JP2001515869A - 粘膜の細胞障害性ｔリンパ球応答 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、粘膜の表面を介して侵入する病原体の感染を防止し又は治療するのに役立つ抗原特異的粘膜細胞障害性Ｔリンパ球応答の誘導のための方法を供する。

Description

【【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、哺乳類における免疫応答を刺激するための方法及び組成物に関する
。より特定すると、本発明は、粘膜免疫性を刺激するための方法及び組成物に関
する。

【０００２】 発明の背景 多くの感染性病原体、たとえばHIV −１は、全身性感染を確立する前、粘膜組
織を通してそれらの哺乳類宿主に侵入する。Veasey, など., Science 280 ：42
7- 430, 1998。 従って、HVI に対して保護することができるワクチンは、長期
粘膜免疫応答を誘発できるべきである。多くの最近の研究は、そのような免疫応
答が粘膜組織の直接的な刺激を必要として、そして弱毒化された生存ウィルス（
Cranage,など., Virology 229 : 143-154, 1997 ）、サブユニットSIV エンベロ
ープ（Lehner, など., Nature Medicine 2 : 767-775, 1996）、HIV −組換えウ
ィルス、たとえば組換えMVA 89.6env (Belyakov など., 未公開) 、又はHIV ペ
プチド構造体（Belyakov, など., Proc. Nat. Acad. Sci. 95 : 1707-1714, 199
8 ）( また、Gallichan, など., J. EXP. Med. 184 : 1879-1890, 1996; Crana
ge, など., Virology 229 ：143-154, 1997;及びRosenthal, など., Semin. Im
munol. 9 : 303-314, 1997 も参照のこと) により達成され得ることを示してい
る。

【０００３】 しかしながら、ワクチン候補体がウィルスによる粘膜攻撃に対して最も効果的
な保護を提供でき、そして何の機構が保護免疫性の介在に関与しているかに関す
る多くの問題が残っている。多くの研究が、感染、たとえば粘膜成分を有するイ
ンフルエンザに対する保護におけるCTL についての役割を示しているが（Taylor
and Askonas, Immunology 58 : 417-420, 1986; Epstein など., J. Immunol.
160: 322-327, 1998; Kulkarni など., J. Virol. 69: 1261-1264, 1995）、そ
れらの報告は、CTL が保護する局部粘膜部位に存在する必要があるかどうかを確
立していない。逆に言えば、他の研究は粘膜におけるCTL の誘発を示しているが
、それらは、それらの細胞が保護において役割を有することを確立していない（
Gallichan and Rosenthal, J. Exp. Med. 184: 1879-1890, 1996; Bennink など
., Immunology 35: 503-509, 1978; Lohman など., J. Immunol. 155; 5855-586
0, 1995; 及びKlavinskis, など., J. Immunol. 157: 2521-2527, 1996, J. Im
munol. 155: 5855-5860, 1995 ）。さらに他の研究は、粘膜における保護免疫性
のワクチンによる誘発を示しているが、しかし複数の免疫応答にもかかわらず、
それらの応答が保護に関与していることを分類できていない（Lehner など., N
ature Medicine 2: 767-775, 1996; Putkonen など., J. Virol. 71: 4981-4984
, 1997; Miller など., J. Virol. 71: 1911-1921, 1997; Quesada-Rolander
など., AIDS Res Hwn Refroviruses 12: 993-999, 1996; Bender など., J. Vi
rol. 70: 6418-6422, 1996; Wang など., Vaccine 15: 821-825, 1997) 。

【０００４】 従って、粘膜感染に対する保護におけるCTL の役割は10年間、興味あるもので
あったが、特にインフルエンザウィルスの場合、従来の研究は、免疫応答を保護
に結合づける基本的機構を同定するのに失敗している。これに関しては、ウィル
スによる粘膜感染が局部IgA 応答を誘発しているので、付随するCTL 応答でなく
、この応答は粘膜路を通してウィルス感染に対する保護を担当していることが容
易に推定される。しかしながら、粘膜HIV 攻撃に対する中和及び保護における分
泌IgA の役割もまた、明確ではない。

【０００５】 CTL は、細胞内の微生物、たとえばウィルス、並びに一定の細菌及び原生寄生
体に対する免疫性の決定的なメディエイターである。CTL は、“標的細胞”の表
面上の主要組織適合性複合体（MHC ）クラスI 分子に結合される“非自己”抗原
性ペプチドを特異的に認識し、そして次に、非自己抗原性ペプチドを発現する標
的細胞を殺す。非自己ペプチドが誘導される非自己ポリペプチドは、ａ）細胞内
微生物によりコードされるタンパク質、ｂ）その発現が微生物により誘発される
宿主−コードされたタンパク質、又はｃ）たとえば腫瘍細胞により発現される変
異体宿主コードのタンパク質であり得る。

【０００６】 従って、誘発性及びエフェクター粘膜免疫系におけるCTL 応答の生成は、粘膜
バリヤーを通して感染を確立する細胞内微生物病原体に対する効果的な保護免疫
性を確立することにおいて重要であり得る。多くの場合、経口路（皮膚、筋肉内
、静脈内又は腹腔内）を通しての抗原の投与は、粘膜免疫性を誘発することがで
きず、そしてその結果、非常に非能率的である。

【０００７】 上記で示されたように、ウィルスによる粘膜攻撃により誘発される粘膜免疫応
答のこれまでの報告は、後者が、上皮内リンパ球様集団において抗ウィルス抗体
応答、及び多くの場合、CTL 応答を誘発することを開示している。Chen など.,
J. Virol. 71: 3431-3436, 1997; Sydora, など., Cell Immunol. 167: 161-16
9, 1996 。 しかしながら、そのような応答は、一般的に、ウィルス感染、又は
特に、HIV 感染に対する保護に相当するかどうかは、明白でない。さらなる研究
は、粘膜を包含する感染、たとえばインフルエンザ又は呼吸シンシチウムウィル
スに対する保護におけるCTL についての役割を示唆している（Taylor など., I
mmunology 58: 417-420,1996; Epstein など., J. Immunol. 160: 322-327,1998
； Kulkarni など., J. Virol. 69: 1260-1264, 1995）。しかしながら、それら
の研究は、CTL が感染の粘膜部位で存在すべきかどうか、又はそれらの主要活性
が全身的に生じるかどうかの問題を取り扱っていない。

【０００８】 従って、免疫性を介在することにおけるCTL の役割及び機構を良好に定義し、
そしてHIV 及び他の病原体に対する免疫保護を、そのような病原体が最初に増殖
する粘膜部位で免疫保護を付与することによって、介在するための新規手段を開
発する必要性が当業界において存在する。 発明の要約 本発明は、被検体において保護的粘膜CTL 応答を誘発するための方法及び組成
物に向けられる。本発明の方法は、可溶性抗原自体、又は可溶性抗原をコードす
るポリヌクレオチドのいずれかを粘膜表面に投与することを包含する。その可溶
性抗原は、十分な長さの天然に存在するポリペプチド又はそれらに由来するフラ
グメント（すなわち、ペプチド）であり得る。投与されるべきペプチドは、天然
に存在するポリペプチドの長さよりも短いいずれかの長さのものであり得る。た
とえば、それらは、5 〜100 個のアミノ酸残基の長さ、好ましくは20〜75個のア
ミノ酸残基の長さ、より好ましくは25〜60個のアミノ酸残基の長さ、及び最も好
ましくは30〜50個のアミノ酸残基の長さであり得る。

【０００９】 可溶性抗原は、粘膜部位でアジュバンドと共に、又はアジュバントを伴わない
で投与される。アジュバントはたとえば、コレラ毒素（CT）、変異体CT（MCT ）
、E.コリ熱不安定性エンテロトキシン（LT）又は変異体LT(MLT) であり得る。IL
-12 及び／又はIFN γは、アジュバントの存在又は不在下で可溶性抗原と共に投
与され得る。他方では、２種のサイトカイン（IL−12及び／又はIFN γ）が、粘
膜投与される可溶性抗原から、任意にはアジュバントと共に、全身的に及び別々
に投与され得る。投与の粘膜路は、IR、鼻腔内（IN）、胃腸内（IG）、膣内（IV
G ）又は気管内（IT）を包含する。

【００１０】 可溶性抗原は、病原性ウィルス（たとえば、HIV-1 、インフルエンザウィルス
又はA 型肝炎ウィルス）、細菌（たとえば、リステリア・モノサイトゲネス（Li
steria monocytogenes））、原生動物（たとえば、ギアルジア・ラムブリア（Gi
ardia lamblia ））に由来することができる。他方では、可溶性抗原は、腫瘍関
連抗原、たとえば前立線腫瘍細胞により生成される前立線特異的抗原、又はメラ
ノーマ細胞により精製されるチロシナーゼであり得る。ペプチド抗原は、クラス
ターペプチドワクチン構造体（CLUVAC）であり得る。たとえば、HIV −１ CLUV
ACは１又は複数の次の配列を含むことができる： EQMHEDIISLWDQSLKPCVKRIQRGPGRAFVTIGK ( 配列番号1), KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIRRIQRGPGRAFVTIGK ( 配列番号2), RDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTRIQRGPGRAFVTIGK ( 配列番号3), AVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIQRGPGRAFVTIGK (配列番号4), DRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIQRGPGRAFVTIGK (配列番号5), DRVIEVVQGAYRAIRRIQRGPGRAFVTIGK (配列番号6), AQGAYRAIRHIPRRIRRIQRGPGPRAFVTIGK (配列番号7), EQMHEDIISLWDQSLKPCVKRIHIGPGRAFYTTKN ( 配列番号8), KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIRRIHIGPGRAFYTTKN ( 配列番号9), RDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTRIHIGPGRAFYTTKN ( 配列番号10), AVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIHIGPGRAFYTTKN (配列番号11), DRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIHIGPGRAFYTTKN (配列番号12), DRVIEVVQGAYRAIRRIHIGPGRAFYTTKN (配列番号13) 又は、 AQGAYRAIRHIPRRIRRIHIGPGRAFYTTKN ( 配列番号14) 。

【００１１】 好ましくは、CLUVA は、配列番号２、９又は１２のアミノ酸配列を含む。抗原
性ペプチドは、本明細書に引用される配列番号により特定される長さよりも長く
、すなわちペプチドはいずれか所定の配列番号を有するペプチドのアミノ及び／
又はカルボキシ末端で１又は複数（たとえば、5, 10, 15, 20 ）のアミノ酸を付
加することによって延長され得る。

【００１２】 本発明はまた、可溶性抗原が供給されるIRにおいて対象に保護粘膜CTL 応答を
誘発するための方法を包含する。好ましくは、IR免疫化により誘発されるCTL 活
性のレベルは、粘膜投与の他の経路（ルート）（たとえば、IN）により誘発され
る活性レベルよりも少なくとも10％高い。より好ましくは、IR免疫化により誘発
される粘膜CTL 活性は、粘膜免疫化の他の経路（たとえば、IN又はIG）により誘
発される活性よりも少なくとも２倍、より好ましくは、少なくとも5 倍、及び最
も好ましくは、少なくとも10倍高い。

【００１３】 本発明の方法が適用される被検体は、哺乳類、たとえばヒト、非ヒト霊長類、
ネコ又はマウスである。 直腸内投与のために適合された、被検体における保護粘膜CTL 応答を誘発する
ための免疫原性組成物もまた、本発明内に提供される。前記組成物は、直腸、結
腸、S 字結腸又は遠位結腸への直腸内供給のために配合された、精製された可溶
性抗原を含んで成る。それらは、直腸浣腸液、発泡剤、坐剤又は局所用ゲルとし
て配合され得、そして一般的には、直腸内供給のために適合された、基材、キャ
リヤー（担体）、又は吸収−促進剤を含むことができる。

【００１４】 より詳細の観点においては、本発明の免疫原性組成物は、直腸用エマルジョン
又はゲル調製物を含むことができ、好ましくはこの場合、可溶性抗原は均質エマ
ルジョン又はゲルキャリヤー、たとえばポリオキシエチレンゲルと共に混合され
る。他方では、可溶性抗原は直腸−適合性発泡剤と共に混合され得る。 他の好ましい観点においては、本発明の免疫原性組成物は、坐剤に配合される
。坐剤は、抗原の直腸内供給のために特異的に適合された基材又は担体から構成
される。好ましい基材は、ポリエチレングリコール、witepsol H15, witepsal W
35, witepsol E85, プロピレングリコールジカプリレート（Sefsol 228）, Migl
yol 810, ヒドロキシプロピルセルロース−H （HPC ）、又はcarbopol−934P (
CP) から選択され得る。より好ましくは、坐剤は、構造及び供給性能を最適化す
るために少なくとも2 種の基本材料を含んで成る。他の観点においては、坐剤は
、可溶性抗原の直腸内分解を最少にするための安定剤を含む。

【００１５】 直腸内供給を最適化するために、本発明の免疫原性組成物はまた、好ましくは
、吸収促進剤、界面活性剤、混合されたミセル、エナミン、酸化窒素ドナー、サ
リチル酸ナトリウム、アセト酢酸のグリセロールエステル、シクロデキストリン
又はβ−シクロデキストリン誘導体、又は中間鎖脂肪酸を含む。 本発明のさらなる観点においては、CTL 応答を増強するアジュバントを含む免
疫原性組成物が提供される。適切なアジュバントは、解毒された細菌毒素、たと
えば解毒されたコレラ毒素（CT）、変異コレラ毒素（MCT ）、変異E.コリ熱不安
定性エンテロトキシン、及び百日咳菌毒素である。好ましくは、アジュバントは
、粘膜組織又はT 細胞結合剤、たとえばプロテインA 、粘膜組織−又はT −細胞
−特異的タンパク質を供給する抗体、又は粘膜組織−又はT −細胞−特異的タン
パク質を結合するリガンド又はペプチドに接合される。より好ましい観点におい
ては、アジュバントは、低められた毒性を示し、そしてプロテインA により介在
される粘膜組織結合を増強する、CT A鎖に接合されるプロテインA により置換さ
れたCTのB 鎖を有する組換えコレラ毒素（CT）である。他方では、アジュバント
は、たとえば、CD4 又はCD8(たとえばHIV V3ループ又そのHIV V3ループのT 細胞
−結合ペプチドフラグメント）を結合することによって、T 細胞に特異的に結合
するタンパク質又はペプチドに接合され得る。

【００１６】 特にことわらなければ、本明細書において使用されるすべての技術及び化学用
語は、本発明が属する当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明
細書に記載されるそれらの方法及び材料に類似する方法及び材料が本発明の実施
又は試験に使用され得るが、適切な方法及び材料が下記に示される。矛盾する場
合、定義を包含する本出願は調節するであろう。さらに、本明細書に記載される
材料、方法及び例は例示的であって、本発明を限定するものではない。

【００１７】 本発明の他の特徴及び利点、たとえばウィルス又は他の感染性疾病の予防は、
次の詳細な記載、図面及び請求の範囲から明らかであろう。 詳細な記載 A.粘膜免疫性の誘発 本発明は、ペプチド、たとえば合成多決定因子HIV −1 gp160 エンベロープ糖
タンパク質ペプチドの粘膜表面へのIR投与が、粘膜免疫系において、粘膜アジュ
バントの不在下でさえ、抗原−特異的保護CTL 応答を誘発することができる発見
に基づかれている。

【００１８】 典型的な合成多決定因子ペプチド（CLUVAC）は、（ａ）ヘルパーT 細胞応答、
（ｂ）CTL 応答、及び（ｃ）高い力価の中和抗体のいくらか又はすべてを、広範
囲のMHC ハプロタイプを発現する所定の種の複数宿主において誘発するエピトー
プを含む副領域から構成される。HIV −１ CLUVAC PCLUS3−18IIIB（配列番号2
）及び粘膜アジュバントCTによるIR免疫化は、粘膜免疫系の誘発（PP）及びエフ
ェクター（LP）部位において、及び全身性リンパ球様組織、すなわちSPにおいて
、ペプチド−特異的CTL を誘発した。対照的に、ペプチドワクチンによる全身性
免疫化は、SPにおいてのみ、HIV −１ペプチド−特異的CTL を生成した。

【００１９】 IR免疫化は、長期続く保護免疫応答を誘発した。たとえば、抗原−特異的CTL
は、免疫化の６ヶ月後、粘膜及び全身部位に見出された。抗原性ペプチドによる
IR免疫化は、同じペプチドによるIN免疫化よりも有意に強いCTL 応答を誘発した
。PCLUS3−18IIIB （配列番号：２）によるIR投与は、単独で投与される場合、
有意な応答を誘発したが、その応答はCTの包含により増強された。CTL は、HIV
−１ gp160を外因的に発現し、又は適切なgp160 ペプチドによりパルスされたMH
C クラスI 陽性標的細胞を認識する、MHC クラスI 分子により制限されたCDB ＋
T リンパ球であった。IR免疫化による粘膜及び全身CTL 応答の誘発は、抗−IL−
12抗体によりi.p. 処理されたマウスにおけるCTL の誘発の阻害により示される
ように、IL−12依存性であった。さらに、IR免疫化のために使用される抗原性ペ
プチド及びCTの組成物におけるIL−12の包含は、IL−12を伴わないで抗原性ペプ
チド及びCTにより誘発される応答よりも、増強された粘膜及び全身性CTL 応答を
もたらした。IR免疫化に続く粘膜及び全身性CTL 生成のIFN γに対する依存性が
、IFN γ−コード遺伝子における早熟停止コドンの結果として機能的IFN γを生
成する能力を欠いているマウスにおいてそのような応答の不在により示された。
停止コドン突然変異は、IFN γの活性を欠いている切断されたタンパク質をコー
ドする遺伝子を引き起こす。

【００２０】 PCLUS3−18IIIB（配列番号：2 ）によるIR免疫化は、HIV −1 IIIB gp160を発
現する組換えワクシニアウィルスによるIR攻撃に対してマウスを保護した。従っ
て、HIV −1 ペプチドは、IR免疫化の後、粘膜及び全身性免疫系におけるCTR 応
答を誘発し、そしてHIV −1 gp160 を発現するウィルスによる粘膜攻撃に対して
保護した。

【００２１】 本発明の免疫化方法は、いずれかの可溶性抗原に対する粘膜CTL 応答を誘発す
るために有用である。従って、本発明は、HIV −1 を包含する、粘膜バリヤーを
通して侵入するウィルスに対して免疫学的保護を誘発するワクチン投与のための
新規方法を提供する。前記方法はまた、粘膜を通して感染を確立する一定の細菌
（たとえば、L.モノサイトゲネス（L. monocytosenes））及び原生動物（たとえ
ば、G.ラムブリア（G. lamblia））による感染からの保護の達成に適用され得る
。さらに、粘膜免疫化はCTL 活性の全身性生成をもたらすので、そのプロトコー
ルはまた、非粘膜路を通して侵入する微生物による感染の予防においても有用で
ある。前記方法はまた、粘膜的に又は非粘膜的に確立される感染の免疫治療のた
めに有用である。最後に、前記方法は、粘膜表面の領域及びその表面から離され
た領域において、癌の免疫治療のために利用され得る。

【００２２】 B. 免疫化の方法 本発明は、細胞内微生物、たとえばウィルス、並びに細胞外細菌及び原生動物
による感染から対象を保護するための方法を特徴とする。前記方法は、適切な微
生物の遺伝子によりコードされ、そして感染された細胞の表面上のMHC クラスI
分子に関して発現されるタンパク質に由来する抗原性ペプチドに対して特異的な
CTL 応答の誘発を包含する。これは、粘膜表面、たとえば直腸、膣、鼻咽頭、胃
又は気管粘膜への適切な可溶性抗原の供給により達成される。適切な微生物は、
粘膜バリヤーを通して宿主に侵入するそれらのもの、たとえばHIV −１、インフ
ルエンザウィルス、腸内ウィルス、たとえばレトロウィルス、A 型肝炎ウィルス
、乳頭腫ウィルス、ネコ免疫欠損ウィルス、ネコ白血病ウィルス、サル免疫欠損
ウィルス、細胞内細菌病原体、たとえばL. モノサイトゲネス及びミコバクテリ
ア、たとえばM. ツベルキュロシス（M. tuberculosis ）及びM. レプラエ（M.
leprae ） を包含するが、但しそれだけには限定されない。粘膜免疫化により
誘発される応答は全身性及び粘膜免疫系において生じるので、前記方法はまた、
非粘膜（たとえば、いくつかのシナリオ、たとえば汚染された注射針により“刺
す”場合のHIV-1,狂犬病ウィルス及びマラリア原生動物）、及び粘膜路を通して
それらの宿主に侵入する細胞内病原体による感染からの保護にも適用され得る。
上記考慮から、粘膜を通してのこの免疫化はまた、細胞内感染の免疫治療のため
にも使用され得る。

【００２３】 最後に、本発明の粘膜免疫療法は、癌を有する対象、特に関連する粘膜の領域
における固形腫瘍、たとえば結腸、直腸、膀胱、卵巣、子宮、膣、前立腺、鼻咽
頭、肺又はあるメラノーマ腫瘍を有するそれらの対象に適用され得る（但し、そ
れらだけには限定されない）。腫瘍免疫性は、腫瘍細胞の表面上のMHI クラスI
分子に結合される腫瘍関連ペプチド（たとえば、前立腺癌における前立腺特異的
抗原ペプチド、結腸癌における癌胎児性抗原ペプチド、膀胱癌におけるヒト乳頭
腫ウィルスペプチド、及びメラノーマにおけるgp100 及びチロシナーゼペプチド
）（Rosenberg など. (1994) J.N.C.I.76:1159; Kawakami など. (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. JSA. 91: 3515 ）に対する特異性を有するCTL により実質的
に介在される。

【００２４】 B.1 抗原性ポリペプチド 本発明に従って投与される可溶性抗原は、いずれかの可溶性炭水化物又はペプ
チド抗原、たとえば関連する微生物により感染された細胞の表面上にMHC クラス
I 分子に関連して天然において発現されるか、又は腫瘍細胞上に発現されるペプ
チドのアミノ酸配列のすべて又は一部を含むものであり得る。感染された細胞の
場合、その細胞表面発現されたペプチドは、感染性剤の遺伝子によりコードされ
るか、又はその発現が感染性剤により誘発されるタンパク質のいずれかに由来す
る。従って、可溶性抗原は、天然に存在する十分な長さのポリペプチド、たとえ
ば十分な長さのHIV −１ gp160もしくはgp120, 又はそれらの抗原フラグメント
であり得る。

【００２５】 CTL による抗原−特異的認識は、CTL の表面上の抗原−特異的T 細胞受容体の
成分と、抗原性ぺプチド及びペプチドが結合するMHC クラスI 分子の両者上の残
基との間の相互作用を包含する。従って、可溶性抗原はまた、（ａ）抗原提供細
胞（APC ）の表面上の多重ハプロタイプのMHC クラスI 分子にそれ自体結合する
ことができ、そしてそれらのMHC クラスI ハプロタイプを発現する対象において
CD8 ＋T 細胞応答をそれ自体刺激することができるか、又は（ｂ）それらの性質
を有するフラグメントAPC によりタンパク質分解的に処理され得る、天然に存在
するポリペプチドのフラグメント（すなわち、ペプチド）でもあり得る。多重MH
C クラスI ハプロタイプに関してCTL 応答を刺激する候補体ペプチドの能力を確
立する手段は、当業者に良く知られており、そして引用により本明細書中に組み
込まれる継続出願のアメリカ特許出願08／060,988 に十分に記載されている。

【００２６】 抗原性ペプチドは、多重ハプロタイプのMHC クラスII分子に結合するように構
築され得、そして多重NHC クラスII ハプロタイプを発現する対象のCD4 ＋ヘル
パーT 細胞前駆体細胞により認識されるであろう。多重MHC クラスIIハプロタイ
プに関してヘルパーT 細胞応答を刺激する候補体ペプチドの能力を確立する手段
は、当業者に良く知られており、そして引用により本明細書に組み込まれる継続
出願アメリカ特許出願08／060,988 に十分に記載されている。

【００２７】 さらに、抗原性ペプチドは、中和化抗体、すなわち関連する微生物又は微生物
により感染された細胞に結合しそしてそれを殺害するそれらの抗体を誘発するエ
ピトープを含むことができる。候補体ペプチドのそれらの性質を確立する手段は
、当業者に良く知られており、そして引用により本明細書中に組み込まれる継続
出願アメリカ特許出願08／060,988 に十分に記載されている。

【００２８】 抗原性ペプチドはまた、適切な微生物により感染された細胞、又は抗原性ペプ
チドが由来するタンパク質をそれらの表面で発現する腫瘍細胞の抗体−依存性細
胞溶解（ADCC）を誘発する抗体を誘発することができる。ADCCは保護機構であり
、それにより、免疫系の特殊化された細胞（K 細胞）が、標的細胞の表面に結合
されるIgG 抗体分子のFc部分を認識し、そしてその関連する標的細胞を溶解する
。候補体ペプチドにより粘膜的に免疫化された試験対象からの血清又は他の体液
、たとえば直腸洗浄物が、当業者に知られている方法によりADCCを介在するそれ
らの能力について試験され得る。標準細胞介在性リンパ溶解（CML ）アッセイが
使用される。手短には、リンパ球様ADCCエフェクター細胞（たとえば、末梢血液
単核（PBMC）又はSP細胞）の源が、試験血清の種々の希釈溶液の存在下で、上記
細胞表面タンパク質を発現する標的細胞と共にインビトロでインキュベートされ
た。プレラベルされた標的細胞からの検出できるラベル（たとえば51Cr）の遊離
により測定され得る標的細胞の溶解は、試験血清におけるADCC誘発性抗体の存在
の指標である。

【００２９】 本発明のペプチドは、クラスターペプチドワクチン構造体（CLUVAC）であり得
る。CLUVACは、ａ）多重MHC クラスII分子（クラスターペプチド）により提供さ
れ得る多重オーバーラップ ヘルパーT 細胞活性化エピトープを有する副領域、
ｂ）CTL 活性化エピトープを有する副領域、及びｃ）中和化抗体の生成を誘発す
る副領域を含むキメラペプチドである。それらのエピトープを含むペプチド配列
は、微生物又は腫瘍関連ポリペプチドの異なった部分に由来することができる。
他方では、CTL 誘発性及び抗体中和性エピトープは、抗原の1 つの副領域に位置
することができ、そしてヘルパーエピトープは第２の副領域に存在することがで
きる。CLUVAC及びそれらの企画は、引用により本明細書に組み込まれる同時係属
出願アメリカ特許出願08／060,988 に広範囲に記載されている。

【００３０】 HIV −１CLUVACは次の配列を含むことができる： EQMHEDIISLWDQSLKPCVKRIQRGPGRAFVTIGK ( 配列番号：1), KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIRRIQRGPGRAFVTIGK ( 配列番号：2), RDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTRIQRGPGRAFVTIGK ( 配列番号：3), AVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIQRGPGRAFVTIGK (配列番号：4), DRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIQRGPGRAFVTIGK (配列番号：5), DRVIEVVQGAYRAIRRIQRGPGRAFVTIGK (配列番号：6), AQGAYRAIRHIPRRIRRIQRGPGPRAFVTIGK (配列番号：7), EQMHEDIISLWDQSLKPCVKRIHIGPGRAFYTTKN ( 配列番号：8), KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIRRIHIGPGRAFYTTKN ( 配列番号：9), RDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTRIHIGPGRAFYTTKN ( 配列番号：10), AVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIHIGPGRAFYTTKN (配列番号：11), DRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIHIGPGRAFYTTKN (配列番号：12), DRVIEVVQGAYRAIRRIHIGPGRAFYTTKN (配列番号：13) 又は、 AQGAYRAIRHIPRRIRRIHIGPGRAFYTTKN ( 配列番号：14) 。

【００３１】 たとえば、CTL 及び／又は中和化抗体エピトープを含むいずれかのペプチドに
特定のクラスターペプチドを結合することは可能である。クラスターペプチドの
例は、次のものを包含する：クラスターペプチド１（このアミノ酸配列（EQMHED
IISLWDQSLKPCVK）( 配列番号：17) は、配列番号１を有するHIV-1 CLUVACの最初
の20個のアミノ酸である）； クラスターペプチド3 （このアミノ酸配列（KQII
NMWQEVGKAMYAPPISGQIR）( 配列番号：18) は、配列番号2 を有するHIV-1 CLUVAC
の最初の24個のアミノ酸である）； クラスターペプチド4 （このアミノ酸配列
（RDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPT）( 配列番号：19) は、配列番号3 を有するHIV-1
CLUVACの最初の24個のアミノ酸である）； 及びクラスターペプチド6 （このア
ミノ酸配列（AVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLER ）( 配列番号：20) は、配列
番号4 を有するHIV-1 CLUVACの最初の33個のアミノ酸である）。

【００３２】 配列番号：2, 9及び12のアミノ酸配列を含むペプチドが特に興味あるものであ
る。最初のもの（PCLUS3-18IIIB ）に対する粘膜応答は下記に示される例におい
て広範囲に特徴づけられる。PCLUS3-18MN ( 配列番号：９) 及びPCLUS6.1-18MN
( 配列番号：12) は、ヒト臨床試験において試験されている。PCLUS3-18IIIB （
配列番号：2 ）内のCTL エピトープは、アミノ酸配列（RIQRGPGRAFVTIGK ）( 配
列番号：15) である。

【００３３】 多くの場合、粘膜アジュバントは、可溶性抗原と共に粘膜組織部位で同時投与
される。そのようなアジュバントは、解毒された細菌毒素、たとえば解毒された
コレラ毒素（CT）、E. コリ熱不安定性毒素（LT）、変異CT（MCT ）（Yamamoto
, など. J. Exp. Med. 185 : 1203(1997); Yamamoto など, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 58 : 5267(1997); Douce など. Infect. Immunity 65 : 2821(1997)）
、変異E.コリ熱不安定性毒素（MLT ）（Di Tommaso など. Infect. Immunity 6
4:974 (1996) ; Partidos など. Immunology 69 : 83 (1996) ）、及び百日咳毒
素を包含するが、但しそれらだけには限定されない。MCT 及びMLT は、親分子の
活性に対してアジュバント活性に実質的に影響を与えないで、毒素を実質的に排
除する点突然変異を含む。他の好ましい態様においては、アジュバントは、粘膜
組織及び／又はT −細胞への高められた結合のために修飾される。従って、本発
明の1 つの観点においては、CT又は他の細菌毒素は、粘膜組織結合剤、たとえば
プロテインA 、粘膜−又はT −細胞−特異的タンパク質（たとえば、受容体）を
結合する抗体、又は粘膜組織−又はT −細胞−特異的タンパク質（たとえば、CD
4 又はCD8 ）を結合するリガンド又はペプチドに接合される。たとえば、CTのB
鎖は、毒性を排除し、そしてプロテインA により介在される粘膜組織結合を増強
するために、CT A 鎖に接合されるプロテインA により置換され得る。他方では
、T 細胞上のCD4 を結合するHIV V3ループが、T 細胞への供給を増強するため
にアジュバントに接合され得る。

【００３４】 サイトカインを増強するCTL 、たとえばIL−2 及びIFN γは、多くの場合、全
身的に投与され、又は好ましくは、可溶性抗原と共に粘膜組織部位で同時に投与
される。 開示される抗原性ペプチドの変異体は、親分子からの異なったアミノ酸（好ま
しくは、保存性変化）を含むことができるが、しかし親分子の生物学的活性、た
とえば粘膜免疫化に続いて特定のCTL 応答を誘発する能力を保持することができ
る。そのような変異体は、標準の手段により合成され得；そして当業者に知られ
ているアッセイにより容易に試験される。抗原性ポリペプチドは典型的には、本
明細書に引用される公称配列番号の長さよりも長く、すなわちポリペプチドは、
いづれかの与えられた配列番号により定義されるペプチドのアミノ又はカルボキ
シ末端にアミノ酸を付加することによって延長され得る。

【００３５】 本発明のペプチド及びポリペプチドはまた、上記に記載されたそれらを包含す
るが、しかし次の手段によりインビボ使用のために修飾されたそれらのペプチド
及びポリペプチドも包含するであろう： （ａ）細胞及び細胞質膜を通してペプチドを指図し、そしてそれを、抗原提供
細胞（APC ）、たとえば可能性あるCTL インデューサーである樹枝状細胞の小胞
体（ER）に運ぶよう作用するであろう、哺乳類シグナルペプチド（Lin など., J
. Biol. Chem. 270 : 14255(1995) ）、又は細胞ペプチド、すなわちペネトラチ
ン（Joliot など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 1864 (1991)）を含むた
めの化学的又は組換えDNA 方法； （ｂ）細胞の表面上に存在するトランスロケーターに対して特異的に結合する
その能力により細胞膜を通してポリペプチド又はペプチドを方向づけるよう作用
するビオチン残基の付加（Chenなど., Analytical biochem. 227 : 168 (1995)
）; （ｃ）関連するポリペプチド又はペプチドの生存性をインビボで促進するため
に、アミノ−及びカルボキシ−末端のいずれかで又は両者での阻止剤の添加。こ
れは、末端が細胞又はER摂取の前、プロテアーゼにより分解される（“少しずつ
かみ取られる(nibbled）”）傾向があるそれらの状況において有用であり得る。
そのような阻止剤は、投与されるべきポリペプチド又はポリペプチドのアミノ及
び／又はカルボキシ末端残基に結合され得る追加の関連するか又は関連しないペ
プチド配列を含むことができるが、それだけには限定されない。これは、ペプチ
ドの合成の間、化学的に、又は組換えDNA 技法により行われ得る（下記セクショ
ン3.3 を参照のこと）。他方では、阻止剤、たとえば当業者に知られているピロ
グルタミン酸又は他の分子が、アミノ及び／又はカルボキシ末端残基に、又はア
ミノ末端でアミノ基、もしくは異なった成分により置換されるカルボキシ末端で
カルボキシル基に結合され得る。同様に、ポリペプチド又はペプチドは、投与の
前、医薬的に許容できる“キャリヤー”タンパク質に共有又は非共有結合され得
る。

【００３６】 また、本発明のペプチドのアミノ酸配列に基づいてのペプチド類似化合物も興
味の対象である。ペプチド類似化合物は、選択されたペプチドの三次元構造に基
づいて三次元構造（すなわち、“ペプチドモチーフ”）を有する合成化合物であ
る。このペプチドモチーフは、複数のハプロタイプのMHC 分子に結合し、そして
ペプチド類似化合物が由来するペプチドの活性と同じか又はそれよりも高いその
ようなMHC 分子を発現する対象からのCD8 ＋及びCD4 ＋T 細胞を活性化する活性
を、そのペプチド類似化合物に提供する。ペプチド類似化合物は、それらの治療
用途を高める追加の特徴、たとえば高められた細胞透過性、より高い親和性及び
／又は結合活性、及び延長された生物学的半減期を有することができる。本発明
のペプチド類似体は典型的には、部分的に又は完全に非ペプチドであるが、しか
しペプチド類似体が基礎づけられるペプチドにおいて存在するアミノ酸残基の側
基に対して同一の側基を有する主鎖を有する。いくつかのタイプの化学結合、た
とえばエステル、チオエステル、チオアミド、レトロアミド、還元されたカルボ
ニル、ジメチレン及びケトメチレン基は、プロテアーゼ耐性ペプチド類似体の構
成においてペプチド結合のための一般的に有用な置換基であることが知られてい
る。

【００３７】 B.2 対象の粘膜に可溶性抗原を供給するためのインビボ方法 粘膜CTL 応答を誘発する本発明の方法においては、可溶性抗原が、誘発性粘膜
免疫系の抗原提供細胞（たとえば、腸のPP）に供給される。供給は、可溶性抗原
自体、たとえば抗原性ペプチド、可溶性抗原をコードする発現ベクター、又はベ
クターによりトランスフェクトされた又はトランスダクトされた細胞のいずれか
を対象に投与することを包含する。

【００３８】 B.2.1 可溶性抗原の投与 可溶性抗原は、ヒト対象への供給のために下記記載の技法と実質的に同じ技法
を用いて、哺乳類の粘膜免疫系に供給され得る。適切な哺乳類の例は、ヒト、非
ヒト霊長類、ウマ、ウシ、羊、犬、ネコ、マウス、ラット、テンジクネズミ、ハ
ムスター、ウサギ及びヤギを包含するが、但しそれらだけには限定されない。

【００３９】 本発明の可溶性抗原は、適切の生理溶液、たとえば生理食塩に溶解されたその
変性されていない状態でヒトの粘膜免疫系に供給され得る。他方では、それは、
細胞及び／又は細胞内膜を通しての輸送を促進し、そして細胞外又は細胞内分解
を妨げるために、セクションB.1 に詳細されるように変性され得る。生物学的膜
を通してその輸送はまた、既知方法（Gabizon など., Cancer Res. 50 : 6371 (
1990); Ranade, J. Clin. Pharmacol. 29 : 685 (1989)）を用いて、リポソーム
又は適切な生物分解性ポリマー微小粒子（また、“微小球体”、“極微小球体”
、“極微小粒子”、又は“微小カプセル”）にそれを封入して供給することによ
っても増強され得る。天然においては、可溶性抗原が粘膜に選択的に標的化され
ることが所望される。これは、可溶性抗原と、関連する粘膜表面とを、たとえば
IR, IVG, IN, 咽頭内（IPG ）又はIT注入又は移植により直接的に達成され得る
。IR免疫化により誘発されるCTL 活性（全身性又は粘膜）は、IN免疫化により誘
発される活性よりも2 倍、好ましくは5 倍、より好ましくは12倍、さらに好まし
くは50倍、及び最も好ましくは200 倍高い。

【００４０】 本発明の可溶性抗原は、関連する細胞（たとえば、樹枝状細胞又はマクロファ
ージAPC ）上の受容体のためのリガンド、又はそれらの細胞により発現される細
胞−表面マーカーに対する抗体を組み込まれているリポソームにおいて供給され
得る。従って、樹枝状細胞表面マーカーに対して特異的な抗体は、抗−樹枝状細
胞抗体及び関連する可溶性抗原の両者を含むリポソームを樹枝状細胞に指図する
ことができる。

【００４１】 可溶性抗原は、単独で又は粘膜アジュバントと一緒に粘膜的に投与され得る。
適切なアジュバントは、CT、MCT 及びMLT を包含するが、但しそれらだけには限
定されない。IL−12及び／又はIFN γまたは、対象に投与され得る。従って、可
溶性抗原は、アジュバントと共に、IL−12（アジュバントの不在下で）と共に、
IFN γ（アジュバントの不在下で）と共に、IL−12及びIFN γ（アジュバントの
不在下で）と共に、アジュバント及びIL−12と共に、アジュバント及びIFN γと
共に、又はアジュバント、及びIL−12及びIFN γと共に投与され得る。IL−12及
びIFN γは、全身的に投与され得、又はペプチドと共に粘膜的に同時投与され得
る。可溶性抗原がリポソーム又は微小粒子に封入されて投与される場合、IL−12
及び／又はIFN γは、同じリポソーム／微小粒子中に同時導入され、又は別のリ
ポソーム／微小粒子中に導入され得る。他方では、サイトカインは、遊離溶解形
で投与され得る。単独で又は組合して使用され得る他のサイトカインの例は、顆
粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF ）、インターロイキン−2 （
IL−2 ）、インターロイキン−7 （IL−7 ）、又は腫瘍壊死因子ａ（TNF ａ）で
ある。それらの及び他の免疫強化するサイトカインが、IL−12及びIFN γについ
て上記で論ぜられた様にして投与される。投与は、1 回又は複数回（2, 3, 4, 5
, 6, 8 又は12回の投与）であり得る。複数回投与の場合、それらは1 日〜1 年
の間隔を開けられ得る。ヘルパーT −細胞エピトープを有さないペプチドを用い
る場合、そのような複数回投与を行うことが必要である。

【００４２】 本発明の好ましい観点においては、可溶性抗原の配合物は、たとえばその可溶
性抗原を直腸浣腸液、発泡剤、坐剤又は局所用ゲルに配合することによって、直
腸内投与（すなわち、直腸、結腸、S 字結腸又は遠位結腸への供給）のために調
製される。それらの直腸供給配合物は、その可溶性抗原と1 又は複数の既知直腸
内供給基材、又は担体材料、直腸吸収−促進材料、及び／又は安定剤とを組合す
ことによって、直腸における改良された供給、安定性及び／又は吸収性について
適合される。

【００４３】 本発明の方法内の可溶性抗原の直腸供給のための好ましい基材配合物は、親和
性及び疎水性ビークル又は担体、たとえば坐剤及び直腸エマルジョン又はゲル調
製物を配合することに通常使用されるそれらの材料を含む。従って、直腸内投与
のために適切な油／水エマルジョンに可溶性抗原を組み込んでいるエマルジョン
ビークルが使用される。他方では、均質ゲルキャリヤー、たとえばポリオキシエ
チレンゲル、たとえばポリオキシエチレン（20）セチルエーテル（BC−20TX）に
可溶性抗原を組み込んでいるゲル配合物が提供される。抗原が直腸的に適合でき
る発泡剤に配合される場合、非−CFC 推進発泡剤が好ましい。

【００４４】 本発明内で使用するための好ましい担体又はデリバリービヒクルは、直腸内使
用のために適合される従来の坐剤基材、たとえばポリエチレングリコールである
。当業者において知られており、そして入手できる典型的なポリエチレングリコ
ールは、PEG400, PEG1500, PEG2000, PEG4000 又はPEG6000 を包含する。これに
関する好ましい基材は、witepsol H15, witepsol W35, witepsol E85 を包含す
る。それらは、それらの所望する親油性及び／又は親水性性質のために選択され
、そしてしばしば、親油性及び親水性基礎層を有する多重層坐剤を形成するため
に選択される。好ましい親油性基材は、低分子量のマクロゲルである。適切な親
油性基材の特定の例は、プロピレングリコールジカプリレート（Sefsol 229）及
びMiglyol 810 を包含する。好ましい親水性基材は、PEG 、たとえばPEG400であ
る。本発明において有用な1 つの配合物においては、ヒドロキシプロピルセルロ
ース−（HPC ）及び／又はcarbopol - 934P (CP) が、内部坐剤層のための基材
として、及びwitepsol 基材が外部層として使用される。

【００４５】 結晶性セルロース又は他の通常の安定剤が、持効性開放を促進するために基材
に選択された量（たとえば、30〜60重量％）で添加され得る。 直腸内供給組成物、特に坐剤を配合するための基材、安定剤及び吸収−促進剤
の選択は、たとえば溶融及び滴下速度、分解硬度、砕解及び特定の分解時間、拡
がり性質及び拡散速度に基づいて、従来の方法に従って決定される。それらの種
々の性質の好ましい値は、知られており、そして直腸内使用のために適合できる
ように抗原配合物を調節するために容易に決定され得る。特に、直腸供給のため
の適切な構造的及び化学的性質を有する持効性坐剤を配合するための適切な値は
知らされており、または容易に確かめられる。この場合、従来の添加剤、たとえ
ば軟化剤、たとえば中性油、Estasan, 等が、配合物のコンシステンシー、供給
速度及び他の特徴を最適化するために含まれ得る。

【００４６】 粘膜供給組成物を配合する場合、粘膜表面への可溶性抗原及び任意には、CTL
−刺激サイトカインの供給を高めるために吸収−促進剤を含むこともまた所望さ
れる。種々の吸収促進剤（すなわち、膜侵入を増強することにより、供給ビーク
ル又は基材から抗原及び／又はCTL −刺激サイトカインの開放又は拡散を増強し
、又は粘膜組織又はT −細胞への抗原及び／又はCTL −刺激サイトカインの供給
を増強する剤）は、当業界において知られており、そして直腸内供給配合物、特
に坐剤への包含のために、本発明の粘膜供給配合物において有用である。それら
は、界面活性剤（たとえばTween80 ）、混合されたミセル、エナミン、酸化窒素
ドナー（たとえば、S −ニトロソ−N −アセチル−DL−ペニシラミン、NOR １、
NOR4−好ましくは、スキャベンジャー、たとえばカルボキシン−PITO又はドクロ
フェナックナトリウムと共に同時投与される）、サリチル酸ナトリウム、アセト
酢酸のグリセロールエステル（たとえば、グリセリル−1, 3−ジアセトアセテー
ト又は1, 2−イソプロピリデングリセリン−3 −アセトアセテート）、及び粘膜
供給のために適合された他の開放−拡散／吸収−促進剤を包含するが、但しそれ
らだけには限定されない。

【００４７】 本発明において有用な吸収−促進剤は、直腸内使用のために特別に適合された
種々の化合物を含む。この場合、直腸薬剤吸収の速度及び程度はしばしば、経口
吸収に関してよりも低く、これはたぶん、薬物摂取のために利用できる比較的小
さな表面積による固有の要因のためである。さらに、直腸配合物の組成（固体対
液体、座材基材の性質）は、吸収工程において重要な要因である。配合物と薬剤
摂取との間の関係は、明確に示されている。従って、吸収−促進剤（たとえば、
界面活性剤、サリチル酸ナトリウム、エナミン）の同時投与は、直腸薬剤吸収を
最適化することへの重要なアプローチを示す。

【００４８】 坐剤、浣腸、浸透ポンプ、又はヒドロゲル配合物を用いての部位−及び速度−
調節された態様での直腸薬剤供給は、粘膜供給を操作するための広範囲の選択、
たとえば濃度の調節、持効性及び免疫原−薬剤効果を提供する。水性及びアルコ
ール性溶液からの吸収は非常に急速に生じるが、しかし坐剤からの吸収は一般的
に遅く、そして坐剤基材の性質、界面活性剤又は他の添加剤の使用、活性成分の
粒子サイズ、等に非常に依存する。

【００４９】 従って、本発明の方法における可溶性抗原及びCTL −刺激性サイトカインを投
与するための好ましい配合物は、粘膜供給を最適化するよう企画される。従って
、それらの剤は、シクロデキストリン及びβ−シクロデキストリン誘導体（たと
えば、2 −ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン及びヘプタキス（2.6
−ジ−O −メチル−β−シクロデキストリン）を包含することができる。好まし
くは、1 又は複数の活性成分により接合され、そして油性基材に配合されるそれ
らの化合物は、直腸内配合物において生物利用性を増強することが十分に示され
ている。直腸内供給のために適合された他の吸収−増強剤は、中鎖脂肪酸、たと
えばモノ−及びジグリセリド（たとえば、カプリン酸ナトリウム−ヤシ油の抽出
物、Capmul）、及びトリグリセリド（たとえば、アミロデキストリン、Estaram
299, Miglyol 810）を包含する。

【００５０】 いずれか1 人のヒト対象のための用量は、多くの要因、および投与される特定
の化合物、投与の時間及び経路、及び同時に投与される他の薬剤に依存すること
が医学業界において良く知られている。本発明の可溶性抗原のための用量は変化
し、そして投与当たり約0.01mg〜100mg であり得る。粘膜アジュバントのための
用量は、投与当たり約0.001mg 〜100mg であろう。IL−12のための用量は、投与
当たり約25μg/kg であり、そしてIFN γのための用量は約300KU 〜30,000KUで
あろう−比較できる用量が他のサイトカインのために使用されるであろう。たと
えば、3,000KU のIFN γが、1 週当たり1 度、人患者に投与され得る。最適用量
を決定するための方法は、薬理学者及び医者に良く知られている。経路は、上記
で引用されたように、粘膜、たとえばIR, IG, IVG, IN, IPG 又はIT であろう
。

【００５１】 B.2.2 可溶性抗原をコードする発現ベクターを利用しての可溶性抗原の
投与。 発現ベクターは、本発明のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド配列がプロモーター又はエンハンサープロモーター組み合わせに操作的に
結合されている核酸から構成され、又はその核酸を含む。プロモーターは、転写
が開始する点の上流の典型的には100 個のヌクレオチド対内のDNA 分子の領域か
ら構成される転写調節要素である。もう1 つの転写調節要素はエンハンサーであ
る。エンハンサーは、時間、位置及び発現レベルによって特異性を提供する。プ
ロモーターとは異なって、エンハンサーは、プロモーターが存在する場合、転写
部位から種々の距離に位置する場合に機能することができる。エンハンサーはま
た、転写開始部位の下流にも位置することができる。発現ベクターのコード配列
は、転写終結領域に操作可能的に連結される。コード配列をプロモーターの制御
下に置くためには、プロモーターの下流（3'）に１〜約50個のヌクレオチドのペ
プチド又はポリペプチドの翻訳読み取り枠の翻訳開始部位を配置することが必要
である。特定のプロモーターの例は、下記に提供される。発現ベクター及びそれ
らの構成のための方法は、当業者に知られている。

【００５２】 適切なベクターは、中でも、プラスミド、及びウィルスベクター、たとえばヘ
ルペスウィルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス、弱毒化されたワクシニ
アウィルス、カナリアポックスウィルス、アデノウィルス及びアデノ−関連ウィ
ルスを包含する。 ヒトにおけるCTL の粘膜誘発への抗原をコードする遺伝子の適用は、インビボ
又はエクスビボに基づくアプローチを利用することができる。

【００５３】 エクスビボ(ex vivo）方法は、対象から細胞（たとえば樹枝状細胞）を収穫し
、細胞を培養し、それらを発現ベクターによりトランスダクトし、そして可溶性
抗原の発現のために適切な条件下で前期細胞を維持する段階を包含する。それら
の方法は分子生物学の業界において良く知られている。トランスダクション段階
は、エクスビボ遺伝子療法のために使用されるいずれかの標準の手段、たとえば
リン酸カルシウム、リポフェクション、エレクトロポレーション、ウィルス感染
及び生物学的遺伝子トランスファーにより達成される。次に、好結果を伴ってト
ランスダクトされた細胞が、たとえば耐薬剤性遺伝子の発現のために選択される
。次に、細胞が致死的に照射され（所望には）、そして対象中に注入又は移植さ
れる。IL−12及びIFN γが、上記（セクションB.2.1 ）で論じられたように、全
身的に、又は相当する粘膜表面に投与され得る。

【００５４】 インビボ(in vivo）アプローチは、対象の粘膜中に遺伝子構造体の直接的な供
給を必要とし、好ましくは興味ある細胞又は組織（たとえば、PPにおける樹枝状
細胞）にその遺伝子構造体を標的化することを必要とする。これは、適切な粘膜
にそれを直接的に投与することによって達成され得る（たとえば、PPの場合、IR
）。組織特異的標的化はまた、静電力又は共有力によりポリ−L −リシンに結合
されるプラスミド又は他のベクターから構成される分子接合体の使用によっても
達成され得る。ポリ−L −リシンは、標的細胞上の受容体に結合できるリガンド
に結合する（Cristiano など. J. Mol. Med. 73 : 479 (1995)）。同様に、上記
セクションB.2.1 に記載されるタイプの細胞特異的抗体は、ベクターに結合され
得、そしてそれにより、それらを、粘膜免疫系の相当する細胞に標的化すること
ができる。組織又は細胞−特異的発現を相対的に誘発するプロモーターは、さら
なるレベルの標的化を達成するために使用され得る。適切な組織−特異的プロモ
ーターは、たとえば誘発IL−2 （Thompson など., Mol. Cell. Biol. 12 : 104
3 (1992)）、IL−4 （Todd など., J. Exp. Med. 177 : 1663 (1993) ）、及び
IFN γ（Penix など., J. Exp. Med. 178 : 483 (1993)）T −細胞標的化プロモ
ーターを包含する。それらのプロモーターは、リンパ球様組織、たとえば粘膜リ
ンパ球様組織、たとえばPPにおける可溶性抗原の生成を可能にする。天然におい
ては、理想的なプロモーターは、樹枝状細胞特異的プロモーターであろう。

【００５５】 ベクターはまた、上記セクションB.2.1 に記載されるように、単独で又は細胞
特異的抗体と共に同時導入される、リピソーム又は他の供給ビークル中への組み
込みにより供給され得る。 DNA 又はトランスフェクトされた細胞は、医薬的に許容できるキャリヤーにお
いて投与され得る。医薬的に許容できるキャリヤーは、ヒトへの投与のために適
切である生物学的に適合するビークル、たとえば生理食塩水である。治療的有効
量とは、処理される動物に医学的に所望する結果を生成することができる本発明
のDNA の量である。医学業界において良く知られているように、いずれか一人の
患者のための用量は、多くの要因、たとえば患者の大きさ、身体表面積、年齢、
投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、一般的の健康、及び同時
に投与される他の薬剤に依存する。用量は変化するが、しかしDNA の投与のため
の好ましい容量は、DNA 分子の約10⁶ 〜10¹²のコピーである。 この用量は、必
要な場合、反復して投与され得る。投与の経路は、セクションB.2.1 において可
溶性抗原について列挙される粘膜経路であろう。 粘膜アジュバント、IL-12 及
びIFN γはまた、セクションB.2.1 に列挙されるのと、同じ組み合わせで、同じ
経路により及び同じ用量で投与され得る。

【００５６】 B.3 ペプチド及びポリペプチド源 本発明の方法に使用されるペプチド及びポリペプチドは、種々の手段により得
られる。小さなペプチド（100 個よりも少ないアミノ酸の長さ）は、当業者に知
られている標準の化学的方法により便利に合成され得る（たとえば、Creighton,
Proteins : Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N
.Y. (1983)）。大きなペプチド（100 個よりも長いアミノ酸）は、組換えDNA 技
法を包含する多くの方法により生成され得る（下記を参照のこと）。いくつかの
ポリペプチド（たとえば、HIV −１、gp160, CT, LT, IL-12 又はIFN γ）は、
市販されている。

【００５７】 ポリペプチド、たとえばHIV −１, gp160, CT, IL-12 又はIFN γは、当業者
に良く知られている方法により生物学的源から精製され得る（Protein Purifica
tion, Principles and Practice, Second Edition (1987) Scopes, Springer Ve
rlag, N.Y.）。それらはまた、当業界において良く知られている技法を用いて、
組換えDNA 技法により、それらの天然に存在する、切断された、キメラ（たとえ
ば、CLUVACにおけるような）、又は融合タンパク質形で生成され得る。それらの
方法は、たとえば、インビトロ組換えDNA 技法、合成技法及びインビボ遺伝子組
換えを包含する。たとえば、次の文献に記載される技法を参照のこと：Sambrook
など. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Maual, Cold Spring Harbor
Press, N.Y.,; 及びAusubel など., eds. (1989), Current Protocols in Mol
ecular Biology, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons
, Inc., N.Y.。他方では、タンパク質をコードするRNA は化学的に合成され得る
。たとえば、Oligonucleotide Synthesis, (1984) Gait, M.J. ed., IRL Press,
Oxford ( 引用により本明細書に組み込まれる) に記載される技法を参照のこと
。

【００５８】 種々の宿主−発現ベクターシステムが、ヌクレオチド配列を発現するために利
用され得る。ペプチド又はポリペプチドが可溶性である場合、それは次のものか
ら回収され得る：（ａ）ペプチド又はポリペプチドが分泌されない場合、宿主細
胞からの培養物；又は（ｂ）ペプチド又はポリペプチドが細胞により分泌される
場合、培養培地。発現システムはまた、ポリペプチドを現場発現する、すなわち
細胞膜に固定される、構築された宿主細胞を包含する。そのような発現システム
からのポリペプチドの精製又は富化は、当業者に良く知られている適切な界面活
性剤及び脂質ミセル及び方法を用いて達成され得る。他方では、そのような構築
された宿主細胞自体はタンパク質の構造的及び機能的特徴を保持するのみならず
、又生物学的活性を評価することが重要である情況において使用され得る。

【００５９】 本発明のために使用され得る発現システムは、微生物、たとえばヌクレオチド
配列を含む、組換えバクテリオファージDNA 、プラスミドDNA 又はコスミドDNA
発現ベクターにより形質転換された細菌（たとえば、E.コリ及びB.サブチリス）
；組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；組換え発現ベクター（バ
キュロウィルス）により感染された昆虫細胞；組換えウィルス発現ベクター（た
とえば、カリフラワーモザイクウィルス、CAMV；タバコモザイクウィルス、TMV
）により感染されているか又は組換えプラスミド発現ベクターにより形質転換さ
れた植物細胞系；又は哺乳類細胞のゲノム（たとえば、メタロチオネイン プロ
モーター）、又は哺乳類ウィルスに由来するプロモーターを含む組換え発現構造
体を有する哺乳類細胞（たとえば、COS, CHO, BHK, 293, 3T3 ）を包含するが、
但しそれらだけには限定されない。

【００６０】 細菌システムにおいては、多くの発現ベクターが好都合には、発現される遺伝
子生成物のために意図される使用に依存して選択され得る。たとえば多量のその
ようなタンパク質が、たとえばインビボ免疫化のために生成される場合、容易に
精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を指図するベクターが所望さ
れる。そのようなベクターは、E.コリ発現ベクターpUR278 (Ruther など., EMB
O J. 2:1791 (1983)) 、ここでコード配列は、融合タンパク質が生成されるよう
lacZコード領域と整合してベクター中にそれぞれ連結され得る；pIN ベクター（
Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13 : 3101 (1985); Van Heeke & Schust
er, J. Biol. Chem. 264 : 5503 (1989)）; 及び同様のものを包含するが、但し
それらだけには限定されない。PGEXベクターはまた、グルタチオンS −トランス
フェラーゼ（GST ）により融合タンパク質として外来性ポリペプチドを発現する
ためにも使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり
、そしてグルタチオン−アガロースビーズへの吸着、続く遊離グルタチオンの存
在下での溶出により、溶解された細胞から容易に生成され得る。PGEXベクターは
、クローン化された標的遺伝子生成物がGST 成分から開放され得るように、トロ
ンビン又は第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように企画される。

【００６１】 哺乳類宿主細胞においては、多くのウィルスに基づく発現システムが利用され
得る。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合、興味あるヌクレオ
チド配列が、アデノウィルス転写／翻訳制御複合体、たとえば後期プロモーター
及び三量体リーダー配列に連結され得る。次にこのキメラ遺伝子が、インビトロ
又はインビボ組換えによりアデノウィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスゲノ
ムの非必須領域（たとえば領域E1又はE3）における挿入は、実行可能であり、そ
して感染された宿主において遺伝子生成物を発現することができる組換えウィル
スをもたらすであろう（たとえば、Logan and Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81 : 3655 (1984) を参照のこと）。特定の開始シグナルはまた、挿入され
たヌクレオチド配列の効果的な翻訳のために必要とされ得る。それらのシグナル
は、ATG 開始コドン及び隣接する配列を包含する。それ自体の開始コドン及び隣
接する配列を包含する完全な遺伝子又はDNA が適切な発現ベクター中に挿入され
る場合、追加の翻訳制御シグナルは必要とされない。しかしながら、コード配列
の一部のみが挿入される場合、たぶんAGT 開始コドンを包含する外因性翻訳制御
シグナルが供給されるべきである。さらに、その開始コドンは、全挿入体の翻訳
を確かにするために、所望するコード配列の読み取り枠と整合して存在すべきで
ある。それらの外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、種々の起源（天然及
び合成）のものであり得る発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写タ
ーミネーター、等の包含により増強され得る（Bittner など., Methods in Enzy
mol. 153 : 516 (1987) ）。

【００６２】 さらに、挿入された配列の発現を調節し、又は所望する特定の態様で遺伝子生
成物を修飾し、そしてプロセッシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク
質生成物のそのような修飾（たとえば、グリコシル化）及びプロセッシングは、
タンパク質の機能のために重要である。適切な細胞系又は宿主システムは、発現
される外来性タンパク質の正しい修飾及びプロセッシングを確かにするために選
択され得る。哺乳類宿主細胞は、CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK,293, 3T3及
びWI38を包含するが、但しそれらだけには限定されない。

【００６３】 組換えタンパク質の長期の高収率生成のためには、安定した発現が好ましい。
たとえば、上記配列を安定して発現する細胞系が構築され得る。複製のウィルス
起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要
素（たとえば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポデア
デニル化部位、等）、及び選択マーカーにより制御されるDNA により形質転換さ
れ得る。外来性DNA の導入に続いて、構築された細胞は、富化された培地におい
て1 〜2 日間、増殖せしめられ、そして次に、選択培地に交換される。組換えプ
ラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、そして細胞がプ
ラスミドをそれらの染色体中に安定して組み込み、そして細胞系中にクローン化
され、そして拡張され得る中心物を形成するための増殖を可能にされる。この方
法は、遺伝子生成物を発現する細胞系を構築するために都合良く使用され得る。
そのような構築された細胞系は、遺伝子生成物の内因性活性に影響を及ぼす化合
物のスクリーニング及び評価において特に有用である。

【００６４】 融合タンパク質は、発現される融合タンパク質に対して特異的に結合する抗体
又はリガンドを利用することによって容易に精製され得る。たとえば、Janknech
t など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972 (1991) により記載されるシス
テムは、ヒト細胞系において発現される、変性されていない融合タンパク質の容
易な精製を可能にする。このシステムにおいては、興味ある遺伝子が、その遺伝
子の読み取り枠が、6 個のヒスチジン残基から成るアミノ−端末標識に翻訳的に
融合されるようにワクシニア組換えプラスミド中にサブクローン化される。組換
えワクシニアウィルスにより感染された細胞からの抽出物が、Ni2 ＋ニトリロ酢
酸−アガロースカラム上に負荷され、そしてヒスチジン−標識されたタンパク質
がイミダゾール含有緩衝液により選択的に溶離される。所望には、ヒスチジン標
識は、適切な酵素により選択的に切断され得る。

【００６５】 次の例は、本発明を例示するものであって、限定するものではない。 実施例材料と方法 ヒトIR免疫 本発明の可溶性抗原を医薬的に許容される担体、例えば生理食塩水
の中に溶かし、そしてアジュバントを伴って又は伴わないで且つサイトカイン、
例えばIL−12及び／又はIFN γを伴って又は伴わないで投与する。サイトカイン
は全身投与するか、又は当該抗原と一緒に投与してよい。可溶性抗原の用量は一
回の投与当り約0.001mg 〜100mg とする。投与は一回又は複数回としてよい。多
重免疫の場合、例えばそれは毎週の投与を４回、しかる後（所望するなら）数ヶ
月（例えば２，３，４，６，８又は12ヶ月）又は数年（例えば２，３，４，５，
10，20又は30年）にわたるブースター投与であってよい。

【００６６】 抗原の投与（アジュバントを伴って及び伴わないで、且つサイトカインを伴っ
て及び伴わないで）は免疫用組成物の組込まれた座剤の浣腸又はフレキシブルシ
グモイドスコープを介してのIR挿入によるものであってよい。CTL 活性化培養物 免疫してから様々な時点で（各実験について別々に）、CTL
活性を評価した。BALB/cマウスを殺し、そして腸及びSPを外科的に取り出した。
単独の細胞の懸濁物を平均的な当業者に周知の方法によりその器官から調製した
。PP及びLPの場合、PPをまず腸の外面から切除した。腸の残部を１〜３mm² の小
断片に切り、それをリン酸緩衝食塩水(PBS）に懸濁した。その組織断片懸濁物を
室温で20分撹拌し、そして同じ条件下で振盪し、その組織から上皮内リンパ球(I
EL）を遊離させた。懸濁IEL を捨て、そして組織断片をPBS 内に溶解せしめたVI
II型コラゲナーゼ（Sigma)(300Ｕ／ml）により室温で１時間処理してLP細胞を遊
離させた。PP細胞を同コラゲナーゼ処理によりこの切除PPから抽出した。次いで
細胞（PP又はLP）を75％及び40％のパーコールを含む不連続勾配に載せ、そして
2,000rpmで20分遠心分離した。リンパ球を75％／40％の界面から回収し、そして
２回洗浄した。SP, PP, LP由来の免疫細胞を１μＭのP18III B-I10ペプチドによ
り５×10⁶ ／mlにおいて、24穴培養プレート内で完全Ｔ細胞培地(CTM）、即ち、
10％の胎児牛血清、２mMのＬ−グルタミン、ペニシリン(100Ｕ／ml）、ストレプ
トマイシン(100μｇ／ml）及び５×10^-5Ｍの２−メルカプトエタノールを含むRP
MI 1640 中で培養した。P18III B-I10はP18III B（SEQ ID NO: 15)の最小必須CT
L エピトープを含むペプチドであり、そして次の配列を有する：RGPGRAFVTI (SE
Q ID NO: 16)。３日後、コンカナバリンＡ活性化脾臓細胞由来の10％の上清液を
インターロイキン−２（IL−２）の起源として加えた。７日間培養後、LPリンパ
球(LPL）を１μＭのP18III B-I10ペプチド(SEQ ID NO: 16）と４×10⁶ の3300ra
d 照射同系SP細胞とにより次の７日間の培養において刺激した。免疫SP及びPP細
胞を同様にして２回の７日間培養期間にわたりin vitro刺激し、それからアッセ
イした。CTL の細胞溶解活性を当業者に周知の方法を利用して⁵¹Crラベル化Ｐ81
5 標的を用い４時間アッセイにより測定した。CTL のペプチド特異性を試験する
ため、⁵¹Crラベル化Ｐ815 標的をアッセイの開始時にペプチドで２時間パルスし
た。％比⁵¹Cr遊離を100 ×（実験遊離値−自発遊離値）／（最大遊離値−自発遊
離値）として計算した。最大遊離値は５％のTriton-X 100の添加により溶解せし
めた細胞の上清液から決定した。コントロールとして、自発遊離値を、エフェク
ター細胞を添加せずにインキュベーションした標的細胞から決定した。トリプリ
ケートの培養物の平均の標準誤差は全て平均値の５％未満であった。ウィルスプラークアッセイ HIV-1 III B gp160 を発現する組換ワクシニアウィ
ルス(vPE16）によるIR負荷の６日後、マウスを殺した。その卵巣を取り出し、単
独細胞懸濁物にまで解離し、そしてvPE16 力価について BSC−２インジケーター
細胞のプレート上で一連の10倍希釈品をプレーティングし、クリスタルバイオレ
ットで染色し、そして各希釈率でのプラーク数をカウントすることによりアッセ
イした。ウィルスの最小検出可能レベルはクロプラーク形成単位(pfu）であった
。 実施例１．粘膜免疫及び全身免疫の後の粘膜CTL 及び全身CTL 応答の対比 マウスを HIV−１ CLUVAC PCLUS3-18III B (SEQ ID NO: 2)(50μｇ／マウス）
の４回投与により（０，７，14及び21日）IR免疫した。１回目の投与の５週から
６ヶ月後、抗原特異的Ｔ細胞をPP, LP及びSPから単離し、そして HIV−１ P18II
I B ペプチド特異的CTL の存在について（図１）、前述の通りに試験した。べた
塗り四角はP18III B-I10（SEQ ID NO: 16)パルス化標的の殺生を示し、そして白
抜きひし形はパルスを施していない標的の殺生を示す。IR免疫は長期間持続する
保護免疫応答を誘導した。抗原特異的CTL が免疫後６ヶ月以上にて、粘膜誘導（
PP）及びエフェクター（LP）部位において、並びに全身系部位（SP）において検
出された。対照的に、全身免疫（S. C. : 不完全フロイドアジュバント中）は脾
臓においてCTL を誘導したが、粘膜誘導系（即ち、PP及びLP）では誘導しなかっ
た。 実施例２．粘膜アジュバントを伴う及び伴わない場合のCTL 応答の対比 BALB/cマウスを合成 HIV−１ CLUVAC PCLUS3-18III B（SEQ ID NO: 2)(１回の
免疫当り50μｇ／マウス）のみで、即ち、アジュバント又はサイトカイン抜きで
、０，７，14及び21日目にて４回IR免疫した。平行して、別のグループのマウス
は、PCLUS3-P18III B (SEQ ID NO: 2) HIV−１ペプチドとCT（１μｇ／マウス）
との組合せによりIR免疫した。35日目に、抗原特異的Ｔ細胞をPP, LP及びSPから
単離した。SP, PP又はLP由来の免疫細胞を培養し、そして前述の通りにして抗原
特異的CTL について試験した（図２）。べた塗り四角はP18III B-I10（SEQ ID N
O: 16)パルス化標的の殺生を示し、そして白抜きひし形はパルスを施していない
標的の殺生を示す。ペプチドのみのIR投与は有意な応答を誘導した。応答はCTを
一緒に投与することにより増強された。 実施例３．粘膜免疫により誘導されたCTL は HIV−１ gp160エンベロープタンパ
ク質を発現する標的を溶解する マウスを HIV−１ CLUVAC PCLUS3-18III B（SEQ ID NO: 2)(１回の免疫当り50
μｇ／マウス）により４回（０，７，14及び21日）、CT（１μｇ／マウス）の存
在下でIR免疫した。35日目に、抗原特異的Ｔ細胞をPP, LP及びSPから単離した。
SP, PP又はLP由来の免疫細胞を前述の通りに培養した。CTL の細胞溶解活性を標
準⁵¹Cr遊離アッセイを利用して測定した（図３）。

【００６７】 標的細胞としては15−12細胞、3T3 18 Neo BALB/c 細胞及びＰ815 細胞の３種
類の細胞系を用いた。15−12細胞は HIV−１ gp160をコードするベクターでトラ
ンスフェクションしたBALB/c 3T3線維芽細胞である(Takahashiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 3105 (1988))；3T3 18 Neo BALB/c 細胞はNeo r 遺伝子は
含むがgp160 遺伝子は含まない発現ベクターによりトランスフェクションされた
BALB/c 3T3線維芽細胞である；そしてＰ815 細胞は培養物に加えられた抗原ペプ
チドを提示する非トランスフェクション細胞である。gp160 発現性の15−12細胞
のCTL 溶解（右パネルのべた塗り四角）をコントロールのgp160 非発現性3T3 18
Neo BALB/c 細胞（右パネルの白抜きひし形）のそれと比較した。Ｐ815 標的細
胞（左パネル）をP18III B-I10ペプチド（SEQ ID NO: 16)（１μＭ）の存在下（
べた塗り四角）又は非存在下（白抜きひし形）で試験した。％比51Cr遊離を前述
の通りに計算した。IR免疫により誘導されたCTL は HIV−gp160 を内因発現する
標的細胞又はP18III Bペプチド（SEQ ID NO: 15)でパルスされた標的細胞のいず
れかを殺生した。 実施例４．IR免疫により誘導されるCTL はIL−12依存性である BALB/cマウスをCLUVAC PCLUS3-18III B (SEQ ID NO: 2) (１回の免疫当り50μ
ｇ／マウス）とCT（１μｇ／マウス）との組合せの４回の投与（０，７，14及び
21日目）によりIR免疫した。ペプチドによる免疫の前日及び翌日にマウスを抗IL
−12抗体(0.5mg／注射：４mg／マウスの総用量）（図４、右パネル）により腹腔
内（i. p.)処置するか、又は未処置とした（図４、左パネル）。35回目に、抗原
特異的Ｔ細胞をPP, LP及びSPから単離した。SP, PP又はLP由来の免疫細胞を前述
の通りに培養した。CTL の細胞溶解活性を前述の通りに測定した（図４）。CTL
のペプチド特異性を試験するため、51Crラベル化Ｐ815 標的をアッセイの開始時
にペプチドP18III B-I10（SEQ ID NO: 16)でパルスするか、又は（コントロール
として）パルスしないままとする、即ちペプチド抜きとする（白抜きひし形）。
IR免疫による粘膜及び全身CTL 応答の双方の誘導は、抗IL−12抗体によりi. p.
処置したマウスのCTL の誘導の阻害により示される通り、IL−12依存性であった
。

【００６８】 BALB/cマウスを０，７，14及び21日目に、合成 HIV−１ CLUVAC PCLUS3-18III
B（SEQ ID NO: 2)(１回の免疫当り50μｇ／マウス）、CT（１回の免疫当り10μ
ｇ／マウス）及び組換IL−12（１回の免疫当り１μｇ／マウス）を含む組成物Ａ
により、又は合成 HIV−１ CLUVAC PCLUS3-18III B（SEQ ID NO: 2)(１回の免疫
当り50μｇ／マウス）及びCT（１回の免疫当り10μｇ／マウス）を含む組成物Ｂ
によりIR免疫し、35日目に抗原特異的Ｔ細胞をPP及びSPから単離した。PP（図９
Ａ）及びSP（図９Ｂ）由来の免疫細胞を別々に培養し、そして前述の通りに抗原
特異的CTL について試験した。図９Ａは組成物Ａ（即ち、IL−12を有する抗原）
により免疫したマウス由来のエフェクター細胞によるペプチドP18III B-I10（SE
Q ID NO: 16)パルス化標的細胞の殺生を示し（白抜き四角）、そして図９Ｂは組
成物Ｂ（即ち、IL−12抜きの抗原）により免役したマウス由来のエフェクター細
胞によるP18III B-I10（SEQ ID NO: 16)パルス化標的細胞の殺生を示す（白抜き
ひし形）。図９Ａ及び９Ｂの双方において、コントロールデータはパルスを施し
ていない標的に対して試験した２組のエフェクター集団を利用して得た。組成物
ＢによるIR免疫により誘発された応答に比しての、組成物ＡによりIR免疫された
マウスに由来するPP（図９Ａ）及びSP（図９Ｂ）エフェクター細胞の双方の増強
したCTL 応答は、IL−12を一緒に投与することが粘膜及び全身CTL 応答を強化す
ることを示唆する。これらのデーターは共に、抗原の粘膜投与を介して粘膜（及
び全身）免疫を誘発するうえでのIL−12の役割についての独立の証拠を供し、そ
して前述の抗体阻害データーの発見を裏付ける。 実施例５．直腸内ペプチド免疫は HIV−gp160 発現性組換ワクシニアウィルスに
よる粘膜負荷から保護する ５匹のマウスのグループを HIV−１ CLUVAC PCLUS3-18III B（SEQ ID NO: 2)(
１回の免疫当り50μｇ／マウス）によりCTとの組合せで０，７，14及び21日目の
４回の投与によりIR免疫した。35日目に、マウスを 2.5×10⁷pfuのgp160III B発
現性ワクシニアウィルス（vPE16)をIR負荷せしめた。６日後、マウスを殺し、そ
してその卵巣を前述の通りにウィルスの存在についてアッセイした（図５）。図
５の左側のバーは免疫していないマウスの卵巣のウィルス力価を示し、そして右
側のバーは免疫したマウスの卵巣のウィルス力価を示す。PLCUS3-18III B（SEQ
ID NO: 2) によるIR免疫は、免疫していない動物と比較しての卵巣中のウィルス
のpfu の4.5logの低下により示される通り（Ｐ＜0.005)、マウスをvPE16 による
IR負荷から保護した。 実施例６．IR及びIN免疫の６ヶ月後の全身CTL 応答の対比 マウスを HIV−１ CLUVAC PCLUS3-18III B（SEQ ID NO: 2)(50μｇ／マウス）
の４回の投与（０，７，14及び21日目）によりIR又はIN免疫した。１回目の投与
の６ヶ月後、抗原特異的Ｔ細胞をSPから単離し、そして前述の通りに HIV−１P1
8III B-I10（SEQ ID NO: 6) ペプチド特異的CTL の存在について試験した（図６
Ａ及び６Ｂ）。べた塗り四角はP18III B-I10（SEQ ID NO: 16)パルス化標的の殺
生を示し、そして白抜きひし形はパルスを施していない標的の殺生を示す。IR免
疫により誘導されたCTL 活性のレベル（図６Ａ）はIN免疫により誘導されたもの
（図６Ｂ）よりも高かった。これらのデーターは、IR免疫が強力な長期持続性の
抗原特異的脾臓免疫応答を誘導することを示唆する。

【００６９】 様々な免疫ルートを評価するため、マウスを HIV−１ CLUVAC PCLUS3-18III B
（SEQ ID NO: 2)(50μｇ／マウス）の４回の投与（０，７，14及び21日目）によ
り粘膜（IR, IN, IG）又は全身（SC）免疫した。１回目の投与の35日後、抗原特
異的Ｔ細胞をPP及びSPから単離し、そして前述の通りに HIV−１P18III B-I10（
SEQ ID NO: 16)ペプチド特異的CTL の存在について試験した。べた塗りバーはP1
8III R-I10（SEQ ID NO: 16)パルス化標的に対する殺生を示し、そして白抜きバ
ーはパルスを施していない標的に対する殺生を示す。IR免疫により誘導されたCT
L 活性のレベルは、他の粘膜ルート（IN及びIG）により誘導されたものと比べ、
誘導性粘膜組織（PP）において有意に高く、そして全身免疫組織（SP）において
ははるかに高くなっていた。CTL 活性はPP及びSPの双方において、３種類の全て
の粘膜ルートを介する免疫で検出された。全身免疫（SC）はSPにおいてのみ有意
なCTL 活性をもたらした。 実施例７．IR免疫により誘導されたCTL はIFN γ依存性である 野生型BALB/cマウス及び機能性IFN γの産生能力を欠くBALB/cマウス(IFNγ^{-/ -} マウス）（Daltonら、Science 259 : 1739 (1993) ; Tishonら、Virology 212
: 244 (1995))をCLUVAC PCLUS3-18III B (SEQ ID NO: 2) (１回の免疫当り50μ
ｇ／マウス）とCT（１μｇ／マウス）との組合せの４回の投与（０，７，14及び
21日目）によりIR免疫した。35日目に、抗原特異的Ｔ細胞をPP, LP及びSPから単
離した。野生型BALB/c及びIFN γ^-/- マウスのSP, PP又はLP由来の免疫細胞を前
述の通りに培養した。CTL の細胞溶解活性を前述の通りに測定した（図８Ａ及び
図８Ｂ）。CTL のペプチド特異性を下記の通りに試験した：⁵¹Crラベル化Ｐ815
標的をペプチドP18III B-I10（SEQ ID NO: 16)によりアッセイの開始時にパルス
化し（中実バー）、又は（コントロールとして）パルス化しない、即ち、ペプチ
ド抜きのままとした（白抜きバー）。IR免疫による粘膜及び全身CTL 応答の誘導
は共に、IFN γ^-/- マウス由来のSP, PP及びLP細胞における検出可能なCTL 活性
の欠如、（図８Ｂ）、並びに野生型BALB/cマウス由来のSP, PP及びLP細胞におけ
る強いCTL 活性（図８Ａ）により示される通り、IFN γ依存性であった。

【００７０】 以上の結果をまとめると、マウスに対する抗原性ペプチドの粘膜投与は腸内粘
膜免疫系の誘導性（パイアー斑（PP))及びエフェクター（固有層（LP))部位の双
方において検出可能である保護CTL 応答の誘導をもたらす。粘膜CTL 応答は粘膜
アジュバントであるコレラ毒素（CT）と抗原性ペプチドとの投与により増強され
、インターロイキン−12（IL−12）に特異的に結合する（それ故、その活性を中
和する）抗体により阻害され、そして機能性インターフェロンγを産生する能力
のないマウスにおいては検出されない。更に、IR免疫のために用いる抗原性ペプ
チドとCTとの組成物にIL−12を含ませることは、IL−12抜きでの抗原性ペプチド
、CTによるIR免疫により得られるものと比べ、PP及びSP CTL応答を増強せしめた
。ウィルス性ペプチドによるIR免疫は、適当なウィルスによる後のIR負荷による
ウィルス感染からの保護を供した。 実施例８ ウィルス粘膜保護を誘発するのに利用するための様々なHIV ワクチン
ペプチドの対比 HIV のV3ループの可変性を理由に、V3ループを利用し、且つIII Ｂ株由来のCT
L エピトープＰ18（Ratnerら、Nature 313 : 277-284 (1985))又は HIV−１のMN
(Gurgoら、Virology 164 : 531-536 (1998))を組込んだ２つのクラスターペプチ
ド構築体の比較を実施した。これらの研究は代表的な分析として実施し、HIV ワ
クチンクラスターペプチド構築体が様々なHIV 株から調製でき、そして粘膜CTL
免疫の誘導を最適化するために横並びアッセイにおいてスクリーニングできるこ
とを実証する。

【００７１】 動物 以下の実施例各々について、雌のBALB/cマウスをFrederick Cancer Res
earch Center (Frederick, MD)から購入した。IFN −γ^-/- マウスはJackson La
boratories (Bar Harbor, ME) から購入した。この研究において利用したマウス
は６〜12週齢のものとした。IFN −γ^-/- マウスを特製の病原体フリーのマイク
ロアイソレーター環境に維持した。

【００７２】 免疫化 マウスを合成HIV ペプチドワクチン構築体PCLUS3-18III B（Ahlersら
、J. Immunol. 150 : 5647-5665 (1993))(１回の免疫当り50^c μｇ／マウス）と
コレラ毒素（CT)(10μｇ／マウス)(List Biological Laboratories, Campbell,
CA) との０，７，14及び21日目での４回の直腸内投与により免疫した。皮下免疫
のため、不完全フロイドアジュバントを使用した。rmIL, −12(Genetics Instit
ute, Inc., Cambridge, MAからの贈呈品）をペプチドワクチンと一緒にDOTAP (B
oehringer Mannheim) 、陽イオンリポフェクチン剤と混合して腹腔内（IP)(１μ
ｇ）又は直腸内（１μｇ）のいずれかで導入した。

【００７３】 細胞の精製 １回目の投与の５週から６ヶ月後、抗原特異的Ｔ細胞をパイアー
斑（PP）、固有層（LP）及び脾臓（SP）から単離した。パイアー斑を腸壁から慎
重に切除し、そしてMegaら、Int. Immunol. 3 : 793-805 (1991)に記載の通りに
してIII 型コラゲナーゼ 300Ｕ／ml (Sigma)を利用して単独細胞にまで解離させ
た。我々のデーターは、正常マウスから単離したPPCD３⁺ Ｔ細胞のほとんどがCD
４⁺ であり、CD３⁺ CD８⁺ Ｔ細胞は率が低いことを示した。更に、コラゲナーゼ
はこの酵素で処理された脾臓Ｔ細胞上のCD３, CD４又はCD８の発現を改変しなか
った。固有層リンパ球(LPL）単離をMegaら、Int. Immunol. 3 : 793-805, (1991
) に記載の通りにして実施した。小腸を個体マウスから切除し、そして腸間膜及
び接続組織をていねいに取り出した。糞物質を腔から無添加培地(RPMI-1640) で
フラッシングした。PPを認定し、そして腸壁から除去した後、腸を縦方向に開き
、短いセグメントに切断し、そして２％の胎児牛血清(FBS）でよく洗った。上皮
細胞層を除くため、組織を 100mlの１mMのEDTAに入れ、そして37℃で撹拌しなが
ら２回インキュベーションした（１回目は40分、次いで20分）。EDTA処理の後、
組織を完全RPMI培地で室温で10分かけて洗い、次いで10％のFCS を含むRPMI 50m
l に入れ、そして撹拌しながら37℃で15分インキュベーションした。その組織及
び培地を50mlのチューブに移し、そして15秒間強く振盪し、次いで上皮細胞を含
む培地を除去した。細胞の機械的除去を毎回新鮮な培地を用いて更に２回繰り返
し、上皮細胞層を完全に除去した。組織検査は絨毛及び固有層の構造が保存され
ていることを示した。LPL を単離するため、組織を小片にまで切り、そしてVIII
型コラゲナーゼ 300Ｕ／ml(Sigma）を含むRPMI 1640 の中で37℃で50分撹拌しな
がらインキュベーションした。細胞含有上清液を集め、洗浄し、次いで不完全RP
MI 1640 の中に再懸濁した。このコラゲナーゼ解離手順を２回繰り返し、そして
単離した細胞をプールし、そして再び洗った。細胞を綿−ガラスウールカラムに
通して死細胞及び組織塊を除き、次いで75％及び40％のパーコール（Pharmacia
Fine Chemicals, Pharmacia Inc., Sweden）を含む不連続勾配を上に積層した。
遠心分離（４℃、600 ｇ，20min)後、75％と40％のパーコールの間の界面をてい
ねいに取り出し、そして不完全培地で洗った。この手順は＞90％の生存リンパ球
を供し、細胞収率は 1.5〜２×10⁶ リンパ球／マウスであった。SPを無菌除去し
、そして単独細胞懸濁物をそれを無菌スクリーンで静かに分けることにより調製
した。赤血球をトリス緩衝化塩化アンモニウムで溶解し、そして残留細胞を２％
のFBS を含むRPMI 1640 でよく洗った。

【００７４】 細胞障害性Ｔリンパ球アッセイ SP, PP, LP由来の免疫細胞を５×10⁶ ／mlに
て24穴培養プレートにおいて不完全Ｔ細胞培地(CTM)[10％のFBS 、２mMのＬ−グ
ルタミン、ペニシリン(100Ｕ／ml）、ストレプトマイシン(100μｇ／ml）及び５
×10^-5Ｍの２−メルカプトエタノールを含むRPMI 1640]の中で培養した。３日後
、我々はIL−２の起源として10％のコンカナバリンＡ上清液含有培地を加えた。
１μＭのP18III B-I10ペプチドと４×10⁶ の3300rad 照射同系脾臓細胞とによる
７日間の刺激の後、LPL を試験した。SP及びPP細胞を同様にして１又は２回の７
日間培養期間にわたりin vitro刺激し、次いでアッセイを行った。CTL 系の細胞
溶解活性を⁵¹Crラベル化標的による４時間アッセイにより測定した。２種類の細
胞系を標的細胞として用いた：１）15−12細胞、Takahashi ら、Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 85 : 3105-3109 (1988)[HIV−１ IIIB gp160 でトランスフェクシ
ョンされ、そしてHIV gp160 を内因発現するBALB/c 3T3線維芽細胞] ：これはコ
ントロールとしてのNeo ^R のみでトランスフェクションされた18 Neo BALB/c 3T
3 線維芽細胞と対比させる；及び２）Ｉ10ペプチド（１μＭ）の存在下又は非存
在下で試験したＰ815 標的。CTL のペプチド特異性を試験するため、⁵¹Crラベル
化Ｐ815 標的をアッセイの開始時にペプチドで２時間パルスした。％比⁵¹Cr遊離
を100 ×（実験遊離値−自発遊離値）／（最大遊離値−自発遊離値）として計算
した。最大遊離値は５％のTriton-X 100の添加により溶解せしめた細胞の上清液
から決定した。自発遊離値はエフェクター細胞を添加せずにインキュベーション
した標的細胞から決定した。

【００７５】 ワクシニアウィルス 組換ワクシニアウィルスvPE16 は単離体III Ｂ（BH８）
由来の HIV−１ gp160遺伝子を発現する (Earlら、J. Virol. 64 : 2448-2451 (
1990))。発現は複合早期／後期Ｐ7.5 プロモーターにより指令される。早期ワク
シニアウィルス遺伝子のための転写終止シグナルとして働く配列Ｔ５NTの２つの
コピーがIII gp160 遺伝子内に存在する。これらは共にオリジナルのコード配列
を保持し、遺伝子の早期転写が可能となるようにvPE16 において改変されている
。ウィルス vSC８をgp160 のない陰性コントロールとして使用した(Chakrabarti
ら、Mol. Cell Biol. 5 : 3403-3409 (1985)) 。vPE16 及び vSC８は共にベータ
ーガラクトシダーゼを発現する。

【００７６】 卵巣内のウィルス力価の測定 クラスターペプチドHIV ワクチン免疫してから
35日目又は６ヶ月目に、マウスに 2.5×10⁷ 又は５×10⁷ pfu のgp160 III B 発
現性ワクシニアウィルス(vPE16）を直腸内負荷した。 HIV−gp160 を発現する組
換ワクシニアウィルスによる負荷の６日後、マウスを殺し、そして卵巣を取り出
し、ホモジナイズし、音波処理し、そして BSC−２インジケーター細胞のプレー
ト上に一連の10倍希釈品をプレートし、クリスタルバイオレットで染色し、そし
て各希釈率においてプラーク数をカウントすることによりvPE16 力価についてア
ッセイした。ウィルスの最小検出可能なレベルは100pfuであった。

【００７７】 種々のHIV ワクチンクラスターペプチド構築体を対比するため、BALB/cマウス
を粘膜アジュバントとしてのCTの存在下で４週間にわたり毎週（０，７，14及び
21日目）ペプチド(PCLUS3-18III B 又はPCLUS3-18MN ）で直腸内免疫した。マウ
スを２週間後（35日目）又は６ヶ月後にパイアー斑（PP）又は脾臓（SP）におけ
る記憶CTL 応答について試験した。CTとの組合せにおける双方のペプチドPCLUS3
-18III B又はPCLUS3-18MN によるIR免疫は腸内PP（図10、パネルＡ）及び脾臓内
（図10、パネルＢ）においてＰ18特異的CTL 応答を誘導する。

【００７８】 しかしながら、PCLUS3-18MN によるIR免疫を経たCTL 応答のレベルはPCLUS3-1
8III BによるIR免疫後よりも有意に低かった。その相違はＨ−２Ｄ^d に対する、
P18MN-T10 と比較しての最小限10量体P18III B-I10の高い親和力を反映しうる(T
akahashiら、Science 246 : 118-121 (1989) ; Takeshitaら、J. Immunol. 154
: 1973-1986 (1995)）。また、P18-MN特異的CTL と比べ、粘膜P18III B特異的CD
８⁺ CTL によるIFN −γのはるかに高い生産性が、特異的ペプチドによるin vit
roで48時間にわたる刺激の後に観察された。gp160 III B を発現する15−12 gp1
60 III Bトランスフェクション化線維芽細胞標的に対して試験したとき、PCLUS3
-18III Bによる免疫により誘発されたCTL もこれらの標的を殺生した。このよう
な観察に基づき、PCLUS3-18III B構築体を下記の保護実験に用いた。

【００７９】 実施例９．クラスターペプチド構築体によるマウスの粘膜免疫は HIVg160を発
現する組換ワクシニアウィルスによる感染に対する長期持続性の保護を供する 上記の実施において、粘膜ルートを介してのウィルス負荷に対して保護するHI
V クラスターペプチドワクチンにより誘導される粘膜免疫応答の能力が実証され
ている。組換タンパク質 HIV−１ III B gp160に対するこの保護の特異性を決定
するため、IR免疫マウスに、免疫を開始して35日後に、 HIV−１ III B gp160を
発現するワクシニアウィルス(vPE16）又はβ−ガラクトシダーゼを発現するコン
トロールワクシニアウィルス(vSC８）のIR点滴により負荷を与えた。vPE16 又は
vSC８を負荷した非免疫動物はコントロールを担う。負荷の６日後、マウスを殺
し、そして卵巣を取り出し、そしてワクシニア力価についてアッセイした（ワク
シニアの感染の６日後、卵巣は最高のウィルス力価を含んだ）。

【００８０】 合成HIV ペプチドワクチンによるIR免疫は、非免疫コントロールと比較して、
HIV−１ III B gp160を発現するワクシニアウィルスによるIR負荷に対してマウ
スを保護したが、無関係なタンパク質β−ガラクトシダーゼのみを発現するワク
シニアウィルスによるIR負荷に対しては保護しない（図11）。かくして、この保
護は HIV−１ gp160を発現するウィルスに特異的であり、そしてペプチドの直腸
内点滴により誘導された任意の非特異的な炎症応答は、最後の免疫投与の２週間
後のウィルス負荷に対して保護するには不十分であった。

【００８１】 粘膜記憶CTL 前駆体の存在が観察されたにもかかわらず、IR免疫の６ヶ月後の
活性のためのin vitro再刺激の必要性（Belyakovら、Proc. Natl. Acad. Sci. 9
5 : 1709-1714 (1998)）、保護の強さ及び期間は不明のままである。この問題を
解決するため、IR免疫マウスをPCLUS3-18III Bにより免疫を開始してから６ヶ月
後に、 HIV−１ III Bを発現するワクシニアウィルス(vPE16）のIR投与により負
荷を与えた。この研究は、HIV クラスターペプチド免疫の６ヶ月でさえも、BALB
/cマウスは組換HIV ワクシニア負荷に対する保護を示すことを示した（図12）。

【００８２】 実施例10．粘膜ウィルス負荷に対するマウスの保護は粘膜部位においてCD８⁺ CTL により媒介される HIV gp160を発現するウィルスによる粘膜負荷に対する保護を司る免疫機構を
決定するため、マウスを４回の免疫の各々の前日及び翌日、更にはvPE16 の負荷
の２日前及び３日後に 0.5mgのモノクローナル抗−CD８抗体（クローン2.43，NI
H, Frederick, MD）でIP処置した。この処置はvPE16 による粘膜負荷に対する保
護の有意な阻害を招いた（図13）。かくして、 HIV−１ gp160を発現するウィル
スに対する粘膜部位における保護はCD８⁺ リンパ球により媒介される。

【００８３】 本明細書において開示するHIV ペプチド構築体は強力な粘膜及び全身MHC クラ
ス±制限CD８⁺ CTL 応答を誘発するため (Belyakovら、Proc. Natl. Acad. Sci. 95 : 1709-1714 (1998)）、保護の媒介におけるこれらの応答の役割を更に調べ
た。ペプチドワクチンによるSC免疫は脾臓CTL は誘発するが粘膜CTL は誘発せず
、一方IR免疫は双方を誘発するため（図14）、全身CTL が粘膜負荷に対して十分
に保護するか、又は局部粘膜CTL が必要なのかを決定するため、SC及びIR免疫を
比較することができる。従って、マウスを０，７，14及び21日目にSCルートによ
りPCLUS3-18III BとIFA とで免疫するか、又はIRルートによりPCLUS3-18III Bと
CTとで免疫し、そしてこれらを比較した。免疫を開始してから35日後に、これら
のマウスのグループ及び非免疫コントロールマウスに HIV−１ gp160を発現する
ワクシニアウィルス(vPE16）のIR投与により負荷を与えた。最後に、負荷の６日
後、マウスを殺し、そしてその卵巣をウィルス力価についてアッセイした。

【００８４】 PCLUS3-18III BによるSC免疫化はvPE16 による粘膜負荷に対してマウスを保護
せず、一方同ペプチドによるIR免疫は保護した（図14Ｂ）、かくして、 HIV−１
gp160を発現するウィルスによる粘膜負荷はマウスの粘膜免疫だけでしか誘導で
きず、そして脾臓CTL 活性ではなく、局部粘膜CTL 活性と相関した。このことに
基づき、 HIV−１ gp160を発現する組換ワクシニアによる粘膜負荷からのCD８⁺ CTL 媒介保護は局部粘膜CD８⁺ CTL を要し、一方全身CTL 応答は十分でないもの
と考えられうる。

【００８５】 実施例11. ワクチンでのIL−12の局所的投与による保護のサイトカイン依存性
及び増強 ペプチドワクチンによる粘膜CTL の誘導は、それが抗IL−12でのマウスの生体
内処理によりブロックされ得る点で内因性IL−12に依存する（Belyakovら、Proc
. Nati. Acad. Sci. 95 : 1709〜1714 (1998))。CTL 応答及び保護においてIL−
12の役割を更に規定するために、BALB/c（Ｈ−２Ｄ^d ) マウスをPCLUS3-18III B
（50μｇ／マウス）でのIR免疫化の各々の日に１μｇのrmIL−12でIPルートによ
り処理した。この処理は粘膜又は全身の部位においてHIV 特異的CTL 活性の大き
な変化を導かなかった（図15）。しかしながら、マウスをペプチドと一緒に直腸
内でrmIL−12（１μｇ）＋DOTAP で処理した場合に、我々は、免疫化の開始後35
日目に、粘膜及び全身部位の両方におけるCTL レベルの大きな増加を見い出した
（図15）。

【００８６】 上述の結果から、局所部位に投与されたrmIL−12及び粘膜免疫化の時間が HIV
−１ gp160を発現するワクシニアウイルスの粘膜攻撃に対する保護を増加させる
可能性を研究した。この問題に取り組むため、BALB/cマウスをペプチドと共に直
腸内でrmIL−12＋DOTAP で免疫化した。次にマウスをHIV １ III B gp160を発現
するワクシニアウイルスのIR投与による免疫化の開始後35日目に攻撃した。本研
究において攻撃ウイルスの投与量の２倍を用い、それにより非免疫化マウスは低
攻撃投与量を用いる先の例での数倍10⁸ でなく数倍10¹⁰のタイターを有した。し
かしながら、免疫化されたマウスは先の実験で見られるように、ウイルスタイタ
ーにおいて４logs超の減少を示した（図16、バー２）。

【００８７】 重要なのは、合成HIV ペプチドワクチン＋rmIL−12でのIR免疫化が、ペプチド
のみでのIR免疫化の後より更に有効に、このgp−160 −組換えワクシニアウィル
スでのIR攻撃に対してマウスを保護した（ウィルスpfu 中６−10ｇ減少対４−10
ｇ減少、ｐ＜0.05）（図16、バー３対バー２）。 粘膜CD８⁺ CTL の誘導はIL−12及びIFN −γに強く依存するので（Belyakovら
、Proc. Nati. Acad. Sci. 95 : 1709〜1714 (1998))ので、サイトカインが粘膜
CTL の形成に直接作用するか否か、及び第２のメカニズムを介して作用するのか
を決定するために行った。この問題に取り組むために、IFN γ^-/- マウス（BALB
/cバックグラウンド）及び慣用的なBALB/cマウスをペプチドと一緒にrmIL−12（
１μｇ／マウス）で処理した。IR免疫化IFN γ^-/- マウスのrmIL−12での粘膜の
処理は粘膜又は全身CTL の誘導を導かなかった。これにより、IL−12はIFN γの
欠如下で粘膜CD８⁺ CTL の誘導に直接作用することができないことが明らかであ
る。

【００８８】 要約すると、先の例は、 HIV−１ gp160を発現する組換えワクシニアウイルス
を HIV−１のための代用物として用いる新規のウイルス攻撃システムを組み込む
。なぜなら我々はマウスに HIV−１を感染させないからである。重要なのは、こ
のシステムにおいて、gp160 に対する中和性抗体はgp160 を発現する組換えワク
シニアに対して保護することができないことである。なぜならウイルスはgp160
をウイルス粒子内に組み込まないが、感染した細胞内でのみそれを発現するから
である。これにより、保護的免疫応答は感染した細胞において指示されなければ
ならない。

【００８９】 この結果は、保護的応答が、CD８⁺ 細胞の生体内涸濁後の保護の排除により、
CD８⁺ 細胞に完全に依存することを示す。これにより、それらの結果は、CD８⁺ CTL(溶解活性を介して又はサイトカインもしくは他の可溶性因子の分泌を介して
にかかわらず）が保護することを疑う余地なく示す。ワクシニア感染に対する保
護が、抗原刺激に対する応答においてCD８⁺ CTL により分泌されるインターフェ
ロン−γにより媒介され得ることが示されている (Harrisら、J. Virol. 69 : 9
10〜915 (1995)) ので、そのメカニズムは感染した細胞の溶解でなくCTL による
このサイトカインの局所的分泌に関連することが可能である。いずれかのメカニ
ズムにより、CTL は保護を媒介する原因となる。

【００９０】 しかしながら、粘膜の免疫化は局所的粘膜部位及び脾臓の両方においてCTL を
誘導するので、この結果はCTL が保護を引きおこすか否かを区別しない。この重
要な問題に着目し、本実施例はペプチドワクチンでの皮下免疫化が少くとも粘膜
免疫化により誘導されるのと同程度のレベルで脾臓内で全身性CTL を誘導するが
粘膜CTL を誘導しないという事実を利用する。両方の免疫化ルートから生ずる脾
臓CTL は HIV−１ gp160を内因的に発現する標的細胞を殺す。これにより、この
エピトープに対する全身性CTL が粘膜攻撃に対して保護するなら、皮下に免疫化
されたマウスは保護されると予想されるであろう。

【００９１】 しかしながら、皮下に免疫化したマウスは粘膜攻撃に対する保護の証拠は示さ
なかった。これにより、その保護は、局所的粘膜部位、バイエル板及び粘膜固有
層におけるCTL 活性と相関し、脾臓内のCTL 活性と相関しなかった。その保護は
CTL によって媒介されるだけでなく、攻撃の局所的粘膜部位におけるCTL も要求
した。全身性CTL は十分でなかった。

【００９２】 局所的粘膜CTL により媒介される保護は保護的免疫応答を媒介するために独立
して十分であるようである。この結論は、ウイルスpfu の２−10ｇ減少が、多く
の複製が卵巣内でおこり得る前に、粘膜ウイルス攻撃の後２日目でさえ卵巣内で
おこる（非免疫化マウスでの2.37×10⁶ pfu からIR免疫化マウスでの3.34×10⁴p
fu) という観察結果により支持される。この発見は、卵巣内のタイターの減少が
感染の最初の粘膜部位を回避することができるウイルスの量の減少を反映する。
更に、CTL 活性の増強及びrmIL−12による保護はサイトカインの局所的粘膜投与
に依存し、全身投与に依存しなかった。

【００９３】 粘膜及び全身免疫化により誘導されるCTL の間の可能性ある差は、SC免疫化か
ら生ずるCTL が、それらが粘膜固有層又はバイエル板内で検出されるという事実
により証明されるように、GI粘膜のためのホーミングレセプターを有さないこと
である。 本開示は、攻撃の部位において局所的粘膜CTL を要求するGI粘膜攻撃に対する
保護の最初の証明である。これらの結果は、ウイルスへの粘膜の露出に対する保
護的ワクチンの開発のための重要な関係を有する。

【００９４】 これらの結果に加えて、本明細書に供される例は、粘膜中の記憶CTL ばかりで
なく粘膜ウイルス攻撃に対する保護的免疫性でも驚くべき持続性を示す。CTL 記
憶を制御する因子、及び記憶CTL を維持することにおける持続的抗原の役割は、
時折関心を集める別の問題を提示する(Ahmed and Gray, Science 272 : 54-60 (
1996) ; Kundigら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93 : 9716〜9723 (1996); E
hlら、Eur. J. Immunol. 27 : 3404-3413 (1997)) が、粘膜の免疫応答及び保護
の文脈においてほとんど研究されていない。全身免疫性の研究において、リンパ
球脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）の感染後に、少くとも325 日間、骨髄内にCTL 記
憶応答が存在したことが示されており (Slitkaら、Blood 90 : 2103 〜2108, (1
997)) 、このことは、この部位における抗ウイルスＴ細胞の長期永続性を示す抗
原特異的CD８⁺ Ｔ細胞数はウイルス除去の後に激減したが、実質的な数はマウス
の生涯を通じて持続した（Muraii-Krishnaら、Immunity 8 : 177〜187, (1998))
。LCMVでの再攻撃により、記憶CD８⁺ Ｔ細胞は迅速に増えた。

【００９５】 これらの結果は、ウイルスの全身感染が長期の記憶及び保護を導き得ることを
示す。粘膜CTL 記憶の場合、免疫化を粘膜ルートを介して行うなら、記憶CTL は
より長く粘膜部位に保持されることが示された(Gallychan及びRosenthal, J. Ex p. Med. 184 : 1879〜1890 (1996))が、このような粘膜CTL による保護の持続時
間は研究されなかった。粘膜の記憶CTL が保護する能力は、部分的に、ウイルス
露出の後にそれらが広がり活性化される迅速性に依存するであろう。それは、粘
膜部位におけるウイルス複製のレベルに関係し得る。これらの理由のため、局所
的粘膜CD８⁺ CTL に依存する粘膜保護の持続時間を決定することが重要である。
ここでの結果は、最初の３週の過程を超える更なる再免疫化なしでペプチドワク
チン構成物で粘膜免疫化した後６ヶ月でさえ、CTL の持続性を示す。この応答は
、gp160 を発現するワクシニアウイルスでの粘膜攻撃に対する保護により行われ
る。

【００９６】 この後者の結果は特に顕著である。なぜなら典型的な免疫原は、長期間、抗原
の存在を維持するであろうアジュバントのいずれの貯蔵形態もなく投与されるペ
プチドであるからである。消化管の腔にデリバリーされた遊離ペプチドは、又は
粘膜細胞による輸送の後でさえ、極めて短い半減期を有するであろうことが予想
されよう。それゆえ、いずれの記憶CTL も持続性抗原の欠如下で保護を媒介する
のに十分なレベルで粘膜内に持続することができ、又は抗原は、特定の細胞結合
形態で、おそらく樹状細胞のＮ４HC分子上に局所的に持続しなければならない。
なお他の可能性は、ペプチドが粘膜フロラ内の抗原の１つと交差すること及びこ
れら交差反応性抗原は記憶CTL を維持することである。CTL によるウイルス感染
に対する保護は、ちょうど誘導されるCTL の数を超える。CTL の質は量と同じく
らい生体内保護のために重要である。先の報告は、激しい組み合わせた免疫欠損
（SCID）マウスに養子移入した高結合活性P18III B特異的CTL が、全てのCTL 系
が試験管内でウイルス感染した標的を溶解するという事実（Alexander-Millerら
、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93 : 4102〜4107 (1996))にかかわらず、同じ
ペプチド−MHC 複合体に特異的な低結合活性CTL よりウイルス排除において 100
〜1000倍有効であったことを示した。これにより、合成ペプチドワクチンでの粘
膜免疫化により誘導されるCTL は保護するのに十分な質で存在しなければならな
いばかりでなく、保護するのに十分に高い結合活性のものでなければならない。

【００９７】 本開示の他の態様は、CTL 応答及び保護的免疫性の誘導の最適化を可能にする
。特定のサイトカイン、例えばIL−12の全身的な抗原免疫化の部位でのデリバリ
ーは全身的CTL 応答を増強することが示されている (Ahlersら、J. Immunol. 15 9 : 3947〜3958 (1997); Iwasakiら、J. Immunol. 159 : 4591〜4601 (1997); X
iang及びErtl. Immunity 2 : 129〜135 (1995); Irvineら、J. Immunol. 156 :
238 〜245 (1996)）。しかしながら、粘膜応答についての比較可能な研究は行わ
れていない。

【００９８】 本明細書に開示されるモデルシステムにおいて、粘膜CTL の誘導はマウスによ
るIL−12の内因性生産に依存する。なぜなら、それは、各々の免疫化の前及び後
に生体内に供される抗IL−12抗体により阻害され得たからである。本実施例にお
いて、直腸内に抗原と共に同時投与されたIL−12はCTL 誘導を大きく増強し、ま
た、ワクシニアウイルス攻撃に対する保護も増加させた。しかしながら、全身的
にデリバリーされた（i. p.)IL−12は全身部位（例えば脾臓）又は粘膜において
CTL 誘導を増強しなかったことが顕著であった。この差は、全身的にデリバリー
されるIL−12の短い半減期のためであり得、それは、CTL 誘導の部位に達するの
に十分に長く生存することを防ぐ。それゆえ、粘膜CTL 誘導及び全身的CTL 誘導
のために、抗原投与及びCTL 誘導の部位に直接、サイトカインをデリバリーする
ことが重要である。

【００９９】 組換えIL−12での粘膜中のCTL 誘導の増強は粘膜ワクチン開発のための有用な
ストラテジーである。この文脈において粘膜部位に局所的に与えられた少い投与
量は、このサイトカインの全身投与に関連している全体的な毒性を有さないよう
である。 ここでの結果は、rmIL−２による生体内でのCTL 応答の増強が、IFN γ^-/- マ
ウスにおいて増加が見られないので、インターフェロン−γに依存することを示
す。少くとも２つのメカニズムがこの結果を説明することができる。第１に、IL
−12はIFN −γの生産を誘導し(Trinchieri, G., Blood 94 : 4008〜4027 (1994
))、次にCTL 応答に直接作用する十分に規定された能力を介して作用し得る。あ
るいは、IFN −γはIL−12レセプターの発現のために重要である(Szaboら、J. E xp. Med. 185 : 817〜824 (1997)) ので、IL−12はCTL に直接作用し得るが、IL
−12Ｒ発現の欠如のためIFN γ^-/- マウスに作用することができない。

【０１００】 CTL 活性は HIV−１に対するヒトにおける保護的免疫性において役割を果たし
得る(Rowland-Jonesら、Adv. Immunol. 65 : 277-346 (1997) ; Yang, 0. 0. 及
びB. D. Walker, Adv. Immunol. 66 : 273-311 (1997) ; Berzofsky 及びBerkow
er, AIDS 9 (A) : S 143-S 157 (1995）に報告）。 HIV−１に対する細胞媒介性
免疫性は未感染の高い危険性の成人(Pintoら、J. Clin. Invest. 96 : 867-876,
(1995); Rowland-Jonesら、Nature Medicine 1 : 59-64, (1995))及び感染した
母から生まれた未感染の子供(Clericiら、AIDS 7 :1427-1433 (1993) ; Luzuria
ga及びSullivan, J. Cell. Blochem. Supplement 17E : 98. (Abstract)(1993))
において証明されている。CTL 活性は、特定の感染した個体において低いウイル
ス負荷及び長期の非進行状態と相関している(Caoら、N. Engl. J. Med 332 : 20
1 〜208 (1995)) 。CTL は急性HIV 又はSIV 感染からの回復とも関連している(C
aoら、N. Engl. J. Med. 332 : 201-208 (1995))。CTL have also been associa
ted with recovery from acute HIV or SIV infection(Yasutomiら、J. Virol. 67 : 1707-1711 (1993); ReimannらJ. Virol. 68 : 2362-2370 (1994) ; Koupら
、J. Virol. 68 : 4650-4655 (1994) ; Borrowら、Nature Medicine 3 : 205-21
1, (1997))。CTL によるエスケープ変異の誘導は、CTL が野生型ウイルスのバル
クを排除していることを意味する（Borrowら、Nature Medicine 3 : 205-211 (1
997); Phillipsら、Nature 354 : 453-459 (1991); Nowakら、Nature 375 : 606
-611 (1995); Goulderら、Nature Medicine 3 : 212-217 (1997); Couillinら、 J. Exp. Med. 180 : 1129-1134 (1994) ; Koenigら、Nature Medicine 1 : 330-
336 (1995)) 。更に、SIV 研究において保護は特定のサルクラスIMHC分子と関係
していた (Heeneyら、J. Exp. Med. 180 : 769〜774, (1994))。CD８⁺ 細胞は、
活性化CD８⁺ 細胞により合成され放出される可溶性因子に関連する非溶解性メカ
ニズムによる自家組織細胞のCD４細胞内でのヒト及びサルレンチウイルスの複製
を抑制することが証明されている（Walkerら、Science 234 : 1563-1566 (1986)
; Tsubotaら、J. Exp. Med. 169 : 1421-1434 (1989) ; Walker及びLevy, Immu nology 66 : 628-630 (1989) ; Mackewiczら、J. Clin. Invest. 87 : 1462-146
6, (1991) ; van Kuykら、J. Immunol. 153 : 4826-4833 (1994)) 。このような
可溶性因子は、サイトカインRANTES, MIP −１α、及びMIP −１βを含む（Cocc
hiら、Science 270 : 1811〜1815 (1995))。

【０１０１】 本開示は、局所的粘膜中に存在しなければならないCTL により媒介される粘膜
ウイルス攻撃に対する保護の最初の証明を供する。また、粘膜部位において組換
えIL−12と一緒に供されるペプチドワクチンによるこのような局所的粘膜CTL の
誘導を増強するための方法及び組成物も供する。粘膜露出の局所部位においてCT
L 免疫化を刺激するためのこれらの方法及び組成物は、ヒトにおいてHIV 感染又
は病気を防ぐためのワクチン開発のための重要なツールを供する。胃腸官は他の
病原の中でも早期SIV 及びHIV 複製の主要な部位であるようであるので、及びこ
の及び他の粘膜部位はこれらの病原のための入口の頻繁な部位であるので、粘膜
部位において保護を達成することは特に重大である。本開示はこれらの目的を満
足させ、他の上述の利点を供する。

【０１０２】 本発明は好ましい実施形態を引用して記載されているが、本発明の精神から離
れることなく種々の改良を行うことができることが理解されるはずである。従っ
て、本発明は、添付の請求の範囲によってのみ限定される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、CTL アッセイの結果を示す一連の線グラフである。IR HIV −１ペプ
チド免疫化は、長期間続く粘膜及び全身性CTL 活性を誘発した。

【図２】 図２は、CTL アッセイの結果を示す−一連の線グラフである。CTは、抗原性ペ
プチドのIR投与によるCTL の誘発を増強した（但し、絶対的ではなかった）。

【図３】 図３は、CTL アッセイの結果を示す一連の線のグラフである。HIV −１ gp16
0 ペプチドによるIR免疫化により誘発されたCTL は、HIV −１ gp160 遺伝子に
よりトランスフェクトされ、そしてその遺伝子を発現する標的細胞を特異的に溶
解した。

【図４】 図４は、CTL のIR誘発がIL−12依存性であることを示したCTL アッセイの結果
を示す一連の線グラフである。

【図５】 図５は、IR免疫化が組換えワクシニアウィルスを発現するHIV −１ gp160によ
るIR攻撃に対して保護することを示す棒グラフである。

【図６】 図６A は、抗原性ペプチドによるIR免疫化の６ヶ月後、動物から得られたSP細
胞を用いてのCTL アッセイの結果を示す線グラフである。 図６B は、抗原性ペプチドによる鼻腔内（IR）免疫化の６ヶ月後、動物から得
られたSP細胞を用いてのCTL アッセイの結果を示す線グラフである。

【図７】 図７A は、エフェクター細胞としてPPを用いてのCTL アッセイの結果を示す棒
グラフである。 図７B は、エフェクター細胞としてSPを用いてのCTL アッセイの結果を示す棒
グラフである。PP及びSP細胞は、抗原性ペプチドによる粘膜（IR, IN, IG）又は
全身性（皮下（SC））免疫化の35日後、動物から得られた。

【図８】 図８A は、野生型BALB/cマウスからのエフェクター細胞を用いてのCTL アッセ
イの結果を示す棒グラフである。 図８B は、機能的IFN γを生成する能力を欠いているBALB/cマウスからのエフ
ェクター細胞を用いてのCTL アッセイの結果を示す棒グラフである。それらの実
験はIFN γに対するCTL のIR誘発の依存性を示す。

【図９】 図９A は、エフェクター細胞としてPPを用いてのCTL アッセイの結果を示す線
グラフである。 図９B は、エフェクター細胞としてSP細胞を用いてのCTL アッセイの結果を示
す線グラフである。PP及びSP細胞は、抗原性ペプチド、CT及びIL−12（組成物A
）、又は抗原性ペプチド及びCT（IL−12を有さない；組成物B ）のいずれかによ
るIR免疫化の35日後、BALB/c マウすから得られた。

【図１０】 図１０A 及び１０B は、PCLUS3-18IIIB 又はPCLUS3-18MN によるIR免疫化がバ
イエル板（パネルA ）及び脾臓（パネルB ）の長期間続く免疫性を誘発すること
を示す。しかしながら、CTL の誘発のレベルは異なっている。P18IIIB-I10 （ぬ
りつぶされた四角）又はP18MN −T10 ペプチド−パルスされた標的物（ぬりつぶ
された丸）の殺害が、パルスされていない標的物（空白の四角又は丸）の殺害と
比較される。パネルA 及びパネルB の両者においては、三重反復試験のSEM はす
べて平均によりも5 ％低かった。

【図１１】 図１１は、HIV −１ペプチドワクチンによる粘膜免疫化により誘発された保護
が特異的であることを示す。35日目、マウスは、gp160IIB (vPE16) を発現する
、2.5 ×10⁷ プラーク−形成単位（pfu ）のワクシニアウィルスにより、又はβ
−ガラクトシダーゼ（vSC8）を発現する、2.5 ×10⁷ pfu のワクシニアウィルス
により結腸内攻撃された。バー＝グループ当たり5 匹のマウスのSEM 。差異はス
チューデントテストによれば、P ＜0.01で有意である。

【図１２】 図１２は、HIV −１ペプチドワクシンによる粘膜免疫化により誘発された保護
が長期間に続くことを示す。免疫化の開始の35日又は6 ヶ月後、マウスは、gp16
0IIIB を発現する、2.5 ×10⁷ pfu のワクシニアウィルスにより直腸内攻撃され
た。バー＝グループ当たり5 匹のマウスのSEM 。差異は、スチューデントテスト
によれば、P ＜0.01で有意である。

【図１３】 図１３は、HIV −ペプチドによる粘膜免疫化により誘発された保護がCD8 陽性
T −細胞に対して依存性であることを示す。BALB/cマウスは、個々の免疫化の
1 日前及び1 日あと、およびvPE16 による攻撃の２日前及び３日後、0.5mg のモ
ノクローナル抗−CD8 抗体（クローン2.43, NIH Frederick, MD ）によりIP処理
された。マウスは、gp160IIIB を発現する2 ×10⁷ pfu のvPR16 ワクシニアウィ
ルスにより直腸内攻撃された。

【図１４】 図１４A 及び１４B は、HIV −１ペプチドによる粘膜免疫化が、粘膜CTL 応答
を誘発し、そして直腸内組換えHIV −１ワクシニア攻撃に対する保護免疫を刺激
することを示す。図１４A は、合成ペプチドHIV ワクシンによる異なった経路の
免疫化による粘膜及び全身性CHL 応答の誘発を示す。ペプチドパルスされた標的
物（ぬりつぶされた棒）の殺害が、50：1 のエフェクター：標的物の比で、パル
スされていない標的物（ぬりつぶされていない棒）の殺害と比較された。パネル
A は、gp160IIIB を発言する、2.5 ×10⁷ プラーク形成単位（pfu ）のワクシニ
アウィルスにより直腸内攻撃されたBALB/cマウスの35日（IRでのSC−バー１、免
疫原なし；バー2 、SC；バー３、IR）での免疫化の結果を示す。

【図１５】 図１５A 及びB は、rm IL-12 による粘膜（全身性ではない）処理によるHIV-
1 ペプチドに対する粘膜（図A ）及び全身性（図B ）CTL 応答の増強を示す。BA
LB/c は、PCLUS3−16IIIBによるIR免疫化（50μg/マウス）のそれぞれの日、１
μg のrmIL-12 によるIP経路（右パネル）又はIR経路（左パネル）により処理さ
れた。35日目、HIV −特異的バイエル板CTL （図15A ）及び脾臓CTL （図15B ）
が研究された。

【図１６】 図16は、HIV ペプチドワクチンと共に、DOTAP におけるrmIL-12 による粘膜処
理がgp160IIIB (vPE16) を発現するワクシニアウィルスによる粘膜攻撃に対する
保護を増強することを示す。グループ当たり5 匹のマウスが、免疫原なしで（バ
ー１）、50μg のPCLUS3−18IIIBのみにより（バー2 ）、又はDOTAP 中、ペプチ
ド＋１μg のrmIL-12 により（バー3 ）、0, 7, 14及び21日目、IR免疫化され、
そしてgp160IIIB を発現する、5 ×10⁷ pfu のワクシニアウィルスにより35日目
に直腸内攻撃された。卵巣におけるウィルスpfu は、6 日後に測定された。

【図１７】 図１７A 及び１７B は、IL−12がIFN γの不在下で粘膜CD8 ＋CTL の誘発にお
いて直接的に作用できないことを示す。IFN γ-/- マウス（BALB/cバックグラウ
ンド）が、ペプチドと共にrmIL-12(1 μg/マウス) ＋DOTAP によりIR免疫化され
た。35日目、HIV −特異的バイエル板CTL （図１７A ）及び脾臓CTL(図１７B)が
研究された。免疫化されたIFN γ-/- マウス( ぬりつぶされた四角) 又は従来の
BALB/cマウス（ぬりつぶされた丸）からのエフェクター細胞による、P18 IIIB-I
10パルスされた標的物の殺害が、パルスされていない標的物( 空白の四角又は丸
) の殺害と比較された。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年３月２８日（２０００．３．２８）

【手続補正３】

【補正対象書類名】要約書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【要約】 本発明は、粘膜の表面を介して侵入する病原体の感染を防止し又は治療するた
めに役立つ抗原特異的粘膜細胞障害性Ｔリンパ球応答の誘導のための方法を供す
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/145 Ａ６１Ｋ 39/21 39/21 39/39 39/39 Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/00 Ｃ０７Ｋ 14/16 ＺＮＡ // Ｃ０７Ｋ 14/16 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ダービー，マイケル エー. アメリカ合衆国，メリーランド 20876, ジャーマンタウン，ヒアフォードシャー ウェイ 11413 (72)発明者 ケルサール，ブライアン エル. アメリカ合衆国，ワシントン，ディーシー 20016，ノース ウエスト，エスクリッ ジ テラス 5030 (72)発明者 ストローバー，ウォーレン アメリカ合衆国，メリーランド 20817, ベゼスダ，ウィッティアー ブールバード 8301 Ｆターム(参考） 4C076 AA01 AA09 AA11 AA27 CC06 CC07 DD01N DD09 DD41N DD46N EE23 EE32 EE39N FF34 FF43 4C084 AA02 BA44 DA02 DA12 DA14 DA24 DA25 MA13 MA16 MA28 MA31 MA56 NA14 ZB072 4C085 AA02 AA38 BA02 BA07 BA51 BA55 BA56 BA69 BB01 BB11 BB17 CC07 CC08 CC32 DD86 EE01 EE06 FF19 GG10 4H045 AA30 BA18 BA19 CA01 CA05 CA11 CA20 DA02 DA04 DA12 DA14 DA18 DA83 DA86 EA34

Claims (69)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物被検体において保護的な粘膜の細胞障害性Ｔリンパ
   球(CTL）応答を誘導するための方法であって、前記被検体の粘膜の組織に、精製
   された可溶性抗原を含む組成物を接触させることを含む方法。
2. 【請求項２】 前記可溶性抗原が抗原性ペプチドであることを特徴とする請
   求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記組成物がアジュバントを更に含むことを特徴とする請求
   項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記アジュバントがコレラ毒素（CT）、変異体コレラ毒素(M
   CT）、又は変異体−大腸菌熱不安定性エンテロトキンソ(MLT）から選択されるこ
   とを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 精製されたサイトカインを前記被検体に投与することを更に
   含む請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記サイトカインを前記被検体の粘膜の表面に接触させるこ
   とを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記精製されたサイトカインが、顆粒球−マクロファージコ
   ロニー刺激因子（GM−CSF)、インターロイキン−２（IL−２）、インターロイキ
   ン−７（IL−７）、インターロイキン−12（IL−12）、又は腫瘍壊死因子ａ（TN
   Fa）から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
8. 【請求項８】 精製されたインターフェロン−γを前記被検体に投与するこ
   とを更に含む請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記精製されたインターフェロン−γを前記被検体の粘膜の
   表面に接触させることを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 精製されたインターフェロン−γを前記被検体に投与する
    ことを更に含む請求項５に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記精製されたインターフェロン−γを前記被検体の粘膜
    の表面に接触させることを特徴とする請求項10に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記組成物が、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子
    （GM−CSF)、インターロイキン−２（IL−２）、インターロイキン−７（IL−７
    ）、インターロイキン−12（IL−12）、又は腫瘍壊死因子から選択される精製さ
    れたサイトカインを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記組成物が、精製されたインターフェロン−γを更に含
    むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記組成物が、精製されたインターフェロン−γを更に含
    むことを特徴とする請求項12に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記抗原が病原性ウイルスから得られるペプチドであるこ
    とを特徴とする請求項１に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記病原性ウイルスが HIV−１であることを特徴とする請
    求項15に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記病原性ウイルスがインフルエンザウイルスであること
    を特徴とする請求項15に記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記病原性ウイルスがロタウイルスであることを特徴とす
    る請求項15に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記抗原が病原性細菌又は原生動物から得られることを特
    徴とする請求項１に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記抗原が腫瘍関連ペプチドであることを特徴とする請求
    項１に記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記抗原が、 EQMHEDIISLWDQSLKPCVKRIQRGPGRAFVTIGK(配列番号：１）， KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIRRIQRGPGRAFVTIGK(配列番号：２）， RDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTRIQRGPGRAFVTIGK(配列番号：３）， AVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIQRGPGRAFVTIGK（配列番号：４），DRVIEV
    VQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIQRGPGRAFVTIGK（配列番号：５），DRVIEVVQGAYRAIRRIQ
    RGPGRAFVTIGK（配列番号：６）， AQGAYRAIRHIPRRIRRIQRGPGRAFVTIGK(配列番号：７）， EQMHEDIISLWDQSLKPCVKRIHIGPGRAFYTTKN(配列番号：８）， KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIRRIHIGPGRAFYTTKN(配列番号：９）， RDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTRIHIGPGRAFYTTKN(配列番号：10）， AVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIHIGPGRAFYTTKN（配列番号：11），DRVIEV
    VQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIHIGPGRAFYTTKN（配列番号：12），DRVIEVVQGAYRAIRRIH
    IGPGRAFYTTKN（配列番号：13）及びAQGAYRAIRHIPRRIRRIHIGPGRAFYTTKN(配列番号
    ：14）。 からなる群から選択される HIV−１クラスターペプチドワクチン構成物（CLUVAC
    ) を含むペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記 HIV−１ CLUVAC が、 HIV−１ CLUVAC PCLUS3-18III
    B(配列番号：２）であることを特徴とする請求項21に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記 HIV−１ CLUVAC が、 HIV−１ CLUVAC PCLUS3-18MN(
    配列番号：９）であることを特徴とする請求項21に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記 HIV−１ CLUVAC が、 HIV−１ CLUVAC PCLUS6.1-18M
    N(配列番号：12）であることを特徴とする請求項21に記載の方法。
25. 【請求項２５】 被検体において保護的な粘膜のCTL 応答を誘導するための
    方法であって、被検体の粘膜の組織を、可溶性抗原を含む組成物に接触させるこ
    とを含み、ここで、前記組成物はアジュバントを含まないことを特徴とする方法
    。
26. 【請求項２６】 精製されたサイトカインを前記被検体に投与することを更
    に含む請求項25に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記サイトカインを前記被検体の粘膜の表面に接触させる
    ことを特徴とする請求項25に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記精製されたサイトカインが、顆粒球−マクロファージ
    コロニー刺激因子（GM−CSF)、インターロイキン−２（IL−２）、インターロイ
    キン−７（IL−７）、インターロイキン−12（IL−12）、又は腫瘍壊死因子ａ（
    TNFa）から選択されることを特徴とする請求項27に記載の方法。
29. 【請求項２９】 精製されたインターフェロン−γを前記被検体に投与する
    ことを更に含む請求項25に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記精製されたインターフェロン−γを前記被検体の粘膜
    の表面に接触させることを特徴とする請求項29に記載の方法。
31. 【請求項３１】 精製されたインターフェロン−γを前記被検体に投与する
    ことを更に含む請求項26に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記精製されたインターフェロン−γを前記被検体の粘膜
    の表面に接触させることを特徴とする請求項31に記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記組成物が、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子
    （GM−CSF)、インターロイキン−２（IL−２）、インターロイキン−７（IL−７
    ）、インターロイキン−12（IL−12）、又は腫瘍壊死因子から選択される精製さ
    れたサイトカインを更に含むことを特徴とする請求項25に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記組成物が、精製されたインターフェロン−γを更に含
    むことを特徴とする請求項25に記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記組成物が、精製されたインターフェロン−γを更に含
    むことを特徴とする請求項33に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記抗原が病原性ウイルスから得られるペプチドであるこ
    とを特徴とする請求項25に記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記病原性ウイルスが HIV−１であることを特徴とする請
    求項36に記載の方法。
38. 【請求項３８】 前記病原性ウイルスがインフルエンザウイルスであること
    を特徴とする請求項16に記載の方法。
39. 【請求項３９】 前記病原性ウイルスがロタウイルスであることを特徴とす
    る請求項36に記載の方法。
40. 【請求項４０】 前記抗原が病原性細菌又は原生動物から得られることを特
    徴とする請求項25に記載の方法。
41. 【請求項４１】 前記抗原が腫瘍関連ペプチドであることを特徴とする請求
    項25に記載の方法。
42. 【請求項４２】 前記抗原が、 EQMHEDIISLWDQSLKPCVKRIQRGPGRAFVTIGK(配列番号：１）， KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIRRIQRGPGRAFVTIGK(配列番号：２）， RDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTRIQRGPGRAFVTIGK(配列番号：３）， AVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIQRGPGRAFVTIGK（配列番号：４），DRVIEV
    VQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIQRGPGRAFVTIGK（配列番号：５），DRVIEVVQGAYRAIRRIQ
    RGPGRAFVTIGK（配列番号：６）， AQGAYRAIRHIPRRIRRIQRGPGRAFVTIGK(配列番号：７）， EQMHEDIISLWDQSLKPCVKRIHIGPGRAFYTTKN(配列番号：８）， KQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIRRIHIGPGRAFYTTKN(配列番号：９）， RDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTRIHIGPGRAFYTTKN(配列番号：10）， AVAEGTDRVIEVVQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIHIGPGRAFYTTKN（配列番号：11），DRVIEV
    VQGAYRAIRHIPRRIRQGLERRIHIGPGRAFYTTKN（配列番号：12），DRVIEVVQGAYRAIRRIH
    IGPGRAFYTTKN（配列番号：13）及びAQGAYRAIRHIPRRIRRIHIGPGRAFYTTKN(配列番号
    ：14）。 からなる群から選択される HIV−１クラスターペプチドワクチン構成物（CLUVAC
    ) を含むペプチドであることを特徴とする請求項25に記載の方法。
43. 【請求項４３】 前記 HIV−１ CLUVAC が、 HIV−１ CLUVAC PCLUS3-18III
    B(配列番号：２）であることを特徴とする請求項42に記載の方法。
44. 【請求項４４】 前記 HIV−１ CLUVAC が、 HIV−１ CLUVAC PCLUS3-18MN(
    配列番号：９）であることを特徴とする請求項42に記載の方法。
45. 【請求項４５】 前記 HIV−１ CLUVAC が、 HIV−１ CLUVAC PCLUS6.1-18M
    N(配列番号：12）であることを特徴とする請求項42に記載の方法。
46. 【請求項４６】 被検体において保護的な粘膜のCTL 応答を誘導するための
    、直腸内投与に適合した免疫原性組成物であって、直腸、結腸、Ｓ状結腸、又は
    遠位結腸への直腸内デリバリーのために調剤された精製された可溶性抗原を含む
    免疫原性組成物。
47. 【請求項４７】 直腸浣腸、泡状体、坐剤、又は局所的ゲルを含む請求項46
    に記載の免疫原性組成物。
48. 【請求項４８】 基材、担体、又は直腸内デリバリーのために適合した吸収
    促進剤を更に含む請求項46に記載の免疫原性組成物。
49. 【請求項４９】 直腸用エマルション又はゲル調製物を含む請求項48に記載
    の免疫原性組成物。
50. 【請求項５０】 前記可溶性抗原が均一ゲル担体と混合されていることを特
    徴とする請求項48に記載の免疫原性組成物。
51. 【請求項５１】 前記均一ゲル担体がポリオキシエチレンゲルであることを
    特徴とする請求項48に記載の免疫原性組成物。
52. 【請求項５２】 前記可溶性抗原が直腸適性の泡状体と混合されていること
    を特徴とする請求項48に記載の免疫原性組成物。
53. 【請求項５３】 前記可溶性抗原が坐剤において調剤されることを特徴とす
    る請求項48に記載の免疫原性組成物。
54. 【請求項５４】 前記坐剤が、ポリエチレングリコール、ウィテップゾール
    （witepsol）Ｈ15、ウィテップゾールＷ35、ウィテップゾールＥ85、プロピレン
    グリコールジカプソレート（Sefsol 228）、Miglyol 810 、ヒドロキシプロピル
    セルロース−Ｈ(HPC）、又はcarbopol−934P（CP）から選択される基材から構成
    されることを特徴とする請求項53に記載の免疫原性組成物。
55. 【請求項５５】 少くとも２の基材材料を含む請求項53に記載の免疫原性組
    成物。
56. 【請求項５６】 前記可溶性抗原の直腸内分解を最小にするための安定剤を
    含む請求項46に記載の免疫原性組成物。
57. 【請求項５７】 吸収促進剤を含む請求項46に記載の免疫原性組成物。
58. 【請求項５８】 前記吸収促進剤が、界面活性剤、混合ミセル、エナミン、
    窒素酸化物供与体、サリチル酸ナトリウム、アセト酢酸のグリセロールエステル
    、シクロデキストリンもしくはβ−シクロデキストリン誘導体、又は中鎖脂肪酸
    から選択されることを特徴とする請求項57に記載の免疫原性組成物。
59. 【請求項５９】 アジュバントを更に含む請求項46に記載の免疫原性組成物
    。
60. 【請求項６０】 前記アジュバントが、コレラ毒素（CT）、変異体コレラ毒
    素(MCT）、変異体−大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、又は百日咳毒素から選
    択されることを特徴とする請求項59に記載の免疫原性組成物。
61. 【請求項６１】 前記アジュバントが粘膜組織又はＴ細胞結合剤にコンジュ
    ゲートされていることを特徴とする請求項59に記載の免疫原性組成物。
62. 【請求項６２】 前記粘膜組織又はＴ細胞結合剤が、プロテインＡ、粘膜組
    織−もしくはＴ−細胞−特異的タンパク質に結合する抗体、又は粘膜組織−もし
    くはＴ−細胞−特異的タンパク質に結合するリガンドもしくはペプチドから選択
    されることを特徴とする請求項61に記載の免疫原性組成物。
63. 【請求項６３】 前記アジュバントが、毒性を排除し、プロテインＡにより
    媒介される粘膜組織結合を増強するため、CTA 鎖にコンジュゲートしたプロテイ
    ンＡにより置換されたCTのＢ鎖を有する組換えコレラ毒素（CT）を含むことを特
    徴とする請求項59に記載の免疫原性組成物。
64. 【請求項６４】 前記アジュバントが、Ｔ細胞に特異的に結合するタンパク
    質又はペプチドにコンジュゲートされていることを特徴とする請求項59に記載の
    免疫原性組成物。
65. 【請求項６５】 前記タンパク質又はペプチドがCD４又はCD８に結合するこ
    とを特徴とする請求項64に記載の免疫原性組成物。
66. 【請求項６６】 前記タンパク質又はペプチドが、HIV V3ループ又はそのＴ
    細胞結合ペプチドフラグメントであることを特徴とする請求項66に記載の免疫原
    性組成物。
67. 【請求項６７】 精製されたIL−12を更に含む請求項59に記載の免疫原性組
    成物。
68. 【請求項６８】 精製されたインターフェロン−γを更に含む請求項59に記
    載の免疫原性組成物。
69. 【請求項６９】 精製されたIL−12を更に含む請求項68に記載の免疫原性組
    成物。