem Adjuvanz BALB/c-Mäuse wurden IR mit 4 Dosen des synthetischen HIV-1-CLUVAC PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO:2) (50 μg/Maus je Immunisierung) alleine, d.h. ohne Adjuvanz oder Cytokine, am Tag 0, 7, 14 und 21 immunisiert. Parallel dazu wurde eine weitere Gruppe von Mäusen IR mit PCLUS3-P18IIIB (SEQ ID NO:2)-HIV-1-Peptid in Kombination mit CT (1 μg/Maus) immunisiert. Am Tag 35 wurden antigenspezifische T-Zellen aus PP, LP und Milz isoliert. Immunzellen der Milz, PP oder LP wurden kultiviert und auf antigenspezifische CTL überprüft (2), wie oben beschrieben. Geschlossene Quadrate zeigen das Abtöten von mit P18IIIB-I10 (SEQ ID NO:16) gepulsten Zielen, und offene Rauten zeigen das Abtöten ungepulster Ziele. Eine IR Verabreichung von Peptid allein induzierte eine signifikante Antwort. Die Antwort wurde durch die gleichzeitige Verabreichung von CT verstärkt.
Beispiel 3: CTL, induziert durch mukosale Immunisierung, lysieren Ziele, die HIV-1-gp160-Hüllprotein exprimieren
Mäuse wurden IR mit 4 Dosen (am Tag 0, 7, 14 und 21) des HIV-1 CLUVAK PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO:2) (5 μg/Maus pro Immunisierung) in Gegenwart von CT (1 μg/Maus) immunisiert. Am Tag 35 wurden antigenspezifische T-Zellen aus PP, LP und Milz isoliert. Immunzellen von SP, PP oder LP wurden wie oben beschrieben kultiviert. Die zytolytische Aktivität von CTL wurde unter Verwendung eines ⁵¹Cr-Freisetzung-Standardtests gemessen (3).
Drei verschiedene Zellinien wurden als Zielzellen verwendet: 15-12-Zellen, 3T3 18 Neo BALB/c-Zellen und P815-Zellen. 15-12-Zellen sind BALB/c-3T3-Fibroblasten, die mit einem Vektor transfiziert sind, der HIV-1-gp160 kodiert (Takahashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3105 (1988)); 3T3 18 Neo BALB/c-Zellen sind BALB/c-373-Fibroblasten, die mit einem Expressionsvektor transfiziert sind, der ein Neo-Gen, jedoch kein gp160-Gen enthält; und P815-Zellen sind untransfizierte Zellen, die antigene Peptide, die der Kultur zugesetzt wreden, präsentieren. Eine CTL-Lyse von gp160 exprimierenden 15-12-Zellen (geschlossene Quadrate in rechten Tafeln) wurden mit der von gp160 nicht exprimierenden 3T3 18 Neo BALB/c-Kontrollzellen (offene Rauten, rechte Tafeln) verglichen. Die P815-Zielzellen (linke Tafel) wurden in Gegenwart von (geschlossene Quadrate) oder ohne (offen Rauten) P18IIIB-I10-Peptid (SEQ ID NO:16) (1 μM) getestet. Die prozentuale spezifische ⁵¹Cr-Freisetzung wurde wie oben beschrieben berechnet. Durch IR Immunisierung induzierte CTL töteten Zielzellen, die entweder HIV-gp160 endogen exprimierten oder mit P18IIIB-Peptid (SEQ ID NO:15) gepulst waren, ab.
Beispiel 4: CTL, induziert duch IR Immunisierung, sind von IL-12 abhängig
BALB/c-Mäusen wurden IR mit 4 Dosen (am Tag 0, 7, 14 und 21) des CLUVAC PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO:2) (50 μg/Maus pro Immunisierung) in Kombination mit CT (1 μg/Maus) immunisiert. Einen Tag vor und einen Tag nach der Immunisierung mit dem Peptid wurden die Mäuse intraperitoneal (i.p.) mit anti-IL-12-Antikörper (0,5 mg pro Injektion: 4 mg/Maus Gesamtdosis) (4, rechte Tafeln) behandelt oder blieben unbehandelt (4, linke Tafeln). Am Tag 35 wurden antigenspezifische T-Zellen aus PP, LP und Milz isoliert. Immunzellen aus Milz, PP oder LP wurden wie oben beschrieben kultiviert. Die zytolytische Aktivität der CTL wurde wie oben beschrieben gemessen (4). Zum Überprüfen der Peptidspezifität der CTL wurden ⁵¹Cr-markierte P815-Ziele mit dem Peptid P18IIIB-I10 (SEQ ID NO:16) zu Beginn des Tests (geschlossene Quadrate) gepulst oder blieben (als eine Kontrolle) ungepulst, d.h. ohne Peptid (offene Rauten). Die Induktion sowohl von mukosalen als auch systemischen CTL-Antworten durch IR Immunisierung war IL-12-abhängig, wie durch die Hemmung der Induktion von CTL bei Mäusen, die i.p. mit anti-IL-12-Antikörper behandelt wurden, gezeigt wurde.
BALB/c-Mäuse wurden IR am Tag 0, 7, 14 und 21 mit entweder Zusammensetzung A, die das synthetische HIV-1-CLUVAC PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO:2) (50 μg/Maus pro Immunisierung), CT (10 μg/Maus pro Immunisierung) und rekombinantes IL-12 (1 μg/Maus pro Immunisierung) enthielt oder mit Zusammensetzung B, die das synthetische HIV 1-CLUVAC PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO: 2) (50 μg/Maus pro Immunisierung) und CT (10 μg/Maus pro Immunisierung) enthielt, immunisiert. Am Tag 35 wurden antigenspezifische T-Zellen aus den PP und der Milz isoliert. Immunzellen aus den PP (9A) und der Milz (9B) wurden getrennt kultiviert und auf antigenspezifische CTL überprüft, wie oben beschrieben. 9A zeigt das Abtöten von mit dem Peptid P18IIIB-I10 (SEQ ID NO:16) gepulsten Zielzellen durch Effektorzellen von Mäusen, die mit der Zusammensetzung A (d.h. Antigen mit IL-12) (offene Quadrate) immunisiert waren, und 9B zeigt das Abtöten der mit P18IIIB-I10 (SEQ ID NO:16) gepulsten Zielzellen durch Effektorzellen von Mäusen, die mit Zusammensetzung B (d.h. Antigen ohne IL-12) (offen Rauten) immunisiert waren. Sowohl in 9A als auch 9B wurden die Kontrollwerte unter Verwendung der zwei Effektorpopulationen, die auf ungepulsten Zielen getestet wurden, erhalten. Die verstärkten CTL-Antworten sowohl von PP- (9A) als auch Milz- (9B) Effektorzellen von Mäusen, die IR mit Zusammensetzung A immunisiert wurden, zeigten im Vergleich zu den Antworten, die durch IR Immunisierung mit Zusammensetzung B ausgelöst wurden, daß eine gleichzeitige Verabreichung von IL-12 die mukosalen und systemischen CTL-Antworten erhöhten. Diese Werte liefern beide unabhängig voneinander einen Hinweis auf die Rolle von IL-12 beim Auslösen von mukosaler (und systemischer) Immunität durch mukosale Verabreichung von Antigenen und bestätigen die Befunde der oben beschriebenen Werte für die Antikörperhemmung.
Beispiel 5: Intrarektale Peptid-Immunisierung schützt vor einem mukosalen Angriff durch HIV-gp160 exprimierendes rekombinantes Vacciniavirus
Gruppen von 5 Mäusen wurden IR mit 4 Dosen des HIV-1-CLUVAC PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO:2) (50 μg/Maus pro Immunisierung) am Tag 0, 7, 14 und 21 in Kombination mit C7 immunisiert. Zum Tag 35 wurden die Mäuse IR mit 2,5 × 10⁷ pfu Vacciniavirus, das gp160IIIB (vPE16) exprimierte, „herausgefordert". Nach 6 Tagen wurden die Mäuse getötet und ihre Ovarien wurden auf das Vorhandensein von Virus untersucht (5), wie oben beschrieben. Der linke Balken in 5 zeigt den Virustiter in den Ovarien von nicht immunisierten Mäusen, und der rechte Balken zeigt den Virustiter in Ovarien von immunisierten Mäusen. Eine IR Immunisierung mit PLCUS3-18IIIB (SEQ ID NO:2) schützte Mäuse gegen einen IR Angriff mit vPE16, wie durch eine 4,5 log-Reduktion der viralen pfu in Ovarien im Vergleich zu nicht immunisierten Tieren gezeigt (p < 0,005).
Beispiel 6: Vergleich der systemischen CTL-Antworten sechs Monate nach IR und IN Immunisierung
Mäuse wurden IR oder IN mit 4 Dosen (am Tag 0, 7, 14 und 21) des HIV-1 CLUVAC PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO:2) (50 μg/Maus) immunisiert. Sechs Monate nach der ersten Dosis wurden antigenspezifisch T-Zellen aus der Milz isoliert und auf das Vorhandensein von HIV-1-P18IIIB-I10 (SEQ ID NO:16) -Peptid-spezifische CTL (6A und 6) überprüft, wie oben beschrieben. Geschlossene Quadrate zeigen das Abtöten von mit P18IIIB-I10 (SEQ ID NO:16) gepulsten Zielen, und offen Rauten zeigen das Abtöten ungepulster Ziele. Das Ausmaß der CTL-Aktivität, induziert durch IR-Immunisierung (6A), war höher als die, die durch IN-Immunisierung (6B) induziert wurde. Diese Werte zeigen, daß eine IR Immunisierung wirksame, langfristige antigenspezifische Immunantworten der Milz induzierte.
Um verschieden Wege einer Immunisierung zu evaluieren, wurden Mäuse mukosal (IR, IN, IG) oder systemisch (SC) mit 4 Dosen (amzum Tag 0, 7, 14 und 21) des HIV-1-CLUVAC PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO:2) (50 μg/Maus) immunisiert. Fünfunddreißig Tage nach der ersten Dosis wurden antigen-spezifische T-Zellen aus den PP und der Milz isoliert und auf das Vorhandensein von HIV-1 P18IIIB-I10 (SEQ ID Nr.: 16) -Peptid-spezifischen CTL überprüft, wie oben beschrieben (7). Geschlossene Balken zeigen das Abtöten von mit P18IIIR-I10 (SEQ ID NO:16) gepulsten Zielen, und offene Balken zeigen das Abtöten von ungepulsten Zielen. Das Ausmaß der durch IR Immunisierung induzierten CTL-Aktivität war in induktivem mukosalem Gewebe (PP) signifikant höher und in systemischem immunologischem Gewebe (SP) viel höher als wenn die Induktion auf anderen mukosalen Wegen (IN und IG) induziert wurde. Eine CTL-Aktivität wurde sowohl in PP als auch der Milz nach Immunisierung auf allen drei mukosalen Wegen nachgewiesen. Nur die systemische Immunisierung (SC) führte zu einer signifikanten CTL-Aktivität in der Milz.
Beispiel 7: CTL, induziert durch IR Immunisierung, sind von IFNγ abhängig
Wildtyp-BALB/c-Mäuse und BALB/c-Mäuse, denen die Fähigkeit, funktionelles IFNγ herzustellen, fehlte (IFNγ^-/--Mäuse) (Dalton et al., Science 259: 1739 (1993); Tishon et al., Virology 212: 244 (1995)) wurden IR mit 4 Dosen (am Tag 0, 7, 14 und 21) des CLUVAC PCLUS3-18IIIB (SEQ ID NO:2) (50μg/Maus pro Immunisierung) in Kombination mit CT (1 μg/Maus) immunisiert. Am Tag 35 wurden antigenspezifische T-Zellen aus PP, LP und Milz isoliert. Immunzellen aus Milz, PP oder LP von Wildtyp-BALB/c- und IFNγ^-/--Mäusen wurden wie oben beschriebne kultiviert. Die zytolytische Aktivität der CTL wurde gemessen (8A und 8B), wie oben beschrieben. Die Peptid-Spezifität von CTL wurde wie folgt getestet: ⁵¹Cr-markierte P815-Ziele wurden mit dem Peptid P18IIIB-I10 (SEQ ID NO:16) zu Beginn des Tests (geschlossene Balken) gepulst oder (als eine Kontrolle) blieben ungepulst, d.h. ohne Peptid (offene Balken). Die Induktion sowohl von mukosalen als auch systemischen CTL-Antworten durch IR Immunisierung war IFNγ-abhängig, wie durch das Fehlen von nachweisbarer CTL-Aktivität in Milz-, PP- und LP-Zellen aus IFNγ^-/--Mäusen (8B) und wirksamer CTL-Aktivität in Milz-, PP- und LP-Zellen von Wildtyp-BALB/c-Mäusen ( 8A) gezeigt.
Wenn man die vorangehenden Ergebnisse zusammenfaßt, führt eine mukosale Verabreichung eines antigenen Peptids an Mäuse zur Induktion einer protektiven CTL-Antwort, die sowohl an induktiven (Peyer-Plaques, PP) als auch effektorischen (Lamina propria, LP) Orten des intestinalen mukosalen Immunsystems, ebenso wie in systemischem lymphoidem Gewebe, d.h. der Milz (spieen, SP) nachweisbar sind. Die mukosale CTL-Antwort wird durch gleichzeitiges Verabreichen des mukosalen Adjuvanzes Choleratoxin (CT) mit dem antigenen Peptid verstärkt, wird durch einen Antikörper, der spezifisch an Interleukin-12 (IL-12) bindet, (wodurch dessen Aktivität neutralisiert wird), gehemmt, und ist bei Mäusen, denen die Fähigkeit, funktionelles Interferon-γ (IFNγ) herzustellen, fehlt, nicht nachweisbar. Weiterhin führte die Aufnahme von IL-12 in die Zusammensetzung aus antigenem Peptid und CT, die zur IR Immunisierung verwendet wurde, zu verstärkten PP- und SP-CTL-Antworten im Verhältnis zu denen, die durch IR Immunisierung mit antigenem Peptid, CT und ohne IL-12 erhalten worden waren. Eine IR Immunisierung mit dem viralen Peptid führte zum Schutz vor einer viralen Infektion nach anschließendem IR Angriff mit dem entsprechenden Virus.
Beispiel 8: Vergleich verschiedener HIV-Vakzin-Peptide zur Verwendung beim Auslösen eines viralen mukosalen Schutzes
Aufgrund der Variabilität der V3-Schleife von HIV wurden weitere Studien durchgeführt, wobei zwei Cluster-Peptid-Konstrukte verglichen wurden, indem die V-Schleife verwendet und das CTL-Epitop P18 aus dem Stamm IIIB (Ratner et al., Nature 313: 277-284, (1985)) oder MN (Gurgo et al., Virology 164:531-536, (1998)) von HIV-1 eingebaut wurden. Diese Studien wurden als eine beispielhafte Analyse durchgeführt, um zu zeigen, daß HIV-Vakzin-Cluster-Peptid-Konstrukte aus verschiedenen HIV-Stämmen hergestellt und in side-by-side-Tests durchgemustert werden können, um die Induktion einer mukosalen CTL-Immunität zu optimieren.
Versuchstiere: Bei jedem der folgenden Beispiele wurden BALB/c-Mäuseweibchen vom Frederick Cancer Research Center (Frederick, MD) bezogen. IFNγ^-/--Mäuse wurden von den Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) bezogen. Die in diesen Studien eingesetzten Mäuse waren 6-12 Wochen alt. Die IFNγ^-/--Mäuse wurden in einer speziellen pathogenfreien Mikroisolatorumgebung gehalten.
Immunisierung: Die Mäuse wurden mit vier Dosen des synthetischen HIV-Peptid-Vakzin-Konstrukts PCLUS3-18IIIB (Ahlers et al., J. Immunol. 150: 5647-5665, (1993)) (50 μg/Maus bei jeder Immunisierung) am Tag 0, 7, 14 und 21 in Kombination mit Choleratoxin (CT) (10 μg/Maus) (List Biological Laboratories, Campbell, CA) durch intrarektale Verabreichung immunisiert. Zur subkutanen Immunisierung wurde inkomplettes Freund'sches Adjuvanz verwendet. rmIL-12 (großzugigerweise abgegeben vom Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA) wurde entweder intraperitoneal (IP) (1 μg) oder intrarektal (1 μg), gemischt mit DOTAP (Boehringer Mannheim), einem kationischen Lipofectionsmittel, gemeinsam mit dem Peptidvakzin abgegeben.
Zellreinigung: Fünf Wochen bis 6 Monate nach der ersten Dosis wurden antigenspezifische T-Zellen aus den Peyer-Plaques (PP), der Lamina propria (LP) und der Milz (SP) isoliert. Es erfolgte eine sorgfältige Excision der Peyer-Plaques aus der interstinalen Wand und sie wurden zu Einzelzellen dissoziiert, indem Collagenase Typ VIII, 300 U/ml (Sigma) verwendet wurde, wie beschrieben (Mega et al., Int. Immunol. 3: 793-805, (1991)). Unsere Ergebnisse zeigen, daß die meisten PP-CD3-T-Zellen, die aus normalen Mäusen isoliert wurden, CD4⁺ waren, während CD3⁺CD8⁺-T-Zellen weniger häufig vorkamen. Weiterhin veränderte Collagenase die Expression von CD3, CD4 oder CD8 auf Milz-T-Zellen, die mit diesem Enzym behandelt wurden, nicht. Die Isolierung von Lamina propria-Lymphozyten (LPL) wurde durchgeführt, wie beschrieben (Mega et al., Int. Immunol. 3: 793-805, (1991)). Die Dünndärme wurden aus einzelnen Mäusen herauspräpariert und die mesenterischen und konnektiven Gewebe sorgfältig entfernt. Fäkalmaterial wurde aus dem Lumen mit nicht-supplementiertem Medium (RPMI 1640) gespült. Nachdem die PP identifiziert und von der intestinalen Wand entfernt worden waren, wurden die Därme der Länge nach geöffnet, in kurze Abschnitte geschnitten und ausführlich in RPMI, das 2 % fötales Rinderserum (FBS) enthielt, gewaschen. Um die Epithelzellschicht zu entfernen, wurden die Gewebe in 100 ml 1 mM EDTA gelegt und zweimal (zunächst für 40 min. und dann für 20 min.) bei 37°C unter Rühren inkubiert. Nach der EDTA-Behandlung wurden die Gewebe in komplettem RPMI-Medium 10 min. bei Raumtemperatur gewaschen und dann in 50 ml RPMI, das 10% FCS enthielt, gelegt, und 15 min. bei 37°C unter Rühren inkubiert. Die Gewebe und das Medium wurden in ein 50 ml-Röhrchen überführt und 15 sec. heftig geschüttelt, und dann wurde das Medium, das die Epithelzellen enthielt, entfernt. Diese mechanische Entfernung von Zellen wurde noch zweimal wiederholt, wobei jedes Mal frisches Medium verwendet wurde, um die Epithelzellschicht vollständig zu entfernen. Die histologische Untersuchung zeigte, daß die Struktur der Villi und der Lamina propria erhalten geblieben war. Um die LPL zu isolieren, wurden die Gewebe in kleine Stücke geschnitten und mit RPMI 1640 das Collagenase Typ VIII, 300 U/ml (Sigma) enthielt, 50 min. bei 37°C unter Rühren inkubiert. Überstände, die Zellen enthielten, wurden gesammelt, gewaschen und dann in komplettem RPMI 1640 resuspendiert. Dieses Dissoziierungsverfahren mittels Collagenase wurde zweimal wiederholt und die isolierten Zellen vereinigt und nochmals gewaschen. Die Zellen wurden über eine Baumwolle-Glaswolle-Säule geschickt, um tote Zellen und Gewebedebris zu entfernen, und dann auf einen diskontinuierlichen Gradienten geschichtet, der 75% und 40% Percoll (Pharmacia Fine Chemicals, Pharmacia Inc., Schweden) enthielt. Nach Zentrifugation (4°C, 600g, 20 min.) wurde die Grenzschicht zwischen dem 75%igem und dem 40%igem Percoll sorgfältig entfernt und mit inkomplettem Medium gewaschen. Dieses Verfahren lieferte > 90% lebende Lymphozyten mit einer Zellausbeute von 1,5-2 × 10⁶ Lymphozyten/Maus. Die Milz wurde aseptisch entfernt, und es wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt, indem sie vorsichtig durch sterile Siebe gedrückt wurden. Die Erythrozyten wurden in Tris-gepuffertem Ammoniumchlorid lysiert, und die restlichen Zellen wurden ausführlich in RPMI 1640, das 20% FBS enthielt, gewaschen.
Cytotoxische T-Lymphozyten-Test: Immunzellen aus SP, PP und LP wurden in einer Konzentration von 5 × 10⁶/ml in 24-Well-Kulturplatten in komplettem T-Zell-Medium (complete T cell medium, CTM) kultiviert: RPMI 1640, das 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und 5 × 10^-5 M 2-Mercaptoethanol enthielt. Drei Tage später wurden 10% eines Concanavalin A-Überstand enthaltenden Mediums als eine Quelle von IL-2 zugesetzt. Die LPL wurden nach siebentägiger Stimulation mit 1 μM P18IIIB-I10-Peptid zusammen mit 4 × 10⁶ mit 3.300 rad bestrahlten syngenen Milzzellen untersucht. SP- und PP-Zellen wurden in vitro auf ähnliche Weise für einen oder zwei siebentägige Kultivierungszeiträume vor dem Test stimuliert. Die zytolytische Aktivität der CTL-Linien wurde durch einen vierstündigen Test mit ⁵¹Cr-markierten Zielen gemessen. Zwei verschiedene Zellinien wurden als Zielzellen verwendet: 1) 15-12 Zellen, (Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 31053109 (1988), BALB/c-373 fibroblasts transfected with HIV-1IIIB gp160 and endogenously expressing HIV gp160), verglichen mit 18 Neo BALB/c 3T3 Fibroblasten, die nur mit Neo^R transfiziert waren, als eine Kontrolle , und 2) P815-Ziele, getestet in Gegenwart von oder ohne I10-Peptid (1μM). Zum Überprüfen der Peptidspezifität von CTL wurden ⁵¹Cr-markierte P815-Ziele zwei Stunden mit Peptid zu Beginn des Tests gepulst. Die prozentuale spezifische ⁵¹Cr-Freisetzung wurde berechnet als 100 × (experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung). Die maximale Freisetzung wurde anhand von Überständen von Zellen bestimmt, die durch Zugabe von Triton-X 100 lysiert wurden. Die spontane Freisetzung wurde aus Zielzellen bestimmt, die ohne Zugabe von Effektorzellen inkubiert worden waren.
Vacciniavirus: Das rekombinante Vacciniavirus vPE16 exprimiert das HIV-1-gp160-Gen aus dem Isolat IIIB (BH8) (Earl et al., J. Virol. 64: 2448-2451 (1990)). Die Expression wird durch den frühen/späten P7.5-Promotor gesteuert. Zwei Kopien der Sequenz T5NT, welche als ein Transkriptionsterminationssignal für frühe Vacciniavirus-Gene dient, sind in dem IIIB gp 160-Gen vorhanden. Beide sind in vPE16 verändert worden, damit die ursprüngliche kodierende Sequenz erhalten bleibt und um eine frühe Transkription des Gens zu ermöglichen. Das Virus vSC8 wird als eine negative Kontrolle ohne gp160 verwendet (Chakrabarti et al., Mol. Cell Biol. 5: 3403-3409 (1985)). Sowohl vPE16 als auch VSC8 exprimieren beta-Galactosidase.
Bestimmung des Virustiters im Ovar: Am Tag 35 oder 6 Monate nach der Cluster-Peptid-HIV-Vakzin-Immunisierung wurden Mäuse intrarektal mit 2,5 × 10⁷ pfu des gp160IIIB (vPE16) exprimierenden Vakziniavirus angegriffen. Sechs Tage nach dem Angriff mit dem rekombinanten Vacciniavirus, das HIV-gp160 exprimierte, wurden die Mäuse getötet, und die Ovarien wurden entfernt, homogenisiert, mit Ultraschall behandelt und auf den vPE16-Titer untersucht, indem serielle 10-fache Verdünnungen auf einer Platte von BSC-2-Indikatorzellen ausplattiert, mit Kritallviolett gefärbt und die Plaques von jeder Verdünnung gezählt wurden. Das minimal nachweisbare Maß an Virus betrug 100 pfu.
Um verschiedene HIV-Vakzin-Cluster-Peptid-Konstrukte zu vergleichen, wurden BALB/c-Mäuse intrarektal mit Peptid (PCLUS3-18IIIB oder PCLUS3-18MN) in Gegenwart von CT als einem mukosalen Adjuvanz wöchentlich über 4 Wochen (am Tag 0, 7, 14, und 21) immunisiert. Die Mäuse wurden entweder 2 Wochen später (Tag 35) oder nach 6 Monaten auf Memory-CTL-Antworten in den Peyer-Plaques (PP) oder der Milz (SP) untersucht. Eine IR-Immunisierung mit beiden Peptiden PCLUS3-18IIIB oder PCLUS3-18MN in Kombination mit CT induzierte eine P18-spezifsche CTL-Antwort in den intestinalen PP (10, Tafel A) und in der Milz (10, Tafel B).
Allerdings war das Ausmaß einer CTL-Anwort nach IR Immunisierung mit PCLUS3-18MN signifikant niedriger als nach IR Immunisierung mit PCLUS3-18IIIB. Der Unterschied kann eine höhere Affinität des mindestens 10-mer P18IIIB-I10 im Vergleich zu P18MN-T10 zu H-2D^d widerspiegeln (Takahashi et al., Science 246: 118-121 (1989); Takeshita et al., J. Immunol. 154: 19731986 (1995)). Auch wurde eine sehr viel größere Produktion von IFNγ durch mukosale P18IIIB-spezifische CD8⁺-CTL im Vergleich zu P18-MN-spezifischen CTL nach Stimulation mit spezifischem Peptid in vitro für 48 Stunden beobachtet. Wenn sie auf 15-12 gp160IIIB-transfezierten Fibroblastenzielen, die endogen gp 160IIIB exprimierten, getestet wurden, töteten die CTL, die durch Immunisierung mit PCLUS3-18IIIB ausgelöst worden waren, ebenfalls diese Ziele. Auf der Grundlage dieser Beobachtungen wurde das PCLUS3-18IIIB-Konstrukt in den unten beschriebenen Schutzexperimenten eingesetzt.
Beispiel 9: Mukosale Immunisierung von Mäusen mit Cluster-Peptid-Konstrukt macht einen langfristigen Schutz vor einer Infektion mit rekombinantem Vacciniavirus, das HIV 1g 60 exprimiert, verfügbar
In den vorangehenden Beispielen wird die Fähigkeit der mukosalen Immunantworten, die durch das HIV-Cluster-Peptid-Vakzin induziert wurden, vor einem Virusangriff auf dem mukosalen Weg zu schützen, gezeigt. Um die Spezifität diese Schutzes vor rekombinantem Protein HIV-1 IIIB gp160 zu bestimmen, wurden IR immunisierte Mäuse am Tag 35 nach dem Beginn der Immunisierung durch IR Infusion mit Vacciniavirus, das HIV-1 IIIB gp160 (vPE16) exprimiert, oder mit Kontroll-Vacciniavirus, das beta-Galaktosidase (vSC8) exprimiert, „herausgefordert". Nicht-immunisierte Tiere, die mit vPE16 oder vSC8 „herausgefordert" wurden, dienten als Kontrollen. Sechs Tage nach dem Angriff wurden die Mäuse getötet, und die Ovarien wurden entfernt und der Vaccinia-Titer untersucht (sechs Tage nach Infektion mit Vaccinia enthalten die Ovarien den höchsten Virustiter).
Eine IR Immunisierung mit dem synthetischen HIV-Peptid-Vakzin schützte Mäuse vor einem IR Angriff mit Vacciniavirus, das HIV-1 IIIB gp160 exprimierte, im Vergleich zu nichtimmunisierten Kontrollen, sie schützte jedoch nicht vor einer IR Impfung mit Vacciniavirus, das nur ein unverwandtes Protein, beta-Galactosidase, exprimierte (11). Demnach war der Schutz spezifisch für ein Virus, das HIV-1 gp160 exprimiert, und jede unspezifische inflammatorische Antwort, intrarektal durch die Peptidinfusion induziert, war nicht ausreichend, um vor einem viralen Angriff zwei Wochen nach der letzten Dosis der Immunisierung zu schützen.
Obwohl das Vorhandensein von mukosalen Memory-CTL-Vorläufern beobachtet wurde, was eine Restimulierung der Aktivität in vitro 6 Monate nach IR Immunisierung erforderte (Belyakov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1709-1714 (1998)), blieb die Stärke und Dauer des Schutzes unklar. Um diese Frage zu lösen, wurden die IR immunisierten Mäuse 6 Monate nach Beginn der Immunisierung mit PCLUS3-18IIIB durch IR Verabreichung mit Vacciniavirus, das HIV-1 IIIB (PE16) exprimierte, „herausgefordert". Diese Studie zeigte, daß sogar 6 Monate nach HIV-Cluster-Peptid-Immunisierung BALB/c-Mäuse einen Schutz gegen einen Angriff mit rekombinantem HIV-Vakzin zeigten (12).
Beispiel 10: Ein Schutz von Mäusen gegen einen mukosalen viralen Angriff wird durch CD8⁺-CTL am mukosalen Ort vermittelt
Um den Immunmechanismus zu bestimmen, der für einen Schutz vor einem mukosalen Angriff mit einem Virus, das gp160 exprimiert, verantwortlich ist, wurden Mäuse IP mit 0,5 mg monoklonalem anti-CD8-Antikörper (Klon 2.43, NIH, Frederick, MD) einen Tag vor und nach jeder der vier Immunisierungen und ebenfalls zwei Tage vor und drei Tage nach dem Angriff mit vPE16 behandelt. Diese Behandlung führte zu einer signifikanten Hemmung des Schutzes vor einem mukosalen Angriff durch vPE16 (13). Folglich wird ein Schutz am mukosalen Ort gegen das Virus, das HIV-1 gp160 exprimiert, durch CD8⁺-Lymphozyten exprimiert, vermittelt.
Da die hier offenbarten HIV-Peptid-Konstrukte sowohl starke mukosale als auch systemische, auf MHC-Klasse I beschränkte CD8⁺-CTL-Antworten auslösen (Belyakov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1709-1714 (1998)), wurde die Rolle dieser Antworten beim Vermitteln eines Schutzes weiter untersucht. Da eine SC Immunisierung mit Peptidvakzin Milz-CTL, jedoch keine mukosalen CTL auslöste, während eine IR Immunisierung beides auslöste (14), können SC und IR Immunisierungen verglichen werden, um zu bestimmen, ob systemische CTL ausreichen, um vor einem mukosalen Angriff zu schützen, oder ob lokale mukosale CTL erforderlich sind. Dementsprechend wurden Mäuse mit PCLUS3-18IIIB plus IFA auf dem SC Weg oder mit PCLUS3-18IIIB und CT auf dem IR Weg am Tag 0, 7, 14 und 21 immunisiert, und diese Ansätze wurden verglichen. Am Tag 35 nach Beginn der Immunisierung wurden diese Gruppen von Mäusen ebenso wie nicht-immunisierte Kontrollmäuse durch IR Verabreichung von Vacciniavirus, das HIV-1 gp160 (vPE16) exprimiert, „herausgefordert". Schließlich wurden 6 Tage nach dieser Impfung die Mäuse getötet, und der virale Titer ihrer Ovarien wurde untersucht.
Eine SC Immunisierung mit PCLUS3-18IIIB schützte die Mäuse nicht vor einem mukosalen Angriff mit vPE16, während eine IR Immunisierung mit dem selben Peptid schützte ( 14B). Folglich kann ein Schutz vor einem mukosalen Angriff mit einem Virus, das HIV-1 gp160 exprimiert, nur durch eine mukosale Immunisierung von Mäusen induziert werden und korreliert mit der lokalen mukosalen CTL-Aktivität, jedoch nicht mit der Aktivität von Milz.-CTL. Auf dieser Grundlage kann man schlußfolgern, daß der CD8⁺-CTL-vermittelte Schutz vor dem mukosalen Angriff mit rekombinantem Vakzin, das HIV-1 gp160 exprimiert, lokale mukosale CD8⁺-CTL erfordert, während eine systemische CTL-Antwort nicht ausreichend ist.
Beispiel 11: Cytokin-Abhängigkeit und Verstärkung des Schutzes durch lokale Verabreichung von IL-12 mit dem Vakzin
Die Induktion von mukosalen CTL durch Peptidvakzin ist abhängig von endogenem IL-12, dergestalt, daß sie durch Behandlung von Mäusen in vivo mit anti-IL-12 unterbunden werden kann (Belyakov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:1709-1714, (1998)). Um die Rolle von IL-12 bei der CTL-Antwort und dem Schutz näher zu definieren, wurden BALB/c (H-2D^d) -Mäuse auf dem IP Weg mit 1 μg des rmIL-12 an jedem Tag der IR Immunisierung mit PCLUS3-18IIIB (50 μg/Maus) behandelt. Diese Behandlung führte nicht zu signifikanten Änderungen der HIV-spezifischen CTL-Aktivität an entweder mukosalen oder systemischen Orten ( 15). Wenn allerdings die Mäuse mit rmIL-12 (1 μg) + DOTAP intrarektal zusammen mit dem Peptid behandelt wurden, fanden wir einen signifikanten Antstieg der CTL-Anzahl sowohl an mukosalen als auch systemischen Orten 35 Tage nach Beginn der Immunisierung (15).
Angesichts der oben dargestellten Ergebnisse wurde die Möglichkeit, daß rmIL-12, verabreicht am lokalen Ort und zum Zeitpunkt der mukosalen Immunisierung, einen Schutz vor einem mukosalen Angriff mit Vacciniavirus, das HIV-1 gp160 exprimiert, steigern könnte, untersucht. Um sich dieser Frage zuzuwenden, wurden BALB/c-Mäuse mit rmIL-12 + DOTAP intrarektal zusammen mit dem Peptid immunisiert. Die Mäuse wurden dann am Tag 35 nach Beginn der Immunisierung durch IR Verabreichung von Vacciniavirus, das HIV-1 IIIB gp160 exprimiert, „herausgefordert. In dieser Studie wurde die zweifache Dosis des angreifenden Virus verwendet, wobei die nicht-immunisierten Mäuse eher einen Titer von mehrfach 10¹⁰ aufwiesen als mehrfach 10⁸, wie dies in den vorangehenden Beispielen unter Verwendung einer geringeren Angriffsdosis beobachtet wurde. Dennoch zeigten die immunisierten Mäuse eine Reduktion des Virustiters von mehr als 4 logs, wie dies in früheren Experimenten beobachtet worden ist (16, Balken 2).
Wichtig ist, daß eine IR Immunisierung mit dem synthetischen HIV-Peptid-Vakzin + rmIL-12 die Mäuse vor einem IR Angriff mit diesem gp160-rekombinanten Vacciniavirus sogar wirksamer schützte als nach der IR Immunisierung mit dem Peptid allein (6 log-Reduktion der viralen pfu gegenüber 4 log-Reduktion, p < 0,05) (16, Balken 3 im Vergleich zu Balken 2).
Da die Induktion von mukosalen CD8⁺-CTL stark abhängig ist von IL-12 und IFNγ (Belyakov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1709-1714 (1998)), wurden hier weitere Studien unternommen, um zu bestimmen, welches Cytokin direkt auf die Erzeugung von mukosalen CTL wirkt und welches durch einen Sekundärmechanismus wirkt. Um sich dieser Frage zuzuwenden, wurden IFNγ^-/--Mäuse (BALB/c-Hintergrund) und herkömmliche BALB/c-Mäuse mit dem rmIL-12 (1 μg/Maus) + DOTAP zusammen mit dem Peptid IR behandelt. Eine mukosale Behandlung von IR immunisierten IFNγ^-/--Mäusen mit rmIL-12 führte nicht zur Induktion von mukosalen oder systemischen CTL (17). Es scheint deshalb, daß IL-12 nicht direkt auf die Induktion von mukosalen CD8⁺-CTL ohne IFNγ wirken kann.
Zusammenfassend beinhalten die vorangehenden Beispiele ein neues virales Angriffssystem, bei dem rekombinantes Vacciniavirus, das HIV-1 gp160 exprimiert, als ein Surogat für HIV-1 verwendet wird, da wir die Mäuse nicht mit HIV-1 infizieren können. Wichtig ist bei diesem System, daß gegen gp160 gerichtete neutralisierende Antikörper nicht vor rekombinantem Vaccinia, das gp160 exprimiert, schützen können, da das Virus gp160 nicht in den Viruspartikel aufnimmt, sondern nur in der infizierten Zellen exprimiert. Folglich muß die protektive Immunantwort zu der infizierten Zelle dirigiert werden.
Die Ergebnisse hier zeigen durch Aufhebung des Schutzes nach einer Depletion von CD8⁺-Zellen in vivo, daß die protektive Antwort vollständig von CD8⁺-Zellen abhängt. Folglich zeigen die Ergebnisse unzweifelhaft, daß es CD8⁺-CTL sind, die schützen (entweder über eine lytische Aktivität oder über eine Sekretion von Cytokinen und anderen löslichen Faktoren. Da gezeigt worden ist, daß ein Schutz gegen eine Vaccinia.-Infektion durch Interferon γ, welches durch CD8⁺-CTL als Antwort auf eine Antigen-Stimulierung sezerniert wird (Harris et al., J. Virol. 69: 910-915 (1995)), vermittelt werden kann, ist es möglich, daß der Mechanismus eine lokale Sekretion dieses Cytokins durch die CTL eher beteiligt als eine Lyse von infizierten Zellen. Durch jeden Mechanismus sind die CTL verantwortlich für das Vermitteln des Schutzes.
Da allerdings die mukosale Immunisierung CTL sowohl an dem lokalen mukosalen Ort als auch in der Milz induziert, unterscheidet dieses Ergebnis nicht, welche CTL für den Schutz verantwortlich sind. Um sich dieser wichtigen Frage zuzuwenden, machen sich die vorliegenden Beispiele die Tatsache zunutze, daß eine subkutane Immunisierung mit dem Peptid-Vakzin systemische CTL in der Milz in einem Ausmaß induziert, das mindestens so groß ist wie das, das durch eine mukosale Immunisierung induziert wird, jedoch keine mukosalen CTL induziert. CTL aus der Milz, die aus beiden Immunisierungswegen hervorgegangen sind, töten Zielzellen, die endogen HIV gp 160 exprimieren, ab. Wenn folglich systemische CTL gegen dieses Epitop vor einem mukosalen Angriff schützten, dann wäre zu erwarten, daß die subkutan immunisierten Mäuse geschützt wären.
Allerdings zeigten die subkutan immunisierten Mäuse keinen Hinweis auf einen Schutz vor einem mukosalen Angriff. Folglich korrelierte der Schutz mit der CTL-Aktivität an lokalen mukosalen Orten, den Peyer-Plaques und der Lamina propria, nicht mit der CTL-Aktivität in der Milz. Der Schutz wurde nicht nur durch CTL vermittelt, sondern erforderte CTL an dem lokalen mukosalen Ort des Angriffs. Systemische CTL reichten nicht aus.
Ein Schutz, der durch lokale mukosale CTL vermittelt wurde, schien unabhängig auszureichen, um eine protektive Immunantwort zu vermitteln. Diese Schlußfolgerung wird die Beobachtung unterstützt, daß eine 2 log-Reduktion der viralen pfu in den Ovarien auftritt, sogar am Tag 2 nach dem mukosalen viralen Angriff (von 2,37 × 10⁶ pfu in nichtimmunisierten Mäusen zu 3,34 × 10⁴ pfu in IR-immunisierten Mäusen), bevor eine Replikation im großen Umfang in dem Ovar hat auftreten können. Dieser Befund weist darauf hin, daß die Reduktion des Titers in dem Ovar eine Reduktion der Menge an Virus, die dem initialen mukosalen Ort der Infektion entkommen können, widerspiegelt. Zusätzlich hing die Verstärkung der CTL-Aktivität und des Schutzes durch rmIL-12 von einer lokalen mukosalen Verabreichung des Cytokins ab, nicht von einer systemischen Verabreichung.
Ein möglicher Unterschied zwischen CTL, die durch mukosale im Vergleich zu systemischer Immunisierung induziert wurden, ist, daß die CTL, die aus der SC Immunisierung hervorgehen, keine „Homing"-Rezeptoren für die GI-Mukosa aufweisen, was auf die Tatsache hinweist, daß sie nicht in der Lamina Propria oder den Peyer-Plaques nachgewiesen werden.
Die vorliegende Offenbarung stellt die erste Demonstration eines Schutzes vor einem GI-mukosalen Angriff dar, welcher lokale mukosale CTL am Ort des Angriffs erfordert. Diese Ergebnisse besitzen wichtige Implikationen für die Entwicklung protektiver Vakzine gegen eine mukosale Exposition gegenüber Viren. Zusätzlich zu diesen Ergebnissen zeigen die hier verfügbar gemachten Beispiele auch eine überraschende Persistenz, nicht nur der Memory-CTL in der Mukosa, sondern auch der protektiven Immunität gegen einen mukosalen viralen Angriff. Faktoren, die das CTL-Gedächtnis steuern, und die Rolle von persistierendem Antigen beim Erhalten von Memory-CTL stellen ein anderes Problem dar, das eine zeitlang von Interesse gewesen ist (Ahmed and Gray, Science 272:54-60 (1996); Kundig et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 9716-9723 (1996); Ehl et al., Eur. J. Immunol. 27: 3404-3413 (1997)), sind jedoch im Zusammenhang mit mukosalen Immunantworten und Schutz wenig untersucht worden. In Studien zur systemischen Immunität wurde gezeigt (Slifka et al., Blood 90: 2103-2108, (1997)), daß nach Infektion mit Lymphozyten-Choriomeningitis-Virus (LCMV), CTL-Memory-Antworten im Knochenmark für mindestens 325 Tage vorhanden waren, was auf eine langfristige Persistenz antiviraler T-Zellen an diesem Ort hinweist. Während die antigenspezifische CD8⁺-Zellzahl nach einer viralen Clearence abrupt abfiel, peristierte eine erhebliche Anzahl während des Lebens der Maus (Muraii-Krishna et al., Immunity 8:177-187, (1998)). Nach wiederholtem Angriff („re-challenge") mit LCMV, trat eine rasche Expansion von Memory-CD8⁺-T-Zellen auf.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß eine systemische Infektion mit einem Virus zu einem langfristigem Gedächtnis und einem langfristigen Schutz führen kann. Im Fall des mukosalen CTL-Gedächtnisses wurde gezeigt, daß Memory-CTL an dem mukosalen Ort länger bleiben, wenn die Immunisierung auf dem mukosalen Weg erfolgte (Gallichan and Rosenthal, J. Exn. Med. 184:1879-1890 (1996)), die Dauer des Schutzes durch derartige mukosale CTL wurde jedoch nicht untersucht. Die Fähigkeit von mukosalen Memory-CTL, zu schützen, wird teilweise von der Schnelligkeit abhängen, mit der sie expandieren und nach einer Virusexposition aktiviert werden können, was mit dem Ausmaß der Virusreplikation an dem mukosalem Ort im Zusammenhang steht. Aus diesen Gründen ist es wichtig, die Dauer des mukosalen Schutzes, der von lokalen mukosalen CD8⁺-CTL abhängt, zu bestimmen. Die Ergebnisse hier zeigen eine Persistenz von CTL sogar 6 Monate nach mukosaler Immunisierung mit dem Peptid-Vakzin-Konstrukt ohne zusätzliche Re-Immunisierung jenseits des anfänglichen 3-Wochen-Durchgangs. Diese Antwort wird begleitet durch einen Schutz vor einem mukosalen Angriff mit Vacciniavirus, das gp160 exprimiert.
Dieses letztere Ergebnis ist besonders auffallend, da es sich bei dem beispielhaften Immunogen um ein Peptid handelt, das ohne jede Depotform von Adjuvanz, welche das Vorhandensein des Antigens über verlängerte Zeiträume aufrecht erhält, verabreicht wird. Es wäre zu erwarten, daß freies Peptid, welches an das Lumen des Darms abgegeben wird, oder sogar nach Transport durch mukosale Zellen, eine sehr kurze Halbwertszeit hätte. Deshalb können entweder Memory-CTL in der Mukosa in einem Ausmaß persistieren, das ausreicht, um einen Schutz in Abwesenheit des persistierenden Antigens zu vermitteln, oder das Antigen muß lokal in einer Art zellgebundener Form persisitieren, möglicherweise auf N4HC-Molekülen dendritischer Zellen. Noch eine andere Möglichkeit ist, daß das Peptid mit einem der Antigene in der mukosalen Flora kreuzreagiert und daß diese kreuzreaktiven Antigene die Memory-CTL aufrecht erhalten.
Ein Schutz gegen eine virale Infektion durch CTL umfaßt mehr als nur die Anzahl der induzierten CTL. Die Qualität von CTL ist genauso wichtig für einen Schutz in vivo wie die Quantität. Frühere Berichte haben gezeigt, daß P18IIIB-spezifische CTL mit hoher Avidität die adoptiv in SCID (severe combined immunodeficient)-Mäuse übertragen wurden, 100- bis 1000-fach wirksamer bei viraler Clearance, als die CTLs mit niedriger Avidität, die für den selben Peptid-Komplex spezifisch waren, trotz der Tatsache, daß alle CTL-Linien virusinfizierte Ziele in vitro lysierten (Alexander-Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 4102-4107 (1996)). Folglich müssen die CTL, die durch mukosale Immunisierung mit dem synthetischen Peptidvakzin induziert wurden, nicht nur in einer ausreichenden Menge vorhanden sein, um zu schützen, sondern müssen auch eine ausreichend hohe Avidität aufweisen, um zu schützen. Andere Aspekte der vorliegenden Offenbarung erlauben eine Optimierung der Induktion der CTL-Antwort und der protektiven Immunität. Es ist gezeigt worden, daß eine systemische Abgabe bestimmte Cytokine, wie etwa IL-12, an den Ort einer Antigen-Immunisierung systemische CTL-Antworten verstärkt (Ahlers et al., J. Immunol.159: 3947-3958 (1997); Iwasaki et al., J. Immunol. 159:45914601 (1997); Xiang und Ert1, Immunity 2: 129-135 (1995); Irvine et al., J. Immunol. 156: 238-245 (1996)). Allerdings sind keine vergleichbaren Studien für mukosale CTL-Antworten durchgeführt worden.
Bei den hier offenbarten Modellsystemen hängt die Induktion von mukosalen CTL von einer edogenen Produktion von IL-12 durch die Maus ab, da sie durch anti-IL-12-Antikörper, verabreicht in vivo vor und nach ihrer Immunisierung, gehemmt werden konnte. In den vorliegenden Beispielen verstärkt IL-12, gleichzeitig mit dem Antigen intrarektal verabreicht, die CTL-Induktion und steigerte auch den Schutz gegen einen intrarektalen Vacciniavirus-Angriff. Allerdings war auffällig, daß systemisch abgegebenes (i.p.) IL-2 eine CTL-Induktion weder an den systemischen Orten (d.h. der Milz) noch in der Mukosa verstärkte. Dieser Unterschied kann auf die kurze Halbwertszeit von IL-12, das systemisch abgegeben wird, zurückzuführen sei, was verhinderte, daß IL-12 lange genug überlebte, um an die Orte der CTL-Induktion zu gelangen. Deshalb ist es für eine mukosale CTL-Induktion ebenso wie für eine systemische CTL-Induktion wichtig, das Cytokin direkt an den Orten einer Antigen-Verabreichung und CTL-Induktion abzugeben.
Eine Verstärkung der CTL-Induktion in der Mukosa mit rekombinanten IL-12 ist eine nützliche Strategie für die Entwicklung mukosaler Vakzine. In diesem Zusammenhang ist es nicht wahrscheinlich, daß kleine Dosen, die lokal an die mukosalen Orte verabreicht werden, die umfassende Toxizität aufweisen, die mit einer systemischen Verabreichung dieses Cytokins in Zusammenhang gebracht worden sind. Die Ergebnisse hier zeigen weiterhin, daß eine Verstärkung der CTL-Antwort in vivo durch rmIL-12 von Interferon-γ abhängt, da eine Verstärkung nicht bei IFNγ^-/--Mäusen beobachtet wurde. Mindestens zwei Mechanismen können dieses Ergebnis erklären. Erstens, IL-12 kann durch seine gut definierte Fähigkeit, eine Interferon-γ-Produktion zu induzieren (Trinchieri, G., Blood 94: 4008-4027 (1994)), wirken, welches dann direkt auf die CTL-Vorläufer wirkt. Alternativ, da IFNγ wichtig ist zur Expression des IL-12-Rezeptors (Szabo, et al., J. Exp. Med. 185: 817-824 (1997)), kann IL-12 direkt auf die CTL wirken, könnte jedoch nicht in der Lage sein, in IFNγ^-/--Mäusen zu wirken, da diesen die IL-12-Rezeptor-Expression fehlt.
Es gibt Hinweise darauf, daß eine CTL-Aktivität eine Rolle bei der protektiven Immunität bei Menschen gegen HIV-1 spielt (zusammenfassend dargestellt in Rowland-Jones et al., Adv. Immunol. 65: 277-346 (1997); Yang, O. O. and B. D. Walker, Adv. Immunol. 66: 273-311 (1997); Berzofsky und Berkower, AIDS 9(A): S 143-5 157 (1995)). Eine zellvermittelte Immunität gegenüber HIV-1 ist bei nicht infizierten Hochrisiko-Erwachsenen gezeigt worden (Pinto et al., J. Clin. Invest. 96: 867-876, (1995); Rowland-Jones et al., Nature Medicine 1: 59-64, (1995)) und bei nicht infizierten Tieren, die von infizierten Tieren geboren wurden (Clerici et al., AIDS 7: 1427-1433 (1993); Luzuriaga and Sullivan, J. Cell. Blochem. Supplement 17E: 98.(Abstract) (1993)). Eine CTL-Aktivität ist mit einer niedrigen viralen Ladung und einem langfristigen Nichtprogressionsstatus bei einigen infizierten Individuen korreliert worden (Cao et al., N. Ensl. J. Med. 332: 201-208 (1995)). CTL sind auch mit dem Wiederaufleben einer akuten HIV- oder SIV-Infektion in Zusammenhang gebracht worden (Yasutomi et al., J. Virol. 67: 1707-1711 (1993); Reimann et al., J. Virol. 68: 2362-2370 (1994); Koup et al. J. Virol. 68:4650-4655 (1994); Boderrow et al., Nature Medicine 3: 205-211, (1997)). Eine Induktion von Auswegmutationen durch CTL legt nahe, daß CTL die Masse des Wildtyp-Viruses eliminiert (Boderrow et al., Nature Medicine 3: 205-211 (1997); Phillips et al., Nature 354: 453-459 (1991); Nowak et al., Nature 375: 606611 (1995); Goulder et al., Nature Medicine 3: 212-217 (1997); Couillin et al., J.Exp. Med. 180: 1129-1134 (1994); Koenig et al., Nature Medicine 1: 330-336 (1995)). Weiterhin wurde in einer SIV-Studie ein Schutz mit einem besonderen Klasse-I-MHC-Molekül des Affen in Zusammenhang gebracht (Heeney et al., J.Exit. Med. 180: 769-774, (1994)). Es ist gezeigt worden, daß CD8⁺-Zellen eine Replikation von Lentiviren des Menschen und Affen in autologen CD4-Zellen durch einen nicht lytischen Mechanismus unterdrücken, woran lösliche Faktoren, welche durch aktivierte CD8⁺-Zellen synthetisiert und freigesetzt werden, beteiligt sind (Walker-et al., Science 234: 1563-1566 (1986); Tsubota et al., J. ExD. Med. 169: 1421-1434 (1989); Walker and Levy, Immunology 66: 628630 (1989); Mackewicz et al., J. Clin. Invest. 87: 1462-1466, (1991); van Kuyk et al., J. Immunol. 153: 4826-4833 (1994)). Derartige lösliche Faktoren schließen die Chemokine RANTES, MIP-1α und MIP-1β ein (Cocchi et al., Science 270: 1811-1815 (1995)).
Die vorliegende Offenbarung macht die erste Demonstration eines Schutzes gegen einen mukosalen viralen Angriff verfügbar, der durch CTL vermittelt wird, die in der lokalen Mukosa vorhanden sein müssen. Ebenfalls verfügbar gemacht werden Verfahren und Zusammensetzungen zum Verstärken der Induktion derartiger lokaler mukosaler CTL durch ein Peptid-vakzin, das gemeinsam mit rekombinantem IL-12 an den mukosalen Ort abgegeben wird. Diese Verfahren und Zusammensetzungen zum Stimulieren der CTL-Immunität an lokalen Orten einer mukosalen Exposition stellen wichtige Werkzeuge zur Vakzinentwicklung, um eine HIV-Infektion oder -Erkrankung beim Menschen zu verhüten, dar. Da der gastrointestinale Trakt ein Hauptort der frühen Replikation von SIV und HIV, neben anderen Pathogenen, zu sein scheint, und da diese und andere mukosale Orte häufige Orte des Eindringens dieser Pathogene sind, ist es besonders bedeutsam, einen Schutz an mukosalen Orten zu erreichen. Die vorliegende Offenbarung stellt diese Ziele zufrieden und macht andere Vorteile verfügbar, wie unten ausgeführt.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme der vorliegend bevorzugten Ausführungsform beschrieben worden ist, sollte verstanden werden, daß verschiedene Modifikationen vorgenommen werden können. Dementsprechend ist die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt.
SEQUENCE LISTING

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zum Induzieren einer protektiven, antigenspezifischen, systemischen und rektalmukosalen zytotoxischen T-Zell-Antwort durch Verabreichen der Zusammensetzung an die rektale Mukosa, wobei die Zusammensetzung ein gereinigtes, lösliches Antigen umfaßt, wobei das Antigen eine erste Region mit überlappenden, T-Helferzellen aktivierenden Epitopen und eine zweite Region mit einem zytotoxische T-Zellen aktivierenden Epitop umfaßt, und wobei die Zusammensetzung zur Verabreichung an die rektale Mukosa formuliert ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Peptid weiterhin eine dritte Region umfaßt, welche ein Epitop kodiert, welches eine systemische antigenspezifische neutralisierende Antikörperantwort auslöst.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein Adjuvanz umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Adjuvanz Choleratoxin (CT), eine Choleratoxinmutante (MCT), eine hitzelabile E. coli-Enterotoxinmutante (MLT) oder Pertussistoxin ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein gereinigtes Zytokin und/oder Interferon-γ umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das gereinigte Zytokin ausgewählt ist aus Granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-7 (IL-7), Interleukin-12 (IL-12), Tumornekrosefaktor-α (TNFα) oder Kombinationen davon.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1-6, wobei das Antigen ein Peptid, abgeleitet von einem Tumor-assoziierten Antigen, einem pathogenen Virus, einem Bakterium oder einem Protozoon ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das pathogene Virus HIV-1, Influenzavirus oder Hepatitis-A-Virus ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Antigen ein Peptid ist, das ein HIV-1-Cluster-Peptid-Vakzin-Konstrukt (Cluster peptide vaccine construct, CLUVAC) umfaßt, ausgewählt aus:
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das HIV-1-Cluster-Peptid die Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 12 aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Zusammensetzung zur intrarektalen Verabreichung an das Rektum, Kolon, sigmoidale Kolon oder distale Kolon formuliert ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung ein rektales Klistir, einen Schaum, ein Zäpfchen oder ein topisches Gel umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung weiterhin eine Grundlage, einen Träger oder einen absorptionsfördernden Wirkstoff, angepaßt an eine intrarektale Verabreichung, umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Zusammensetzung eine rektale Emulsion oder ein Gelpräparat einschließt.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das lösliche Antigen einem homogenen Gelträger zugemischt ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der homogene Gelträger ein Polyoxyethylen-Gel ist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Zäpfchen eine Grundlage, ausgewählt aus einem Polyethylenglycol, Witepsol H15, Witepsol W35, Witepsol E85, Polyethylenglycoldicaprylat (Sefsol 228), Miglyol 810, Hyroxypropylcellulose-H (HPC) oder Carbopol-934P (CP), umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Zusammensetzung mindestens zwei Grundlagenmaterialien umfaßt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 11-18, wobei die Zusammensetzung weiterhin einen stabilisierenden Wirkstoff zum Minimieren des intrarektalen Abbaus des löslichen Antigens umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der absorptionsfördernde Wirkstoff ausgewählt ist aus einem oberflächenaktiven Agenz, einer gemischten Micelle, Enamin, einem Stickstoffoxid-Donor, Natriumsalicylat, einem Glycerinester von Acetoessigsäure, Cyclodextrin oder einem β-Cyclodextrin-Derivat oder einer mittelkettigen Fettsäure.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Adjuvanz mit einem Mukosagewebebindenden Wirkstoff oder einem T-Zell-bindenden Wirkstoff konjugiert ist.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Mukosagewebe- oder T-Zell-bindende Wirkstoff ausgewählt ist aus Protein A, einem Antikörper, der an ein Mukosagewebe-Protein bindet, einem Antikörper, der an ein T-Zell-spezifisches Protein bindet oder einem Liganden oder Peptid, der/das an ein Mukosagewebe-spezifisches Protein oder T-Zell-spezifisches Protein bindet.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Adjuvanz ein rekombinantes Choleratoxin (CT) mit einer B-Kette von CT, substituiert durch Protein A, das mit einer CT-A-Kette konjugiert ist, umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei der T-Zell-bindende Wirkstoff ein Proteinligand oder Peptid ist, der/das an CD4 oder CD8 bindet.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Protein oder Peptid eine V3-Schleife eines HIV-Hüllproteins oder ein T-Zell-bindendes Peptidfragment davon umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Zusammensetzung weiterhin gereinigtes IL-12 umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 21 oder 26, wobei die Zusammensetzung weiterhin gereinigtes Interferon-γ umfaßt.