KR101294290B1 - 예방 또는 치료를 위해 제ｉ류 주조직 적합성복합체〔ｍｈｃ〕-제한 에피토프에 대한 면역 반응을 유발,향상 및 지속하는 방법 - Google Patents
예방 또는 치료를 위해 제ｉ류 주조직 적합성복합체〔ｍｈｃ〕-제한 에피토프에 대한 면역 반응을 유발,향상 및 지속하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 구현은 바람직하게는 제I류 MHC-제한 에피토프에 대한 면역 반응, 바람직하게는 다가 반응을 유발, 향상 및 지속시키는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이 방법 및 조성물은 예방 또는 치료의 목적으로 이용할 수 있다.
Description
관련출원의 상호참조
본원은, "예방 또는 치료를 목적으로 제I류 MHC-제한 에피토프에 대한 면역 반응을 유발, 향상 및 지속하는 방법"을 명칭으로 하는 발명에 관하여 2004년 12월 29일에 출원된 미국 가출원 제60/640,402호를 35 U.S.C. § 119(e)에 의거하여 우선권으로 주장하며, 상기 발명의 내용은 참고로서 본 명세서에 수록되어 있다.
여기에 기술된 본 발명의 구현예는 제I류 MHC-제한 면역반응을 유발하고, 상기 반응의 특성 및 강도를 제어하며, 발병 과정에서 면역학적으로 효과적인 중재를 촉진하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 구현예는 면역 조성물과 이들의 특성, 및 이들을 효과적으로 이용할 수 있는 투여 순서, 적기 및 경로에 관한 것이다.
주조직적합성
복합체(
Major
Histocompatibility
Complex, MHC
) 및 T 세포
타겟의
인지
T 임파구(T 세포)는 특이 항원 신호에 응답하여 작용하는 항원특이적 면역세포이다. B 임파구 및 이로부터 생성되는 항체 역시 항원특이적 성분들이다. 그러나 B 임파구와 달리 T 세포는 유리된 형태 또는 가용성 형태에서는 항원과 반응하지 않는다. 항원에 반응하는 T 세포의 경우, 항원은 주조직적합성 복합체(MHC) 라고 알려진 표시 복합체에 결합될 필요가 있다.
MHC 단백질은 외부 세포로부터 T 세포를 자연체 혹은 "자가"세포로 분화시키는 수단을 제공한다. MHC 분자는 T 세포에 의해 추후 관찰될 잠재적 펩티드 에피토프를 표시하는 면역 수용체 범주에 속한다. 여기에는 두가지 종류의 MHC 즉, 제I류 MHC 및 제II류 MHC가 있다. CD4+ T 세포는 제II류 MHC 단백질과 상호작용하여 주로 헬퍼 표현형을 갖는 반면, CD8+ T 세포는 제I류 MHC 단백질과 작용하여 세포붕괴 표현형을 갖는다. 그러나 이들은 각각 조절 기능, 특히 억제 기능도 갖고 있다. 양쪽 MHC는 모두 구조의 대부분이 세포의 외표에 존재하는 전달막 단백질이다. 또한 양쪽 MHC는 모두 그들의 외부에 펩티드 결합 분열체(cleft)를 갖는다. 상기 분열체 내에는 고유의 혹은 외부로부터의 단백질 소절편이 결합되어 있고 세포외 환경과 관련하여 존재한다.
항원 표시세포 (APCs) 라는 세포는 MHC를 이용하여 항원을 T 세포에 나타낸다. T 세포는 항원이 MHC에 존재할 경우 이를 인지할 수 있다. 이러한 조건을 MHC 제한이라고 부른다. 항원이 인지성 MHC에 의해 표시되지 않을 경우 T 세포가 이를 인지하지 못하여 항원 신호에 대해 반응을 할 것이다. 인지성 MHC에 결합된 펩티드에 특이적인 T 세포는 이들 MHC-펩티드 복합체와 결합하여 면역 반응의 후속 단계 를 이행한다.
명목 제I류 MHC 또는 제II류 MHC 제한 에피토프에 상응하는 펩티드는, T 세포 반응을 유발, 증폭 혹은 조정할 목적으로 유래시킬 수 있는 가장 간단한 형태의 항원에 속한다. 펩티드 에피토프는 체내 프라이밍 처리된 T 세포주, 클론 혹은 T 세포 하이브리도마를 재자극할 때 체외에서 효과적이라는 사실이 공지되었음에도 불구하고, 이들의 체내 효능은 극히 제한적이었다. 이는 다음의 두가지 요인에 의한 것이다:
(1) 빠른 신장 청소 및/또는 분해로 인한 펩티드의 약동학적 프로파일(PK)이 낮아 APC에 대한 접근이 제한된다;
(2) 강하고 지속적인 면역 반응 특히, Tc1 이나 Th1 세포 (IFN-감마 및 TNF-알파를 생성하는)로 이루어진 반응을 유발 또는 증폭하기 위한 항원-유발 T 세포 수용체 (TCR)-의존형 신호발생(신호 1)이 충분치 않다. 또한 펩티드와 관련한 제한 PK를 포위하기 위해 펩티드나 데포(depot) 보강제를 이용할 경우, 적절한 면역화 보조제 혹은 조절제를 함께 사용하지 않으면 가변적인 무반응도 또는 "면역 편향"을 촉발할 수도 있다.
본 발명의 구현예는 제I류 MHC 제한 에피토프에 대한 면역 반응을 조정하는, 보다 구체적으로는 상기 면역 반응을 유발, 진행 및/또는 증폭시키는 방법 및 조성물을 포함한다.
일부 구현예는 면역 방법에 관한 것이다. 이 방법은 예를 들어 포유동물에 대해, 제1 항원을 함유하거나 또는 그 일부를 코드화할 수 있는 면역원을 함유한 제1 조성물을 전달하는 단계; 및 증폭 펩티드를 함유할 수 있는 제2 조성물을 상기 포유동물의 림프계에 직접 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 펩티드는 상기 제1 항원의 에피토프에 상응하고 제1 조성물 및 제2 조성물은 동일하지 않다. 상기 방법은 또한 효과기(effector) T 세포 반응을 얻고, 분석 혹은 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
제1 조성물은 항원이나 그의 면역성 절편을 코드화하는 핵산을 포함할 수 있다. 제1 조성물은 pAPC에서 상기 에피토프를 발현할 수 있는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 프로토조아, 박테리아 또는 바이러스 벡터의 성분으로서 전달될 수 있다. 제1 조성물은 면역성 폴리펩티드 및 면역강화제 등을 포함할 수 있다. 상기 면역강화제는 예를 들어, 사이토킨, 톨 유사 수용체(toll-like receptor) 등을 들 수 있다. 보강제는 면역자극성 서열, RNA 등을 포함할 수 있다.
면역성 폴리펩티드는 증폭 펩티드를 들 수 있다. 면역성 폴리펩티드는 또한 제1 항원일 수 있다. 면역성 폴리펩티드는 프로토조아, 박테리아, 바이러스, 또는 바이러스 유사 입상물 등의 한 성분으로서 전달될 수 있다. 보강제는 프로토조아, 박테리아, 바이러스, 바이러스 벡터 또는 바이러스 유사 입상물 등의 한 성분으로서 전달될 수 있다. 제2 조성물은 보강제 및 면역강화제를 함유하지 않을 수도 있다. 전달 단계는 포유동물의 림프계에 대한 직접 투여를 포함할 수 있다. 포유동물의 림프계에 대한 직접 투여는 림프절 또는 림프 경락(vessel)에 대한 직접 투여를 포함한다. 2개 이상의 림프절이나 림프 경락에 직접 투여할 수 있다. 림프절은 예를 들어, 서혜부, 겨드랑이, 자궁경부 및 편도선 림프절을 들 수 있다. 효과기 T 세포 반응은 세포독성 T 세포 반응일 수 있다. 효과기 T 세포 반응은 프로-염증성 사이토킨의 생성을 포함할 수 있으며, 상기 사이토킨은 예를 들어, (감마)γ-IFN 또는 TNFα(알파)를 들 수 있다. 효과기 T 세포 반응은 또한 T 세포 케모킨, 예를 들어, RANTES 나 MIP-1α등의 생성을 포함할 수 있다.
에피토프는 예를 들어 하우스키핑 에피토프 또는 면역 에피토프 등을 들 수 있다. 상기 전달 단계나 투여 단계는 예를 들어, 1회 정맥주사, 반복 정맥주사 등을 포함할 수 있다. 또한 전달 단계나 투여 단계는 연속 주입, 예를 들어, 약 8 내지 7일간 행해지는 연속 주입을 포함할 수 있다. 이 방법은 또한, 전달 단계 종료부터 투여 단계의 개시 사이에 간격을 둘 수 있으며, 이 간격은 최소한 약 7일이다. 또한 상기 간격은 예를 들어, 약 7일 내지 14일, 약 17일, 약 20일, 약 25일, 약 30일, 약 40일, 약 50일, 약 60일이 될 수도 있다. 상기 간격은 또한 약 75일 이상, 약 80일, 약 90일, 약 100일 혹은 그 이상이 되기도 한다.
제1 항원은 질병 관련 항원이며, 상기 질병 관련 항원은 종양 관련 항원, 병원체 관련 항원이 될 수도 있다. 본 발명의 구현예는 상술한 면역 방법을 활용한 질병 치료방법을 포함한다. 제1 항원은 타겟 관련 항원일 수 있다. 상기 타겟은 종양성 세포, 병원체 감염 세포 등이 될 수 있다. 예를 들어, 임의의 종양성 세포를 타겟으로 할 수 있다. 병원체 감염 세포는 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 프로토조아, 진균 등에 의해 감염된 세포 또는 예를 들어, 프리온(prion)의 피해를 입은 세포를 포함할 수 있다.
효과기 T 세포 반응은 하나 이상의 표시자, 예를 들어, 사이토킨 분석, 엘리스폿(Elispot) 분석, 세포독성 분석, 테트라머 분석, DTH-반응, 임상 반응, 종양 수축, 종양 소거, 종양 진행의 억제, 병원체 역가의 감소, 병원체 소거, 질병 증세의 완화 등에 따라 검출될 수 있다. 상기 방법은 제1 항원에 대한 효과기 T 세포 반응을 수득, 검출 또는 분석하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 또다른 구현예는 포유동물에 대해, 제1 항원 또는 그의 면역성 절편을 코드화하는 핵산을 함유한 제1 조성물을 전달하는 단계; 및 펩티드를 함유한 제2 조성물을 상기 포유동물의 림프계에 직접 투여하는 단계를 포함하는 것으로서, 여기서 상기 펩티드는 상기 제1 항원의 에피토프에 상응하는 것을 특징으로 하는 면역방법에 관한 것이다. 상기 방법은 또한 항원에 대한 효과기 T 세포 반응을 수득, 검출 혹은 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 구현예는 종래의 항원 특이적 면역 반응을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 펩티드를 함유하는 조성물을 포유동물의 림프계에 직접 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 조성물은 면역 반응의 유발에 이용되지 않았다. 이 방법은 항원 특이적 면역 반응의 증대를 수득, 검출 또는 분석하는 단계를 더 포함한다. 상기 증대방법은 반응을 계속 지속하고, 정지기 T 세포를 재활성화하고, 항원 특이적 T 세포의 집단을 확대시키는 것을 포함한다. 상기 조성물에 면역강화제가 포함되지 않는 경우도 있다.
본 발명의 다른 구현예는 제1 항원의 적어도 일부 및 제2 항원의 적어도 일부를 함유하거나 코드화할 수 있는 면역원을 포함하는 제1 조성물을 포유동물에 전달하는 단계; 및 제1 펩티드를 함유한 제2 조성물 및 제2 펩티드를 함유한 제3 조성물을 상기 포유동물의 림프계에 직접 투여하는 단계를 포함하고, 제1 펩티드는 제1 항원의 에피토프에 상응하고 상기 제1 조성물은 제2 또는 제3 조성물과 동일하지 않을 수 있는 것을 특징으로 하는 면역방법에 관한 것이다. 상기 방법은 제1 또는 제2 항원에 대한 효과기 T 세포 반응을 수득, 검출 또는 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 및 제3 조성물은 각각 제1 및 제2 펩티드를 포함할 수 있다. 제2 및 제3 조성물은 단일조성물의 일부가 될 수 있다.
그 밖의 구현예는 항원 특이적 관용원(tolerogenic) 또는 조절 면역 반응을 일으키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 보강제 무함유 펩티드를 함유한 조성물을 포유동물의 림프계에 직접 주기적으로 투여하는 단계를 포함하며, 상기 펩티드는 항원의 에피토프에 상응하고 상기 포유동물은 에피토프에 대해 미숙하다. 이 방법은 관용원 또는 조절 T 세포 면역 반응을 수득, 검출 및 분석하는 단계를 더 포함한다. 면역 반응은 예를 들어, 염증성 질환 등을 치료하는데 도움을 줄 수 있다. 염증성 질환은 예를 들어, 제II류 MHC 제한 면역 반응으로부터 유래된다. 상기 면역 반응은 면역억제 사이토킨, 예를 들어, IL-5, IL-10 또는 TGB-β 등의 생성을 포함할 수 있다.
본 발명의 구현예는 하나 이상의 비말 동반약 및 하나 이상의 증폭약을 포함하는 일련의 면역약을 포유동물의 림프계에 직접 투여하는 단계를 포함하고, 상기 비말 동반약은 면역원을 코드화할 핵산을 포함하고 상기 증폭약은 바이러스, 바이러스 벡터 또는 복제 가능 벡터를 함유하지 않은 것을 특징으로 하는 면역 방법에 관한 것이다. 이 방법은 항원 특이적 면역 반응을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 방법은 예를 들어, 1 내지 6개 이상의 비말 동반약을 포함할 수 있다. 이 방법은 다수의 비말 동반약을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이때의 약량은 1일 내지 약 7일 동안 투여된다. 비말 동반약, 증폭약 또는 비말 동반약 및 증폭약은 다수 쌍의 주사로 전달될 수 있으며, 각 쌍의 처음 부분은 후속 부분의 약 4일 이내에 투여되고 또한 여러 쌍의 처음 부분들 간의 시간 간격은 약 14일 이상이다. 마지막 비말 동반약 및 첫번째 증폭약 간의 간격은 예를 들어 약 7일 내지 약 100일 사이가 될 수 있다.
다른 구현예는 1 내지 6 이상의 비말 동반약과 하나 이상의 증폭약을 함유한 것으로서, 포유동물에서 면역 반응을 유발하기 위한 면역 조성물군에 관한 것이며, 상기 비말 동반약은 면역원 코드화 핵산을 포함하고, 상기 증폭약은 펩티드 에피토프를 포함하며, 상기 에피토프는 핵산을 발현하는 pAPC에 의해 표시되거나 표시가능하다. 하나의 약은 예를 들어, RNA 같은 보강제를 포함할 수 있다. 비말 동반약 및 증폭약은 림프계, 림프절 등에 대한 직접 투여에 적합한 담체에 담을 수 있다. 핵산은 플라스미드를 들 수 있다. 에피토프는 제I류 HLA 에피토프, 예를 들어, 표 1-4에 열거된 것 중 하나를 포함할 수 있다. 바람직한 HLA로 HLA-A2를 들 수 있다. 면역원은 에피토프 어레이를 포함하며, 이 어레이는 단체분리(liberation) 서열을 포함할 수 있다. 면역원은 기본적으로 타겟 관련 항원을 포함한다. 타겟 관련 항원은 종양 관련 항원, 미생물 항원, 기타 항원 등을 들 수 있다. 면역원은 에피토프 클러스터를 함유하는 타겟 관련 항원의 절편을 포함할 수 있다.
또다른 구현예는 1 내지 6개의 비말 동반약 및 하나 이상의 증폭약을 포함하는 것으로서 포유동물에서 제I류 MHC 제한 면역 응답을 유발하기 위한 면역 조성물군을 포함하며, 여기서 비말 동반약은 면역원 또는 면역원 코드화 핵산 및 면역강화제를 함유하고, 증폭약은 펩티드 에피토프를 함유하며, 또한 상기 에피토프는 pAPC에 의해 표시될 수 있다. 면역원 코드화 핵산은 면역강화제 기능을 할 수 있는 면역자극 서열을 더 포함할 수 있다. 면역원은 면역강화제를 포함하거나 유발할 수 있는 바이러스 혹은 복제 가능 벡터를 들 수 있다. 면역원은 또한 박테리아, 박테리아 용해물 또는 정제된 세포벽 성분이 될 수도 있다. 또한, 박테리아 세포벽 성분은 면역강화제 기능을 할 수 있다. 면역강화제는 예를 들면, TLR 리간드, 면역자극 서열, CpG-함유 DNA, dsRNA, 세포내 패턴 인식 수용체(PRR) 리간드, LPS, 키라야 사포닌, 투카레졸, 프로-염증성 사이토킨 등을 들 수 있다. 다가 반응을 촉진하는 바람직한 구현예에서, 상기 조성물군은 다양한 개별 항원이나 그의 조합체에 상응하는 다수개의 비말 동반약 및/또는 다수개의 증폭약을 투여 목적으로 포함한다. 다수개의 비말 동반약은 단일 조성물의 일부로서 또는 하나 이상의 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 증폭약은 비연속적인 시점 및/또는 한 곳 이상의 부위에 투여될 수 있다.
다른 구현예는 각종 사이토킨 프로파일을 발생하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 펩티드의 결절내 투여는 플라스미드 DNA 백신에 의해 초기 유발된 반응을 증폭시키는데 효율적이다. 또한, 사이토킨 프로파일은 플라스미드 DNA 유발/펩티드 증폭에 의해 뚜렷해지며 그 결과로서 DNA/DNA 또는 펩티드/펩티드 프로토콜 보다 케모킨(화학유인 사이토킨)이 증가하고 면역억제 사이토킨 생성은 저하하게 된다.
각종 구현예에 이용된 증폭 펩티드는 면역 항원의 에피토프에 상응한다. 어떤 구현예에서, 상기 상응성은 에피토프의 자연 서열을 충실히 반복하는 것을 포함한다. 어떤 구현예에서, 상응성은 하나 이상의 아미노산이 변형 또는 대체되었거나 에피토프의 길이가 달라진 자연 서열의 유사체인 상응하는 서열을 포함할 수도 있다. 이러한 유사체는 에피소드의 면역 기능을 유지한다(즉, 이들은 기능적으로 유사하다). 바람직한 구현예에서, 상기 유사체는 자연 서열과 비교시 이와 유사하거나 개선된 것으로서, 하나 이상의 제I류 MHC 분자와의 결합을 가진다. 또다른 바람직한 구현예에서, 유사체는 자연 서열과 비교하여 이와 유사하거나 더 개선된 면역성을 갖는다. 유사체를 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법에 관한 예시적인 연구는 2002년 4월 4일자 미국 특허 출원 제10/117,937호(공개번호 제2003-0220239 A1호) 및 2003년 9월 5일자 미국 특허 출원 제10/657,022호(공개번호 제20040180354호) 으로서 공히 "에피토프 서열"을 명칭으로 하는 발명; 및 2004년 6월 17일자 미국 가특허 출원 제60/581,001호(공개번호...) 및 2005년 6월 17일자 미국 특허 출원 제11/156,253호(공개번호...) 으로서 공히 "SSX2 펩티드 유사체"를 명칭으로 하는 발명; 또한 2005년 6월 17일자 미국 가특허 출원 제60/580,962호 및 미국 특허 출원제11/155,929호(공개번호...)으로서 공히 "NY-ESO 펩티드 유사체"를 명칭으로 하는 발명에 소개되어 있으며 이들의 구체적 내용은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다.
또다른 구현예는 면역 프로토콜의 비말 동반 및 증폭시 이용할 보강제 무함유 약제의 제조에 펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 상술한 바와 같이 본 발명의 조성물, 키트, 면역원 및 화합물을 각종 질병 치료 약제, 면역 반응 증폭, 특정 사이토킨 프로파일의 생성 등에 이용할 수 있다. 본 발명의 구현예는 면역 반응 증폭 방법에서 보강제 무함유 펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 구현예는 표 1 내지 4에 열거된 것을 포함하여 MHC에 대한 XR이성을 가진 에피토프에 관련한 조성물, 방법, 사용방법 및 치료방법에 관한 것이다. 또다른 구현예는 표 1 내지 4에 열거된 하나 이상의 MHC 및 이의 조합물을 포함하는 반면, 또다른 구현예는 특별히 하나 이상의 MHC 또는 그의 조합물을 배제한다. 표 3 및 4는 열거된 HLA 항원의 빈도를 포함한다.
어떤 구현예는 면역 반응을 발생시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 포유동물에 대해 제1 항원(항원 A)의 적어도 일부 및 제2 항원(항원 B)의 적어도 일부를 포함하거나 이를 코드화하는 면역원을 포함할 수 있는 제1 조성물(조성물 1)을 전달하는 단계; 및 제1 펩티드(펩티드 A)를 함유한 제2 조성물(조성물 2) 및 제2 펩티드(펩티드 B)를 함유한 제3 조성물(조성물 3)을 상기 포유동물의 림프계에 직접 투여하는 단계를 포함하고, 상기 펩티드 A는 항원 A의 에피토프에 상응하고 펩티드 B는 항원 B의 에피토프에 상응하며, 상기 조성물 1은 조성물 2 또는 조성물 3과 동일하지 않은 것을 특징으로 한다. 이 방법은 상기 항원 중 하나 또는 양측에 대한 효과기 T 세포 반응을 수득하는 단계를 더 포함한다.
어떤 측면에서, 조성물 2 및 조성물 3은 각각 펩티드 A 및 펩티드 B를 포함할 수 있다. 펩티드 A 및 B는 각 부위 또는 다른 시점에서 동일한 부위에 투여한다. 조성물 1은 항원 A 및 B를 모두 또는 그의 일부를 코드화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 또한 조성물 1은 두 개의 핵산 분자를 포함하며 이 중 하나는 항원 A 또는 그의 일부를 코드화하고 나머지 하나는 항원 B 또는 그의 일부를 코드화한다.
제1 항원 및 제2 항원은 임의의 항원이 될 수도 있다. 바람직하게는, 상기 제1 항원 및 제2 항원은 멜라노마 항원, CT 항원, 칼시노마-관련 항원, CT 항원 및 기질 세포, CT 항원 및 신혈관성 항원, CT 항원 및 미분화 항원, 칼시노마-관련 항원 및 기질 항원 등을 들 수 있다. 각종 항원 조합물은 2004년 6월 17일자 미국 출원 제10/871,708호(공개번호 제20050118186호)으로서 "각종 암 용도의 조성물에 함유된 종양관련 항원의 조합물"을 명칭으로 하는 발명; 2004년 12월 29일자 미국 가출원 제60/640,598호 및 동일자로 출원된 미국출원 (....)(공개번호 ....)(대리인 정리번호 제MANNK.049A호) 으로서 양측 공히 "각종 암 용도의 조성물에 함유된 종양 관련 항원이 조합물"을 명칭으로 하는 발명에서 제공하는 것으로서, 이들의 내용 전반이 본 명세서에 참고로 수록되어 있다. 바람직하게, 상기 항원 A 또는 B를 포함한 항원은 SSX-2, 멜란 A, 티로시나제, PSMA, PRAME, NY-ESO-1 등을 들 수 있다. 기타 다른 항원도 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 구현예 및 다른 구현예에서 2개 이상의 조성물, 면역원, 항원, 에피토프 및/또는 펩티드를 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 물질 중 하나 이상을 3개, 4개, 5개 또는 그 이상으로 이용할 수 있다.
또다른 구현예는 예를 들어, 제1 항원(항원 A)의 적어도 일부를 포함 또는 코드화하는 면역원(면역원 1)을 함유한 제1 조성물(조성물 1) 및 제2 항원(항원 B)의 적어도 일부를 포함 또는 코드화하는 면역원(면역원 2)을 함유한 제2 조성물(조성물 2)을 포유동물에 전달하는 단계; 및 제1 펩티드(펩티드 A)를 함유한 제3 조성물(조성물 3), 및 제2 펩티드(펩티드 B)를 함유한 제4 조성물(조성물 4)를 상기 포유동물의 림프계에 직접 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 펩티드 A는 항원 A의 에피토프에 상응하고 펩티드 B는 항원 B의 에피토프에 상응하며 상기 조성물 1은 조성물 2 또는 조성물 3와 동일하지 않은 것을 특징으로 하는 면역반응 발생 방법에 관한 것이다.
어떤 측면에서, 상기 조성물 2는 예를 들어 조성물 3 과 동일하지 않다. 조성물 1 및 조성물 3은 예를 들어, 동일한 부위에 전달될 수 있으며, 상기 부위는 서혜부 림프절을 들 수 있다. 또한 조성물 2 및 4는 조성물 1 및 3과 상이한 부위, 예를 들어, 또다른 서혜부 림프절에 전달할 수 있다.
그 밖의 구현예는 예를 들어 제1 항원 및 제2 항원에 면역 반응을 유발하는 수단을 포함하는 제1 조성물을 전달하는 단계; 및 제1 펩티드 함유 제2 조성물과 제2 펩티드 함유 제3 조성물을 포유동물의 림프계에 직접 투여하는 단계를 포함하고, 상기 제1 펩티드는 제1 항원의 에피토프에 상응하고 제2 펩티드는 제2 항원의 에피토프에 상응하며, 제1 조성물은 제2 또는 제3 조성물과 동일하지 않은 것을 특징으로 하는 면역반응 발생 방법에 관한 것이다. 면역반응을 유발하는 수단은 예를 들어, 항원이나 그 일부를 발현하는 수단을 포함한다.
또한, 일부의 구현예는 예를 들어 제1 항원의 적어도 일부 및 제2 항원의 적어도 일부를 포함 또는 코드화할 면역원을 함유하는 제1 조성물을 포유동물에 전달하는 단계; 및 상기 항원에 대한 반응을 증폭하는 단계를 포함하는 면역방법에 관한 것이다. 바람직하게, 항원에 대한 반응을 증폭하는 단계는 제1 항원의 일부에 상응하는 제1 펩티드를 제2 림프계 기관에 투여하는 단계 및, 제2 항원의 일부에 상응하는 제2 펩티드를 상이한 제2 림프계 기관에 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
도 1a 내지 1c는 림프내 면역에 의한 면역 반응의 유발을 도시한다.
도 2는 타겟(림프절)으로의 항원 전달에 의한 제I류 MHC-제한 에피토프에 대한 면역 조절 또는 관리를 위한 프로토콜의 예를 도시한다.
도 3은 도 4에 묘사된 데이터에 상응하는 각 웰을 가시화하여 보여준다.
도 4는 ELISPOT로 측정하고, 펩티드를 인지할 IFN-γ(감마) 생성 T 세포의 갯수(빈도)로 나타낸 것으로서, 도 2에 도시된 프로토콜을 응용한 결과로서의 면역 반응의 강도를 도시한다.
도 5는 도 2에 도시된 바와 같은 타겟으로의 항원 전달에 의해 발생된 T 세포의 세포독성 프로파일을 도시한다.
도 6은 도 2에 도시된 바와 같은 프로토콜에 의해 발생된 제I류 MHC-제한 T 세포의 교차 반응성을 도시한다.
도 7a는 세가지 종류의 생물학적 반응 변형자(프로-염증성 사이토킨, 케모킨 또는 화학유인제, 면역 조절 혹은 억제자 사이토킨)의 성분들을 생성하고, 그 후 도 2에 도시된 면역 프로토콜에 응용되는 림프구의 능력으로 표현되는 면역성 프로파일을 도시한다.
도 7b는 도 2에 도시된 면역 프로토콜에 의해 생성된 T 세포의 유동세포 분석법에 의해 표현형을 나타나는 세포 표면 마커를 도시한다. 림프절에 대한 펩티드의 반복 투여로 면역 편향 및 조절 T 세포를 유발한다.
도 8a 및 8b는 DNA, 펩티드 또는 DNA과 펩티드의 비말 동반/증폭 서열로 면역시킨 생쥐에 있어서, 테트라머에 의해 측정된 특이적 T 세포의 빈도를 나타낸다.
도 8c는 DNA("pSEM"), 펩티드("ELA" = ELAGIGILTV (서열 번호:1) 또는 DNA 및 펩티드의 비말 동반/증폭 서열로 면역시킨 생쥐에 있어서, 각종 림프계 기관 및 비림프계 기관에서 체내 발생하는 특이적 세포독성을 도시한다.
도 9a는 펩티드 증폭으로 소생된 반응에 따라, 펩티드로 면역 및 증폭시킨 동물에서 테트라머 염색된 순환 T 세포의 유지 또는 붕괴를 도시한다.
도 9b는 펩티드 증폭으로 소생된 반응에 따라, DNA로 면역시키고 펩티드로 증폭시킨 동물에서 테트라머 염색된 순환 T 세포의 유지 또는 붕괴를 도시한다.
도 9c는 펩티드 증폭으로 소생된 반응에 따라, DNA로 면역 및 증폭시킨 동물에서 테트라머 염색된 순환 T 세포의 유지 또는 붕괴를 도시한다.
도 10a는 각종 2-주기 면역 증폭을 이용한 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 도시한다.
도 10b는 각종 3-주기 면역 증폭을 이용한 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장 을 도시한다.
도 10c는 각종 프로토콜로 프라이밍 처리 및 펩티드로 증폭시킨 동물에 있어서, 테트라머 염색에 의해 검출된 순환 항원 특이적 T 세포의 확장을 도시한다.
도 10d는 림프 기관 및 비림프 기관에서 테트라머 염색에 의해 검출된 각종 면역요법에 따른 항원 특이적 T 세포의 확장을 도시한다.
도 11a는 플라스미드 DNA 및 펩티들 생쥐를 면역시키는 접종 스케줄의 예시를 도시한다.
도 11b는 각종 면역 프로토콜 (DNA 및 펩티드를 개별적으로 또는 역순으로 번갈아하는)에 의해 트리거된 ELISPOT 분석으로 결정한 면역 반응을 도시한다.
도 12a는 플라스미드 및 펩티드로 면역시킨 생쥐에 있어서, 혈액 및 림프절에서의 항원 타겟 세포의 체내 고갈을 도시한다.
도 12b는 플라스미드 및 펩티드로 면역시킨 생쥐에 있어서, 비장 및 폐에서의 항원 타겟 세포의 체내 고갈을 도시한다.
도 12c는 도 12a 및 12b에 나타낸 결과의 요약을 도시한다.
도 12d는 각종 프로토콜에 의해 면역된 생쥐에서, 특이적 T 세포의 빈도와 항원 타겟 세포의 체내 소거 사이의 상관관계를 나타낸다.
도 13a는 플라스미드 DNA 및 펩티드로 생쥐를 면역시키는 접종 스케줄 및 상기 생쥐에 대해 행한 특성 측정값을 도시한다.
도 13b는 면역된 생쥐에서, 인간 종양 세포의 체내 소거를 측정하기 위해 이용되는 프로토콜과 관련된 접종 스케줄을 도시한다.
도 13c는 플라스미드 DNA 및 펩티드로 면역시킨 생쥐의 폐에서의 항원 타겟 세포 (인간 종양 세포)의 체내 고갈을 도시한다.
도 14a는 도 14b에 도시된 항-SSX-2 반응을 일으키는데 이용된 면역 프로토콜을 도시한다.
도 14b는 DNA 비말 동반/펩티드 증폭법을 적용한 후의 순환 SSX-2 특이적 T 세포의 확장을 테트라머 염색으로 검출한 결과를 도시한다.
도 15a는 멜란 A (ELAGIGLTV (서열번호: 1) 및 SSX2 (KASEKIFYV (서열번호: 2)의 에피토프에 대한 동시면역에 대한 각종 비말 동반 및 증폭 프로토콜 대상이 된 생쥐의 비장에서의 항원 타겟 세포의 체내 소거를 도시한다.
도 15b는 멜란 A (ELAGIGILTV (서열번호: 1) 및 SSX2 (KASEKIFYV (서열번호: 2)의 에피토프에 대한 동시면역에 대한 각종 비말 동반 및 증폭 프로토콜의 대상이 된 생쥐의 혈액에서의 항원 타겟 세포의 체내 소거를 도시한다.
도 15c는 도 15a 및 15b에서 상세히 도시한 결과를 요약한 것이다.
도 16은 2주기형 각종 비말 동반 및 증폭 프로토콜의 대상이 된 생쥐에 있어서, 테트라머 염색으로 측정된 순환 항원-특이적 C8+ T 세포의 확장을 도시한다.
은A 및 17B는 DNA/DNA/펩티드(A) 또는 DNA/펩티드/펩티드(B)로 이루어진 2주기형 각종 비말 동반 및 증폭 프로토콜의 대상이 된 동물에서 순환 항원-특이적 T 세포의 지속 유지를 도시한다.
도 18은 DNA/DNA/DNA로 이루어진 2주기형 각종 비말 동반 및 증폭 프로토콜의 대상이 된 동물에서 장기 생존한 기억을 도시한다.
도 19는 DNA/펩티드 비말 동반 및 증폭 프로토콜로 환자를 등록 및 치료하는 임상 실험의 도식을 도시한다.
도 20는 두개의 플라스미드: SSX2 41-49를 발현하는 pCBP 및 멜란 A 26-35(A27L)를 발현하는 pSEM를 사용하는 접종 스케줄을 도시한다.
도 21은 혼합물로서의 두개의 플라스미드의 투여로 유발된 특이적 세포 독성 대 개별 부위에 대한 투여를 도시한다.
도 22는 도 20에 도시된 면역 프로토콜에 대한 펩티드 증폭 단계의 부가를 도시한다.
도 23은 벡터 및 펩티드 각각을 혼합물로 이용하는 경우에도 펩티드 증폭으로 열성 에피토프의 면역성을 구제하는 것을 나타낸 데이터를 도시한다.
도 24a 및 24b는 임상 실험에서 강한 다가 반응을 유발하는 또다른 면역 프로토콜을 도시한다.
도 25는 다가 반응을 유도할 수 있는 플라스미드를 도시한다.
도 26은 다가 플라스미드로 면역 반응을 개시하는 프로토콜 및 펩티드의 결절내 투여에 의한 준우성 에피토프에 대한 반응의 구제를 도시한다.
도 27a는 다가 플라스미드를 이용한 프라이밍 및 펩티드의 결절내 투여에 의한 우성(멜란 A) 에피토프에 대한 반응 증폭으로 수득한 특이적 T 세포의 빈도를 도시한다.
도 27b는 다가 플라스미드를 이용한 프라이밍 및 펩티드의 결절내 투여에 의한 준우성 에피토프(티로시나제 369-377)에 대한 반응 증폭으로 수득한 특이적 T 세포의 빈도를 도시한다.
도 28a는 다가 플라스미드를 이용한 프라이밍 및 펩티드의 결절내 투여에 의한 우성(멜란 A) 에피토프에 대한 반응 증폭으로 수득한 특이적 세포독성을 도시한다.
도 28b는 다가 플라스미드를 이용한 프라이밍 및 펩티드의 결절내 투여에 의한 준우성 에피토프(티로시나제 369-377)에 대한 반응 증폭으로 수득한 특이적 세포독성을 도시한다.
도 29는 다가 플라스미드를 이용하여 프라이밍하고 우성 및 준우성 에피토프에 대한 반응을 동시적으로 증폭하는 면역 프로토콜을 도시한다.
도 30a는 다가 플라스미드를 이용한 프라이밍 및 펩티드의 결절내 투여에 의한 우성(멜란 A) 및 준우성(티로시나제) 에피토프에 대한 반응 증폭으로 수득한 멜란 A 특이적 T 세포의 빈도를 도시한다.
도 30b는 다가 플라스미드를 이용한 프라이밍 및 펩티드의 결절내 투여에 의한 우성(멜란 A) 및 준우성(티로시나제) 에피토프에 대한 반응 증폭으로 수득한 티로시나제 특이적 T 세포의 빈도를 도시한다.
도 30c는 pSEM 으로 프라이밍 처리 및 멜란 A와 티로시나제 펩티드로 증폭한 생쥐에서, 멜란 A 및 티로시나제 특이적 T 세포의 빈도를 도시한다. 두 마리 생쥐로부터 얻은 결과를 나타낸다.
도 31은 다가 플라스미드에 의해 개시 및 증폭된 뒤, 우성(멜란 A 26-35) 및 준우성(티로시나제 369-377) 에피토프에 상응하는 혼합물로서의 펩티드를 결절내 투여하여 얻은 T 세포에 대한 체내 세포독성 데이터를 도시한다.
도 32는 증폭전 pSEM/pBPL 면역된 동물의 2중 다색 테트라머 분석의 결과를 도시한다.
도 33은 플라스미드 pSEM 및 pBPL의 혼합물로 유발시키고 SSX2 및 티로시나제 펩티드 에피토프 유사체로 증폭시킨 생쥐의 면역 반응에 대한 2중 다색 테트라머 분석의 결과를 도시한다.
도 34는 플라스미드 pSEM 및 pBPL의 혼합물로 유발시키고 SSX2 및 티로시나제 펩티드 에피토프 유사체로 증폭시킨 3마리 생쥐 각각의 면역 반응에 대한 2중 다색 테트라머 분석의 결과를 도시한다.
도 35a는 1차 증폭후 IFN-γ-ELISpot 분석의 결과를 도시한다.
도 35b는 2차 증폭후 IFN-γ-ELISpot 분석의 결과를 도시한다.
도 36은 4개의 종양 관련 항원 전체를 발현하는 인간 멜라노마 종양 세포로 CFSE 체내 실험을 도시한다. 패널 A 내지 D는 각각 테트라머 분석, IFN-γ-ELISpot 분석 및 프로토콜 종료뒤 희생시킨 각 생쥐의 체내 종양 세포를 나타낸다. 페널 A는 자연체 대조군 생쥐에서 얻은 데이터를, 패널 B 및 C는 실질적으로 4가 면역성을 달성한 3그룹 및 2그룹으로부터 나온 두 마리의 생쥐에서 얻은 데이터를, 또한 패널 D는 실질적으로 1가 면역성을 달성한 3그룹으로부터 나온 생쥐에서 얻은 데이터를 도시한다.
도 37은 다가 면역성을 유발하는 전체적인 방법을 도시한다.
본 발명의 구현예는 예를 들어, 타겟 세포에 특이적인 면역 세포를 생성하거나, 타겟 세포에 대한 효과적인 면역 반응을 지향하거나 또는 염증성 질환에 작용혹은 이를 치료하기 위한 방법과 조성물을 제공하는 것이다. 이 방법과 조성물은 예를 들어, 백신 및 치료제 등의 면역 조성물, 또한 예방 및 치료방법을 포함한다. 본 명세서에서는 항원의 형태, 서열 및 투여 적기를 선택하고 항원을 2차적 림프계 기관에 직접 전달함으로써 면역 반응의 강도뿐만 아니라 정성적 특징을 조정할 수 있다는 새로운 뜻밖의 발견에 대해 기술한다.
바람직한 구현예는 T 세포 반응을 유발 및 증폭하는 조성물과 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 이러한 방법은 면역원 코드화 핵산을 포함하는 조성물을 동물에 전달하는 비말 동반 단계를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 동물 신체의 여러 위치에 전달될 수 있으며 바람직하게는 림프계, 예를 들어, 림프절에 전달된다. 비말 동반 단계는 조성물을 1회 이상 전달, 예를 들어, 소정 기간 동안 혹은 소정 기간 동안 지속적인 형태로 분무하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 방법은 펩티드 면역원을 함유한 조성물을 투여하는 것을 포함하는 증폭 단계를 포함할 수 있다. 증폭 단계는 1회 이상, 예를 들어 소정 기간 동안 간격을 두고 1회 정맥주사 또는 소정 기간 동안 연속으로 행할 수 있다. 모든 구현예에 필요한 것은 아니지만 일부의 구현예는 면역강화제 혹은 보강제를 함유하는 조성물을 사용하는 것을 포함한다.
방법, 형태 및 조성물을 모두 포함하여 하기에 열거된 출원들의 내용 전반이 본원에 참고로 수록되어 있다: 2003년 6월 17일자 미국 가출원 제60/479,393호, 발 명의 명칭은 "제I류 MHC-제한 면역 반응의 조절방법" 이다; 2004년 6월 17일자 미국 출원 제10/871,707호(공개번호 제20050079152호), 2004년 12월 29일자 미국 가출원 제60/640,402호, 및 상기 출원과 동일자의 미국 출원 ......(공개번호 ....)(대리인 정리번호 제MANNK.047A호), 이들의 발명의 명칭은 공히 "예방 또는 치료를 목적으로, 제I류 MHC-제한 에피토프에 대한 면역반응을 유발, 향상 및 지속하는 방법" 이다; 2004년 6월 17일자 미국 출원 제10/871,708호(공개번호 제20050118186호), 발명의 명칭은 "각종 암 용도의 조성물에 함유된 종양 관련 항원의 조합물" 이다; 2004년 12월 29일자 미국 출원 제60/640,598호 및 상기 출원과 동일자의 미국 출원 ......(공개번호 ....)(대리인 정리번호 제MANNK.049A호), 이들의 발명의 명칭은 공히 "각종 암 용도의 조성물에 함유된 종양 관련 항원의 조합물" 이며, 이들의 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다. 또한, 다음의 출원들은 당해 분야의 공지 방법 및 조성물과 함께 사용할 수 있는 방법 및 조성물을 포함한다. 플라스미드 및 플라스미드 형태에 관한 원리는 미국 출원 제10/292,413호(공개번호 제20030228634 A1호)에 개시되었고 이는 "타겟 관련 항원의 에피토프를 코드화하는 발현벡터 및 그 형성 방법"을 발명의 명칭으로 하며, 그 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다. 또다른 방법, 조성물, 펩티드 및 펩티드 유사체는 다음의 출원들에 공지되어 있다: 2004년 6월 17일자 미국 가출원 제60/581,001호 및 미국 출원 제11/156,253호(공개번호 ....), 이들은 공히 "SSX-2 펩티드 유사체"를 발명의 명칭으로 하고, 그의 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있으며; 2004년 6월 17일자 미국 가출원 제60/580,962호 및 2005년 6월 17일자 미국 출원 제11/155,929호(공개번호 ....), 이들은 공히 "NY-ESO 펩티드 유사체"를 발명의 명칭으로 하고, 그의 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있으며; 또한 2002년 4월 4일자 미국 출원 제10/117,937호(공개번호 제20030220239호) 및 2003년 9월 5일자 제10/657,022호(공개번호 제20040180354호), 이들은 공히 "에피토프 서열"을 발명의 명칭으로 하고, 그의 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되었다.
어떤 구현예에서, 면역원의 특성 및 이것이 맞닥뜨릴 상황에 따라, 유발된 면역 반응은 이의 구체적인 활성 및 성질이 다를 수 있다. 특히, 펩티드로 면역화 하는 경우 세포독성 T 세포(CTL) 반응을 일으킬 수 있으며, 이 반응을 추가 주사로 더 증폭하려는 시도는 증폭 대신 조절 T 세포 군집을 확장하고 및 관찰가능한 CTL 활성을 감퇴시키는 방향으로 진행하기도 한다. 따라서, 별도의 면역강화 작용 없이, 림프절 내의 세포 표면에 고 MHC/펩티드 농도를 제공하는 조성물을 이용하면, 조절 혹은 관용원적 반응을 목적대로 향상시킬 수 있다. 이와 대조적으로, 앰플 면역강화 신호를 제공하는 면역 조성물 (예, 톨 유사 수용체 리간드 [또는 이들이 유발한 사이토킨/오토크린 인자])은 제한된 항원만을 제공하는 경우라도, 반응을 유발할 뿐 아니라 그대로 비말 동반하므로, 앰플 항원(예, 주사 펩티드)을 이용한 후속의 거동은 관측된 활성의 특징을 변경하지 않고도 반응을 증폭시킬 수 있다. 따라서, 일부의 구현예는 예를 들어 면역반응 프로파일, 수득된 반응의 종류 및 생성된 사이토킨의 종류 등을 조절하는 방법을 포함한다. 일부의 구현예는 CTL의 확장을 촉진하는 방법 및 조성물에 관한 것이고 또한, 예를 들어 CTL에 앞서서 조절 세포의 확장을 촉진하는 방법 및 조성물에 관한 구현예도 있다.
상술한 방법들은 펩티드만을 이용하거나 비말 동반 및 증폭법을 따르지 않는 다수의 프로토콜보다 유리하다. 상술한 바와 같이, 다수의 펩티드계 면역 프로토콜 및 벡터계 프로토콜은 여러 결함을 갖고 있다. 그럼에도 불구하고 성공할 경우, 펩티드계 면역 혹은 면역 증폭법은 다른 방법들 특히 예를 들어, 특정의 미생물 벡터보다 더 유리하다. 이는 더 복잡한 벡터, 예를 들어 생균 바이러스나 박테리아 벡터는 체내 복제 혹은 재조합시 유해한 부작용을 유발하기도 하며; 또는 벡터 자체에 대한 중화 항체를 발생함으로써 반복적인 투여시 비효율적으로 될 수 있다. 또한, 더 강한 면역원이 되도록 처리하는 경우, 펩티드는 ("교차 공정"에서 혹은 세포 감염 후에 단백질 또는 더 복잡한 항원을 이용함으로써) 프로테아좀 조절 과정을 피할 수 있다. 이는 제I류 MHC 제한 표시를 위한 세포형 항원 처리 과정이, 원하는 타겟에 상응하는 에피토프의 면역성을 방해할 우려가 있는 준우성 에피토프가 아닌 우성(선호적인) 에피토프를 선택하는 고유의 현상이기 때문이다. 결국, 효과적인 펩티드계 면역처리는 면역치료법 개발 과정을 단순화 및 단축할 수 있다.
따라서 효과적인 펩티드계 면역 증폭법 특히, 상술한 바와 같은 구체적인 내용을 포함하는 방법은 면역요법 (암 및 만성 감염증 치료를 위한)에 또는 예방 백신 접종 (특정의 감염성 질환에 대한)에 있어서 크게 유리하다. 또다른 장점은, 상술한 각종 구현예에서 활용되고 있는 번거롭거나 불안전하거나 또는 복잡한 보강 기술들을 동시에 사용하는 것을 피할 수 있다는 점이다.
정의:
별도의 언급이 없는 한 여기에서 기술된 다음과 같은 용어들은 본원의 상세한 설명에서 명시한 의미를 갖는 것으로 한다.
프로페셔날 항원 표시 세포 (pAPC) - T 세포 공동자극 분자를 보유하고 T 세포 반응을 유발할 수 있는 세포. pAPC의 특징이 뚜렷한 것으로 수지상 세포, B 세포 및 마크로파지 등을 포함한다.
주변 세포 - pAPC 가 아닌 세포
하우스키핑 프로테아좀 - 주변 세포에서 정상적으로 작용하고 pAPC에는 존재하지 않거나 강하게 작용하지 않는 프로테아좀
면역 프로테아좀 - pAPC에서 정상적으로 작용하는 프로테아좀; 면역 프로테아좀은 또한 감염된 조직이나 인터페론에 노출된 일부의 주변 세포에서도 작용한다.
에피토프 - 면역 반응을 자극할 수 있는 분자나 물질. 바람직한 구현예에서, 이 정의에 따른 에피토프는 특별히 한정되지 않으나, 폴리펩티드 및 폴리펩티드 코드화 핵산을 포함하고 상기 폴리펩티드는 면역 반응을 자극할 수 있다. 또다른 바람직한 구현예에서, 상기 정의에 따른 에피토프는 특별히 한정되지 않으나, 세포 표면에 존재하는 펩티드를 포함하고 이 펩티드는 T 세포 수용체(TCR)과 상호작용할 수 있도록 제I류 MHC의 결합 크래프트에 대해 비공유 결합 상태이다. 제I류 MHC에 의해 표시되는 에피토프는 미성숙 혹은 성숙 형태이다. "성숙" 이란, 하우스키핑 에피토프를 포함하거나 이것으로 구성된 선구물질 ("미성숙")과 구별되는 MHC 에피토프를 말하며, 또한 비제한적으로 단독 처리 또는 프로테오좀 소화, N-말단 트리 밍 또는 외인성 효소활성의 작용 등과 조합하여 처리함으로써 분리되는 1차번역 생성물에 존재하는 다른 서열들도 포함한다. 따라서, 성숙 에피토프는 다소 긴 폴리펩티드에 숨겨진 형태로 제공되며, 이 폴리펩티드의 면역능은 상기 에피토프에 일부 기인한다; 마찬가지로, 성숙 에피토프는 TCR에 의해 인식될 MHC 결합 크래프트 속에 결합하는 최종 형태로 제공될 수 있다.
MHC 에피토프 - 포유동물의 제I류 또는 제II류 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자를 위한 공지 혹은 예상되는 결합 친화력을 가진 폴리펩티드. 그 특징이 뚜렷한 제I류 MHC 분자를 표 1 내지 4에 나타낸다.
하우스키핑 에피토프 - 바람직한 구현예에서 하우스키핑 에피토프는, MHC 에피토프로서 하우스키핑 프로테아좀이 우세적으로 작용하는 세포 상에 출현하는 폴리펩티드 절편으로 정의된다. 또다른 바람직한 구현예에서, 하우스키핑 에피토프는 상술한 정의에 따른 하우스키핑 에피토프를 함유하는 폴리펩티드로 정의되며 1개 내지 수개의 다른 아미노산과 나란히 배치된다. 또다른 바람직한 구현예에서, 하우스키핑 에피토프는 상술한 정의에 따른 하우스키핑 에피토프를 코드화하는 핵산으로 정의된다. 하우스키핑 에피토프의 예는 다음의 출원에 공지되어 있다: 2002년 2월 25일자 미국 출원 제10/117,937호(공개번호 제20030220239 A1호), 2005년 2월 25일자 11/067,159호(공개번호 2005-0221440 A1호), 2005년 2월 25일자 11/067,064호(공개번호 제2005-0142144 A1호) 및 2003년 9월 5일자 10/657,022호(공개번호 제2004-0180354 A1호), 또한 2003년 5월 9일자 PCT 국제출원 PCT/US2003/027706호(공개번호 제WO2004/022709 A2호); 2001년 4월 6일자 미국 가출원 제60/282,211호; 2001년 11월 7일자 제60/337,017호; 2002년 3월 7일자 제60/363,210호; 및 2002년 9월 6일자 제60/409,123호. 이들은 공히 "에피토프 서열"을 발명의 명칭으로 하며, 그의 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되었다.
면역 에피토프 - 바람직한 구현예에서 면역 에피토프는, MHC 에피토프로서 면역 프로테아좀이 우세적으로 작용하는 세포에 출현하는 폴리펩티드 절편으로 정의된다. 또다른 바람직한 구현예에서, 면역 에피토프는 상기 정의에 따른 면역 에피토프를 함유하는 폴리펩티드로 정의되며 1개 내지 수개의 또다른 아미노산과 나란히 배치된다. 또다른 바람직한 구현예에서 면역 에피토프는, 에피토프 클러스터 서열을 포함하고 제I류 MHC에 대해 공지 혹은 예상된 친화력을 가진 2개 이상의 폴리펩티드 서열을 함유한 폴리펩티드로 정의된다. 그 밖의 또다른 바람직한 구현예에서 면역 에피토프는 상술한 정의에 따른 면역 에피토프를 코드화하는 핵산으로 정의된다.
타겟 세포 - 바람직한 구현예에서 타겟 세포는, 예를 들어, 바이러스나 기타 세포내 기생물에 감염된 세포 혹은 종양 세포 등의 면역계 성분들에 의해 작용할 수 있는 병원성 조건에 관련된 세포이다. 또다른 구현예에서, 타겟 세포는 본 발명의 백신 및 방법에서 타겟이 되는 세포이다. 상기 정의에 따른 타겟 세포의 예는 특별히 한정되지 않으나: 종양 세포 및, 세포내 기생물, 예를 들어 바이러스, 박테리아 또는 프로토조아 등이 들어있는 세포를 포함한다. 타겟 세포는 또한, 적절한 에피토프 분리를 측정 또는 확인하는 분석법의 일부인 CTL의 타겟이 되고 또한, 원하는 에피토프에 대한 면역성 혹은 T 세포 특이성을 측정하기 위한 세포 발현 면역 프로테아좀에 의해 처리되는 세포도 포함할 수 있다. 이러한 세포는 해당 서열을 발현하도록 변형되거나 펩티드/에피토프에 의해 간단히 펄스 처리된다.
타겟-관련 항원 (TAA) - 타겟 세포에 존재하는 단백질이나 폴리펩티드.
종양-관련 항원 (TuAA) - 타겟 세포가 종양 세포인 TAA.
HLA 에피토프 - 인간 제I류 또는 제II류 HLA 복합 분자에 대한 공지 혹은 예상되는 결합 친화력을 가진 폴리펩티드. 특히 그 특징이 뚜렷한 제I류 HLA를 표 1 내지 4에 나타낸다.
항체 - 자연 면역글로부린(Ig), 폴리- 또는 모노클로날 혹은 Ig 결합 도메인의 전체 혹은 일부를 구성하는 분자는 생화학적으로 유발되거나 재조합 DNA 또는 기타의 수단에 의해 형성된다. 이것의 예로서 특히 F(ab), 단일쇄 Fv, 및 Ig 가변 영역-파지 피복 단백질 융해물을 포함한다.
실질적 유사성 - 이 용어는 서열 실험으로 결정된 바와 같이 비논리적 방식에 따라 기준 서열과 상이한 서열을 뜻한다. 동일한 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 서열은 분해 위치에서의 상이점 혹은 비코드화 영역의 길이나 조성에 있어서의 소소한 차이점에도 불구하고 실질적으로 유사하다. 보존적 치환이나 소길이 변화에 의해서만 달라지는 아미노산 서열은 실질적으로 유사하다. 또한, N-말단 배치 잔사의 갯수가 상이한 하우스키핑 에피토프, 또는 면역 에피토프 및 어느 말단의 배치 잔사의 갯수가 상이한 에피토프 클러스터를 포함하는 아미노산 서열도 실질적으로 유사하다. 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 코드화하는 핵산 자체도 실질적으로 유사하다.
기능적 유사성 - 이 용어는 생물학적 혹은 생화학적 성질의 실험에 의해 결정된 바와 같이 비논리적 방식에 따라 기준 서열과 상이한 서열에 관한 것이나 상기 서열은 실질적으로 유사하지 않을 경우도 있다. 예를 들어, 두개의 핵산을 동일한 서열에 대해 교배 탐식자로 이용할 수 있으며 또한 서로 다른 아미노산 서열도 코드화한다. 교차-반응성 CTL 반응을 유발하는 두개의 펩티드는 비논리적 아미노산 치환에 의해 서로 달라지더라도 (또한 실질적인 동일성 정의의 범주에 속하지 않더라도) 기능적으로 유사하다. 동일한 에피토프를 인식하는 항체쌍 또는 TCR는, 구조적 차이가 존재함에도 불구하고 기능적으로 서로 유사하다. 면역 기능의 유사성에 관한 시험은 "변경된" 항원으로 면역한 후 유발된 반응 즉, 특별히 한정되지는 않으나 항체 반응, CTL 반응, 사이토킨 생성 등을 포함하는 반응의 능력을 시험하여 타겟 항원을 인식함으로써 수행된다. 따라서, 두개의 서열은 특정 측면에서 서로 상이하지만 여전히 동일한 기능을 유지하도록 설계한다. 본 발명에 따른 서열의 상기 설계된 서열 변이체가 본 발명의 구현예에 포함된다.
발현 카세트 - 프로모터 및 기타 전사 및 번역 제어 요소, 즉 특별히 한정되지는 않지만, 인핸서, 종결 코돈, 내부 리보좀 입력 부위 및 폴리아데닐화 부위에 결합 조작된 폴리펩티드 코드화 폴리누클레오티드 서열을 뜻한다. 카셋트는 또한 한 숙주 분자에서 또다른 숙주 분자로 쉽게 이동시키는 서열을 포함한다.
삽입 에피토프 - 어떤 구현예에서 삽입 에피토프는 더 긴 폴리펩티드에 전체가 함유된 에피토프이고, 또한 또다른 구현예의 경우 더 긴 폴리펩티드에 있어서 에피토프 전체가 내부 위치에 존재하지 않도록 하는 방식으로 N-말단 또는 C-말단 이 삽입되는 에피토프를 포함할 수 있다.
성숙 에피토프 - 에피토프가 MHC 펩티드 결합 크레프트에 결합될 때 존재하는 것 이외의 다른 서열을 갖지 않은 펩티드.
에피토프 클러스터 - 폴리펩티드 또는 이를 코드화할 핵산 서열 즉, 자연 단백질 서열을 포함한 자연 단백질 서열의 시그먼트로서 공유된 MHC 제한 요소에 대한 결합 친화력을 가진 2개 이상의 공지 혹은 예상된 에피토프를 함유한다. 바람직한 구현예에서 상기 클러스터 내의 에피토프의 밀도는 완전한 단백질 서열 내의 공유 MHC 제한 요소에 대한 결합 친화력을 가진 모든 공지 혹은 예상된 에피토프의 밀도보다 크다. 에피소드 클러스터는 2000년 4월 28일자 미국 출원 제09/561,571호에 더욱 상세히 기술되어 있으며, 그의 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다.
분리 서열 - 활성, 예를 들어, 면역 프로테아좀 활성, N 말단 트리밍 및/또는 다른 과정이나 활성을 단독 혹은 조합하여 포함하는 활성을 가공하여 하우스키핑 에피토프가 분리되는 근거를 제공하는 더 큰 서열에 구현된 하우스키핑 에피토프를 포함하거나 코드화하는 설계 혹은 가공된 서열.
CTLp - CTL 선구물질은 세포독성 활성을 표현하도록 유도될 수 있는 T 세포이다. CTLp를 관측하는 수단인 2차 체외 용해 활성은 자연 효력 및 기억 CTL의 조합체로부터 체내 야기할 수 있다.
기억 T 세포 - 체내 위치에 관계없이, 항원에 의해 사전 활성화 되었으나 이펙터 기능을 얻기 위해 항원에 대한 재노출을 필요로 하는 정지기의 생리학적 상태 에 있는 T 세포이다. 표현형으로서 이것은 통상 CD62L-CD44hi CD107α-IGN-γ-LTβ-TNF-α- 이고 세포 주기의 G0에 속한다.
효과기 T 세포 - 항원과 만나면 효과기 기능을 쉽게 표현하는 T 세포이다. 효과기 T 세포는 보통 림프계를 빠져나와 면역학적 주변부에 들어갈 수 있다. 표현형으로서 이것은 통상 CD62L-CD44hi CD107α+IGN-γ+LTβ+TNF-α+ 이고 활성 순환한다.
효과기 기능 - 일반적으로 세포독성 활성 및/또는 사이토킨 분비를 달성하는 것을 포함하는 T 세포 활성화.
T 세포 반응의 유발 - 다수의 구현예에서, 자연형 또는 경우에 따라 정지기 세포로부터 T 세포를 발생하고; 이를 활성화하는 과정을 포함한다.
T 세포 반응의 증폭 - 다수의 구현예에서, 세포수, 활성화된 세포의 수, 활성 레벨, 증폭율 또는 특정 반응에 수반된 T 세포의 유사 변수를 증대시키는 과정을 포함한다.
비말 동반 - 다수의 구현예에서, 유발된 T 세포 혈통의 면역 프로파일에 대한 안정성을 부여하는 유도과정을 포함한다. 각종 구현예에서 "비말 동반"은 "유발" 또는 "개시"에 상응하는 의미이다.
톨-유사 수용체 (TLR) - 톨 유사 수용체(TLRs)는 미생물 및 숙주 분자의 특정 성분에 의해 활성화되는 동류의 패턴 인식 수용체이다. 선천적 면역계의 일부로서 이것은 다수의 변원체에 대한 제1 방어선 역할을 하는 것과 함께 적응 면역성에도 기여한다.
톨-유사 수용체 (TLR) 리간드 - 톨-유사 수용체를 결합 및 활성화할 수 있는 분자. 비제한적인 예를 들면, 인터페론을 유도하는 것으로 알려진 폴리 IC A 합성 2중 나선 RNA 이 있다. 이 폴리머는 폴리이노신산 및 폴리사이티딜산 중 하나의 나선, 2중 나선 RNA, 메틸화되지 않은 CpG 올리고데옥시리보누클레오티드 또는 다른 면역자극 서열(ISSs), 리포폴리사카라이드(LPS), β-글루칸, 이미다졸 퀴놀린 및 이들의 유도체와 유사체 중 하나로 구성된다.
면역강화용 보강제 - pAPC 나 T 세포, 예를 들어: TLR 리간드, 세포내-패턴 인식 수용체(PRR) 리간드, 키라야 사포닌, 투카레졸, 사이토킨 등을 포함하는 세포를 활성화하는 보강제. 바람직한 보강제는 Marciani, D.J. Drug Discovery Today 8:934-943, 2003의 문헌에 공지되어 있으며 그의 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다.
면역자극 서열 (ISS) - 메틸화되지 않은 CpG 서열을 함유하는 올리고데옥시리보누클레오티드. CpG는 또한 박테리아 형성된 DNA, 특히 플라스미드에 구현된다. 또 다른 구현예는 다양한 유사체를 포함하며; 바람직한 구현예는 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합 또는 비생리적 염기를 가진 분자이다.
백신 - 바람직한 구현예에서 백신은 질병을 예방하거나 예방을 돕는 면역 조성물일 수 있다. 다른 구현예에서, 백신은 질병을 치료하거나 치료를 돕는 조성물이다. 또한 다른 구현예에서 백신 조성물은 질병을 완화시키거나 완화를 도울 수 있다. 그 밖의 또다른 구현예에서 백신 면역 조성물은 치료제 및/또는 예방제로 사용할 수 있다.
면역 - 질병의 부분적 또는 완전한 예방을 유도하는 방법. 또는 항원에 대한 면역계 반응을 유발 또는 증폭시키는 방법. 두번째 정의에서, 이것은 예방 면역 반응, 특히 프로-염증성 혹은 활성 면역 및 조절 반응도 포함한다. 따라서, 어떤 구현예에서 면역은 내성과 구분되며 (면역계가 프로염증성 혹은 활성 면역의 생성을 피하는 과정) 또다른 구현예에서는 내성을 포함한다.
표 1
I류
MHC
분자
제I류
인간
뮤린 (생쥐)
래트
RT1.Aa
RT1.A1
보빈 (소)
Bota-A11
Bota-A20
닭
B-F4
B-F12
B-F15
B-F19
침팬지
Patr-A*04
Patr-A*11
Patr-B*01
Patr-B*13
Patr-B*16
개코원숭이
Papa-A*O6
머카크
Mamu-A*01
스윈 (돼지)
SLA (haplotype d/d)
바이러스 호모로그
제I류 hCMV 호모로그 UL18
표 2
제I류
MHC
분자
제I류
인간
뮤린 (생쥐)
래트
RT1.Aa
RT1.A1
보빈 (소)
Bota-A11
Bota-A20
닭
B-F4
B-F12
B-F15
B-F19
바이러스 호모로그
제I류 hCMV 호모로그 UL18
표 3
HLA
-A 항원의 유전자 빈도 측정값
a유전자 빈도
b표준 편차
표 4
HLA
-B 항원의 유전자 빈도 측정값
a유전자 빈도. b표준 편차. c관측된 유전자수는 0
표 5
CT
유전자 목록
*
* 참조: Scanlan et al. "암/고환 유전자: 검토, 표준화 및 논의", Cancer Immunity, Vol. 4, p.1 (2004년 1월 23일), 그의 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다.
다음의 연구 검토는 본 발명의 조작 측면을 더 구체적으로 이해하기 위한 것 이다. 그러나 이러한 검토가 본 발명의 특허청구 범위에 기술되지 않은 조작에 관한 기타의 세부적 이론으로 한정하는 것은 아니다.
종양 형성 과정 또는 미생물 감염을 효과적으로 면역 조절하는 것은 이동, 효과기 기능 및 기억 세포로의 미분화 같은 복수의 능력이 부여된 항원 특이적 T 세포의 유발 및 확장을 수반한다. 면역 반응의 유발은 여러가지 방법으로 시도할 수 있으며 상이한 형태, 면역 반응의 강도 및 질적 수분에 대한 가변적 영향을 갖는 항원의 투여를 수반한다. 면역 반응의 조절을 달성하는데 한가지 제한 요인은 결과로 나온 에피토프를 처리 및 특이적 T 세포에 제공할 수 있는 타겟 pAPC 이다.
이 문제를 해결하는 한가지 방법은 pAPC 및 T 세포에 풍부한 미세환경인 2차 림프계 기관으로 항원을 직접 전달하는 것이다. 항원은 예를 들어, 각종 벡터에 의해 폴리펩티드나 발현 항원으로서 전달된다. 면역 강도 및 특성 측면의 결과는 예를 들어, 투약량, 제형, 벡터의 성질 및 분자 환경 등을 포함한 변수들에 의해 제어될 수 있다. 본 발명의 구현예는 면역 반응의 제어를 향상시킬 수 있다. 면역 반응의 제어는 예를 들어, 조절 반응 내지 프로-염증성 반응까지 필요에 따라 상이한 면역 반응을 유발하는 능력을 포함한다. 바람직한 구현예는 활성 면역요법에 중요한 역할을 하는 제I류 MHC 제한 에피토프에 대한 반응의 강도 및 특성을 제어하는 개선된 방법을 제공한다.
종래의 면역 방법은 몇가지 중대한 한계점을 노출했다: 첫째, 백신의 농도 결정을 한가지 또는 극히 제한된 초감수성 판독 분석 결과로부터 얻은 면역성 데이터로부터 외삽처리하는 경우가 잦다. 흔히, 백신법에서의 농도 추정에도 불구하고, 임상적 반응은 주목할만한 결과가 아니었거나 평범한 수준이었다. 둘째로, 면역후 통상의 T 효과기 세포를 따라 T 조절 세포가 생성 및/또는 확장할 수 있으며 이러한 세포는 원하는 면역 반응을 방해할 수 있다. 활성 면역요법에 있어서 상기 메카니즘의 중요성은 최근에서야 인식되었다.
면역원의 결절내 투여는 면역 반응의 강도와 프로파일을 제어하는 기초를 제공한다. 이러한 투여 결과로서 달성된 pAPC을 효율적으로 체내 공급함으로써 심지어 가장 간단한 형태의 항원- 펩티드 에피토프 -을 사용하더라도 적절한 면역 강도를 얻을 수 있으며, 이러한 형태의 항원이 아니면 약동학적 성질이 열화하는 것이 보통이다. 반응 효과는 또한 면역원의 성질, 벡터 및 면역 프로토콜을 통해 제어할 수 있다. 이러한 프로토콜은 만성적 감염 또는 종양 형성 과정에서 반응을 향상/변화시키는데 적용된다.
면역은 전통적으로 면역 반응의 강도를 증대하기 위하여 항원을 반복 투여하는 것에 의존했다. DNA 백신을 사용하면 고효율의 반응을 달성하나, 반응의 강도는 증폭약을 반복 투여해도 높은 값을 얻기 어려웠다. 이러한 두가지 특성 즉, 고효율과 저강도는 이들 벡터로 달성한 MHC 상의 에피토프 부하(loading) 레벨이 비교적 낮은 것이 원인이기 쉽다. 반면, 임상적으로 필요한 수준의 높은 반응 강도를 달성하기 위해서는 생바이러스 벡터에 코드화된 항원을 이용하여 이러한 백신을 증폭하는 것이 더욱 보편화되었다. 그러나, 생벡터(live vectors)를 이용하면 안전성 문제, 선투여에 의해 유발된 벡터에 대한 체액 반응으로 인한 후증폭의 효과 감소, 및 발생 및 제조 비용 등과 같은 여러가지 문제점을 동반할 수 있다. 따라서, 생벡 터나 DNA의 단독 사용은 비록 고효율의 반응을 유도할지라도 반응 강도 또는 그의 유지가 제한되는 결과를 가져올 수 있다.
본 명세서에서 기술하는 구현예는 펩티드에 적용시 효율적인 면역 치료 수단으로 이용한 방법 및 프로토콜에 관한 것이다. 이 방법은 저 PK의 펩티드를 사용하지 않으며, 특이적 및 통상적으로 복합적인 처방에 적용할 경우 면역 반응을 활성 증폭 및/또는 제어하는 결과를 가져온다. 바람직한 구현예에서, 림프계 기관에 펩티드를 직접 투여하면, 강하거나 중간 혹은 약한 면역 반응 (종래 기술에 의한 검출 레벨이거나 그보다 낮을 때)을 유발하는 것으로 Tc1 세포로 구성된 프라이밍제를 사용함에 따라 면역 반응이 예상외로 강하게 증폭한다. 본 발명의 바람직한 구현예는 모든 면역단계에서 항원의 림프내 투여를 택할 수 있는 한편, 림프내 투여는 보강제 무함유 펩티드에 관련한 가장 바람직한 투여 방식이다. 림프내 투여를 이용한 펩티드 증폭은 이미 유발된 기존의 면역 반응에 적용할 수 있다. 사전 유발은 항원에 대한 자연 노출이나 또는 피하주사, 피내주사, 복강주사, 근육주사 및 점막 투여에 제한없이 널리 이용하는 투여 경로를 통해 일어날 수 있다.
또한 여기에서 보인 바와 같이, 특이적 T 세포의 추후 확장을 가져오는 최적의 개시 작용은 풍부한 공동자극 환경(림프절 등)에서 자연 T 세포를 한계량의 항원에 노출함으로써 더 우수하게 달성할 수 있다. 이 결과, 항원 표시 세포에 대한 MHC-펩티드 복합체를 고친화성으로 인식하는 T 세포 수용체를 운반하는 T 세포가 활성화되며, 또한 후속의 자극에 더 반응성이 큰 기억 세포를 발생할 수 있다. 유익한 공동자극 환경은 면역강화제를 이용함으로써 더 증대하거나 확보될 수 있으 며, 따라서 림프내 투여가 유리하지만 면역 반응의 개시에 필요한 모든 구현예에 이용되는 것은 아니다. 유발/비말 동반을 위한 에피토프형 펩티드를 사용하는 구현예에서, 비교적 저약량의 펩티드 (증폭량이나 MHC 포화 농도와 비교하여)를 사용함으로써, 특히 직접적인 림프내 투여를 이용할 경우 항원 제시를 제한한다. 이러한 구현예는 보통 비말 동반을 성취하기 위해 면역강화제를 수반한다.
저약동학의 유리 펩티드는 대부분의 투여 경로에 사용하는데 지장이 있었지만, 2차 림프계 기관 특히 림프절에 대한 직접 투여는 연속식 주입 혹은 다량의 주사(예를 들면 일일 주사)로 계속해서 항원 레벨을 유지할 때 효율적인 것으로 입증되었다. CTL 생성을 위한 결절내 투여는 다음의 출원에 기술되어 있다: 미국 출원 제09/380,534호, 현재 미국 특허 제6,977,074호로 등록된 제09/776,232호(공개번호 제20020007173 A1호), 및 2005년 12월 19일자 미국 출원....호(공개번호....)(대리인 정리번호 제MANNK.001CP2C1호), 및 PCT 출원 제PCT/US98/14289호(공개번호 제WO 9902183 A2호). 이들 공히 "CTL 반응을 유발하는 방법"을 발명의 명칭으로 하며 그 내용 전반이 본 명세서에 참고로 수록되어 있다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 펩티드의 결절내 투여는 플라스미드 DNA 백신으로 초기 유발한 반응을 증폭하는데 효과적이었다. 더욱더, 사이토킨 프로파일은 플라스미드 DNA 유발/펩티드 증폭으로 뚜렷해졌으며 그 결과, DNA/DNA 또는 펩티드/펩티드 프로토콜보다 케모킨(화학유인 사이토킨)은 증가하고 면역억제 사이토킨은 감소한다.
따라서, 이러한 DNA 유발/펩티드 증폭 프로토콜은 암 및 만성 감염 치료백신을 포함한 조성물의 효과를 개선할 수 있다. 이러한 면역치료에 유리한 에피토프 선택 원리는 다음의 미국 출원에 기술되어 있다: 미국 출원 제09/560,465호, 제10/026,066호(공개번호 제20030215425 A1호), 2001년 11월 7일자 제10/005,905호, 2004년 7월 20일자 10/895,523호(공개번호 제2005-0130920 A1호) 및 2004년 7월 20일자 10/896,325호(공개번호 ....), 이들 공히 "항원 표시 세포의 에피소드 동기화"를 발명의 명칭으로 한다; 제09/561,074호(현재 미국특허 제6,861,234호) 및 2004년 10월 1일자 제10/956,401호(공개번호 제2005-0069982 A1호), 이들 공히 "에피토프 발견 방법"을 발명의 명칭으로 한다; 2000년 4월 28일자 제09/561,571호, 발명의 명칭은 "에피토프 클러스터" 이다; 2002년 3월 7일자 제10/094,699호(공개번호 제20030046714 A1호), 2005년 6월 30일자 제11/073,347호(공개번호 ....), 이들 공히 "암 용도의 항신혈관 제조방법"을 발명의 명칭으로 한다; 및 2002년 4월 4일자 제10/117,937호(공개번호 제20030220239 A1호), 2005년 2월 25일자 11/067,159호(공개번호 제2005-0221440 A1호), 제10/067,064호(공개번호 제2005-0142114 A1호), 제10/657,022호(공개번호 제2004-0180354 A1호) 및 PCT 출원 제PCT/US2003/027706호(공개번호 제WO 04/022709 A2호), 이들 공히 "에피토프 서열"을 발명의 명칭으로 하며, 그 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다. 벡신 플라스미드의 전체 설계 측면은 다음의 출원에 개시되어 있다: 2000년 4월 28일자 미국 출원 제09/561,572, 2002년 8월 20일자 10/225,568호(공개번호 제2003-0138808 A1호), 이들 공히 "타겟-관련 항원의 에피토프를 코드화하는 발현 벡터"를 발명의 명칭으로 한다; 미국 출원 제10/292,413호(공개번호 제20030228634 A1호), 제10/777,053호(공개번호 제20004-0132088 A1호), 2004년 4월 30일자 제 10/837,217(공개번호 .....), 이들 공히 "타겟-관련 항원의 에피토프를 코드화하는 발현 벡터 및 그의 설계 방법"을 발명의 명칭으로 한다; 제10/225,568호(공개번호 제2003-0138808 A1호), PCT 출원 제 PCT/US2003/026231호(공개번호 제WO 2004/018666), 미국특허 제6,709,844호 및 2003년 5월 13일자 미국 출원 제10/437,830호(공개번호 제2003-0180949 A1호), 이들 공히 "플라스미드 증폭에서 불필요한 증폭 중간체의 회피방법"을 발명의 명칭으로 하며, 그 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다. 특정 암에 대한 면역 반응을 지향하는데 유리한 특이적 항원 조합물은 다음의 출원에 개시되어 있다:2003년 6월 17일자 미국 가출원 제60/479,554, 2004년 6월 17일자 미국 출원 제10/871,708호(공개번호 제2005-0118186 A1호), PCT 출원 제PCT/US2004/019571호(공개번호 제WO 2004/112825), 2005년 12월 29일자 미국 가출원 제60/640,598, 및 이것과 동일자로 출원된 미국 출원......(공개번호.....)(대리인 정리번호 제MANNK.049A), 이들 공히 "각종 암에 대한 백신에 함유된 종양 관련 항원의 조합물"을 발명의 명칭으로 하며, 그 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다. BRM의 림프내 투여 방법 및 그의 장점은 다음의 출원에 개시되어 있다: 2005년 12월 29일자 미국 가출원 제60/640,727호, 이것과 동일자로 출원된 미국 출원....(공개번호....)(대리인 정리번호 제MANNK.046A호), 이들 공히 "림프계 기관에 생물학적 반응 변형체를 타겟 투여함으로써 면역 반응을 트리거, 유지 및 조정하는 방법"을 발명의 명칭으로 하며, 그 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다. 그 밖의 방법, 조성물, 펩티드 및 펩티드 유사체는 다음의 출원에 개시되어 있다: 2001년 11월 7일자 미국 출 원 제09/999,186호, 발명의 명칭은 "항원 상용화방법"이다; 2005년 12월 29일자 미국 가출원 제60/640,821호, 이것과 동일자로 출원된 미국 출원....(공개번호...)(대리인 정리번호 제MANNK.048A호), 이들 공히 "면역 반응의 유발시 CD4+ 세포를 바이패스하는 방법"을 발명의 명칭으로 하며, 그 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다.
다른 관련 내용들은 다음의 출원에 개시되어 있다: 2005년 6월 17일자 미국 출원 제11/156,369호(공개번호...) 및 가출원 제60/691,889호, 이들 공히 "에피토프 유사체"를 발명의 명칭으로 하며, 그 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다. 또한 관련 내용은 다음의 출원에 개시되어 있다: 2005년 6월 17일자 미국 가출원 제60/691,579호, 발명의 명칭은 "암 세포 및 종양 기질에 발현된 우성 및 준우성 에피토프에 대한 다가 면역 반응을 유발하는 방법 및 조성물" 이다; 2005년 6월 17일자 미국 가출원 제60/691,581호, 발명의 명칭은 "칼시노마 용도의 다가 비말 동반 및 증폭 면역치료제" 이며 그 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다.
뜻밖에도, 전통적인 프라임-증폭 스케줄에 따라 펩티드를 결절내 반복 주사하면 초기 투약후 관측된 반응과 비교시 세포독성 반응의 강도가 감소했다. 면역 반응 프로파일의 실험에서 상기 결과는 무반응이 아닌 면역 조절(억제)을 유발했기 때문이다. 이는 대조적으로, DNA-코드화 면역원, 보통은 플라스미드를 강조하는 프로토콜을 유발 및 증폭한다. 결절내 항원 투여에 의한 pAPC의 직접 부하는 일반적으로 보강제에 대한 필요성을 감소시키거나 아예 없앤다. 이러한 보강제 결여는 통 상 프로염증성이라고 하며, 펩티드 면역으로 관측된 것과는 다른 면역 반응 프로파일(예, 조절 면역 혹은 관용원 면역)의 유도를 촉진할 수 있다. 하기 실시예에서 보는 바와 같이 초기 주사 부위에서 멀리 떨어진 2차 림프계 기관에서 반응을 측정하므로 그 결과는 진행중인 면역성 반응을 변화(억제)시키는 본 발명의 구현예에 따르는 사용 방법 및 조성물을 뒷받침한다. 이 접근은 동일한 항원을 타겟화 하거나 또는 염증 부위와 관련된 기타 적절한 항원을 타겟으로 하고 면역억제 사이토킨에 의해 조정되는 주변인 효과에 근거하여 제II류 MHC 제한 원인을 가진 염증성 질환에도 유용하다.
펩티드 반복 투여로 점차 세포독성 면역 반응이 감소하는 결과에도 불구하고, 복제불가능 재조합 DNA(플라스미드) 같은 작용제로 유도하면, 실질적으로 후속의 약에 영향을 미쳐 재조합 DNA 및 펩티드에 의해 발현된 에피토프에 대해 외형적 면역 증폭이 가능하며 또한 이의 세포독성을 유발할 수 있다. 실제로, 재조합 DNA 벡터나 펩티드의 단일 또는 복수 투여시 면역 반응이 일어나지 않거나 약간 일어나는 것에 그쳤고 DNA로 유발 및 펩티드로 증폭하면 더욱 큰 반응을 얻을 수 있었다. 이러한 반응은 반응율 및 반응 강도로 표시된다. 하기의 실시예에서, 재조합 DNA 유발/펩티드-증폭 프로토콜을 이용하면 반응율은 2배 이상, 반응 강도(평균 및 중간값)는 3배 이상이었다. 따라서, 바람직한 프로토콜은 림프계 및 비림프계 기관에서 항원성 세포를 체내에서 처리할 수 있는 면역성(Tc1 면역성)을 유도한다. 대부분 암 면역치료에서 제한 요인 중 하나는, MHC/펩티드 제시의 감소로 인하여 생길 가능성이 있는 면역 조절된 공격에 대한 종양세포의 감수성이 제한적이라는 것이 다. 바람직한 구현예에서, 외형적 면역 확대는 전염성이 큰 세균에 의해 감염되었을 때 관측되는 면역 반응과 대체로 같거나 이를 초과하는 강도의 DNA 유발/펩티드 증폭에 의해 달성된다. 강도 증가는 낮은 MHC/펩티드 제시도를 보상하는데 도움이 되고, 예를 들어 HLA 형질전환 생쥐 같은 특수한 임상전 모델에서 보는 바와 같이 인간 종양 세포가 소거되는 결과를 가져온다.
재조합 DNA 비말 동반약의 특이적 서열 및 림프계 기관에 투여된 펩티드 증폭약을 동반한 상기 유발 및 증폭 프로토콜은 따라서, 강한 T 세포 반응의 유발, 증폭 및 유지를 위하여, 예를 들면, 감염성 질환이나 종양 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 이러한 질환은 육종류(예, 신장, 난소, 유방, 폐, 직장, 전립선, 두경부, 방광, 자궁, 피부 등), 멜라노마, 기타 기관의 종양 특히, 태야종양(예, CEA, CA 19-9, CA 125, CRD-BP, Das-1, 5T4, TAG-72 등), 조직 미분화(예, 멜란-A, 티로시나제, gp100, PSA, PSMA 등) 또는 암-고환 항원(예, PRAME, MAGE, LAGE, SSX2, NY-ESO-1 등, 표 5 참조) 등과 같은 특정 혹은 특정가능한 종양 관련 항원들을 발현하는 암류를 포함할 수 있다. 암-고환 유전자 및 암치료에 대한 이들의 관계는 공지 문헌에서 검토한 바가 있다 (참조: Scanlon et al, Cancer Immunity 4:1-15,(2004), 그 내용의 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다.) 종양 신혈관계에 관련된 항원(예, PSMA, VEGFR2, Tie-2)은 또한 2005년 6월 30일자 미국 출원 제10/094,699호(공개번호 제20030046714 A1호) 및 제11/073,347호(공개번호 .....)에서 기술된 바와 같이 암질환에 대해 유용하다. 상기 출원은 공히 "암 용도의 항 신혈관계 조제물"을 발명의 명칭으로 하며 이의 내용 전반은 본 명세서에 참 고로서 수록되어 있다. 본 발명의 방법과 조성물은 각종 유기체 및 질병 상태를 타겟으로 한다. 예를 들면, 타겟 유기체는 박테리아, 바이러스, 프로토조아, 진균 등을 포함할 수 있다. 타겟 질병은 예를 들어, 프라이온에 의해 생긱 것들을 포함할 수 있다. 타겟 유기체, 세포 및 질병과 관련된 예시적인 질병, 유기체 및 항원과 에피토프는 현재 미국 특허 제6,977,074호로 등록된 미국 출원 제09/776,232호(공개번호 제20020007173 A1호)에 개시되었으며, 이의 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다. 대상으로 하는 감염성 질환 중에는 만성적 염증을 일으키는 경향이 있는 작용제가 원인이 되는 것들(HIV, 단순포진 바이러스, CMV, B형 및 C형 간염 바이러스, 파필로마 바이러스 등) 및/또는 급성 염증과 관계있는 것들(예, 인플루엔자 바이러스, 홍역, RSV, 에볼라 바이러스 등)도 포함된다. 관심의 대상이 되는 바이러스는 발암 가능성이 있는 - 예방이나 치료 측면에서 - 바이러스로 예를 들면, 파필로마 바이러스, 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스 및 HTLV-1 등이 있다. 이러한 감염성 작용제는 모두 펩티드 에피토프 같은 조성물을 설계하기 위한 기초로 이용할 수 있는 한정된 혹은 한정가능한 항원을 갖는다.
이러한 방법의 바람직한 응용 분야는 (도 19 참조) 재조합 DNA를 복수회 투여하고 (예, 1 내지 10회 이상, 2 내지 8회, 3 내지 6회, 바람직하게는 약 4 또는 5회)(투약량의 범위는 0.001 내지 10mg/kg, 바람직하게는 0.005 내지 5mg/kg) 그 후 1회 이상(바람직하게는 약 2회)의 펩티드를 바람직하게는, 면역 측면에서 불활성인 비히클 또는 제형(투약량의 범위는 1ng/kg 내지 10mg/kg, 바람직하게는 0.005 내지 5mg/kg)과 함께 투여함으로써 하나 이상의 림프절에 주사 혹은 주입하는 것을 포함한다. 상기 투약량은 대상체의 크기와 반드시 비례할 필요는 없으며, 인간의 경우 상기 투약량의 범위에서 낮은 쪽이고 생쥐의 경우는 높은 쪽이다. 주사 투여시 바람직한 플라스미드 및 펩티드의 농도는 대체로 0.1㎍/ml 내지 10mg/ml 이고 가장 바람직한 것은 약 1mg/kg 이며, 대상체의 크기나 종류와는 무관한 것이 보통이다. 그러나, 특히 효능이 있는 펩티드는 상기 투약량의 범위 중 하위 부분에서 최적의 농도 예를 들어, 1 내지 100㎍/ml의 농도를 가질 수 있다. 펩티드 단독의 프로토콜을 이용하여 허용량을 상기 범위의 상단 쪽으로 이동 촉진하는 것이 바람직하다 (예, 0.5 내지 10mg/ml). 이 순서를 강한 체내 면역 반응을 유지하는데 필요한 만큼 반복할 수 있다. 또한 DNA의 최종 비말 동반량 및 펩티드의 최초 증폭량 간의 시간 간격은 중요하지 않다. 바람직하게는 약 7일 이상, 심지어 수개월을 넘기도 한다. DNA 및/또는 펩티드를 주사하는 횟수는, 최종 수일간(바람직하게는 2 내지 7일간) 주입물을 교체하면 줄일 수 있다. 주사할 때와 유사한 정맥주사액으로 주입을 시작하고 그 뒤 저속 주입 (DNA의 경우 24 내지 12000㎕/일 으로 약 25 내지 2500㎍/일, 펩티드의 경우 0.1 내지 10,000㎍/일)하는 것이 바람직하다. 이것은 수작업으로 또는 인슐린 펌프 같은 프로그램형 펌프를 이용하면 달성할 수 있다. 이러한 펌프는 공지되어 있으며 구현예에서 요구하는 바에 따라 주기적 스파이크나 기타의 투약 프로파일이 가능하다.
본 발명은 하나 이상의 유발약을 투여한 후 하나 이상의 증폭약을 투여하는 것을 포함하는 1주기형 면역 방법에 대해 설명하였다. 본 발명의 다른 구현예는 반복 주기형 면역 방법도 포함한다. 이러한 반복 주기는 반응 강도를 증대시키기 위 해 이용할 수 있다. 또한 다가 반응을 원할 때 개별 대상 모두가 1주기형 면역의 결과로 타겟 항원 각각에 대한 실질적 반응을 달성해야 하는 것은 아니다. 면역 주기는 특정의 개별 대상이 각 타겟 항원에 대해 적절한 반응을 나타낼 때까지 반복할 수 있다. 각 면역 주기는 각 성분의 투약 순서, 적기 또는 횟수 등을 조정하여 변화시켜서 균형성이 더 우수한 반응을 이끌어 낼 수 있다. 복수의 면역 주기는, 예를 들어, 시간에 따라 확장되는 반응의 활성 효과기 상태를 유지하기 위해 시간 전체에 걸쳐 반응을 지속시키는데 이용할 수 있으며 또한 질병이나 기타의 의학적 상태를 치료하는데 유리하다.
이 방법에서는 증폭 단계에서 단백질에 대한 공역 처리나 보강제 첨가 등이 없이 펩티드를 성공적으로 이용하는 한편 이러한 성분들은 결핍되어서는 안된다. 따라서, 공역 펩티드, 보강제, 면역강화제 등을 본 발명의 구현예에서 이용할 수 있다. 림프계 예를 들어 펩티드-펄스 수지상 세포로 귀소하는 능력을 가진 것으로, 림프절에 투여한 복잡한 펩티드 조성물, 다양한 형태의 펩티드 에피토프 또는 항원으로 구성되거나 이것을 포함하는 리포좀 제형 같은 현탁물, 응집물, 에멀션, 작은 입상체, 나노결정 등을 유리 펩티드로 치환할 수 있다. 반대로 결절내 투여에 따른 펩티드 증폭은 낮은 레벨이라도 T 기억 세포를 유발할 수 있는 임의의 수단 및/또는 경로를 통한 프라이밍 처리에 따른다.
항원 발현의 모자이크화에 따라 내성 발생을 줄이거나 항원의 돌연변이 또는 손실을 위해 다수, 바람직하게는 2 내지 4개의 면역원을 부가적으로 면역화하는 것이 바람직하다. 항원 조합체를 이용할 수도 있다. 특정 암에 대한 항원 발현의 프 로파일을 통해 어느 항원 혹은 항원 조합체를 사용할지 결정할 수 있다. 예시적 방법은 다음의 출원에 개시되어 있다: 2004년 6월 17일자 미국 가출원 제60/580,969호, 2005년 6월 17일자 미국 출원 제11/155,288호, 이것과 동일자 출원의 미국 출원 ....(공개번호 ....)(대리인 정리번호 제MANNK.050CP1호) 으로서 이들 공히 "각종 암에 대한 진단에 이용되는 종양 관련 항원의 조합체"를 발명의 명칭으로 하며, 그 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다. 특정 암의 치료에 적절한 특정의 항원 조합체도 다음의 출원에 개시되어 있다: 미국 가출원 제60/479,554호, 미국 출원 제10/871,708호(공개번호 제2005-0118186 A1호) 및 PCT 출원 제PCT/US2004/019571호, 이들은 상술한 바와 같다. 다수의 항원이나 단일 항원에서 얻은 에피토프에 대한 면역 반응을 트리거 하기 위해, 상기 방법들은 다수의 면역 성분들 각각 또는 그 혼합물 형태로 전달하는데 이용할 수 있다. 면역원을 개별 전달하는 경우, 상이한 림프절에, 상이한 시점에서 동일한 림프절에 또는 상이한 시점에서 상이한 림프절에 다양한 성분을 투여하는 것이 바람직하다. 이것은 특히, 모든 펩티드 구성분에 용해성 및 안정성을 제공할 단일 제형은 분할하기 어렵기 때문에 펩티드 전달에 바람직하다. 단일 핵산 분자는 다수개의 면역원을 코드화할 수 있다. 이와 별도로, 점도가 문제인 고농도 핵산을 반드시 필요로 하지 않으면서 원하는 약을 공급할 수 있다면, 다수의 항원을 위한 모든 구성분 면역원의 서브셋 혹은 하나의 면역원을 코드화할 다수의 핵산 분자를 함께 혼합할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 림프계에 대한 직접 투여를 요구한다. 바람직한 구현예에서, 이 림프계는 림프절이다. 구심형 림프혈관도 마찬가지로 바람직하다. 림프절 선택은 중요하지 않다. 크기와 수용성 측면에서 서혜부 림프절이 바람직하지만, 겨드랑이 및 경부절과 편도선도 마찬가지로 적절하다. 면역 반응을 유발 또는 증폭하기 위해서는 단일 림프절에 투여하면 된다. 복수개의 림프절에 투여하면 반응의 신뢰도 및 강도를 증대시킬 수 있다. 다가 반응을 촉진하는 구현예로서 다수개의 증폭 펩티드가 이용될 때, 특수한 경우에는 각 특정 림프절에 1개의 펩티드만 투여하는 것이 바람직하다. 따라서 예를 들어, 1개의 펩티드를 우측 서혜부 림프절에 투여하는 동시에 두번째 펩티드를 좌측 서혜부 림프절에 투여할 수 있다. T 임파구는 이동하기 때문에 동일 부위에 개시 또는 증폭약을 투여하는 것은 중요한 사항이 아니며, 따라서 또다른 펩티드는 유발 부위가 아닌 다른 림프절에도 투여할 수 있다. 이와 별도로, 예를 들어, 앞서 먼저 증폭 펩티드를 투여했던 동일한 림프절에 대해 수일후 다른 펩티드를 투여할 수도 있는데 이는 유발 및 증폭간 시간 간격이 중요한 변수가 아니기 때문이다. 어떤 구현예의 경우 상기 시간 간격은 약 1주일 이상 될 때도 있다. 증폭 펩티드의 격리 투여는 이것의 MHC-결합 친화성이 유사하다면 그다지 중요치 않은 것이 일반적이나, 상기 친화성이 상이해지면 중요성이 커지기도 한다. 각종 펩티드의 비상용성 제형도 격리 투여가 바람직하다.
면역 방법으로 득을 볼 수 있는 환자들은 MHC 단백질 발현 프로파일과 면역 반응성의 일반적 레벨을 한정하는 방법을 이용하여 모집한다. 또한 면역 레벨은 말단 혈관에 접근하여 표준 기술로 관측할 수 있다. 결국, 치료 프로토콜은 항원 발현의 변화 및 유발 또는 증폭 상태에 대한 반응성을 기준으로 조정할 수 있다. 예 를 들어, 비말 동반약을 일부 투여한 뒤 증폭하지 않고, 검출가능한 반응을 얻을 때까지 비말 동반약을 반복 투여한 후 증폭 펩티드를 투여할 수 있다. 마찬가지로, 효능이 감토하는 경우, 항원 특이적 조절 T 세포 갯수가 증가하거나 내성화에 관련한 증거가 관측되는 경우 스케줄에 따른 펩티드 증폭 혹은 유지약을 끊고, 펩티드 증폭에 앞서 추가로 비말 동반약을 투여할 수 있다. 면역 반응성을 평가 및 관측하기 위한 진단 기술을 면역화 방법과 통합하는 것은 다음의 출원에 기술되어 있다: 2004년 6월 17일자 미국 가출원 제60/580,964호, 2005년 6월 17일자 미국 출원 제11/155,928호(공개번호 ....), 이들 공히 "진단 및 치료법의 통합에 따른 활성 면역요법의 효능 개선"을 발명의 명칭으로 하며, 그 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다.
본 발명에 따른 방법적 구현예를 실행함에 있어서, 적어도 두가지의 조성물이 이용되며, 특히 단일 타겟 항원 이상일 경우 함께 또는 다른 시점에 투여할 여러가지 조성물을 포함하기도 한다. 따라서 본 발명의 구현예는 면역 조성물군 및 서브군과 개별 투여용 약을 포함한다. 다가 특성은 다가 면역원을 포함하는 조성물이나 다가 면역원의 조합물을 사용하거나, 하나 이상의 1가 면역원을 함유한 조성물을 공동으로 사용함으로써 달성할 수 있다. 특정 치료법이나 이 방법에 따른 프로토콜에서 사용하기 위해 제조된 다수의 조성물은 면역치료용 제조물을 한정한다. 어떤 구현예에서, 상기 제조물을 구성하는 조성물 전체 혹은 서브군을 키트 안에 함께 포장하기도 한다. 경우에 따라, 단일 에피토프나 에피토프군을 타겟으로 하는 유발 및 증폭 조성물을 함께 포장할 수 있다. 또다른 경우, 다수의 유발 조성물을 키트 안에 배열할 수 있고 이에 상응하는 증폭 조성물을 또다른 키트에 배열할 수 있다. 이와 별도로, 조성물을 포장하고, 본 발명의 방법에 따라 원하는 결과를 달성하기 위해 서로 조합하여 사용하는 방법을 설명하기 위한 인쇄물 형태 혹은 기계적 판독 매체 상의 처방서와 함께 개별 판매하기도 한다. 당해 분야의 지식이 있다면 상기 방법의 변형예가 가능함을 명백히 이해할 것이다. 특정 프로토콜 또는 처방법에 이용되는 모든 조성물보다 적은 수의 조성물을 포함하는 다양한 포장 방식을 통해, 종양 항원 발현이나 면역치료제 혹은 이의 다양한 구성분에 대해 관측된 반응 등에 근거하여 치료의 개별화를 도모할 수 있으며, 이는 다음의 출원에 개시되어 있다: 2004년 6월 17일자 미국 가출원 제60/580,969호, 2005년 6월 17일자 미국 출원 제11/155,288호(공개번호....), 및 2005년 12월 29일자 미국 출원....(대리인 정리번호 제MANNK.050CP1호), 이들 공히 "각종 암의 진단에 이용되는 종양 관련 항원의 조합체"를 발명의 명칭으로 한다; 또한 미국 가출원 제60/480,964호, 미국 출원 제11/155,928호(공개번호....), 이들 공히 "진단법과 치료법의 통합에 따른 활성 면역요법의 효능 개선"을 발명의 명칭으로 하며 이들의 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다.
어떤 구현예에서,본 발명의 구현에 대해 기술 및 특허청구하기 위해 이용된 분자량, 반응 조건과 같은 특성, 구성분 발현 갯수 등은 "약"이라는 용어를 써서 일부 변경이 가능함을 이해할 수 있다. 따라서, 상기 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위에 명시된 수치 파라미터는 근사치를 뜻하며, 어떤 구현예에서 상기 근사치는 특정 구현예에서 달성하고자 하는 성질에 따라 달라질 수 있다. 또다른 구현 예에서, 수치 파라미터는 보고된 다수의 중요한 숫자들 관점에서 해석해야 하고 또한 통상의 근사법을 적용한다. 본 발명의 광범위한 구현예를 구성하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치값은 실험에 따른 정확한 값으로 조사되었다. 본 발명의 어떤 구현예에 존재하는 수치값은 각 시험 측정시 발견된 표준 편차로 인한 오차를 함유한다.
또다른 구현예에서, 본 명세서에 기술된(특히 첨부된 특허청구범위의 내용에 있어서) "a" "an" 및 "the" 등의 용어는 단수와 복수를 모두 포함하는 것으로 이해한다. 상술한 값들의 범위를 인용하는 것은 이 범위에 속하는 각각의 값을 개별 인용하는 간결한 수단으로 단순 해석한다. 별도의 언급이 없으면, 각 개별 값은 개별적으로 인용된 것으로 간주하여 본 명세서에 포함된다. 여기서 기술하는 모든 방법은 별도의 언급이나 이의가 없는 한 적절한 순서로 행한다. 어떤 구현예에 포함된 실시예 또는 예시에 관한 용어(예, "와 같은" 및 "등")는 본 발명을 예시하기 위한 것에 불과하며 따라서 특허청구범위를 제외하고 본 발명의 범위를 한정할 수 없다. 상세한 설명에 포함되지 않은 용어는 특허청구 범위 이외의 부분으로서 본 발명의 실행에 중요한 역할을 하는 것으로 이해한다.
각 구성요소나 구현예의 그룹화를 본 발명을 제한하는 것으로 해석하지 않는다. 각 그룹 구성원은 개별 혹은 다른 구성원 또한 기타의 구성요소와 함께 조합하여 인용한다. 그룹내 하나 이상의 구성원은 편의 및/또는 특허성의 관점으로 구성한 그룹에 포함되거나 이로부터 분리된다. 이와 같은 포함 혹은 분리시, 본 명세서는 상기 그룹을 변형태로 수용하며 따라서 특허청구범위에 이용되는 마르쿠스 그룹 의 기술 형식을 만족하는 것으로 본다.
바람직한 본 발명의 구현예는 상술한 바와 같으며 당해 발명자가 알고 있는 최선의 실시형태를 포함한다. 이러한 구현예의 변형 형태는 당해 지식을 가진 경우라면 상술한 기술 내용으로부터 명확히 이해할 수 있다. 당해 분야의 전문가라면 이러한 변형 형태를 적절히 응용할 수 있으며 본 발명은 상기 기술된 것 이외의 방법으로도 실행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다수 구현예는 해당 법령에 따라 허용되는 범위에서 특허청구범위에 언급된 내용의 변경 및 등가물을 모두 포함한다. 또한 별도의 지적이나 명확한 이의가 없는 한, 모든 가능한 변형 형태에 상술한 구성요소를 조합한 것도 본 발명에 포함된다.
또한, 본 명세서에서 다수의 특허 및 발행 공보를 참고 문헌으로 인용하였다. 상술한 인용문 및 발행 공보는 그의 내용 전반을 본 명세서에 참고로서 수록하고 있다.
마지막으로, 본 명세서에서 기술된 본 발명의 구현예는 본 발명의 윈리를 예시하기 위한 것으로 이해한다. 응용가능한 변형이나 수정도 본 발명의 범위에 포함되며 따라서, 비제한적인 실시예를 통하여 본 발명의 또다른 구성방식도 상술한 내용에 따라 활용할 수 있다. 따라서 본 발명은 여기에 기술된 내용에 한정되지 않는다.
다음의 실시예는 예시를 목적으로 한 것에 불과하며 본 발명 및 다양한 구현예의 범위를 제한하지 않는 것으로 해석한다.
실시예
1.
림프내
면역을 통한
고효율적
면역 반응 유발
인간 제I류 MHC (A*0201, "HHD"로 정의: Pascolo et al., J. Exp. Med. 185(12):2043-51, 1997의 내용을 참조하며 이의 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다)의 가상 단사슬 형태를 발현하는 형질변환 유전자를 가진 생쥐를 다음과 같이 결절내 면역처리했다. 5개 그룹의 생쥐(n=3)를, 유발 목적으로 멜란-A 26-35 A27/L 유사체(pSEM)를 발현하는 플라스미드로 면역한 뒤 다양한 주사 경로를 통해 1주 후에 증폭시켰다: 피하(sc), 근육주사(im) 및 림프내(in, 서혜부 림프절을 통한 직접 접종). 접종 스케줄 및 투약량은 도 1a에 나타낸다. 증폭 1주 후, 생쥐를 희생시켰다; 비장림프구를 준비하여 태그를 붙인 항-CD8 mAbs 및, 멜란-A 26-35 특이적 T 세포 수용체를 인식할 테트라머를 이용하여 염색했다. 대표적인 데이터는 도 1b에서 보는 바와 같다: 피하주사 및 근육주사로 테트라머+CD8+ T 세포의 빈도를 1% 이하로 했다. 반면에 플라스미드의 림프내 투여는 6% 이상의 빈도를 달성했다. 추가로, 비장림프구를 멜란-A로 체외 자극한 후 각 E:T 비율에서 51Cr-라벨의 타겟 세포(T2 세포)에 대해 시험했다 (도 1c). 동물에서 취한 비장림프구를 림프절 주사로 면역하면, 표준 세포독성 분석에 따라 각 E:T 비율에서 최고 수준의 체외 용해율을 나타내었다.
실시예
2.
상이한 형태의 면역원을 투여하는 순서의 영향
HHD 생쥐에 각종 서열 내의 플라스미드(pSEM) 또는 펩티드(멜란 A: ELAGIGILTV; 서열번호 1)를 결절내 투여하여 면역시켰다. pSEM으로 코드화한 면역 성 폴리펩티드는 미국 출원 제10/292,413호(공개번호 제20030228634 A1호)에 개시되어 있으며 이의, 발명의 명칭은 "타겟 관련 항원의 에피토프를 코드화하는 발현 벡터 및 그 설계를 위한 방법" 이고 그 내용의 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다.
면역화 프로토콜(도 2)은:
(i) 유발 상태/유발약: 서혜부 림프절에 대해, 25㎍(마이크로그램)의 플라스미드 또는 50㎍(마이크로그램)의 펩티드를 함유하는 25㎕(마이크로리터)의 멸균수를 제0일 및 제4일에 나란히 주입했다.
(ii) 증폭약: 실시예 1에 상술한 바와 같고 유발 상태가 완전히 종료된 뒤 2주 후에 개시했다.
비장림프구를 분리하고 pAPC의 존재하에 동족 펩티드로 체외 자극한 후에 표준 기술로 면역 반응을 측정했다. 복수의 분석 결과에서 유래한 결과를 고려하고, 각종 효과기 및 조절 기능을 신속 평가한 뒤 더 광범위한 반응 측면을 제공함으로서 면역 반응의 프로파일 윤곽을 그릴 수 있다. 갯수 뿐만 아니라 응용된 평가 방식도 고려한다; 예를 들어 서로 다른 프로염증성 사이토킨에 관한 두가지 분석은 한가지 분석 및 케모킨이나 면역억제성 사이토킨에 관한 분석을 행하는 것만큼 정보성이 우수하지 못하다.
실시예
3
실시예
2에 기술된 바와 같이 면역된 생쥐에 대한
ELISPOT
분석
ELISPOT 분석은 사이토킨 생성을 위한 펩티드 특이적 T 세포의 빈도를 측정 한다. 도 3은 대표적인 실시예를 중복 표시한다; 또한 도 4는 개별적으로 발현한 데이터의 요약을 사이토킨 생성 세포의 수/106개의 반응 세포로 나타낸다. 이 결과는 펩티드로 면역시킨 생쥐와 대조하여, 플라스미드-면역되거나 플라스미드-비말 동반/펩티드 증폭된 생쥐는 멜란-A 펩티드를 인식하는 IFN-γ(감마)-생성 T 세포의 빈도가 증가했다. 플라스미드로 비말 동반 및 펩티드로 증폭시킨 4마리의 생쥐 중 4마리는 1/2000 초과의 빈도를 나타냈다. 대조적으로, 프로토콜을 통해 플라스미드로 면역시킨 생쥐 4마리 중 2마리가 1/2000 초과의 빈도를 나타냈다. 면역원으로 펩티드만 사용한 생쥐는 한마리도 IFN-γ(감마)-생성 T 세포의 반응이 향상되지 않았다. 실제로, 펩티드의 반복 투여시 세포의 빈도가 감소했으며 이는 플라스미드로 비말 동반한 후 투여한 펩티드의 경우와 현저히 대조적이다.
실시예
4
실시예
2에 기술된 바와 같이 면역된 생쥐의 세포독성 활성의 분석
함침된 비장림프구를 각 그룹으로부터 준비(비장 수득, 다지기, 적혈세포 용해)하고, rIL-2의 존재하에 LPS-자극처리, 멜란-A 펩티드 피복된 동형 pAPC로 7일간 배양했다. 세포를 세척하고, 멜란-A 펩티드(ELA)로 펄스처리된 51Cr-태그 부착된 T2 타겟 세포와 함께 4시간 동안 상이한 비율로 배양했다. 상청액에 방출된 방사능을 γ(감마)-계수기로 측정했다. 반응을 용해율(%) = (시료 신호 - 배경)/(최대 신호 - 배경) X 100으로 정량화했다. 이때의 배경은 분석 배지에 배양시 타겟 세포 단독에서 방출된 방사능이고, 최대 신호는 세제로 용해시킨 타겟 세포에서 방출된 방사능이다. 도 5는 상술한 세포독성 분석의 결과를 도시한다. 펩티드를 이용 한 체외 자극후 달성된 세포독성 활성의 레벨은, 체내의 유발약으로 DNA를 수용한 그룹이 유발약으로 펩티드를 수용한 그룹보다 훨씬 높았다. ELISPOT 데이터에 따르면, DNA 조성물로 면역 반응을 유발했을 때 안정한 증폭가능 효과기 기능이 유도되었으며 반면 펩티드만 사용한 면역화는 면역 반응이 감소했고 반응 강도는 반복 투여시 더욱더 저하했다.
실시예
5
교차 활성
3가지 상이한 펩티드로 피복된 타겟 세포에 대하여, 실시예 4에 기술된 바와 같이 비장림프구를 준비 및 사용했다: 멜란-A 유사체 면역원 및 이에 상응하는 인간 및 뮤린 에피토프를 나타내는 것. 도 6에 나타낸 바와 같이, 유사한 세포독성 활성이 3개의 타겟 모두에서 관측되었고 이는 자연 서열에 대한 반응의 교차-활성을 보여준다.
실시예
6
림프절에 대한 펩티드의 반복 투여는 면역 편향 및 조절 T 세포를 유발한다.
상술한 면역화 절차에 의해 생성된(및 도 2에 도시된) 특이적 T 세포의 사이토카인 프로파일은 ELISA 또는 Luminex®로 평가했다 (Luminex® 분석은 다중 형태로 배양중인 T 세포에 의해 생성된 사이토카인을 측정하는 방법이다). 상술한 바와 같이 생성된 혼합 림프구 배양물의 7일 상청액을 이용하여 다음의 생물학적 반응 변화제를 측정했다: MIP-1α, RANTES 및 TGF-β (캡처 ELISA, 항-사이토킨 항체 및 특이적 시약, 예를 들어, 비오틴-태그 부착 항체, 스트렙타비딘-호스 라디쉬 페록시다제 및 비색 기질로 피복한 플레이트를 사용함; R&D 시스템). 다른 사이토킨은 T1/T2 및, 특수업체(BD Pharmingen)에서 제작한 T 염증 키트를 이용하여 Luminex®로 측정했다.
도 7a의 데이터는 3개의 다른 면역 프로토콜을 서로 비교하여, 면역 반응 프로파일에 대한 예상 밖의 효과를 보여준다: 플라스미드 비말 동반은 프로-염증성 사이토킨을 분비하는 T 세포를 유발시키고 펩티드의 반복 투여는 IL-10, TGF-베타 및 IL-5 등의 조절 또는 면역 억제자 사이토킨을 생성하는 결과를 가져왔다. 펩티드 단독 프로토콜에 이용한 접종 스케줄은 림프계 내에 에피토프를 계속 유지시키는 것이 아니라 주기적으로 제공했으며 그대신 반응의 효과기 상태를 연장하는 것으로 이해해야 한다. 결국, 플라스미드 비말 동반과 후속의 펩티드 증폭은 증가된 양의 T 세포 케모킨 MIP-1α 및 RANTES를 생성하는 결과를 가져왔다. MIP-1α 및 RANTES 등의 T 세포 케모킨은 종양이나 감염 부위에 대한 전달 대사를 조절할 때 중요한 역할을 할 수 있다. 면역 감시 과정에, 타겟 관련 항원에 대한 특이적인 T 세포는 동족 리간드와 접촉하여 케모킨을 함유한 조정자를 증식 및 생성하기도 한다. 이것들은 항원이 인식되는 부위에서 T 세포의 수색을 증폭하여 더 우수한 반응력을 갖게 한다. 이 데이터는 벌크 배양물에서 얻은 상청액으로부터 수득했다 (중복 측정값의 평균 + SE, 2회 독립 측정).
표준법을 통해 세포를 폐간 조직 및 비장에서 회수하여, 멜란-A 특이적 T 세 포를 확인하기 위한 테트라머 작용제와 함께 CD8, CD62L 및 CD45RB에 대한 항체를 이용하여 염색했다. 도 7b의 데이터는 CD8+ 테트라머+ T 세포군집을 표시한다 (y축은 CD45RB, x축은 CD62L).
이와 같이 수득한 결과는 펩티드 단독을 주사한 동물의 면역 편향성을 입증한다 (IFN-감마 감소, TNF-알파 생성, IL-10, TGF-베타 및 IL-5 증가, CD62L- CD45Rblow CD8+ 테트라머+ 조절 세포의 외형적 유도).
실시예
7.
림프절에 대해 투여된 펩티드(증폭) 및
복제불가한
플라스미드(비말 동반)를 변화시켜 얻은 면역 반응의 고효율 유발
인간 제I류 MHC HLA.A2 유전자로 형질전환된 HHD 생쥐 3개 그룹을 멜란-A 종양 관련 항원에 대한 림프내 투여를 통해 면역시켰다. 서혜부 림프절에 pSEM 플라스미드(25㎍/림프절) 또는 ELA 펩티드(ELAGIGILTV (서열번호 1), 멜란 A 26-35 유사체)(25㎍/림프절)을 직접 접종한 뒤 3일 후에 2차 주사하여 동물을 프라이밍 처리(유발)했다. 10일 후, 생쥐를 다시 동일한 형태로 pSEM 이나 ELA로 증폭한 뒤 3일 후 마지막 증폭 처리하여 반응을 증폭시키면(유사한 접종 스케줄에 대해 도 11a 참조), 다음과 같은 유발 및 증폭 조합물이 형성된다: pSEM+pSEM, pSEM+ELA, 및 ELA+ELA (각 그룹당 12마리 생쥐). 10일 뒤, 멜란-A 특이적 테트라머 시약(HLA-A*0201 MART1 (ELAGIGILTV (서열번호 1))-PE, Beckman Coulter)으로 면역 반응을 관찰했다. 후안구동 혈관을 통해 각 생쥐의 피를 뽑아 2000rpm에서 25분간 밀도 원심분리를 이용하여(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs) PBMC를 분리했다. PBMC를 CD8에 대한 마우스 특이 항체(BD Biosciences) 및 멜란-A 테트라머 시약으로 함께 염색하고, FACS 칼리버 흐름 세포분석기(BD)를 이용하는 흐름 세포분석법(flow cytometry)에 따라 특이 백분율을 측정했다. 상이한 프라임/증폭 조합물로 생성한 특이적 CD8+ 세포를 도 8a 및 8b에 나타낸다. 플라스미드-프라임/펩티드 증폭 그룹(pSEM + ELA)은 동물 전체에서 평균 4.6%의 테트라머 백분율의 외형적 면역 반응을 유발했다. 반응자 생쥐는 면역되지 않은 대조군의 평균치에 해당하고 표준편차(SE)는 3배인 값을 나타낸 2%의 테트라머 백분율을 갖도록 한정되었다. 이러한 값은 당해 분야에서 매우 외형적인 반응으로 판단되며 벡터의 복제를 통해서만 달성될 수 있는 것이 보통이다. pSEM + ELA 면역그룹은 반응자로 확인된 12마리의 생쥐 중 10마리를 포함하고 있어 대조군(p(Fisher)=0.036)과 비교하면 통계적으로 현저히 큰 차이를 나타내었다. 다른 두 면역군 pSEM + pSEM 및 ELA + ELA는 12마리의 반응자 중 6마리를 얻었으나 p값이 0.05 이상이라서 통계적으로 그 차이가 크지 않다. 이들 생쥐의 면역성을 측정하기 위해, 펩티드 체내 피복된 타겟 세포를 이용하여 동물을 실험했다. 비장림프구를 리터메이트 대조군 HHD 생쥐에서 분리하여 20㎍/mL ELA 펩티드로 2시간 동안 배양했다. 이들 세포를 CFSEhi 형광물(4.0μM로 15분간)로 염색하고 면역된 생쥐에, 펩티드로 배양하지 않고 CFSElo 형광물(0.4μM)로 염색한 등량비의 대조군 비장림프구를 공동 정맥주사했다. 18시간 후, 비장, 림프절, PBMC 및 폐를 실험 동물(그룹당 5마리)로부터 제거하고 흐름 세포분석법으로 CFSE 형광물을 측정함으로써 타겟 세포의 특이적 소거를 측정했다. 그 결과는 도 8c에 나타낸다. pSEM + ELA 프라임/증폭그룹에서 5마리 중 4마리가 외형적 면역 반 응을 나타냈고, 시험 조직 각각에서 타겟의 약 50%를 성공적으로 제거했다. 각 실험 그룹의 대표적인 히스토그램도 함께 나타낸다 (PBMC).
실시예
8
펩티드 증폭은 DNA 로 유발하고 테트라머 레벨이 기저선에 근접할 때까지 그대로 둔 동물에서 면역 메모리 세포를 효과적으로 재활성화 시킨다.
도 9a에 도시한 바와 같이, 멜란-A 테트라머 레벨을 면역후의 생쥐(그룹당 5마리)에게서 측정했다. 접종 스케줄 종결뒤 5주 후, 테트라머 레벨은 기저선으로 거의 복귀했다. 6주째에 동물을 ELA 펩티드로 증폭시켜 면역 반응이 회복될 수 있는지 확인하였다. pSEM 플라스미드(DNA/DNA, 도 9c)로 사전 면역시킨 동물은 ELA 증폭으로 멜란-A 특이적 CD8+ T 세포가 예상을 넘어서 10% 이상의 레벨로 크게 확대하였음이 확인되었다. 한편, ELA 펩티드를 사전 주사한 동물(도 9a)은 테트라머 염색 세포의 빈도가 낮아 ELA 증폭에 따른 효과가 거의 생기지 않았다. 초기 면역화로 DNA 및 후속으로 펩티드를 수용한 생쥐는 펩티드 증폭에 따른 세포 확장이 현저했지만, 다른 그룹들과 비교할 때 중급 수준인 것을 나타났다 (도 9b). 이들 결과는 DNA/DNA 비말 동반 및 펩티드-증폭 면역법에 대한 높은 합리성을 명확히 입증하고 있다.
실시예
9
림프계 및
비림프계
기관에서 특이적 T 세포의 고빈도를 달성하기 위한 면역 최적화
도 9a 내지 9c에 도시한 바와 같이, 플라스마 주사 클러스터 2개로 이루어진 클러스터군을 이용한 비말 동반 면역과 그 후 펩티드를 이용한 증폭을 거쳐 면역 가능한 반응을 얻었다. 이에 관한 또다른 증거는 펩티드 투여전(도 10a) 및 후(도 10b)의 테트라머 레벨를 도시한 도 10a 내지 10c에 나타낸다. 각 생쥐의 테트라머 레벨을 뚜렷이 볼 수 있으며 DNA/DNA/펩티드 면역 프로토콜을 수용하는 생쥐에서 T 세포의 총 CD8+ 군집의 30% 까지 나타내었다. 이 결과는 도 10c에서 그래프로 요약하여 나타낸다. 또한, 고 테트라머 레벨은 상기 개량된 면역 프로토콜을 수용하는 동물의 혈액, 림프절, 비장 및 폐에서 뚜렷이 입증된다 (도 10d).
이 프로토콜에 의해 생성된 CTL의 표현형을 특성화하기 위해 복수의 실험을 실행했다. 펩티드 증폭 결과 CD43+, CD44+, CD69+, CD62L-, CD45RBdim, 펩티드-제I류 MHC-특이적 T 세포군집이 확장되었기 때문에, 이 조건하에 개시한 면역 프로파일은 그 영향을 받았다. 이들 특이적 T 세포는 비림프계 기관을 군락화했고, 추가로 특이적 자극을 가함으로써 자극 펩티드 복합체의 밀도에 의존하는 방식으로 CD107α 및 IFN-γ의 발현을 신속히 달성했다.
실시예
10
플라스미드 및 펩티드 면역원의 정확한 투여 순서가 면역 반응의 강도를 결정한다.
6개의 생쥐 그룹(n=4)은, 서혜부 림프절에 직접 접종함으로써 프라이밍 및 증폭법을 이용하여, 멜란-A 26-35 A27L 유사체(pSEM) 또는 멜란-A 펩티드를 발현하는 플라스미드로 면역시켰다. 접종 스케줄은 도 11a에서 보는 바와 같다 (플라스미드 또는 펩티드/림프절을 50㎍ 씩 좌우 대칭 형태로 투약하여). 2개의 생쥐 그룹은 플라스미드로 초기화한 후 플라스미드나 펩티드로 증폭했다. 또다른 2개의 생쥐 그룹은 펩티드로 초기화한 후 플라스미드나 펩티드로 증폭했다. 마지막 2개는 대조군 생쥐로서 펩티드나 플라스미드로 초기화하고 증폭은 하지 않았다. 마지막 접종뒤 4주 후에 비장을 수득하고 비장림프절 현탁액을 제조, 함침 및 항-INF-γ 항체가 피복된 ELISPOT 플레이트 내에서 멜란-A 펩티드로 자극처리했다. 배양 48시간 후, 평가를 진행하여 멜란-A를 인식한 사이토킨-생성 T 세포의 빈도를 자동 계수하였다. 이 데이터는 도 5b에서 특이적 T 세포/백만개의 반응자 세포의 빈도(3회 측정의 평균 + SD)로 나타냈다. 이 데이터는 플라스미드와 펩티드의 초기화 및 증폭 투약 순서를 역으로 하면 전체 반응 강도에 큰 영향을 미치는 것을 입증했다: 플라스미드 비말 동반후 펩티드 증폭시 반응이 가장 크며, 펩티드로 초기화한 후 플라스미드로 증폭시에는 펩티드의 반복 투여와 유사할 정도로 현저히 낮은 반응성을 나타냈다.
실시예
11
면역 반응과 면역 프로토콜 간의 상관관계 및, 림프계 및
비림프계
기관 내에서
타겟
세포를 소거하여 조절하는 체내 효능
비말 동반 및 증폭 프로토콜로 수득한 면역 반응을 평가하기 위해, 4그룹의 동물(n=7)에 대해 멜란-A로 피복된 세포를 이용하여 체내 실험했다. 비증림프구를 리터메이트 대조군 HHD 생쥐에게서 분리하여 20㎍/mL 펩티드로 2시간 동안 배양했다. 이들 세포는 CFSEhi 형광물(4.0μM로 15분간)로 염색하고 면역된 생쥐에, CFSElo 형광물(0.4μM)로 염색한 등량비의 대조군 비장림프구를 공동 정맥주사했다. 18시간 후, 비장, 림프절, PBMC 및 폐를 실험 동물로부터 제거하고 흐름 세포 분석법으로 CFSE 형광물을 측정함으로써 타겟 세포의 특이적 소거를 측정했다. 도 12a 및 12b는 면역되지 않은 대조군 동물 혹은, 펩티드/펩티드, DNA/펩티드 또는 DNA/DNA의 면역 프로토콜을 수용하는 동물의 조직으로부터 얻은 CFSE 히스토그램 플롯을 도시한다 (각 그룹에서 두마리의 대표 생쥐를 나타낸다). DNA-비말 동반/펩티드 증폭 그룹은 림프계 및 비림프계 기관 내의 타겟 세포의 사멸 레벨이 높은 것으로 나타났고(도 12c) 테트라머 레벨과의 상관관계를 나타내는 면역 프로토콜만 표시했다(도 12d, 모든 시험 조직에 대해 r2=0.81 이상).
실시예
12
개량된 비말 동반 및 증폭 프로토콜에 의한 면역된 동물에서 인간 종양 세포의 소거
멜란-A 항원의 면역성은 개량된 프로토콜로 면역화한 후 인간 멜라노마 종양 세포로 생쥐를 처리하여 시험했다. 도 13a는 시험한 3개 그룹에 대해 이용된 개량 면역화법을 도시한다. 면역처리된 생쥐는 인간 타겟 세포 624.38 HLA.A2+를 정맥 주사하고, 도 13에 도시한 바와 같이 CFSElo로 라벨 처리된 624.28 HLA.A2- 대조군 세포와 등량비로 혼합한 CFSEhi 형광물로 라벨 처리했다. 14시간 후, 생쥐를 희생시키고 폐(인간 타겟이 축적된 기관)는 흐름 세포분석법으로 타겟 세포의 특이적 용해에 대해 분석했다. 도 13c은 각 그룹에서 나온 생쥐로부터 유래된 대표적 CFSE 히스토그램 플롯을 나타낸다. 폐에 있는 타겟의 특이적 사멸이 거의 80%로 나타나므로 DNA 비말 동반 및 펩티드 증폭이 인간 종양 세포에 대하여 생쥐를 면역시키는 것이 분명했다. 더 긴 DNA 비말 동반 주사 처리군은 또한 멜란-A 테트라머와 반응 성인 CD8+ 세포의 빈도 증가를 유도했다.
실시예
13
DNA
-비말 동반, 펩티드 증폭법이
SSX2
-유래
에피토프
KASEKIFYV
(
SSX2
41
-49
)에 대한 외향적 면역성을 가져온다
도 14a에서 정의한 접종 스케줄을 이용하여 SSX2 종양 관련 항원에 대해 동물을 면역시키면 외향적 면역 반응을 나타냈다. 도 14b는 pCBP 플라스미드로 프라임 처리(비말 동반)하고 SSX241-49 K41F 또는 K41Y 펩티드 유사체로 증폭시킨 생쥐의 대표적 테트라머 염색을 보여준다. 이 유사체는 SSX241-49 에피토프에 특이적인 T 세포와의 교차 반응성을 갖는다. 이들 실시예는 비말 동반 및 증폭 프로토콜로, 유효한 CD8 T 세포의 80%에 달하는 SSX2 항원 특이성을 유발할 수 있음을 나타낸다. pCBP 플라스미드와 이의 설계원리는 미국 출원 제10/292,413호(공개번호 제2003228634 A1)에 개시되어 있고 이의 발명의 명칭은 "타겟 관련 항원의 에피토프 코드화를 위한 설계 벡터 및 그 설계 방법" 이며, 그 내용의 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다. 또다른 방법, 조성물, 펩티드 및 펩티드 유사체는 2004년 6월 17일자 미국 가출원 제60/581,001호 및 2005년 6월 17일자 미국 출원 제11/156,253호에 기술되어 있고, 이들 공히 발명의 명칭은 "SSX-2 펩티드 유사체" 이고 그 내용의 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다. 또다른 방법, 조성물, 펩티드 및 펩티드 유사체는 2004년 6월 17일자 미국 가출원 제60/580,962호 및 2005년 6월 17일자 미국 특허 제11/155,929호에 기술되어 있고 이들 공히 발명의 명칭은 "NY-ESO 펩티드 유사체" 이고 그 내용의 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다.
실시예
14
비말 동반 및 증폭법은 상이한 항원에 위치한
에피토프에
대해 면역 반응을 동시 유발을 위해 사용할 수 있다
4개의 HHD 생쥐 그룹(n=6)을 pSEM 단독, pCBP 단독, pSEM 및 pCBP의 혼합물로 또는 좌측 림프절에 pSEM을, 우측 림프절에 pCBP를 각각 림프절 주사로 접종하여 면역시켰다. 주사 10일 후 다시 동일한 방식으로 상기 그룹을 ELA 또는 SSX2 펩티드 증폭으로 처리했다. 면역화된 생쥐 전부를 면역되지 않는 대조군과 비교했다. 생쥐에 대한 실험은 ELA 또는 SSX2 펩티드로 피복된 HHD 리터메이트 비장림프구와 함께 실행했으며, 트리플 피크 CFSE 체내 세포독성 분석을 이용하면 두개의 항원 타겟의 특이적 용해성을 동시에 평가할 수 있게 된다. 같은 갯수의 대조군-CFSElo, SSX2-CFSEmed 및 ELA-CFSEhi 세포를 면역 생쥐에 정맥 주사한 뒤 18시간 후에 생쥐를 희생시키고, 흐름 세포분석기(flow cytometer)를 이용하는 CFSE 형광물에 의해 비장(도 15a) 및 혈액(도 15b)에서의 타겟 세포 제거 상태를 측정했다. 도 15a 및 도 15b는 생쥐 개체로부터 수득한 SSX2 및 멜란-A 항원 타겟의 특이적 용해율을 도시하고 도 15c는 그 결과를 막대 그래프 형식으로 요약한다. 동물을 두가지 백신의 혼합물로 면역시키면 상기 항원에 대해 면역성이 생기고 최대 면역 반응의 결과를 가져왔다. 이것은 비장내 평균 SSX2 특이적 용해율이 30+/-11 이고 멜란-A의 경우 는 97+/-1 인 것을 나타냈다.
준우성 에피토프에 대한 반응을 포함한 다가 반응을 유발하는 변형예는 하기의 실시예 24 내지 34에서 구체적으로 예시한다.
실시예
15
반복 주기형
DNA
비말 동반 및 펩티드 증폭처리법으로 강한 면역성을 달성 및 유지한다
3개의 동물 그룹(n=12)이 다음과 같은 2주기형 면역 프로토콜을 수용했다: DNA/DNA/DNA; DNA/펩티드/펩티드; 또는 DNA/DNA/펩티드. 멜란-A 테트라머 레벨을 각각의 면역 주기를 거친 생쥐에 대해 측정하여 도 16에 나타냈다. 초기 DNA/DNA/펩티드 면역 주기를 거친 결과, 평균 21.1+/-3.8%의 테트라머+ CD8+ T 세포를 얻었으며 이 값은 다른 두 그룹보다 거의 2배 이상 큰 것이다. 2차 주기의 비말 전도 및 증폭 면역에 의하여 DNA/DNA/펩티드 그룹에 대한 평균 테트라머 백분율이 32.6+/-5.9 까지 54.5% 가 상승하였으며, 이는 DNA/DNA/펩티드 레벨보다 2.5배 높은 것이고 또한 DNA/DNA/DNA 그룹 레벨보다 8.25배 높은 값이다. 그 외에, 상기 조건에서 다른 접종 스케줄은 테트라머 양성 T 세포의 빈도를 거의 증가시키지 않았다.
실시예
16
플라스미드와 펩티드 벡터를 교대시키는 면역 유발 및 증폭법에 의해
트리거된
장기 유지 기억 T 세포
4마리의 HHD 형질전환 동물(3563, 3553, 3561 및 3577)은 다음과 같은 2주기 형 비말 동반 및 증폭 프로토콜을 수용했다: DNA/DNA/펩티드. 1차 주기는 제-31일, 제-28일, 제-17일, 제-14일, 제-3일, 제O일에 각각 면역화 처리했고; 2차 주기는 제14일, 제17일, 제28일, 제31일, 제42일 및 제45일에 면역화 처리했다. 생쥐를 제120일에 펩티드로 증폭시켰다. 멜란-A 테트라머 레벨은, 각각의 면역 주기 뒤 제7일 내지 제10일에 생쥐에 대해 측정했고 또한 2차 면역 주기 뒤 90일까지 주기적으로 측정했다. 다이어그램의 화살표는 주기 종료 시점을 나타낸다(도 17A). 4마리의 동물 모두 마지막 증폭후 반응을 나타냈으며 이는 내성의 유도가 아니라 면역 기억의 지속 상태를 입증한다.
5마리의 HHD 형질전환 동물(3555, 3558, 3566, 3598 및 3570)은 다음과 같은 2주기형 비말 동반 및 증폭 프로토콜을 수용했다: DNA/펩티드/펩티드. 상기한 내용과 마찬가지로, 1차 주기는 제-31일, 제-28일, 제-17일, 제-14일, 제-3일, 제O일에 각각 행하는 면역화처리를 포함하고; 2차 주기는 제14일, 제17일, 제28일, 제31일, 제42일 및 제45일에 각각 행하는 면역화처리를 포함했다. 생쥐를 제120일에 펩티드로 증폭시켰다. 멜란-A 테트라머 레벨은, 각각의 면역 주기 뒤 제7일 내지 제10일에 생쥐에 대해 측정했고 또한 2차 면역 주기 뒤 90일까지 주기적으로 측정했다(도 17B). 상기의 비말 동반 및 증폭 프로토콜을 비교하여, 각 주기에서 추후의 DNA 주사를 위해 펩티드를 교체하는 경우 면역 기억이 감퇴하거나 반응성이 떨어지는 결과를 얻었다.
실시예
17
실질적
확장력을
가진 장기 유지 기억 T 세포는
결절내
DNA
투여로 생성된다
7마리의 HHD 형질전환 동물은 다음과 같은 면역화 프로토콜을 수용했다: DNA/DNA/DNA. 1차 주기는 제-31일, 제-28일, 제-17일, 제-14일, 제-3일, 제O일; 2차 주기는 제14일, 제17일, 제28일, 제31일, 제42일 및 제45일에 각각 행하는 면역화처리를 수반했다. 생쥐를 제120일에 펩티드로 증폭시켰다. 멜란-A 테트라머 레벨은, 각각의 면역 주기 뒤 제7일 내지 제10일에 생쥐에 대해 측정했고 또한 2차 면역 주기 뒤 90일까지 주기적으로 측정했다. (도 18). 7마리 동물 모두 2회의 면역 주기 동안 및 그 후에 테트라머+ 세포의 경계선 빈도율(%)을 나타냈으나 펩티드 증폭후 강한 반응으로 성장했고, 따라서 실질적인 면역 기억을 나타냈다.
실시예
18
항원 및 면역강화
보강제의
여러 조합체는
CTL
반응의 비말 동반에 효과적이다
펩티드의 결절내 투여는 TLR 같은 보강제를 포함하거나 이와 조합되는 작용제(복제 또는 복제불가한)를 림프내 투여함으로써 트리거된 면역 반응을 증폭하는 효능이 매우 우수한 수단이다.
대상체(생쥐, 인간 또는 기타 포유동물)는 플라스미드, 바이러스, 펩티드 및 보강제(CpG, dsRNA, TLR 리간드), 재조합 단백질 및 보강제(CpG, dsRNA, TLR 리간드), 죽은 미생물 또는 정제된 항원(예, 면역강화 활성을 가진 세포벽 성분) 등의 벡터를 결절내 주입 또는 주사함으로써 비말 동반 처리 및 보강제 없이 펩티드의 결절내 주사로 증폭 처리된다. 증폭 전 및 후 테트라머 염색 및 기타의 방법으로 측정된 면역 반응은 그 강도가 현저히 증가한 것을 보여준다. 이와 대조적으로, 다 른 경로를 통하여 보강제 없이 펩티드를 이용한 증폭 처리는 이와 유사한 면역 반응을 달성하지 못한다.
실시예
19
펩티드의
결절내
투여는 임의의 투여 경로를 통하여 항원 및 면역강화
보강제에
의해
트리거된
면역 반응을 증폭시키는 효능이 매우 우수한 수단이다
대상체(생쥐, 인간 또는 기타 포유동물)는 플라스미드, 바이러스, 펩티드 및 보강제(CpG, dsRNA, TLR 리간드), 재조합 단백질 및 보강제(CpG, dsRNA, TLR 리간드), 죽은 미생물 또는 정제된 항원(예, 면역강화 활성을 가진 세포벽 성분) 등의 벡터를 비경구 투여 혹은 점막 투여함으로써 면역화 처리 및 보강제 없이 펩티드의 결절내 주사로 증폭 처리된다. 증폭 전 및 후 테트라머 염색 및 기타의 방법으로 측정된 면역 반응은 그 강도가 현저히 증가한 것을 보여준다. 이와 대조적으로, 결절내 이외의 다른 경로를 통하여 보강제 없이 펩티드를 이용한 증폭 처리는 이와 유사한 면역 반응을 달성하지 못한다.
실시예
20
비말 동반 및 증폭 면역 프로토콜을 이용한 내성 파괴
자가 항원(종양 관련 항원 같이)에 대한 면역 반응성을 회복하거나 내성을 파괴하기 위하여, 대상체(생쥐, 인간 또는 기타 포유동물)를 플라스미드, 바이러스, 펩티드 및 보강제(CpG, dsRNA, TLR 리간드), 재조합 단백질 및 보강제(CpG, dsRNA, TLR 리간드), 죽은 미생물 또는 정제된 항원(예, 면역강화 활성을 가진 세포벽 성분) 등의 벡터로 면역화 처리 및 보강제 없이 펩티드(자가 에피토프에 상응 하는)의 결절내 주사로 증폭 처리된다. 증폭 전 및 후 테트라머 염색 및 기타의 방법으로 측정된 면역 반응은 그 강도("내성 파괴")가 현저히 증가한 것을 보여준다.
실시예
21
비말 동반 및 증폭 면역화를 위한 임상 실험
임상 및 연구소 기준을 따라 종양 혹은 감염성 질환을 치료하는데 필요한 것으로 환자를 진단하고; 1차 제균 요법을 적용하지 않고 치료하며; 이의 활성 면역요법을 평가한다. 질환 특성 및 치료 제품의 특성 등에 따른 추가 기준(항원 프로파일링, MHC 하플로타이핑, 면역 반응성 등)에 기초하여 등록한다. 벡터(플라스미드)와 단백질 항원(펩티드)을 정확한 순서로 림프내 주사나 주입(정맥주사, 프로그램형 펌프 또는 기타의 수단)하여 치료한다(도 19). 가장 바람직한 프로토콜은 플라스미드 비말 동반과 그 후의 펩티드 증폭약을 포함하는 반복 주기를 수반한다. 이러한 주기의 빈도와 지속성을 면역적, 임상적 및 기타의 수단을 통해 측정한 반응에 따라 조정할 수 있다. 투여 조성물은 다수의 벡터, 항원 또는 에피토프를 함유하는 1가나 다가 물질이다. 투여시 하나 또는 복수개의 림프절에 동시 투여 혹은 스태거 형식으로 지그재그 투여할 수 있다. 이 치료를 받는 환자는 증상 완화를 나타낸다.
실시예
22
병원성 T 세포의
탈활성화
또는 면역 편중을 발하는 임상 실험
자가면역 또는 감염성 질환에 걸린 환자에게 임상 및 연구소 기준을 따라 종양 혹은 감염성 질환을 치료하는데 필요한 것으로 환자를 진단하고; 1차 제균 요법 을 적용하지 않고 치료하며; 이의 활성 면역요법을 평가한다. 질환 특성 및 치료 제품의 특성 등에 따른 추가 기준(항원 프로파일링, MHC 하플로타이핑, 면역 반응성 등)에 기초하여 등록한다. T1-촉진 보강제를 빼고 면역 편중을 증폭시키는 면역 조정제와 함께 펩티드를 림프내 주사나 주입(정맥주사, 프로그램형 펌프 또는 기타의 수단)하여 치료한다. 그러나, 주기적 정맥주사는 이 방법에 의해 면역 편중을 일으키는 방식이다. 펩티드 치료는 주단위, 격주단위 혹은 가끔(예, 매월) 면역성이나 임상적 상태에 대한 적절한 효과를 얻을 때까지 실시된다. 이러한 치료는 단일 투여 또는 도 2의 그룹 2에서 보는 바와 같은 짧은 시간 간격을 둔 다수의 투여를 수반한다. 관리요법은 가끔씩 주사하는 것을 포함하는 제어된 방법을 통해 나중에 시행한다. 투여 조성물은 다수의 에피토프를 함유하는 1가 또는 다가 물질이다. 이 조성물은 림프계에서 펩티드 잔류를 연장하는 성분을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 투여시 하나 또는 복수개의 림프절에 동시 투여 혹은 스태거 형식으로 지그재그 투여할 수 있다. 적절한 임상적 방법 이외에도, 펩티드나 관련없는 에피토프를 면역화하는데 특이적인 T 세포를 측정하여("에피토프" 전개) 반응을 관찰했다.
실시예
23
면역 조성물 (예, 바이러스 백신)
6개 그룹(n=6)의 HLA-A2 형질전환 생쥐에 대해 다음과 같은 스케줄대로 서혜부 림프절에 좌우 대칭 형식으로 25㎍의 플라스미드 벡터를 주사한다: 제0일, 제3일, 제14일 및 제17일. 상기 벡터는 HIV gag에서 3개의 A2 제한 에피토 프(SLYNTVATL(서열번호:3), VLAEAMSQV(서열번호:4), MTNNPPIPV(서열번호:5))를, pol에서 2개(KLVGKLNWA(서열번호:6),ILKEPVHGV(서열번호:7)), 또한 env에서 1개(KLTPLCVTL(서열번호:8))를 코드화한다. 마지막 비말 동반의 주기 2주 후, 상기 다섯개의 펩티드를 모두 포함하는 혼합물을 생쥐에 주사한다 (3일 간격으로 5㎍/펩티드/결절의 양을 좌우 대칭 형태로). 7일 후 생쥐의 피를 뽑아 각 펩티드에 대한 테트라 염색을 통해 반응을 평가한다. 그 후 생쥐 중 절반을 env, gag 또는 pol를 발현하는 재조합 백신 바이러스로 실험하고(103 TCID 50/생쥐) 또한, 제7일에 종래의 플라크 분석법을 이용하여 난소에서 바이러스 역가를 측정한다. 나머지 절반은 희생하여 비장림프구를 5일간 펩티드로 자극하고, 세포독성 활성은 펩티드로 피복된 타겟 세포에 대해 측정한다. 대조군으로 생쥐에 플라스미드 또는 펩티드만 주사한다. 플라스미드로 비말 동반 처리하고 펩티드로 증폭 처리한 생쥐는 테트라머 염색 및 세포독성에 의해 5개의 펩티드 모두에 대해 강한 면역성을 나타낸다.
보다 일반적으로, 내성을 파괴하고 면역 반응성을 회복 또는, 바이러스, 박테리아, 기생충이나 미생물 등의 비-자가 항원에 대한 면역을 유발시키기 위하여, 대상체(생쥐, 인간 또는 기타 포유동물)를 플라스미드, 바이러스, 펩티드 및 보강제(CpG, dsRNA, TLR 리간드), 재조합 단백질 및 보강제(CpG, dsRNA, TLR 리간드), 죽은 미생물 또는 정제된 항원(세포벽 성분) 등의 벡터로 면역 처리 및 보강제 없이 펩티드(타겟 에피토프에 상응하는)의 결절내 주사로 증폭 처리된다. 증폭 전 및 후 테트라머 염색 및 기타의 방법으로 측정된 면역 반응은 면역 반응의 강도가 크게 증가한 것을 보여준다. 이러한 처리 방법은 감염으로부터 보호를 위해 또는, HBV, HCV, HPV, CMV, 인플루엔자 바이러스, HIV, HTLV, RSV 등과 같은 작용제에 의해 생긴 만성 감염을 치료하는데 사용할 수 있다.
실시예
24
2개의 플라스미드를 이용한 접종 스케줄:
SSX2
41-
49를
발현하는
pCBP
및
멜란
-A 26-35(A27L)를 발현하는
pSEM
도 20에서 보는 바와 같이, 2개 그룹의 HHD 생쥐(n=4)를 제0일과 제4일에, pSEM 및 pCBP 혼합물을 또는 좌측 서혜부 림프절에는 pSEM을 우측 서혜부 림프절에는 pCBP를 림프절 주사하여 면역화 처리했다. 플라스미드의 양은 25㎍/플라스미드/1일량 이었다. 2주후, 동물을 희생하고 세포독성을 펩티드로 펄스 처리하거나 하지 않은 T2 세포에 대해 측정했다.
실시예
25
벡터 분리는 열성
에피토프의
면역성을 구제한다
실시예 24에서 설명한 바와 같이 면역화 처리한 동물을 희생시켜 얻은 비장림프구를 그룹 단위로 함침 처리 및 2개의 펩티드, 멜란-A 26-35(A27L) 또는 SSX2 41-49 중 하나로 자극 처리했다. 51Cr-부하 및 펩티드-펄스 처리된 T2 타겟 세포로 배양하여 측정했다. 도 21의 데이터는 각종 타겟 세포에 대한 특이적 세포독성(n=4/그룹)을 나타낸다.
그 결과, 플라스미드 혼합물을 사용시 pCBP 플라스미드에 의해 유발된 반응을 방해했으나, 투여 부위에 대해 2개의 플라스미드를 분리해서 pCBP의 활성을 구제했다. 서로 다른 항원을 운반하는 상이한 벡터의 공동 투여시 면역성 측면에서 계층적 서열을 형성하게 된다. 벡터 분리는 열성 성분의 면역성을 구제하며 그 결과 다가 반응이 일어난다.
실시예
26
면역화 프로토콜에 대한 펩티드 증폭 단계의 추가
도 22에서 보는 바와 같이, 4개 그룹의 HHD 생쥐(n=6)를 제0일과 제4일에, pSEM 및 pCBP 혼합물을 또는 좌측 서혜부 림프절에는 pSEM을 우측 서혜부 림프절에는 pCBP를 림프절 주사하여 면역화 처리했다. 대조군의 생쥐는 pSEM 또는 pCBP 플라스마 단독으로 면역화했다. 플라스미드의 양은 25㎍/플라스미드/1일량 이었다. 2주후인 제14일 및 제17일에, 동물을 멜란-A 및/또는 SSX2 펩티드로 증폭 처리하여 약량과 조합체 측면에서 플라스미드 면역 상태를 관측했다. 다시 2주후인 제28일에, 상기 동물의 체내 세포독성을 평가하기 위해, CFSE로 염색하고 및 멜란-A(ELA) 혹은 SSX2 펩티드로 펄스 처리하거나 처리하지 않은 비장림프구로 상기 동물을 실험했다.
실시예
27
벡터 및 펩티드가 각각 혼합물 형태로 사용되어도 펩티드 증폭은 열성
에피토프의
면역성을 구제한다
실시예 26에서 기술한 바와 같이 동물을 면역화 처리하고, ELA 또는 SSX2 펩티드로 피복된 HHD 리터메이트 비장림프구와 또한, 2개의 항원 타겟에 대한 특이적 용해율을 동시 평가할 수 있게 해주는 트리플 피크 CFSE 체내 세포독성 분석법을 응용하여, 이 동물을 실험했다. 같은 갯수의 대조군-CFSElo, SSX2-CFSEmed 및 ELA-CFSEhi 세포를 면역화된 생쥐에 정맥주사하고 18시간 후 상기 생쥐를 희생시켜, 흐름 세포분석기를 이용하는 CFSE 형광물에 의해 비장 내의 타겟 세포 제거 상태를 측정했다 (도 23). 상기 도면은 생쥐 개체로부터 취한 SSX2 및 멜란-A 항원 타겟의 특이적 용해율, 각 그룹의 평균치와 SEM을 보여준다.
흥미로운 것은, 처음에 플라스미드를 그 다음에 펩티드를 포함하는 2개의 백신으로 된 혼합물로 동물을 면역해서 양쪽 항원에 면역성을 부여하였고 그 결과 최대의 면역 반응을 결과로서 얻었다. 이 결과에서, 비장의 경우 평균 SSX2 특이적 용해율이 30±11 이고 멜란-A의 경우 97±1 임을 확인했다. 따라서 도 23에 도시된 바와 같이, 벡터와 펩티드가 각각 혼합물로 사용된 경우라도 펩티드 증폭은 열성 에피토프의 면역성을 구제할 수 있다.
실시예
28
비말 동반 및 증폭 면역화를 위한 임상 실험
강한 다가 반응의 유발을 위한 두가지 시나리오가 도 24에 도시되어 있다: 첫번째(A)는, 플라스미드와 펩티드를 혼합물로 사용하는 경우라도 증폭을 위해 펩티드를 사용하여 다가 면역 반응을 회복한다. 두번째(B)는, 플라스미드와 펩티드 성분들을 분리하여 다가 면역 반응을 유발할 수 있도록 하는 것이다. 공통 에피토프를 위한 비말 동반 플라스미드가 투여되는 동일한 림프절에 펩티드를 투여하는 것이 바람직하다. 그러나 이것은 T 기억 세포가 CD52L 발현을 상실했고 다른 림프 계 기관을 군집화하므로 반드시 필요한 것은 아니다. 도 24에 나타낸 비말 동반 및 증폭간 시간 간격은 있으면 편리하지만 중요하지는 않다. 실질적으로 간격이 짧으면 바람직하지 않으며 반면 간격이 훨씬 길면 양호하게 수용할 수 있다.
실시예
29
다가 반응 유발을 위한 단일 플라스미드
도 25 및 하기의 표에서 도시한 바와 같이, 플라스미드 pSEM은 개방 판독 프레임 ("동기형 폴리펩티드 코드화 서열") 내에 함께 결합된 두개의 상이한 항원 (멜란-A 및 티로시나제)로부터 복수개의 펩티드를 포함한다. 따라서 발현 능력을 소유하며 단일 에피토프와 달리 면역화를 유도한다. 코드화된 펩티드 서열은 다음과 같다: 티로시나제 1-9; 멜란 A/MART-1 26-35(A27CL); 티로시나제 369-377; 및 멜란-A/MART-1 31-96.
플라스미드 내의 폴리펩티드용 cDNA 서열은, 항원 표시 세포가 취할 때 폴리펩티드를 위한 메신저의 효율적인 전사를 허용하는 사이토메갈로바이러스(CMVp)로부터 프로모터/인핸서 서열의 제어하에 있다. 코드화 서열의 3' 말단에서 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(BGH 폴리A)는 세포핵에서 세포질 속으로 위치변경함과 동시에 안정성을 증대하기 위해 메신저의 폴리아데닐화 신호를 제공한다. 세포핵으로의 플라스미드 운반을 촉진하기 위해 시미안(Simian) 바이러스 40 으로부터 핵 도입 서열(NIS)은 플라스미드 골격에 삽입되었다. CpG 면역자극 모티프 중 하나의 복제물은 면역 반응을 증폭시키는 플라스미드로 가공된다. 최근에, 플라스미드에 두개의 원핵생물 유전성 성분이 대장균, 카나마이신 내성 유전자(Kan R) 및 pMB 박 테리아 복제 기원의 증폭에 원인으로 작용한다. pSEM에 관한 것은 여기에 참고로서 수록한 미국 출원 제10/292,413호에서 발견할 수 있으며 이것은 pMA2M 및 pVAXM3 등 다양한 명칭으로 부른다.
| 유전자 성분명 | 설명 |
| CMV 인핸서/프로모터 | 전체 사이토메갈로바이러스 즉시 유전자 인핸서와 프로모터 영역 |
| BGH 폴리아데닐화 영역 |
소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역. 메시지의 반감기를 확장하는 것으로 알려진 컨센서스 서열을 함유한다 |
| 카나마이신 내성 유전자 | 카나마이신 약물 내성을 플라스미드를 클론 및 발효하는데 이용한 박테리아 숙주 세포(TOP10)에 제공할 수 있는 트랜스포존 Tn10 |
| PMB 복제기원(역방향) | PMB 복제기원은 ColE1 과 비슷하지만 플라스미드 박테리아 기원이 다소 상이하다.이것은 100 내지 1500개의 복제 플라스미드 DNA/박테리아 세포를 지지할 수 있는 고급 복제 기원이다. 플라스미드 백신 구조물에서 스톡 pVAX 플라스미드에 관하여 그 방향을 역행시켜 원치 않는 중간체의 생성을 제거했다.미국 특허 제6,709,844호를 참조한다.이의 내용 전반은 본 명세서에 참고로 수록되어 있다. |
| ISS 서열 (대장균에서 자연발생) | 서열 GTCGTT은 인간 면역 세포에서 항바이러스 DNA 보강제 반응을 유발할 수 있는 것으로 보고된 CpG서열을 자연 발생하는 것으로 바람직하다 |
| 2차 ISS 서열 (합성/ACL 1 부위) | 서열 AACGTT는 ACLI 부위이고 뮤린 면역 세포에서 항바이러스 DNA 보강제 반응을 유발할 수 있는 것으로 보고된 바람직한 CpG 서열이다. |
| 핵 도입 서열(NIS) SV40 72 bp 반복 | SV40 72 염기쌍 반복체는 효과적인 핵 도입 서열(NIS) 역할을 하는 것으로 보고되어 있고 플라스미드에서 타겟 진핵 세포로의 고전사레벨을 가능하US하는 벡터XQ게 한다. 전체 SV40 복제 기원은 NIS에 포함되지 않으며 포유동물 세포에서 에피소말 복제를 지지하지 않는다. |
실시예
30
다가 벡터를 이용하여 초기화 후의
준우성
에피토프에
대한 면역 반응을 "구제" 또는 증폭하는 프로토콜
치료에 관련된 에피토프를 공동 발현하는 벡터의 한계로 잘 알려진 것은, 에피토프 중 하나가 면역성 유발에 있어서 주요한 역할을 하는 것으로 예측되는 반면, 다른 것들은 보조의 역할을 한다는 점이다 (특히 이러한 에피토프가 동일한 MHC 제한 요소에 결합될 때).
도 26에서 이러한 프로토콜을 개시한다: 8개의 HHD 생쥐 그룹(n=4)은 제0일, 제3일, 제14일 및 제17일에 pSEM를 림프절 주사하여 면역 처리했다. 플라스미드의 양은 25㎍/플라스미드/1일량 이었다. 제28일 및 제31일에, 생쥐에게 멜란-A 26-35(도 27a) 또는 티로시나제 369-377(도 27b)에 상응하는 증폭 펩티드를 25㎍의 펩티드/1일량으로 결절내 투여했다. 면역 반응은, 면역 종료뒤 2주 후에 멜란-A는 티로시나제 특이 시약을 이용하여 말초 혈액의 CD8+ T 세포를 테트라머 염색함으로써 측정했다.
도 27의 결과는, 한편으로는 pSEM을 이용한 프라이밍 처리로 멜란-A에 대한 현저한 반응을 유발했고 다른 한편으로는 티로시나제에 대한 반응을 검출할 수 없었다는 걸 보여준다. 이와 공동으로, 펩티드만으로 면역시킨 동물은 에피토프에 대하여 테트라머 반응을 검출할 수 없었다. 이 데이터는 멜란-A 에피토프가 티로시나제 에피토프에 대해 면역적으로 우세한 역할을 한다는 추측을 입증한다. 그러나 pSEM 프라이밍 후에 멜란-A 펩티드로 면역화시킨 동물에서, 티로시나제("자연 펩티드")로 증폭한 뒤 티로시나제에 대한 면역 반응(도 27b, 첫번째 그룹)은 멜란-A에 대해 달성된 레벨과 비교시 비슷한 강도였다.
요약하면, 티로시나제 펩티드를 림프절내 투여해서 상기 에피토프에 대하여 pSEM에 의해 초기화된 면역 반응을 구제했고, 따라서 반응을 개시하는데 이용된 벡터(pSEM)의 관점에서 멜란-A에 관련한 보조적인 역할을 극복했다.
실시예
31
다가 벡터를 이용하여 개시한 후
준우성
에피토프에
대한 면역 반응을 "구제" 또는 증폭하는 프로토콜: 세포독성 면역의 평가
면역화는 실시예 30에 기술된 바와 같이 행했다: 8개의 HHD 생쥐 그룹(n=4)은 제0일, 제3일, 제14일 및 제17일에 pSEM를 림프절 주사하여 면역 처리했다. 플라스미드의 양은 25㎍/1일량 이었다. 제28일 및 제31일에, 생쥐에게 멜란-A 26-35(도 28a) 또는 티로시나제 369-377(도 28b)에 상응하는 증폭 펩티드를 25㎍의 펩티드/1일량으로 림프절에 투여했다. 멜란-A 또는 티로시나제 에피토프 펩티드로 비장림프구의 체외 재자극에 따라 면역 종료한 후, 14일간 세포독성 분석으로 면역성을 평가했다. 요약하면, 비장림프구를 준비(비장 수득, 다지기, 적혈세포 용해)하고, rIL-2의 존재하에 LPS-자극처리, 멜란-A (도 28a) 또는 티로시나제 (도 28b) 펩티드 피복된 동형 pAPC로 7일간 배양했다. 세포를 세척하고, 51Cr-라벨화된 멜란-A+, 티로시나제+ 624.38 타겟 세포와 함께 4시간 동안 상이한 비율로 배양했다. 상청액에 방출된 방사능을 γ(감마)-계수기로 측정했다. 반응을 용해율(%) = (시료 신호 - 배경)/(최대 신호 - 배경) X 100으로 정량화했다. 이때의 배경은 분석 배지에 배양시 타겟 세포 단독에서 방출된 방사능이고, 최대 신호는 세제로 용해시킨 타겟 세포에서 방출된 방사능이다.
실시예 30에서와 같이, 도 28에 도시된 결과는 결절내 펩티드 증폭에 의해 면역 초기화 벡터(pSEM)에 관련하여 준우성인 에피토프(티로시나제)에 대한 면역성의 구제/증폭을 나타낸다.
실시예
32
초기화 벡터에 관련하여 하나는 우성이고 하나는
준우성인
두개의
에피토프에
대해 면역 반응을 동시적으로 공동 유발 및 증폭시키는 프로토콜
상술한 두개의 실시예에서 준우성 에피토프에 대한 반응의 구제는 우성 에피토프에 대한 반응의 증폭이 없는 곳에서 나타났다. 그 후 양측 반응의 동시 증폭을 시도했다.
도 29에서 보는 바와 같이, 이러한 프로토콜은 다음과 같다: 4개의 HHD 생쥐 그룹(n=6)은 제0일, 제3일, 제14일 및 제17일에 pSEM를 림프절 주사하여 면역 처리했다. 플라스미드의 양은 25㎍/1일량 이었다. 제28일 및 제31일에, 생쥐에게 멜란-A 26-35(좌측 서혜부 림프절) 및 티로시나제 369-377(우측 서혜부 림프절) 에피토프에 상응하는 펩티드를 25㎍의 펩티드/1일량으로 사용하여 동시 면역화했다. 면역 반응은, 면역 종료뒤 2주 후에 멜란-A(도 30a) 또는 티로시나제(11b) 특이 시약을 이용하여 말초 혈액의 CD8+ T 세포를 테트라머 염색함으로써 측정했다. 데이터는 CD8+ 서브군 내의 평균% 테트라머+ 세포로 표시했다. pSEM 플라스미드로 프라이밍 처리 및 펩티드 유사체 멜란 A 26-35 A27Nva {E(Nva)AGIGILTV; 서열번호 9}(좌측 림프절) 및 티로시나제 369-377 V377Nva {YMDGTMSQ(Nva); 서열번호 10}(우측 림프절)으로 증폭 처리된 동물은, 다색 테트라머 염색(도 30c)으로 측정시 각 에피토프에 특이적인 다가 면역 반응을 나타냈다. 도트 플롯은 말초 혈액에서 취한 전체 CD8 양성 세포에 이용되었고 각 생쥐 개체에 대하여 2중 면역 반응을 나타낸다. 테트라머 레벨은 CD8 양성 T 세포로써 계산되었다.
도 30의 결과는 멜란 A 및 티로시나제 펩티드의 공동 투여 즉, 면역 초기화 벡터(pSEM)에 관하여 우성/준우성 관계가 있는 멜란 A 및 티로시나제 에피토프 양쪽에 대해 면역 반응을 공동 증폭할 수 있다.
실시예
33
하나는 우성 및 하나는
준우성인
두개의
에피토프에
대한 세포독성 반응의 공동 유발 및 증폭 - 펩티드 혼합물을 이용하는 초기화 벡터 안에서
보다 단순화된 제조물 제형 방법을 설명하기 위하여, 우성 및 준우성 에피토프를 발현하는 2가 플라스미드를 함께 사용하고, 이어서 앞서의 실시예에서 언급했던 것처럼, 펩티드를 각각 개별 투여하는 것이 아니라 우성 및 준우성 펩티드 혼합물을 투여함으로써 각 에피토프에 대한 반응 증폭 처리를 행하는 또다른 방법을 시험했다.
6개의 HHD 생쥐 그룹(n=6)을 상기 실시예에서 설명했던 것처럼 면역화하고(또는 각각 개별 면역하지 않고), 림프절 내에서 펩티드(멜란-A+ 각종 티로시나제 펩티드들의 혼합물로서)를 12.5㎍/펩티드/1회분의 약량으로 사용하여 증폭시켰고, 이것의 스케줄은 다음과 같다: 제0일, 제3일에 플라스미드; 제14일 및 제17일에 펩티드를 투여하고 2주 후에 상기의 순서를 한번 더 반복한다. 이용된 티로시나제 펩티드는: 상술한 Tyr 369-377; 플라스미드가 코드화하였으나 변형 세포에 의해서는 생성되지 않는 Tyr 1-9; 및 플라스미드에 의해 코드화되지 않은 Tyr 207-215 이다.
면역요법 즉 상술한 바와 같이 CFSE 분석으로 종결 2주 뒤에 면역 반응을 측정했다. 요약하면: 비장림프구를 리터메이트 대조군 HHD 생쥐로부터 분리하여 20㎍/mL ELA 또는 20㎍/ml의 티로시나제 펩티드로 2시간 동안 배양했다. 이들 세포를 다시 CFSEhi 및 CFSEmed 형광물로 염색한 후, 면역된 생쥐에 대해, CFSElo 형광물로 염색한 등량비의 대조군 비장림프구와 더불어 공동으로 정맥 주사했다. 18시간 후 비장을 제거하고, 흐름 세포분석법을 이용 및 하기의 식에 따라 체내 특이적 용해율(%)을 계산함으로써 타겟 세포의 특이적 소거 상태를 측정했다:
{[1-(% CFSEhi or med/% CFSElo )] - [1-(% CFSEhi or med 대조군/% CFSElo 대조군)]} x 100
여기서 각 %는 각각의 피크로 나타낸 전체 시료의 비율을 표시한다.
전체적으로, 도 31에 나타낸 결과 (멜란-A 에피토프로 피복 혹은 티로시나제 에피토프로 피복한 비장림프구에 대한 체내 특이적 용해율 %; 또한 x 축은 증폭에 이용된 펩티드를 도시한다)로부터, 우성(멜란-A) 및 준우성(티로시나제 369-377) 에피토프에 대한 면역성의 공동 증폭은 플라스미드 초기화/펩티드 증폭의 방식에서 증폭 단계 중에 펩티드 혼합물을 이용하여 실현했다. 또한 펩티드만 사용하면 효과적인 반응을 얻지 못했다. 상기의 펩티드 조합체에 있어서, 양쪽 에피토프에 대해 중요한 반응을 얻었다. 그러나 펩티드 혼합물을 이용하여 성공할 예상 확률은 각종 펩티드의 MHC 결합 친화성이 서로 유사할 때 더 커지며 반대로 친화성간 차이가 벌어지면 성공에 대한 예상도 낮아진다.
실시예
34
고차
다가성
(
higher
order
multivalency
) 반응의 유발
이 연구에서, 면역성은 두개의 2가 플라스미드로 유발 및 4개의 펩티드 에피 토프 유사체로 증폭시켰다. 플라스미드 pSEM을 이용하여 멜란-A 및 티로시나제 에피토프에 대한 면역성을 유발했고, 상술한 바와 같이 유사체 멜란-A(A27Nva) 및 티로시나제(V377Nva)를 이용하여 반응을 증폭했다. 면역성은 또한 플라스미드 pBPL을 이용하여 에피토프 SSX2 41-49, NY-ESO-1 157-165에 대해 유발시켰다. pBPL로 코드화한 면역원 폴리펩티드는 미국 출원 제10/292,413호(공개번호 제20030228634 A1호)에 개시되어 있으며, 상기 출원은 "타겟 관련 항원의 에피토프를 코드화할 발현 벡터 및 그 설계 방법"을 발명의 명칭으로 하며 그 내용 전반은 본 명세서에 참고로서 수록되어 있다. 증폭에는 펩티드 에피토프 유사체 SSX2 41-49(A42V) 및 NY-ESO-1 157-165 (L158Nva, C165V)를 이용했다. 에피토프 유사체에 대한 기타의 연구도 여기에 참고로서 인용 수록된 에피토프 유사체 관련 출원에 포함된다. 이들 유사체는 통상 자연계 서열과 비교할 때 MHC에 대한 결합의 안정성 및 탁월한 친화성을 갖고 있지만 자연 서열을 인식하는 TCR와 교차 반응한다.
3개의 암컷 HHD-A2 생쥐 그룹은 서혜부 림프절에 좌우 대칭 형태로 투여한 pSEM/pBPL (각각 100㎍ 플라스미드/일; 25㎕/주사된 림프절) 혼합물로 면역 처리했다. 그룹 1(n=10)은 전체 프로토콜에서 제1일, 제4일, 제15일, 제18일, 제28일, 제32일, 제49일 및 제53일에 주사한 플라스미드만 수용했다. 그룹 2 및 3 (각 그룹당 n=25)은 제1일, 제4일, 제15일 및 제18일에 플라스미드를 주사 공급하고 그 후로는 펩티드를 수용했다. 제25일에, 면역된 동물로부터 혈액을 수거하고 MHC 테트라머 분석을 이용하는 흐름 세포분석법에 따라 CD8+ T 세포를 분석했다. 수득한 반응을 자연 상태의 리터메이트 대조군 생쥐(n=5)와 비교했다.
그룹 2의 생쥐는 제28일, 제32일, 제49일 및 제53일에 펩티드 티로시나제 V377Nva(25㎍/일)를 우측 림프절에, 또한 SSX2 A42V(25㎍/일)를 좌측 림프절에 각각 투여하여 증폭시켰다. 그룹 3의 동물은 제28일 및 제32일에 펩티드 티로시나제 V377Nva(25㎍/일)를 우측 림프절에, 또한 SSX2 A42V(25㎍/일)를 좌측 림프절에 각각 투여하고, 다시 제49일 및 제53일에 NY-ESO-1 L158Nva, C165V(12.5㎍/일)를 우측 림프절에 또한 멜란-A A27Nva(25㎍/일)를 좌측 림프절에 각각 투여함으로써 증폭 처리했다. 주사물은 모두 25㎍/주사된 림프절이었다. 제39일 및 제60일에 각 그룹으로부터 혈액을 수거했고 CD8+ T 세포 분석은 테트라머 분석을 이용하여 시행했다. 반응을 자연 상태의 리터메이트 대조군(n=5)과 비교하였다.
제41일 및 63일에, 각 그룹에서 선별된 동물을 희생시키고 비장을 꺼내어 비장림프구 세포 현탁액 상에서 IFNγ ELISPOT 분석했다.
제62일에, 각 그룹에서 선별된 동물에 대하여, 4개의 종양 관련 항원을 발현하는 CFSE-라벨화 624.38 인간 멜라노마 세포를 정맥주사로 투여했고 따라서, SSX2, NY-ESO-1, 티로시나제 및 멜란 A 특이적 CTL을 위한 타겟 용도로 사용했다.
플라스미드가 실험 완충액(127mM NaCl, 2.5mM Na2HPO4, 0.88mM KH2PO4, 0.25mM, Na2EDTA 및 0.5% ETOH를 물에 용해하여 제조; 2mg/ml 각 플라스미드, 4mg/ml 전체) 내에서 형성되었다. 멜란-A 26-35 (A27Nva), 티로시나제 369-377(V377Nva) 및 SSX2 41-49 (A42V) 유사체를 1.0mg/ml 농도의 PBS 내에서 형성되었다. NY-ESO 157-165 (L158Nva, C165V) 펩티드 유사체는 5% DMSO를 함유하는 0.5mg/ml 농도의 PBS에서 면역 용도로 제조되었다. 세포분석 데이터는 BD FASC 캘리버형 흐름 세포분석기를 사용하여 수거하고, 림프구 집단에서 CellQuest 소프트웨어를 게이트 조작하여 상기 데이터를 분석하였다. PBMC는 FITC 공역화된 래트 항마우스 CD8a(Ly-2) 모노클로날 항체(BD Biosciences, 553031) 및 MHC 테트라머; 또는 HLA-A*0201 SSX2 (KASEKIFY)(서열번호: 11)-PE MHC 테트라머(Beckman Coulter, T02001), HLA-A*0201 NY-ESO (SLLMWITQC)(서열번호: 12)-APC MHC 테트라머(Beckman Coulter, T02001), HLA-A*0201 멜란-A (ELAGIGILTV)(서열번호: 1)-PE MHC 테트라머(Beckman Coulter, T02001), 또는 HLA-A*0201 티로시나제 (YMDGTMSQV)(서열번호: 13)-APC MHC 테트라머(Beckman Coulter, T02001) 등에 의해 공동 염색되었다.
IFN-γ ELISpot 분석을 다음처럼 행했다. 안락사한 동물로부터 제27일 및 제62일에 비장을 제거했고, 밀도 원심분리(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs)를 이용하여 단핵 세포를 분리하여 HL-1 배지에 재현탁했다. 비장림프구(5 또는 3 x 105 세포/웰)을 10㎍의 멜란-A 26-35 A27L, 티로시나제 369-377, SSX2 41-49 또는 NY-ESO-1 157-165 펩티드를 이용하여 96 웰 막필터 플레이트(Multiscreen IP membrane 96-well plate, Millipore)의 3중 웰 안에서 배양했다. 시료를 실험 진행에 앞서 37℃에서 5% CO2 및 100% 습도하에 42시간 동안 배양했다. 비장림프구로 배양하기에 앞서 마우스 IFN-γ 피복 항체를 이용하여 필터를 피복하고, 물로 세포를 용해 및 필터로부터 씻어낸 후 비오티닐화 검출 항체를 첨가하여 신호를 발생시켰다 (IFN-γ 항체쌍, Ucytech). Ucytech에서 구한 GABA 공역물 및 기질을 IFN-γ 스폿 생성 에 이용했다. 면역된 동물의 CTL 반응은, 상기 스폿 생성 24시간 후 IFN-γ 스폿 분석용으로 조정된 ELISpot 판독 소프트웨어를 이용한 AID 국제 플레이트 리더에서 측정했다.
체내 세포독성 분석은 제61일에 다음과 같이 행하였다. 인간 624.38(HLA A*0201pos) 배양된 멜라노마 종양 세포를 CFSEhi (Vybrant CFDA SE 세포 추적 키트, 분자 탐식자) 형광물(15분간 1.0μM)로 염색했다. 또한, 인간 624.28 HLA-A2(HLA A*0201neg) 배양된 멜라노마 종양 세포를 CFSElo 형광물(15분간 1.0μM)로 염색했다. 2마리의 생쥐를 각 그룹(그룹 1, 2 및 3)에서 고 테트라머 레벨에 기초하여 선택했고 2마리의 자연 상태 대조군 생쥐는 20 x 106 CFSEhi 라벨의 624.38(HLA A*0201pos) 인간 멜라노마 세포를 같은 수의 CFSElo 라벨의 624.28(HLA A*0201neg)와 혼합한 것을 정맥주사를 통해 2시간 간격으로 나누어 전달한 분취물 형태로 수용했다.
약 14시간 후, 생쥐를 희생시키고, 폐조직을 제거하고, 단일 세포 현탁액을 제조한 뒤, 흐름 세포분석법으로 CFSE 형광성을 측정함으로써 A*0201pos 인간 타겟 세포의 특이적 소거를 측정했다. 특이적 용해율(%)은 상술한 바와 같이 계산하였다.
결과로 얻은 면역 반응은 프로토콜의 각 지점에서 평가했다. 도 32는 3개의 그룹 모두에 공통이었던 4차 플라스미드 주사후 7일 뒤에 테트라머 분석으로 확인된 반응을 도시한다. 티로시나제 에피토프를 제외한 모든 그룹에서 실질적으로 반 응이 관측되었다. 멜란-A 26-35 및 NY-ESO-1 157-165는 우성의 에피토프인 것으로 확인되었다. 더욱 균형적인 4가 면역 반응을 얻기 위하여, 티로시나제 V377Nva 및 SSX2 A42V 펩티드 에피토프 유사체를 그룹 2 및 3에 투여하여 준우성 에피토프에 대한 반응을 증폭시켰다. 그룹 1은 플라스미드 혼합물로 추가 면역했다. 도 33에서 보는 바와 같이, 플라스미드를 이용한 추가 면역(그룹 1)만 우성 에피토프에 대한 반응을 증폭시켰다. 이와 대조적으로, 2개의 준우성 에피토프에 상응하는 펩티드를 투여하자, 4개의 에피토프에게 모두 더욱 균형적인 반응을 가져왔다. 도 34는 충실한 4가 반응을 생성할 수 있음을 입증하는, 선택된 동물 개체의 반응을 나타낸다. 제27일에 희생시킨 생쥐 서브군의 IFN-γ ELISpot 분석으로 테트라머 데이터(도 35a)에서 관찰된 일반 패턴을 확인했다. 또다른 생쥐 그룹은 제59일에 완료된 추가의 증폭 단계후 제62일에 희생시키고, 이것에 대해 IFN-γ ELISpot 분석을 행했다(도 35b). 그룹 1에서, 최종 단계의 면역시 다시 플라스미드 혼합물을 사용했으며 초기 단계의 면역에서 관찰된 것과 유사한 반응 형태를 지속했다. 준우성 에피토프에 상응하는 펩티드만 사용할 경우(그룹 2), 4개의 에피토프에 대해서 비교적 균형잡힌 반응을 유지하였다. 4개의 에피토프 모두에 상응하는 펩티드를 그룹 3에 투여했다. 티로시나제 에피토프에 대한 반응의 영향으로 멜란-A 에피토프의 우세성이 다시 나타났으나, 에피토프에 대한 큰 반응이 여전히 관찰되었다. 두번째 시점에서 희생시킨 동물군의 일반적인 반응성은 서로 상이하기 때문에, 도 35a 및 35b에 도시된 반응의 절대적 강도는 직접 비교할 수 없다는 점에 유의한다. 체내 세포독성 활성 역시, 타겟 항원 4종류 모두를 발현하는 CFSE 라벨화된 인간 종양 세포를 이 용하여 실험해서 평가했다. 종양 세포는 SSX2, PRAME 티로시나제 및 멜란-A를 자연 발현하는 세포주 624.38의 유도체였으며, 이 유도체는 안정하게 NY-EOS-1을 발현하기 위하여 플라스미드 벡터를 이용해서 변형시켰다. 자연 상태의 생쥐에서 예상한 바와 같이, 테트라머의 배경 레벨이나 ELISpot 분석에 따른 IFN-γ 반응에서, HLA-A2- 대조군(도 36a)과 비교시 HLA-A2+ 종양 세포의 특이적 소실은 나타나지 않는다. 그러나 실제로 4가 반응이 있는 생쥐에게서 특이적 소실이 관측되었으며, 더 균형적인 반응은 더 우수한 결과를 가져왔다. 테트라머 및 ELISpot 분석으로 확인된 에피토프 특이적 반응을 도 36b(71%의 특이적 용해율) 및 도 36c(95%의 특이적 용해율)과 같이 비교한다. 실질적으로 1가 반응을 가진 생쥐에서는 특이적 용해 현상이 관찰되지 않았다. 1가 반응으로 인한 체내 세포독성도 상술한 내용에서 확인되었으나(실시예 7), 이 실험에서 타겟 세포는 에피토프 발현성이 현저히 증가했다. 따라서, 다가 반응은 타겟 항원 발현 레벨의 방호 효과를 극복하는 것으로 확인되었다.
실시예
35
다가 면역성을 유발하는 보편적인 방법
이 방법은 (도 37에서 도시한 바와 같이) 다음의 단계들을 포함한다.:
상이한 항원 또는 동일한 항원으로부터 에피토프를 확인한다. 이러한 에피토프는 서로 상대적인 우성/준우성 (예, 광범위하고 상이한 크기의 발현이나 표현, TCR 기술의 편향 등)의 관계가 있거나 자연 특성 측면에서 공동으로 우성이 될 수도 있다.
이러한 에피토프에 관련된 서열을 보상하고 동일한 판독 프레임 혹은 동일한 벡터, 예를 들면, 에피토프에 포함되는 발현 벡터를 가공한다. 새로운 환경은 자연 특성과 비교시 서로에 대한 우성/준우성의 관계를 변경하거나 새로 확립할 수도 있다.
벡터를 이용한 면역화는 다른 것들과 비교하여 상대적인 특이성(우성 에피토프)에 의해 우세해질 수 있는 반응을 개시한다.
상응하는 펩티드를 투여하여 준우성 에피토프에 대한 반응을 증폭한다. 펩티드는 자연 서열이거나 이의 유사체일 수 있다. 펩티드는 단독으로 투여하거나 우성 및/또는 준우성 에피소드에 상응하는 다른 펩티드와 함께 같은 위치 또는, 더 바람직하게, 각각 다른 위치에 투여할 수도 있다.
이상과 같이 기술한 본 발명의 실시예에 따른 방법은 여기에 포함되는 각종 조성물, 항원, 에피토프, 유사체 등을 다르게 변경할 수 있다. 예를 들면, 기타 다른 종류의 암 항원을 이용할 수 있다. 또한 다수의 에피토프를 교체할 수 있고 본원에 기술된 것을 포함한 각종 에피토프 유사체를 사용할 수도 있다. 본 발명의 방법은 바이러스 질환이나 질병에 대한 다가 면역 반응을 포함, 면역 반응을 일으키는데 사용할 수 있다.
본 발명의 각종 변형 및 대안에 대하여 기술하였다. 당해 분야의 지식을 가진 자라면 다른 변형과 대안도 가능함을 명백히 이해할 것이다. 본 발명의 다양한 구현예는 이러한 변형 및 대안을 특별히 포함하거나 배제할 수도 있다.
여기서 인용한 각 문헌들은 그 내용 전반을 본 명세서에 참고로서 수록하고 있다.
상술한 바와 같이 제I류 MHC 제한 에피토프에 대한 면역 반응, 더 구체적으로는 다가 반응을 유발, 향상 및 지속시키는 본 발명의 방법 및 조성물은 백신 및 치료제와 같은 면역 조성물의 제조 및 염증성 질환의 예방이나 치료에 적절히 이용할 수 있다.
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1 5
Claims (45)
- 제1 항원의 적어도 일부를 함유하거나 또는 코드화하는 제1 면역원을 포함하는 제1 비말동반 조성물(entraining composition) 및 제2 항원의 적어도 일부를 함유하거나 또는 코드화하는 제2 면역원을 포함하는 제2 비말동반 조성물; 및포유동물의 림프계에 직접적으로 연속 전달하기 위한 제1 펩티드를 포함하는 제1 증폭 조성물을 포함하되,상기 제1 항원의 에피토프는 면역 보조역할을 하고, 상기 제 2항원의 에피토프는 상호 관련하여 면역 주요역할을 하는 것으로 상정하고, 상기 제1 펩티드는 상기 제1 항원의 보조 에피토프에 상응하며, 상기 제1 증폭조성물은 상기 제1 또는 제2 비말동반 조성물과 동일하지 않고, 상기 제1 및 제2 비말동반 조성물과 상기 제1 증폭조성물의 투여는 상기 보조 및 주요 에프토프와의 감지 가능한 반응을 유발하는 것을 특징으로 하는 포유동물의 면역을 위한 면역조성물 군(a set of immunoginic compositions).
- 제 1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 비말동반 조성물은 동일한 것인 면역조성물 군.
- 제 2항에 있어서, 단일 거대분자는 상기 제1 및 제2 면역원을 포함하는 것인 면역조성물 군.
- 제 1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 비말동반 조성물에 연속하여 포유동물의 림프계에 직접 전달하기 위한 제2 펩티드를 함유하는 제2 증폭조성물을 추가로 포함하되, 상기 제2 펩티드는 상기 제2 항원의 에피토프에 상응하고, 상기 제2 증폭조성물은 상기 제1 또는 제2 비말동반 조성물과 동일하지 않은 것인 면역조성물 군.
- 제 4항에 있어서, 상기 제1 및 제2 증폭조성물은 각각 제1 및 제2 펩티드를 포함하는 것인 면역조성물 군.
- 제 4항에 있어서, 상기 제1 및 제2 비말동반 조성물은 서로 다른 부위에 전달되는 것인 면역조성물 군.
- 제 4항에 있어서, 상기 제1 및 제2 펩티드는 서로 다른 부위에 투여되는 것인 면역조성물 군.
- 제 4항에 있어서, 상기 제1 면역원은 상기 제1 펩티드가 투여된 곳과 동일한 부위에 전달되는 것인 면역조성물 군.
- 제 4항에 있어서, 상기 제1 및 제2 펩티드는 동일한 시간에 투여되는 것인 면역조성물 군.
- 제 4항에 있어서, 상기 제1 및 제2 펩티드는 서로 다른 날에 투여되는 것인 면역조성물 군.
- 제 1항에 있어서, 상기 제1 항원은 티로시나제, 멜란-A, SSX-2, NY-ESO-1, PRAME, PSMA, VEGFR2, VEGF-A 및 PLK1로 이루어진 군에서 선택되는 것인 면역조성물 군.
- 제 1항에 있어서, 림프계에 대한 직접 전달은 서혜부 림프절에 대한 투여를 포함하는 것인 면역조성물 군.
- 제 1항에 있어서, 면역화는 CTL 반응을 유발하는 것을 포함하는 것인 면역조성물 군.
- 제 1항에 있어서, 상기 전달은 제1 펩티드와 동일한 에피토프형 펩티드를 전달하는 것을 포함하고, 상기 제1 증폭조성물은 다량의 에피토프형 펩티드를 함유함으로써 상기 제1 또는 제2 비말동반 조성물과 상이한 것인 면역조성물 군.
- 제 1항에 있어서, 상기 제1 비말동반 조성물 및 제2 비말동반 조성물 중 적어도 하나는 면역강화제를 추가로 포함하는 것인 면역조성물 군.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 비말동반 조성물 및 증폭조성물은 반복적 면역주기(repeated cycles of immunizations)를 위한 것인 면역조성물 군.
- 제 19항에 있어서, 주기 반복은 의학적 요구를 달성하기 위해 효과적인 면역반응을 유지하는데 충분한 시간 동안 계속되는 것인 면역조성물 군.
- 제 20항에 있어서, 상기 주기 반복은 면역반응의 다가성(multivalency)을 개선하는 것인 면역조성물 군.
- 2개 이상의 항원 각각에 대한 1개 이상의 비말동반약(entraining dose) 및 적어도 하나의 증폭약을 포함하되, 상기 각 항원에 대한 비말동반 약은 면역원 혹은 상기 면역원을 코드화하는 핵산을 포함하며, 면역강화제를 추가로 포함하고, 상기 면역원은 상기 항원 중 적어도 일부를 포함하며; 제1 항원의 에피토프는 면역 보조역할을 하고, 상기 제 2항원의 에피토프는 상호 관련하여 면역 주요역할을 하는 것으로 상정하고; 상기 증폭약은 포유동물의 림프계에 직접적인 연속 전달을 위한 펩티드 에피토프를 포함하며, 상기 펩티드는 보조 에피토프에 상응하고, 상기 비말동반약과 증폭약은 동일하지 않은 것을 특징으로 하는, 포유동물에서의 면역반응 유발을 위한 면역 조성물군(a set of immunoginic compositions).
- 삭제
- 제 22항에 있어서, 상기 면역원을 코드화하는 핵산은 면역강화제 역할을 하는 면역자극 서열을 추가로 포함하는 것인 면역 조성물군.
- 제 22항에 있어서, 상기 면역강화제는 TLR 리간드, 면역자극 서열, CpG-함유 DNA, dsRNA, 세포내 패턴 인식 수용체(PRR) 리간드, LPS, 키라야(quillaja) 사포닌, 투카레졸 및 프로-염증성 사이토킨으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 면역 조성물군.
- 제 22항에 있어서, 상기 비말동반약은 결절내 전달에 적용되는 것인 면역 조성물군.
- 삭제
- 제 26항에 있어서, 핵산의 일일 투약량은 25 내지 2500㎍인 면역 조성물군.
- 제 26항에 있어서, 상기 증폭약은 수용자의 kg 당 5 내지 5000㎍의 펩티드인 면역 조성물군.
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