JP2004536787A - 血液免疫反応の誘導による悪性腫瘍治療方法 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、悪性腫瘍を治療する方法としてのワクチン特異免疫反応を含む血液免疫反応の誘出に関する。
【背景技術】
【0002】
本出願は、2001年3月9日出願の米国仮特許出願第60/274679号の利益を主張するものである。
【0003】
この10年のヒト癌抗原の分子同定は(Knuth等、1989、「Cytolytic T−cell clones against an autologous human melanoma:specificity study and definition of three antigens by immunoselection」、Proc Natl Acad Sci USA 86:2804〜2808、van der Bruggen等、1991、「A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma」、Science 254:1643〜1647、Rosenberg、S.A.1991、「Cancer vaccines based on the identification of genes encoding cancer regression antigens」、Immunol Today 18:175〜182)、それらの抗原を特異的に標的とする抗原特異癌免疫療法の新時代の到来を告げた(Celluzzi等、1996、「Peptide−pulsed dendritic cells induce antigen−specific CTL−mediated protective tumor immunity」、J Exp Med 183:283〜287、Zitvogel等、1996、「Therapy of murine tumors with tumor peptide−pulsed dendritic cells:dependence on T cells,B7 costimulation,and T helper cell 1−associated cytokines」、J Exp Med 183:87〜97、Sogn、J.A.1998、「Tumor immunology:the glass is half full」、Immunity 9:757〜763、Gilboa、E.1999、「The makings of a tumor rejection antigen」、Immunity 11:263〜270)。しかしながら、いくつかのそのようなアプローチ(たとえば、ペプチド、DNAワクチン、およびウイルスベクター)は、実際の患者治療においてほとんど、またはまったく成功していない(Gilboa、E.1999、Immunity 11:263〜270、Pardoll、D.M.1998、「Cancer vaccines」、Nat Med 4:525〜531、Fong、L.およびEngleman、E.G.2000、「Dendritic cells in cancer immunotherapy」、Annu Rev Immunol 18:245〜273)。特に、同時に複数の腫瘍抗原を用いてヒトを免疫するのが困難であることが示されている。
【0004】
樹状細胞(DC)は、免疫反応を開始し、調節するように特殊化された抗原提示細胞である(Steinman、R.M.1991、「The dendritic cell system and its role in immunogenicity」、Annu Rev Immunol 9:271〜296、Banchereau等、2000、「Immunobiology of dendritic cells」、Ann Rev Immunol 18:767)。アジュバントとしてのそれらの臨床上の使用は、血液単球(Romani等、1994、「Proliferating dendritic cell progenitors in human blood」、J Exp Med 180:83〜93、Sallusto、F.およびLanzavecchia、A.1994、「Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony−stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha」、J Exp Med 179:1109〜1118)またはCD34+前駆細胞(Caux等、1992、「GM−CSF and TNF−alpha cooperate in the generation of dendritic Langerhans cells」、Nature 360:258〜261)から培養において多数の樹状細胞を産生する方法の発達によって促進されてきた。米国特許第6004807号は、10%(v/v)熱不活性化ウシ胎児血清を補足した組織培地を用いるCD34造血前駆細胞からの樹状細胞の産生を教示している。動物モデルにおいて、TAA負荷DCは防御/拒絶抗腫瘍反応を誘導することが報告されている(Boczkowski等、1996、「Dendritic cells pulsed with RNA are potent antigen−presenting cells in vitro and in vivo」、J Exp Med 184:465〜472、Flamand等、1994、「Murine dendritic cells pulsed in vitro with tumor antigen induce tumor resistance in vivo」、Eur J Immunol 24:605〜610、Mayordomo等、1995、「Bone marrow−derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity」、Nat Med 1:1297〜1302、Mayordomo等、1997、「Bone marrow−derived dendritic cells serve as potent adjuvants for peptide−based antitumor vaccines」、Stem Cells 15:94〜103、Porgador、A.およびGilboa、E.1995、「Bone marrow−generated dendritic cells pulsed with a class I−restricted peptide are potent inducers of cytotoxic T lymphocytes」、J Exp Med 182:255〜260、Song等、1997、「Dendritic cells genetically modified with an adenovirus vector encoding the cDNA for a model antigen induce protective and therapeutic antitumor immunity」、J Exp Med 186:1247〜1256、Specht等、1997、「Dendritic cells retrovirally transduced with a model antigen gene are therapeutically effective against established pulmonary metastases」、J Exp Med 186:1213〜1221、Toes等、1996、「Protective antitumor immunity induced by immunization with completely allogeneic tumor cells」、Cancer Res 56:3782〜3787)。
【0005】
いくつかの進行中の臨床試験および報告された臨床試験は、ヒト癌においてワクチンとしてTAA負荷DCを用いている(Gilboa、E.1999、Immunity 11:263〜270、Timmerman、J.M.およびLevy、R.1999、「Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy」、Annu Rev Med 50:507〜529、Palucka等、1999、「Dendritic cells and tumor immuniy」、Curr Opin OEM Drugs、Gilboa等、1998、「Immunotherapy of cancer with dendritic−cell−based vaccines」、Cancer Immunol Immunother 46:82〜87、Bell等、1999、「Dendritic cells」、Advances in Immunology 72:255〜324、Banchereau等、2000、「Immunobiology of dendritic cells」、Ann Rev Immunol 18:767〜812)。予備試験においていくつかの反応が報告されており、(i)リンパ腫イディオタイプ負荷血液由来DCの注射に基づく先駆的研究(Hsu等、1996、「Vaccination of patients with B−cell lymphoma using autologous antigen−pulsed dendritic cells」、Nat Med 2:52〜58)、(ii)GM−CSFを用いて単球を培養することによって産生されたペプチドパルスAPCの投与(Mukherji等、1995、「Induction of antigen−specific cytolytic T cells in situ in human melanoma by immunization with synthetic peptide−pulsed autologous antigen presenting cells」、Proc Natl Acad Sci USA 92:8078〜8082)、(iii)メラノーマペプチド負荷単球由来DCによるワクチン接種(Nestle等、1998、「Vaccination of melanoma patients with peptide−or tumor lysate−pulsed dendritic cells」、Nat Med 4:328〜332、Thurner等、1999、「Vaccination with mage−3A1 peptide−pulsed mature,monocyte−derived dendritic cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma」、J Exp Med 190:1669〜1678)、および(iv)前立腺特異膜抗原(PSMA)ペプチドパルス単球由来DCの注射(Salgaller等、1998、「Report of immune monitoring of prostate cancer patients undergoing T−cell therapy using dendritic cells pulsed with HLA−A2−specific peptides from prostate−specific membrane antigen(PSMA)」、Prostate 35:144〜151)を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ワクチンの有効性の判定は、免疫療法プロトコルにおいてもっとも難しいパラメータの1つである。最終的な有効性は、腫瘍退縮の割合、無病生存期間、または少なくとも無増悪期間によって測定されるべきであるが、これらのエンドポイントは充分に長い追跡を必要とする。したがって、所与の免疫療法アプローチが適切であるかどうかを断定するためには、これらの有効性の条件に基づく数年の臨床試験が必要である。そのため、早期の測定を可能にし、臨床転帰を予測するいわゆる「代替マーカ」の研究が進行中である。現時点で、腫瘍および/またはワクチン特異免疫反応のin vitro測定は、代替マーカとして適切であることは示されていない(Srivastava、P.2000、「Immunotherapy of human cancer:lessons from mice」、Nat Immunol 1:363〜366に報告)。さらに、血液などのもっとも容易に得られる器官において測定された反応は不適切であると考えられている。実際、大多数の試験において、誘発された免疫反応と臨床反応との間には大きな違いがあり、ほとんど相関は見出されない。これらの所見は、腫瘍抗原に特異的なT細胞の存在ならびに腫瘍退縮に注目する腫瘍病変部のバイオプシーなどの別法の開発を促した。しかしながら、そのようなアプローチは、得られる病変部が限られており、ゲノム解析を行うことのできる医療施設も少数に限られている。さらに、単離T細胞は通常、その特異性および機能性を評価するためにin vitroでの増幅および困難な技術を要する。したがって、そのような方法は、大規模な臨床試験に有用でなく、成功していないアプローチの早期判定を可能にするとは思われない。
【課題を解決するための手段】
【0007】
ワクチン特異的な免疫反応を含む血液免疫反応の誘出と臨床反応との関係に基づく悪性腫瘍の治療方法がここに見出された。患者の経時的な総腫瘍免疫スコアの測定は、時宜を得て治療の有効性を予測し、患者の臨床転帰をモニターする手段を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0008】
一態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された少なくとも2種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含むワクチン接種用の有効量のベクターをそのような治療を必要としている哺乳動物に投与することを含む方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはCD34+造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【0009】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、少なくとも2種以上の腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドを含むワクチン接種用の有効量のベクターをそのような治療を必要としている哺乳動物に投与することを含み、そのワクチンが哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法である。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【0010】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、ワクチン接種用の有効量の2種以上のベクターをそのような治療を必要としている哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された1種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含む方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはCD34+造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【0011】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、ワクチン接種用の有効量の2種以上のベクターをそのような治療を必要としている哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された1種の独特の作用剤を含み、ベクターが哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法である。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【0012】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、少なくとも2種の腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドを負荷した抗原提示細胞を含むワクチン接種用の有効量のベクターをその哺乳動物に投与することを含む方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはCD34+造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【0013】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、少なくとも2種以上の腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドを含むワクチン接種用の有効量のベクターをその哺乳動物に投与することを含み、そのベクターが哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法である。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【0014】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、ワクチン接種用の有効量の2種以上のベクターをその哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された1種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含む方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはCD34+造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【0015】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、ワクチン接種用の有効量の2種以上のベクターをその哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された1種の独特の作用剤を含み、ベクターが哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法である。この方法において、ワクチン接種用のベクターは、コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含むこともできる。
【0016】
他の態様において、本発明は、ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが少なくとも2種以上の腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、またはコントロール抗原を負荷した抗原提示細胞を含み、第1の時点でワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第1サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で免疫前細胞を保存する段階、ワクチンで患者を免疫する段階、その後の少なくとも1時点で患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、個別かつ同時に外因性抗原の不在下で免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、免疫前細胞および免疫後細胞の増殖量を測定する段階、免疫後細胞の増殖量を免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、1以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはCD34+造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。
【0017】
他の態様において、本発明は、ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが2種以上のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された1種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、第1の時点でワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第1サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で免疫前細胞を保存する段階、ワクチンで患者を免疫する段階、その後の少なくとも1時点で患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、個別かつ同時に外因性抗原の不在下で免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、免疫前細胞および免疫後細胞の増殖量を測定する段階、免疫後細胞の増殖量を免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、1以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはCD34+造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。
【0018】
他の態様において、本発明は、ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが少なくとも2種以上のワクチン接種のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された1種の独特の作用剤を含み、そのベクターが哺乳動物において抗原提示細胞を標的とし、第1の時点でワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第1サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で免疫前細胞を保存する段階、ワクチンで患者を免疫する段階、その後の少なくとも1時点で患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、個別かつ同時に外因性抗原の不在下で免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、免疫前細胞および免疫後細胞の増殖量を測定する段階、免疫後細胞の増殖量を免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、1以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。
【0019】
他の態様において、本発明は、ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが少なくとも2種以上の腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、またはコントロール抗原を含むワクチン接種用ベクターを含み、そのベクターが哺乳動物において抗原提示細胞を標的とし、第1の時点でワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第1サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で免疫前細胞を保存する段階、ワクチンで患者を免疫する段階、その後の少なくとも1時点で患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、個別かつ同時に外因性抗原の不在下で免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、免疫前細胞および免疫後細胞の増殖量を測定する段階、免疫後細胞の増殖量を免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、1以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。
【0020】
他の態様において、本発明は、ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも2種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、第1の時点で患者をワクチンで免疫する段階、免疫後の少なくとも1時点で患者の作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、少なくとも2種の作用剤に対する正の免疫学的反応がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはCD34+造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。
【0021】
他の態様において、本発明は、ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが2種以上のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された1種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、第1の時点で患者をワクチンで免疫する段階、免疫後の少なくとも1時点で患者の作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、少なくとも2種の作用剤に対する正の免疫学的反応がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。一実施形態において、抗原提示細胞は、樹状細胞、好ましくはCD34+造血前駆細胞由来の樹状細胞である。この樹状細胞は、異種血清成分の不在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによって産生できる。この樹状細胞は、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによっても産生できる。
【0022】
他の態様において、本発明は、ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも2種以上の作用剤を含むワクチン接種用のベクターを含み、第1の時点で患者をワクチンで免疫する段階、免疫後の少なくとも1時点で患者の作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、少なくとも2種の作用剤に対する正の免疫学的反応がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。
【0023】
他の態様において、本発明は、ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、そのワクチンが2種以上のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された1種の独特の作用剤であり、患者をワクチンで免疫する段階、免疫後の少なくとも1時点で患者の作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、少なくとも2種の作用剤に対する正の免疫学的反応がその患者におけるワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法である。
【0024】
他の態様において、本発明は、2種以上の免疫反応から対象の臨床転帰を予測する方法であって、臨床反応によって分類された以前に治療された対象と比較する個別のグループとしてその対象を同定する段階、すべてのプロファイルの対に関して、第2のプロファイルと比較した第1のプロファイルの順序を上位、下位、同位、または未決定として判定することによってすべてのプロファイルを半順序付けする段階であって、各変数に関して第1のプロファイルが上位または同位であり、少なくとも1つの変数に関して第1のプロファイルが上位である場合、第1のプロファイルを上位とすることを半順序付けが含む段階、すべての対の半順序付けに適合するすべての順位を算出する段階であって、2つの順序付けされた対象のうち上位である対象に高い順位が付与される段階、順位を平均することによって各プロファイルに関してスコアを求める段階、およびその平均スコアが対象のプロファイルのスコアにもっとも類似しているグループを選択することによって臨床転帰を予測する段階を含む方法である。
【0025】
他の態様において、本発明は、CD34樹状細胞を産生する方法であって、異種血清成分の不在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養する段階を含む方法である。
【0026】
他の態様において、本発明は、CD34樹状細胞を産生する方法であって、組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清の存在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養する段階を含む方法である。
【0027】
他の態様において、本発明は、腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも2種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含むワクチンであって、その抗原提示細胞がCD34造血前駆細胞の組織培養から単離されたCD34樹状細胞であり、組織培養が異種血清成分を含まないワクチンである。
【0028】
他の態様において、本発明は、腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも2種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含むワクチンであって、その抗原提示細胞がCD34造血前駆細胞の組織培養から単離されたCD34樹状細胞であり、その組織培養が組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清を含むワクチンである。
【0029】
他の態様において、本発明は、2種以上のワクチン接種用ベクターを含むワクチンであって、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された1種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、その抗原提示細胞がCD34造血前駆細胞の組織培養から単離されたCD34樹状細胞であり、その組織培養が異種血清成分を含まないワクチンである。
【0030】
他の態様において、本発明は、2種以上のワクチン接種用ベクターを含むワクチンであって、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された1種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、その抗原提示細胞がCD34造血前駆細胞の組織培養から単離されたCD34樹状細胞であり、その組織培養が組織培養への添加前に熱不活性化されていない自己血清を含むワクチンである。
【0031】
他の態様において、本発明は、哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする、腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも2種以上のベクターを含むワクチンである。
【0032】
本発明は、免疫反応の誘導によって悪性腫瘍を治療する方法を対象とする。本発明によれば、ワクチン特異免疫反応を含む血液免疫反応の誘出は、悪性腫瘍の治療における臨床反応と関連している。血液のワクチン誘導免疫反応の評価は、治療有効性の予測因子を提供する。
【0033】
本発明の重要な態様は、免疫反応の誘導による悪性腫瘍治療の多面的アプローチの新規かつ統合的な概念である。この新規なアプローチは、以下に示す4つの重要な要因の少なくとも2つを取り入れる。1)ワクチン接種の適切な様式またはベクター、たとえば樹状細胞の使用、2)複数の腫瘍関連抗原の使用、3)コントロール抗原の使用、および4)複数の簡易なアッセイを用いる誘出免疫反応の総体的評価である。
【0034】
本発明において、ワクチンは、悪性腫瘍と診断された患者に疾患進行を低減させるために投与される。さらに、本発明のワクチンは、悪性腫瘍の個々の発生確率を低減するために予防的に投与することができる。
【0035】
本発明の方法において、これに限定されるものではないが、転移性メラノーマを含む腫瘍疾患を有する患者に、これに限定されるものではないが、CD34+前駆細胞由来の自己DCを含むワクチン接種用の適切なベクターを皮下注射する。このワクチン接種用ベクターは、複数の腫瘍抗原、たとえば複数のメラノーマ抗原由来のペプチド(たとえば、MelanA/MART−1、チロシナーゼ、MAGE−3、およびgp100)を含有する。このワクチン接種用ベクターは、これに限定されるものではないが、コントロール抗原、たとえばインフルエンザマトリクスペプチド(Flu−MP)、またはスカシ貝ヘモシアニン(KLH)を含む他の抗原を含むこともできる。本発明の方法の一実施形態において、ワクチン接種用の単一ベクターは、これに限定されるものではないが、腫瘍抗原を含む複数の抗原、および任意選択でコントロール抗原を含有する。本発明の他の実施形態において、抗原は、それぞれ単一抗原を含有する複数のベクターの投与によって送達することができる。予防的治療に関しては、類似のプロトコルが用いられるであろう。
【0036】
本発明において用いられるワクチン接種用ベクターには、これに限定されるものではないが、CD34造血前駆細胞から産生された樹状細胞が含まれ、たとえばこれに限定されるものではないが、ランゲルハンス細胞、および間質樹状細胞が含まれる。ワクチン接種に用いられるベクターは、樹状細胞、または他の抗原提示細胞からなることができ、あるいはこのワクチンは患者に送達されるとき、樹状細胞、または他の抗原提示細胞を標的とすることができる。
【0037】
本発明の重要な態様は、それらの樹状細胞を患者に注入することを可能にする条件下で、ワクチン接種用ベクターとして用いられる樹状細胞を産生する新規な方法である。本発明の方法によれば、樹状細胞は、ウシ胎児血清などの異種血清成分を補足していない組織培地において培養することによってCD34造血前駆細胞から産生される。この組織培地は血清成分を含有しないか、あるいは自己血清が補足されている。本発明の方法において、自己血清は熱不活性化されておらず、5%または10%(v/v)で用いることができる。本発明の方法において、CD34造血前駆細胞は、好ましくは9日間培養される。本発明の組織培養において形成されるすべての細胞は、ワクチン接種用のベクターとみなされる。
【0038】
本発明に用いられるワクチンは、血液免疫反応を誘導する任意の組成物であることができる。好ましくは、このワクチンは、いくつかの腫瘍抗原を含むいくつかの抗原からなる。代表的な腫瘍抗原には、4種のメラノーマ抗原、MelanA/MART−1、チロシナーゼ、gp100、およびMAGE−3が含まれる。他の代表的な抗原には、コントロール抗原、たとえばウイルス抗原、フルマトリクスペプチド、またはタンパク抗原(たとえばKLH)が含まれる。
【0039】
本発明の方法において、これに限定されるものではないが、KLHおよびフルマトリクスペプチドを含むコントロール抗原に対する免疫反応は、患者の免疫能力を示し、腫瘍抗原に対する免疫反応を予測する。これに限定されるものではないが、KLHおよびフルマトリクスペプチドを含むコントロール抗原に対する反応の欠如は、腫瘍抗原に対する反応の欠如、および早期の疾患進行を予測する。
【0040】
本発明の方法において、このワクチンは、たとえば「自然」増殖のような未同定抗原に対する免疫反応の誘導をもたらす。それらの未同定抗原は、ワクチン製剤に存在するか、あるいはワクチン接種の過程で誘導される可能性がある。本発明によれば、そのような抗原に対する免疫反応は、患者の免疫能力を示し、腫瘍抗原に対する患者の免疫反応を予測する。これに限定されるものではないが、ワクチン製剤に存在するか、あるいはワクチン接種の過程で誘導された未同定抗原を含むそのような抗原に対する免疫反応はさらに臨床反応を予測する。
【0041】
本発明におけるワクチン投与の経路には、これに限定されるものではないが、皮下、皮内、または真皮内注射が含まれる。本発明において、患者は、一生涯、または悪性腫瘍の進行までワクチン投与されるべきである。悪性腫瘍進行の場合、そのワクチンは改変されるべきであり、これに限定されるものではないが、新規な抗原の使用を含む。予防的治療に関しては、類似のプロトコルが用いられるであろう。
【0042】
本発明において、ワクチン治療は、少なくとも2つの期からなり、これに限定されるものではないが誘導期、および強化期を含む。誘導期において、ワクチンは短い間隔で投与され、好ましくは、これに限定されるものではないが隔週である。強化期において、ワクチンは長い間隔で投与され、好ましくは、これに限定されるものではないが月に1回である。強化期に次いでブースター免疫処置を行うことができ、好ましくは、これに限定されるものではないが3〜6月毎である。
【0043】
本発明において、コントロール抗原および腫瘍抗原に対して誘出された免疫の総体的評価は、当分野で知られている任意の手段によって求めることができる。たとえば、PBMC増殖アッセイを用いることができ、このアッセイでは免疫前および免疫後に患者から得たPBMCを、外因性抗原を添加せずに、あるいは抗原の存在下で培養し、次いでT細胞増殖を求める。別の方法では、これに限定されるものではないが、血中エフェクターT細胞(一晩のアッセイ)、および血液記憶T細胞(簡易リコールアッセイ)を含む、腫瘍抗原に特異的な機能性T細胞の存在を求めるためにELISPOTを用い、これはワクチン接種試験における早期臨床転帰を予測する。好ましくは、メラノーマ抗原に対する誘出免疫反応は以下の2つのレベルで求める。1)一晩のアッセイにおける血中エフェクターT細胞、および2)単一in vitroT細胞刺激を用いる1週間リコールアッセイにおける記憶T細胞である。
【0044】
本発明の方法によれば、ワクチン投与の頻度は、第1回ワクチン接種後、好ましくは5日目および14日目における血液免疫反応の評価に基づいて個別に決定することができる。このような早い時期に免疫反応が存在することは、患者が誘導期に低頻度、たとえば月に1回ワクチン接種を必要としていることを明らかにする。この時期に免疫反応が存在しないことは、患者が誘導期により高頻度、好ましくは隔週のワクチン接種を必要としていることを明らかにする。
【0045】
ある患者の総体的腫瘍免疫スコアの評価は、早期臨床転帰に関連している。治療の総体的な免疫学的効果は、好ましくは以下の方法の1つまたは両方によって評価される。1)周辺尤度スコアを用いて反応プロファイルを比較する方法、および/または2)これに限定されるものではないが、自然PBMC増殖(すなわち、外因性抗原を添加しない)の誘導の有無、コントロール抗原に対する免疫反応の誘導の有無、いずれかのアッセイにおけるメラノーマ抗原(MelAg)に対する免疫反応の誘導の有無、および/または2種を超えるメラノーマ抗原に対する免疫反応の誘導の有無を含む観察結果に応じて患者を分類する方法である。自然PBMC増殖の誘導は、ワクチン接種試験における早期の好ましい臨床転帰を予測する。自然PBMC増殖の不在は、ワクチン接種試験における早期疾患進行を予測する。これに限定されるものではないが血中エフェクターT細胞(一晩のアッセイ)および血液記憶T細胞(簡易リコールアッセイ)を含む、いずれかのアッセイでの少なくとも2種の腫瘍抗原に対する免疫反応の誘導は、ワクチン接種試験における早期の好ましい臨床転帰を予測する。これに限定されるものではないが血中エフェクターT細胞(一晩のアッセイ)および血液記憶T細胞(簡易リコールアッセイ)を含む、いずれかのアッセイでの2種未満の腫瘍抗原に対する免疫反応の存在は、ワクチン接種試験における早期疾患進行を予測する。
【実施例1】
【0046】
誘出された免疫反応の臨床反応との比較
本発明の方法を評価するために、転移性メラノーマを有する18名のHLA A*0201+患者に、別のランゲルハンス細胞成分を含む、CD34+前駆細胞由来の自己DCを皮下注射した。DCを、4種のメラノーマ抗原(MelanA/MART−1、チロシナーゼ、MAGE−3、およびgp100)由来のペプチド、ならびにコントロール抗原としてインフルエンザマトリクスペプチド(Flu−MP)およびスカシ貝ヘモシアニン(KLH)でパルスした。KLHに関してPBMC増殖アッセイを用い、flu−MPおよびメラノーマ抗原(MelAg)に関してELISPOTアッセイを用いて、誘出免疫反応を求めた。メラノーマ特異反応は、2つのレベル1)一晩のアッセイにおける血中エフェクターT細胞、および2)単一in vitroT細胞刺激を用いる1週間リコールアッセイにおける記憶T細胞において評価した。治療の総体的な免疫学的効果は、2つの方法1)周辺尤度スコアを用いる反応プロファイルの比較、および2)コントロール抗原、任意のアッセイでのMelAg、および2種を超えるMelAgに対する反応の誘導に関する観察結果に応じた患者の分類によって評価した。
【0047】
DCは、18名の患者のうち16名で、コントロール抗原(KLH、Flu−MP)に対する免疫反応を誘導した。同じ16名の患者において、1種または複数のメラノーマ抗原(MelAg)に対する増強された免疫反応が認められ、これには2種を超えるMelAgに対して反応した10名の患者が含まれる。本出願人等は最初に、ワクチン後アッセイにおける2倍超の増加、および10を超える抗原特異IFN−γELISPOTを免疫反応の指標として用いた。いずれのアッセイによってもコントロール抗原およびメラノーマ抗原に反応しなかった2名の患者(#3および#13)は、急速に腫瘍が進行し、計画された療法を完了できなかった。評価可能疾患を有する17名の患者のうち、0、1、または2種のメラノーマ抗原に反応した7名の患者のうち6名は、試験開始10週後の再ステージングにおいて進行性疾患を有した。対照的に、3種または4種すべてのメラノーマ抗原に反応した10名の患者では1名にのみ腫瘍進行が認められた(p=0.002、フィッシャー正確確率検定)。これらの患者のうち7名で1つを超える腫瘍転移の縮小が観察された。
【0048】
DCワクチン後の抗腫瘍免疫の総体的な評価を得るために、本出願人等は、直接およびリコールアッセイ両方による4種すべての抗原に対する絶対免疫反応データを、腫瘍免疫スコア(−8.5〜+8.5)に統合した。評価可能疾患を有する17名の患者のなかで、進行性疾患を有する7名の患者で腫瘍免疫が低かった(p=0.043)。腫瘍免疫スコアは、臨床転帰と関連した。負の腫瘍免疫スコアを有する8名の患者の6名が、進行性疾患を有した。他方、正の腫瘍免疫スコアを有する9名の患者のうち、1名のみが進行した。したがって、これらの分析は共に、DCワクチン接種後の早期臨床転帰が誘出免疫反応に相関したことを示している。
【0049】
材料および方法
試験デザインおよび適格性基準
この試験のスキームを図1に示す。組入れ基準は、バイオプシーによってAJCCのIV期転移性メラノーマと診断;年齢18歳以上;カルノフスキー全身状態>80%;HLA−A*0201表現型;流行性耳下腺炎、ヒストプラスマ症、またはストレプトキナーゼ抗原に対して皮内皮膚試験陽性;フローサイトメトリにより正常の血液CD4およびCD8T細胞数;および量的に正常な免疫グロブリンレベルであった。試験除外基準は、試験開始前4週未満の前化学療法または生物療法;未治療CNS病変;大きな肝臓転移病変;妊娠;または同時コルチコステロイドおよび/または免疫抑制療法であった。喘息、静脈血栓症、うっ血性心不全、自己免疫疾患、またはウイルス性肝炎を含む活動性感染症の病歴を有する患者も除外された。すべての患者から書面によるインフォームドコンセントを受け、さらに本試験は食品医薬品庁、国立癌研究所(NCI)、および施設内治験審査委員会によって承認された。患者は、合計で4回のワクチン接種の間、14日毎に抗原負荷CD34DCを皮下(s.c.)投与され、6週の外来患者ワクチン接種コースを受けた。DCは、コホート毎投与量0.1、0.25、0.5、および1×106DC/kg/注射の投与増加デザインで投与した。
【0050】
DCワクチンの調製および投与
DC前駆細胞の採取
末梢血幹細胞動員のために、患者に組換えG−CFS(Neupogen;Amgen、Thousand Oaks、CA)10μg/kg/日をs.c.で5日間与え、次いで2日続けて白血球搬出を行って動員されたCD34+HPCを集めた。CEPRATE SC幹細胞濃縮システム(CellPro Inc.、Seattle、WA)を用いて細胞を処理して、CD34+HPCの濃縮集団(純度62±17%、回収158±133×106)を得て、次いでそれを低温保存した。
【0051】
DCワクチンの調製
医薬品の安全性試験の実施に関する基準(GLP)に従ってすべての手順を行った。自己血清、10−5M2−β−メルカプトエタノール、および1%L−グルタミンを補足した濃度0.5×106/mlの培地(X−VIVO−15、Bio Whittaker、Walkersville、MD)で培養することによって、CD34+HPCからCD34−DCを産生した。臨床使用に承認された以下のヒト組換えサイトカインを用いた。GM−CSF(50ng/ml、Immunex Corp.、Seattle、WA)、Flt3−L(100ng/ml、Immunex Corp.)、およびTNF(10ng/ml、CellPro Inc.、Seattle、WA)である。培養は、各患者に割り当てた個別のインキュベータを用いて、37℃、5%CO2で、加湿インキュベータにおいて行った。培養の第8日に、細胞の20%を一晩、KLH(2μg/ml、Intracell Corp.、Rockville、MD)およびHLA−A*0201制限フルマトリクスペプチド(Flu−MP)GILGFVFTL58−66(2.5μg/ml)でパルスした。残りの細胞を一晩、KLH(2μg/ml)およびメラノーマ抗原由来の4種のHLA−A201制限ペプチド(MelanA/MART−127−35:AAGIGILTV、gp100g209−2M:IMDQVPFSV、チロシナーゼ368−376、YMDGTMSQV、MAGE−3271−279:FLWGPRALV)(2.5μg/ml)でパルスした。ペプチドはすべてGMP品質であり、NCIから得るか(MelanA/MART−1、gp100、およびチロシナーゼ)、購入した(Flu−MPおよびMAGE−3、MultiPeptide Systems、San Diego、CA)。一晩抗原を負荷した後、CD34−DCを滅菌食塩水で3回洗浄し、カウントし、メラノーマペプチド(1μg/ml)を含有する滅菌食塩水10mlに再懸濁した。22℃で2時間インキュベートした後、細胞を遠心分離し、注射のために滅菌食塩水9mlに再懸濁した。ワクチン放出基準には、1)DC注射48時間前細菌培養陰性、2)抗原パルス後グラム染色陰性、3)DC投与2時間前Giemsa染色サイトスピンでの樹状細胞形態、4)細胞生存率>80%、および5)表現型分析による判定で細胞製剤中DC(CD1a+およびCD14+)最小値20%が含まれた。各DCバッチのさらなる品質試験には、1)モノクローナル抗体のパネルとの反応性、および2)混合リンパ球反応における刺激能の判定が含まれた。
【0052】
ワクチンの投与
ワクチン接種は、3つの注入部位(両大腿/上腕)に皮内投与した。所属リンパ節を外科手術によって除去および/または照射した四肢には注入しなかった。長脊髄針を用いてDCを注入し、6〜8cmの距離に拡げた。
【0053】
臨床モニタリング
NCIのCommon Toxicity Criteriaに従って有害事象にランクを付けた。すべての患者について、ベースラインおよび第4回のDCワクチン接種の4週間後(試験開始から10週)に腫瘍状態の評価を行った。標的病巣における25%超の増大および/または新しい病巣の発生を疾患の進行と定義した。
【0054】
免疫学的モニタリング
ワクチン接種前の少なくとも2時点、ならびに各ワクチン接種後5および/または14日、ならびに第4回のワクチン接種後14または28日の時点で、PBMCサンプルを採取し、凍結した。免疫前および免疫後PBMCを、アリコートに凍結し、コード化、解凍し、盲検法で共にアッセイした。
【0055】
抗原特異増殖
PBMC(105細胞/ウェル)を、1〜10μg/mlの勾配用量のKLH、および陽性コントロールとしてブドウ球菌エンテロトキシンA(SEA)の不在下または存在下、トリプリケートのウェルで培養した。培養の第3日(SEA)または5日(KLH)に、分析物を一晩3Hチミジンでパルスし、16時間後に採取した。
【0056】
単一抗原特異T細胞からのIFN−γ放出ELISPOTアッセイ
抗原特異IFN−γ生成T細胞を検出するためのELISPOTアッセイを、以前に記載のとおり行った(Dhodapkar等、1999、「Rapid generation of broad T−cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells」、J Clin Invest 104:173〜180、Dhodapkar等、2000、「Mature dendritic cells boost functionally superior CD8(+)T−cell in humans without foreign helper epitopes」、J Clin Invest 105:R9〜R14)。簡潔に述べると、PBMC(2×105細胞/ウェル)を、10μg/mlのペプチド抗原の存在下または不在下、10μg/mlの1次抗IFN−γmab(Mabtech、Stockholm)でプレコートしたプレートに添加した。抗原は、DCワクチンに用いたものと同じHLA A*0201制限ペプチド(4種のメラノーマペプチドおよびFlu−MP)であった。T細胞機能に関して、陽性コントロールとしてSEAを用い、陰性コントロールとしてHLA A*0201制限gagペプチドを用いた。一部の実験では、細胞収量に応じて、インフルエンザウイルス感染PBMC(MOI2)をAPCとして用いた。抗原特異SFCを、コントロールペプチドによるバックグラウンドを減じた後に算出した。抗原特異スポット形成細胞に関する免疫後測定値が基準より2倍超高く、10超SFC/2×105細胞である場合、免疫反応を正にスコアした。
【0057】
抗原特異リコールT細胞反応
培養において抗原特異T細胞が増殖および分化する能力を評価するために、免疫前および免疫後PBMCを共に解凍し、1μg/mlペプチドでパルスした自己成熟DC(PBMC:DC比30:1)を用いて7日間共培養(2×105細胞/ウェル)した。7日後、細胞をELISPOTプレートに移し、特異抗原を用い、または用いずに、照射(3000ラド)T2細胞(T:APC比20:1)を用いて一晩培養した。抗原特異SFCを、非パルスT2細胞によるバックグラウンドを減じた後に算出した。
【0058】
遅延型過敏(DTH)反応
過敏反応を試験するために、それぞれの抗原で個別にパルスした105CD34−DCを患者の背部に皮内注射し、48時間で注入部位の硬変を測定した。
【0059】
統計解析
KLHおよびFlu−MPに対する特異免疫反応の存在を実証するために、離散データの符号検定を用いた(Wittkowski、K.M.1998、「Versions of the sign test in the presence of ties」、Biometrics 54:789〜791)。防御免疫に関して異なるメラノーマ抗原の役割は知られていないので、本出願人等は、直接アッセイおよびリコールアッセイの両方で測定した4種すべてのメラノーマ抗原に対するワクチン接種後反応を、周辺尤度アプローチに基づくノンパラメトリック法を用いて免疫スコアに統合した(Kalbfleisch、J.D.およびPrentice、R.L.1973、「Marginal likelihoods based on Cox’s regression and life model」、Biometrika 60:267〜278、Wittkowski、K.M.1988、「Friedman−type statistics and consistent multiple comparisons for unbalanced designs」、J Am Stat Assoc 83:1163〜1170)。それらの免疫反応プロファイルに従ってn個の個体をスコア化するために、すべての対の順位付けに適合するすべての順位(数1〜nの順列)を算定する。その結果として、高い免疫反応を有する者は高い順位を付与される。8つの変数のそれぞれが少なくとも同程度に高く、少なくとも1つの変数がより高い場合、免疫反応はより高いとみなされる。患者の免疫スコアは、互換順位のなかの対応する順位の平均から期待されるスコアを引いたものである。免疫されたすべての患者を、「治療意図(intent−to−treat)」アプローチにおける解析に含めた。
【0060】
本試験の結果を以下に要約する。
【0061】
患者の特性
表Iは、患者の特性、ならびに開始時およびDCワクチン後の疾患状態を示す。化学療法にはDTIC、Cisplatinum、およびVelbanを含み、すべてのCNS病変は試験開始前に手術によって除去するか、照射されていた。LN:リンパ節、CE:臨床検査、PD:進行性疾患。患者#4および#8は、既往の軽度白斑を有し、DCワクチン接種中に進行した。
【0062】
転移性メラノーマを有する18名のHLA−A201+患者に、CD34−DCを注射した(図1および表I)。4名の患者(患者#1、#9、#12、および#13)は、試験の開始前に手術および照射によって処置されたCNS病変を有し、4名の患者(患者#2、#4、#5、および#16)は、前化学療法を受けており、5名の患者(患者#2、#4、#6、#9、および#15)は臨床または免疫反応を伴わない前生物療法を受けていた(表I)。3名の患者(患者#3、#13、および#20)は試験完了前に進行した。
【0063】
DCワクチン
各ワクチン接種のためにG−CSF動員血CD34+HPCから新鮮なDCを産生した。凍結/解凍CD34+HPCをGM−CSF、TNF−αおよびFLT3リガンド生成MHCクラスI+、HLA−DR+、CD80+、CD86low、およびCD83lowDCを用いて9日間培養した(データは示していない)。DCには、CD1a+CD14−ランゲルハンス細胞(LC)、ならびにCD1a±CD14+間質DC前駆体(intDC)が含まれた。LC表現型は、CD1a+DCにおいてLangerin染色を明らかにする共焦点顕微鏡検査によって確認した(データは示していない)(Valladeau等、2000、「Langerin,a novel C−type lectin specific to Langerhans cells,is an endocytic receptor that induces the formation of Birbeck granules」、Immunity 12:71〜81)。CD1a+CD14−細胞の平均比率は9±3%(範囲4〜17%、中央値=9%)であり、CD1a±CD14+細胞の平均比率は32±9%(範囲19〜52%、中央値=30%)であった。
【0064】
【表1】
【0065】
【表2】
【0066】
コントロール抗原に対する反応
DCワクチン接種は、18名の患者のうち16名(患者#3および#13を除く全患者)でKLH特異免疫反応を始動した(正確確率符号検定でp=0.00007、図2)。高用量のDCがより多くのKLH特異増殖を誘導するという兆候はなかった。16名の患者(患者#3および#20を除く全患者)を、DCワクチン接種後DTHに関して評価した。これらの患者のうち13名(患者#1および#19を除く全患者)は、KLHに対するDTHが発現した(中間値10mm、範囲6〜47mm)(データは示していない)。
【0067】
表IIは、ワクチン接種前/接種後PBMCにおけるペプチド抗原特異IFN−γELISPOT数を示す。データは、血中エフェクター(直接、SFC/2×105細胞)および抗原パルスDCによるin vitro増幅後(リコール、SFC/105細胞)に関して示す。データは、早期進行した患者#3、#13、および#20を除いて、ワクチン前/第4回ワクチン後として示す。患者#3および#20は4回のワクチンを完了したが、第4回ワクチン後の血液試料は得られなかった(3回のワクチン後の反応を示す)。患者#13は2回のワクチン後にCNS進行を有し、CNS照射およびDecadronによって治療し、プロトコル外でその後のワクチンを完了した(2回のワクチン後の反応を示す)。NDは、細胞低収量のためアッセイしなかったサンプルを表す。
【0068】
Flu−MPパルスDCを注射した17名の患者(フルワクチンにアレルギー歴を有する患者#18を除くすべて(の患者))のうち、15名の患者(患者#3および#13を除くすべて(の患者))において少なくとも1つのアッセイによってFlu−MP特異記憶T細胞反応の増強が認められた(表IIおよび図3)。これらの誘出T細胞は、インフルエンザ感染PBMCから自然にプロセシングされた抗原も認識した(データは示していない)。
【0069】
2名の患者を除くすべての患者がKLHおよびFlu−MPパルスDCの両方に反応したという所見は、本研究に参加した転移性メラノーマを有する患者が免疫反応性であったことを示す。
【0070】
メラノーマ特異血液CD8T細胞のin vivo増幅
非培養T細胞における反応
患者#8を除いて、基準の血液サンプルでは少数のみのメラノーマ抗原特異IFN−γ産生細胞が検出された(表IIおよび図4)。この反応は、(コントロールウェルの値から測定値を差し引いた値)免疫後サンプルにおいて2倍超の増加があり、MelAg特異ELISPOTの最小値が10である場合、増強されたとみなした。DCワクチン接種後、1種以上のMelAgに対する反応の増強が、18名の患者のうち8名の非培養T細胞において検出可能であった(表II)。5名の患者がMAGE−3に対して、4名がMelanA/MART−1に対して、5名がgp100に対して、7名がチロシナーゼペプチドに対して反応の増大を示した(表IIおよび図4)。高用量のDCを受けた患者がより高いメラノーマ特異免疫を有するという兆候はない。このように、MelAgパルスCD34−DCは、メラノーマ患者においてMelAg特異血中エフェクターの増強をもたらす。
【0071】
【表3】
【0072】
培養T細胞における反応
次いで、メラノーマペプチドパルス自己DCを用いて1週間培養した後に血液CD8T細胞がメラノーマ特異反応を増大する能力を求めた。ほとんどの患者は、免疫前サンプルにおいて低レベルのMelAg特異記憶細胞を有した(患者#21を除く)。しかしながら、評価した15名の患者のうち14名で、DCワクチン接種後、少なくとも1種のメラノーマペプチドに対して反応の増大が見られ(表IIおよび図5)、それらの患者のうち5名は、4種すべてのメラノーマペプチドに反応した(患者#1、#5、#9、#6、#17)。
【0073】
メラノーマ抗原に対する総体的反応
表IIIに、DCワクチン、免疫反応、および臨床転帰を要約する(PD=進行疾患、NP=進行なし、NE=反応評価不能)。全体的に見て、DCワクチン接種後、1種以上のMelAgに対する免疫の増強が、少なくとも1つのアッセイで18名の患者のうち16名に観察された(表III)。それらの患者のうち、少なくとも1つのアッセイで、それぞれ3、4、および6名の患者において、2、3、または4種すべてのMelAgに対して免疫の増強が見られた。このように、メラノーマペプチドパルスCD34−DCによるワクチン接種は、メラノーマ患者においていくつかのMelAgペプチドに対する免疫の増強をもたらす。
【0074】
臨床転帰
評価可能な17名の患者のうち7名が、腫瘍の進行を経験した(PD、測定可能な疾患の進行および/または新しい病変)(表I)。残りの10名の患者は、この時点(試験開始から10週)で進行はなかった。それらのなかで、3名の患者(患者#4、#17、および#21)は、新しい病変も測定可能な疾患の進行もなく、開始時に複数の病変を有した4名の患者(患者#5、#8、#12、および#18)は、1つまたは複数の疾患部位で縮小を経験し、開始時に限局型の疾患のみを有した3名の患者(患者#1、#9、および#10)は、疾患の徴候が消失した。非進行性の患者は、その後の試験においてさらなるDCワクチン接種を受けた。患者#5は、他の機関でさらなる免疫療法を受けた。
【0075】
【表4】
【0076】
免疫学的反応と臨床転帰の相関
表IVに、血液の免疫反応と臨床転帰との相関を要約する。本出願人等は最初に、ワクチン後アッセイでの2倍超の増加、および10を超える抗原特異IFN−γELISPOTを免疫反応の指標として用いた(Dhodapkar等、1999、J Clin Invest 104:173〜180、Dhodapkar等、2000、J Clin Invest 105:R9〜R14)。いずれのアッセイによってもコントロール抗原およびメラノーマ抗原に反応しなかった2名の患者(#3および#13)は、急速に腫瘍が進行し、計画された療法を完了できなかった。評価可能疾患を有する17名の患者のうち、0、1、または2種のメラノーマ抗原に反応した7名の患者の6名は、試験開始10週後の再ステージングにおいて進行性疾患を有した(表IIIおよび表IV)。対照的に、3種または4種すべてのメラノーマ抗原に反応した10名の患者では1名にのみ腫瘍進行が認められた(p=0.002、フィッシャーの正確確率検定)。これらの患者のうち7名で、1つを超える腫瘍転移で縮小が観察された。
【0077】
DCワクチン後の抗腫瘍免疫の総体的な評価を得るために、本出願人等は、以前に記載のとおり(Kalbfleisch、J.D.およびPrentice、R.L.1973、Biometrika 60:267〜278、およびWittkowski、K.M.1988、J Am Stat Assoc 83:1163〜1170)、直接およびリコールアッセイによる4種すべての抗原に対する絶対免疫反応データを、腫瘍免疫スコア(−8.5〜+8.5)に統合した。評価可能疾患を有する17名の患者のなかで、進行性疾患を有する7名の患者で腫瘍免疫が低かった(p=0.043)。腫瘍免疫スコアは、臨床転帰と関連した。負の腫瘍免疫スコアを有する8名の患者の6名が、進行性疾患を有した(図6)。他方、正の腫瘍免疫スコアを有する9名の患者のうち、1名のみが進行した。
【0078】
したがって、これらの両方の分析は、DCワクチン接種後の早期臨床転帰が誘出免疫反応に依存していることを実証した。
【0079】
【表5】
【実施例2】
【0080】
抗原負荷樹状細胞のワクチン接種はin vivoで免疫反応の急速な誘導をもたらす すべてのサンプルにおけるKLH特異免疫反応の速度論の分析は、大多数の患者において、2種のKLH濃度で2回のKLH負荷CD34−DCの注射が有意な(t検定でp=0.018および0.045)増殖反応を誘導するのに充分であったことを示した(図7)。表Vは、自然増殖の値を減じた2種のKLH濃度(10および1ng/ml)でのワクチン接種過程の各時点におけるKLH特異PBMC増殖(cpm値)を示す。しかしながら、各患者の分析は、18名の患者のうち9名で、第1回のKLHパルスDCの注射後にすでにKLH特異増殖が検出可能であることを明らかにした(表V)。さらに、それらの9名の患者のうち5名で、最初の観察時点、すなわち注射5日後の時点において、KLHに対する増殖反応に有意な増加(t検定でp=0.044)が見られた(表V)。KLHに反応した残りの患者のなかで、4名の患者が2回のワクチン後、2名の患者が3回のワクチン後に検出可能な反応を有し、3名の患者は有意な増殖反応が見られるまでに4回のKLHパルスDCの注射を要した。
【0081】
17名の患者が、細胞の20%がFlu−MPペプチドで負荷されたCD34−DCワクチンを受けた。表VIは、血中エフェクター(すなわち16時間アッセイ)のワクチン接種過程の各時点におけるFlu−MPペプチド特異IFN−γELISPOT数/105PBMCを示す。17名の患者のうち15名で、フル特異免疫(免疫後のいずれかの時点におけるフル特異IFN−γELISPOTが少なくとも2倍の増加と定義する)が誘導され、DC注射の回数と共に増加した(図8)。KLHと同様に、Flu−MPペプチドに対する反応は急速に誘導され(図8)、17名の患者のうち8名で、第1回のDC注射後にすでに認められた(表VI)。それらの8名の患者のうち4名で、5日後にすでにFlu−MP特異T細胞の頻度に顕著な増加(p=0.053)が観察された(表VI)。Flu−MPに反応した残りの患者のなかで、4名の患者が2回のワクチン後、2名の患者が3回のワクチン後に検出可能な反応を有し、1名の患者のみが有意な反応が見られるまでに4回のFlu−MPパルスDCの注射を要した。
【0082】
【表6】
【0083】
すべてのサンプルにおけるメラノーマ抗原特異免疫反応の速度論の分析は、MART−1ならびにチロシナーゼの場合、2回のペプチド負荷DCの注射が、基準に比べてMART−1反応T細胞の頻度に有意な増加が観察されるのに充分であったことを示した(図9)。gp100の場合、単回のワクチン接種後にすでに有意な増加が見られ、MAGE−3の場合、4回のペプチド負荷DCの注射が、MAGE−3特異T細胞の有意な増加が観察されるのに必要であった(図9)。すべてのペプチドに関して、反応はワクチン接種の反復と共に増加する。表VIIは、血中エフェクター(すなわち16時間アッセイ)のワクチン接種過程の各時点におけるメラノーマペプチド特異IFN−γELISPOT数/105PBMCを示す。表VIIに示したように、7名の患者は、単回のDC注射後すでにメラノーマ抗原特異T細胞の頻度に検出可能な増加があった。
【0084】
最後に、メラノーマ特異反応の速度論の分析、および進行性患者と非進行性患者との比較は免疫反応と臨床反応の相関を明らかにし、したがって腫瘍免疫スコアを用いて見出された相関が確証された(図10)。
【0085】
このように、抗原パルスCD34−DCによるワクチン接種は、そのワクチンに存在する抗原、コントロール抗原およびメラノーマ抗原の両方に対する免疫反応の急速な誘導を可能にする。免疫反応は臨床反応に相関し、疾患の進行を経験した患者は、血液中で検出可能なメラノーマ特異免疫反応を増大しない。
【0086】
【表7】
【0087】
【表8】
【0088】
【表9】
【実施例3】
【0089】
抗原負荷樹状細胞の反復ワクチン接種は臨床反応を可能にする
転移性メラノーマ(最新の対癌米国合同委員会メラノーマステージングシステムを用いてIV期)を有する患者12名(女性5名と男性7名、年齢の中央値57歳(範囲43〜73歳)に、最初の4回のプライミングDCワクチン接種後、ブースターメラノーマ抗原負荷CD34−DCワクチン接種を与えた(表Iの患者#1、#4、#8、#9、#10、#12、#13、#16、#17、#18、#19、および#21)。これらのDCは、スカシ貝ヘモシアニン(KLH)タンパク質およびインフルエンザマトリクスペプチド、ならびにメラノーマ抗原を負荷した。DCワクチン接種は、約0.1〜1.0×106DC/kg/ワクチン接種のDCワクチン接種用量で皮下的に投与した。最初の4回のワクチン接種後に疾患の安定化または部分反応を経験した8名の患者に、4回目のワクチン接種の約2カ月後に開始して追加の4回のワクチン接種(DC5〜8)を月1回ワクチン投与し、最初の4回のワクチン接種で完全寛解を経験した2名(患者#9および#10)に、4回目のワクチン接種後2カ月、5カ月、9カ月、および15カ月にワクチン投与した。最初の4回のワクチン接種後に完全寛解を経験した1名の患者に、4回目のワクチンのおおよそ8カ月後に単回のDCワクチン接種を行った(患者#1)。最初の4回のDCワクチン接種後に安定疾患であった1名の患者に、月1回の間隔で2回のワクチン接種を行ったが、その後、進行性メラノーマを有し、プロトコルを取りやめた。
【0090】
4名の患者が非維持完全寛解のままであり、生存している。さらに2名の患者が、DCワクチン接種プロトコルの完了後、転移巣切除(metastatecomy)を経て完全寛解であり、生存している。プロトコルの完了後に追加の免疫療法を受けた1名の患者は、プロトコルの最終DCワクチン接種の20カ月後、疾患安定で生存している。DCプロトコルで治療を受けた5名の患者が、進行性転移性メラノーマにより死亡している。DCワクチン接種に対する反応が評価不能であった1名の患者は、プロトコルの完了2カ月後に再発した。脳転移性疾患の完全な退縮を含む完全寛解を経験した1名の患者は、8回目のDCワクチン接種のおおよそ9カ月後に再発した。1名の患者は、6回のDCワクチン接種後に進行性疾患を発症した。2名の患者は、プロトコル完了から2〜4カ月後に進行性メラノーマを有した。DCワクチン接種に関連した重要な臨床有害事象はなかった。図11〜14は、転移性メラノーマの診断(図11)および試験開始(図12)からの無病生存、ならびに転移性メラノーマの診断(図13)および試験開始(図14)からの患者生存を含むKaplan Meier生存曲線を示す。
【0091】
最後に、培養において抗原特異T細胞が増殖および分化する能力を評価するために、免疫前および免疫後PBMCを共に解凍し、1μg/mlペプチドでパルスした自己成熟DC(PBMC:DC比30:1)を用いて7日間共培養(2×105細胞/ウェル)した。7日後、細胞をELISPOTプレートに移し、特異抗原を用い、または用いずに、照射(3000ラド)T2細胞(T:APC比20:1)を用いて一晩培養した。抗原特異SFCを、非パルスT2細胞によるバックグラウンドを減じた後に算出した。この評価に用いたペプチドには、DCワクチンに存在した4種のペプチド(ワクチン抗原)、およびワクチンに存在しない腫瘍抗原を代表する2種のペプチド(ESO−1およびTERT)が含まれた。表VIIIに示したように、ワクチンに存在した2種を超えるメラノーマ抗原に特異的なT細胞を有した7名のメラノーマ患者のうち4名は、さらに他の腫瘍抗原に特異的な検出可能なT細胞を有し、免疫反応の拡大を示唆した。これらの4名の患者は、完全寛解(CR)である(患者#9、#10、#18、および#21)。残りの3名の患者のなかで、2名の患者は、初期の疾患安定化(SD)後に進行(PD)を経験した。gp100特異T細胞のみを有した1名の患者は、メラノーマ病変が完全に消失したが、後に再発した。
【0092】
【表10】
【実施例4】
【0093】
自然増殖PBMC反応と臨床反応の相関
治療開始前および第4回DCワクチン接種後2〜4週のサンプルにおける増殖性PBMC反応の分析は、外因性抗原を添加せずに培養したDC免疫後血液サンプルのPBMCが増殖し、2名の患者において、この増殖が進行性白斑の存在と相関したことを明らかにした(Mel5およびMel8)(図15)。すべての患者において、治療開始前および第4回ワクチン後の様々な時点でのサンプルの自然増殖を求めた(表IX)。
【0094】
表IXおよび図16に示したように、指数が1未満の5名の患者のうち4名は早期進行性疾患を有し、指数が1超から10未満の5名の患者のうち4名は試験開始10週後に臨床反応を有し(進行なし)、指数が10超の患者はすべて臨床反応を有した。これは免疫後の2つの異なる時点における血液サンプルの自然増殖の分析(図17)、および2つの異なる研究室で同一のサンプルを用いて得られたデータ(図17)によって確認された。さらに、図18に示したように、自然増殖、すなわち外因性抗原を用いない増殖の指数は、抗原特異増殖、すなわちKLHの指数と有意に相関し、自然増殖のレベルが抗原特異増殖反応を予測する可能性を示唆した(単回帰においてp=0.003)。最後に、この増殖性細胞はCD4+T細胞である(図19)。さらに、DCワクチン接種によって誘発された免疫系の活性化は、ワクチン接種前および接種後のサンプルに関して表Xに示したように、破傷風トキソイドに対する増殖反応の増加によってもっともよく例示できた。
【0095】
DCワクチンはTTを負荷していなかったが、評価した14名の患者のうち10名のTT反応は、免疫後サンプルで高かった(増加倍数の範囲1.6〜82、中央値1.7倍)。
【0096】
このように、DCワクチン接種は、同定された(すなわちワクチンで送達)抗原、ならびに未知抗原の両方に対する非常に強い免疫化をもたらす。血液免疫反応のレベルは臨床反応に相関し、臨床反応を予測する。
【0097】
【表11】
【0098】
【表12】
【図面の簡単な説明】
【0099】
【図1A】本明細書に示した臨床試験の試験デザインを示す図である。
【図1B】本明細書に示した臨床試験のワクチン接種および血液採取のスケジュールを示す図である。
【図2】コントロール抗原に対する反応、KLH依存性増殖反応を示す図である。免疫前/免疫後末梢血単核細胞(PBMC)を、10μg/mlKLHを用いて5日間培養する。KLH特異T細胞増殖は、3H TdR取り込みに基づいて求める。免疫前=白い棒。免疫後=灰色の棒。KLH=スカシ貝ヘモシアニン。
【図3】コントロール抗原flu−MPペプチドに対する反応を示す図である。ベースラインおよび4回のDCワクチン接種後に得られたPBMCを、10μMのflu−MPペプチドを用いて一晩培養する。抗原特異IFN−γ分泌細胞を、ELISPOTアッセイを用いて定量化し、IFN−γELISPOT数/2×105PBMCとして表す。コントロールウェルで得られた数を減じる(平均、1スポット/2×105PBMC、範囲0〜8)。ベースライン=白い棒。4回のDCワクチン接種後=灰色の棒。
【図4】メラノーマ抗原特異反応、短期(一晩)のアッセイで検出された血中メラノーマ特異効果細胞を示す図である。ベースラインおよび4回のDCワクチン接種後に得られたPBMCを、ワクチン接種(10μM)に用いた4種のメラノーマペプチドそれぞれを用いて一晩培養する。評価された患者のそれぞれの特異T細胞反応をIFN−γELISPOT数/2×105PBMCとして表す。左から右、MAGE−3、MelanA/MART−1、チロシナーゼ、gp100。コントロールgagペプチドを用いて、またはペプチドを用いないウェルで得られた値を減じる(平均、1スポット/2×105PBMC、範囲0〜8)。
【図5】メラノーマ抗原特異反応、メラノーマ抗原特異記憶効果細胞(リコールアッセイ)を示す図である。ベースラインおよび4回のDCワクチン接種後に得られたPBMCを、成熟メラノーマペプチドパルス自己単球由来DCを用いて7日間培養した。T細胞を採取し、ペプチド誘導IFN−γ放出を、メラノーマペプチドパルスT2細胞を用いた一晩の培養において測定した。評価された患者のそれぞれの反応をIFN−γELISPOT数/1×105PBMCとして表す。非パルスT2細胞を用いて得られた値を減じる。MAGE−3:スポット平均数ワクチン前/ワクチン後1/7、範囲0〜25/0〜23、MART−1:スポット平均数ワクチン前/ワクチン後5/3、範囲0〜37/0〜33、チロシナーゼ:スポット平均数ワクチン前/ワクチン後2/4、範囲0〜19/0〜39、gp100:スポット平均数ワクチン前/ワクチン後2/9、範囲0〜25/0〜33。
【図6】免疫反応と臨床転帰の相関を示す図である。4種すべてのメラノーマ抗原に関する直接アッセイおよびリコールアッセイ両方の免疫反応を順位化し、腫瘍免疫スコア(−8から+8)に統合した。データを腫瘍免疫スコア(y軸)対臨床反応(x軸)としてプロットする。それぞれの数字は患者IDを示す。4グループの患者を示す。ワクチン後1つまたは複数の病変の縮小を伴う患者(点付きの棒)、安定疾患の患者(横線の棒)、10週時点で疾患の進行した患者(PD、ジグザグ線の棒)、早期進行の患者(10週の評価前、早期PD、縦線の棒)。
【図7】KLH特異反応の速度論を示す図である。免疫前(第0日)および免疫後の異なる時点(縦座標軸に示す)で採取した末梢血単核細胞(PBMC)を、10μg/mlまたは1μg/mlのKLHを用いて5日間培養する。KLH特異T細胞増殖は、3H TdR取り込みに基づいて求める(縦軸)。*示した時点でのcpm値のベースライン(第0日)に対する比較の有意(t検定)(*=p<0.05、**=p<0.005)。
【図8】Flu−MP特異反応の速度論を示す図である。ベースラインおよびDCワクチン接種後の示した時点後(縦座標軸)に得られたPBMCを、10μMのflu−MPペプチドまたはコントロールペプチド(hiv−gag)を用いて一晩培養する。抗原特異IFN−γ分泌細胞を、ELISPOTアッセイを用いて定量化し、IFN−γELISPOT数/2×105PBMCとして表す。
【図9A】メラノーマ特異反応の速度論を示す図である。ベースラインおよびDCワクチン接種後の示した日数後(x軸)に得られたPBMCを、ワクチン接種(10μM)に用いた4種のメラノーマペプチドそれぞれを用いて一晩培養した。本図はMART−1を用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異T細胞反応をIFN−γELISPOT数/2×105PBMCとして表す(y軸)。コントロールgagペプチドを用いて、またはペプチドを用いないウェルで得られた値をコントロールとして示す。N=示した時点での評価に関してサンプルを入手できた患者数。*示した時点でのELISPOTの基準(第0日)に対する比較の有意(t検定)。右上に示したP値は、各ペプチドに関するELISPOTのコントロールに対する比較の有意を示す。
【図9B】メラノーマ特異反応の速度論を示す図である。ベースラインおよびDCワクチン接種後の示した日数後(x軸)に得られたPBMCを、ワクチン接種(10μM)に用いた4種のメラノーマペプチドそれぞれを用いて一晩培養した。本図はチロシナーゼを用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異T細胞反応をIFN−γELISPOT数/2×105PBMCとして表す(y軸)。コントロールgagペプチドを用いて、またはペプチドを用いないウェルで得られた値をコントロールとして示す。N=示した時点での評価に関してサンプルを入手できた患者数。*示した時点でのELISPOTの基準(第0日)に対する比較の有意(t検定)。右上に示したP値は、各ペプチドに関するELISPOTのコントロールに対する比較の有意を示す。
【図9C】メラノーマ特異反応の速度論を示す図である。ベースラインおよびDCワクチン接種後の示した日数後(x軸)に得られたPBMCを、ワクチン接種(10μM)に用いた4種のメラノーマペプチドそれぞれを用いて一晩培養した。本図はgp100を用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異T細胞反応をIFN−γELISPOT数/2×105PBMCとして表す(y軸)。コントロールgagペプチドを用いて、またはペプチドを用いないウェルで得られた値をコントロールとして示す。N=示した時点での評価に関してサンプルを入手できた患者数。*示した時点でのELISPOTの基準(第0日)に対する比較の有意(t検定)。右上に示したP値は、各ペプチドに関するELISPOTのコントロールに対する比較の有意を示す。
【図9D】メラノーマ特異反応の速度論を示す図である。ベースラインおよびDCワクチン接種後の示した日数後(x軸)に得られたPBMCを、ワクチン接種(10μM)に用いた4種のメラノーマペプチドそれぞれを用いて一晩培養した。本図はMAGEを用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異T細胞反応をIFN−γELISPOT数/2×105PBMCとして表す(y軸)。コントロールgagペプチドを用いて、またはペプチドを用いないウェルで得られた値をコントロールとして示す。N=示した時点での評価に関してサンプルを入手できた患者数。*示した時点でのELISPOTの基準(第0日)に対する比較の有意(t検定)。右上に示したP値は、各ペプチドに関するELISPOTのコントロールに対する比較の有意を示す。
【図10A】非進行性患者の血液中のTAA特異反応が腫瘍進行を伴う患者に比べて高いことを示す図である。ベースラインおよびDCワクチン接種後の示した日数後(x軸)に得られたPBMCを、ワクチン接種(10μM)に用いた4種のメラノーマペプチドをそれぞれ用いて一晩培養する。本図はMART−1を用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異T細胞反応をIFN−γELISPOT数/2×105PBMCとして表す(y軸)。
【図10B】非進行性患者の血液中のTAA特異反応が腫瘍進行を伴う患者に比べて高いことを示す図である。ベースラインおよびDCワクチン接種後の示した日数後(x軸)に得られたPBMCを、ワクチン接種(10μM)に用いた4種のメラノーマペプチドをそれぞれ用いて一晩培養する。本図はチロシナーゼを用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異T細胞反応をIFN−γELISPOT数/2×105PBMCとして表す(y軸)。
【図10C】非進行性患者の血液中のTAA特異反応が腫瘍進行を伴う患者に比べて高いことを示す図である。ベースラインおよびDCワクチン接種後の示した日数後(x軸)に得られたPBMCを、ワクチン接種(10μM)に用いた4種のメラノーマペプチドをそれぞれ用いて一晩培養する。本図はgp100を用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異T細胞反応をIFN−γELISPOT数/2×105PBMCとして表す(y軸)。
【図10D】非進行性患者の血液中のTAA特異反応が腫瘍進行を伴う患者に比べて高いことを示す図である。ベースラインおよびDCワクチン接種後の示した日数後(x軸)に得られたPBMCを、ワクチン接種(10μM)に用いた4種のメラノーマペプチドをそれぞれ用いて一晩培養する。本図はMAGEを用いたものである。評価された患者のそれぞれの特異T細胞反応をIFN−γELISPOT数/2×105PBMCとして表す(y軸)。
【図11】転移性メラノーマの診断からの無病生存を示す、本試験の全患者に関する生存曲線を示す図である。
【図12】試験開始からの無病生存を示す、本試験の全患者に関する生存曲線を示す図である。
【図13】転移性メラノーマの診断からの患者生存を示す、本試験の全患者に関する生存曲線を示す図である。
【図14】試験開始からの患者生存を示す、本試験の全患者に関する生存曲線を示す図である。
【図15A】一部の患者において自然増殖が存在し、DCワクチン接種は転移性メラノーマを伴う患者でin vitro「自己反応」を誘出することを示す図である。外因性抗原を添加せずに培養したDC免疫後血液サンプルのPBMCは増殖し、2名の患者において、これは進行性白斑の存在と関連する(Mel5およびMel8)。本図はベースラインおよび4回目のDCワクチン後2〜4週間におけるチミジン取り込み(cpm×103)を示す図である。
【図15B】一部の患者において自然増殖が存在し、DCワクチン接種は転移性メラノーマを伴う患者でin vitro「自己反応」を誘出することを示す図である。外因性抗原を添加せずに培養したDC免疫後血液サンプルのPBMCは増殖し、2名の患者において、これは進行性白斑の存在と関連する(Mel5およびMel8)。本図は自然増殖が2回のDCワクチン後にすでに発現可能であることを示す図である。
【図16】ワクチン接種後血液サンプルにおける自然増殖レベルと臨床反応との相関を示す図である。自然増殖指数(縦軸)は、ワクチン接種後PBMCの5日間培養から得たcpm値のワクチン接種前に対する比として算出する。縦座標軸は、患者番号および10週の臨床状態を示す。
【図17A】ワクチン接種後血液サンプルにおける自然増殖レベルと臨床反応との相関を示す図である。自然増殖指数(縦軸)は、ワクチン接種後PBMCの5日間培養から得たcpm値のワクチン接種前に対する比として算出する。本図は最終ワクチン接種後14〜28日の分析(アッセイは1つの検査室で盲検で行った)を示す。P値はt検定の有意水準を示す。図17Aの括弧内の数値は、図17Bに示した患者と同一の15名の患者のサンプルで得た値であり、図17Aの他の数値は、18名の患者の分析である。
【図17B】ワクチン接種後血液サンプルにおける自然増殖レベルと臨床反応との相関を示す図である。自然増殖指数(縦軸)は、ワクチン接種後PBMCの5日間培養から得たcpm値のワクチン接種前に対する比として算出する。本図はワクチン接種後2〜5カ月の分析(アッセイは別の検査室で盲検で行った)を示す。P値はt検定の有意水準を示す。図17Aの括弧内の数値は、図17Bに示した患者と同一の15名の患者のサンプルで得た値であり、図17Aの他の数値は、18名の患者の分析である。
【図18】自然増殖レベルとDCワクチン接種によって誘導された抗原特異反応との相関を示す図であり、DCワクチンによって誘導された抗原特異反応は「自己反応的」反応と相関している。DC免疫前および免疫後サンプルのPBMCを、KLHを用いて、または外因性抗原を加えずに培養する。増殖は第5日のチミジン取り込みによって測定する。反応指数は、免疫前および免疫後サンプルから得られたcpm(3回ずつ2度)の比として算出する。
【図19】自然増殖細胞はCD4T細胞であり、ごく少数のみがCD19+B細胞であることを示す図である。ワクチン接種後PBMCを5日間培養する。この培養物に最後の16時間BrdUを混入し、CD4陽性T細胞またはCD19+B細胞によるBrdU取り込みを、抗BrdU FITC結合抗体による染色およびフローサイトメトリによって明らかにする。
Claims (35)
- 哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された少なくとも2種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含むワクチン接種用の有効量のベクターをそのような治療を必要としている前記哺乳動物に投与することを含む方法。
- 哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、少なくとも2種以上の腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドを含むワクチン接種用の有効量のベクターをそのような治療を必要としている前記哺乳動物に投与することを含み、前記ワクチンが前記哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法。
- 哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、ワクチン接種用の有効量の2種以上のベクターをそのような治療を必要としている前記哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された1種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含む方法。
- 哺乳動物において悪性腫瘍を治療する方法であって、ワクチン接種用の有効量の2種以上のベクターをそのような治療を必要としている前記哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された1種の独特の作用剤を含み、前記ベクターが前記哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法。
- 哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、少なくとも2種の腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドを負荷した抗原提示細胞を含むワクチン接種用の有効量のベクターを前記哺乳動物に投与することを含む方法。
- 哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、少なくとも2種以上の腫瘍抗原または腫瘍抗原由来ペプチドを含むワクチン接種用の有効量のベクターを前記哺乳動物に投与することを含み、前記ベクターが前記哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法。
- 哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、ワクチン接種用の有効量の2種以上のベクターを前記哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された1種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含む方法。
- 哺乳動物において悪性腫瘍を予防する方法であって、ワクチン接種用の有効量の2種以上のベクターを前記哺乳動物に投与することを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドからなるグループから選択された1種の独特の作用剤を含み、前記ベクターが前記哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする方法。
- 前記抗原提示細胞が、樹状細胞である請求項1、3、5、または7に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、CD34+造血前駆細胞由来の樹状細胞である請求項9に記載の方法。
- 前記樹状細胞が、異種血清成分の不在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによって産生される請求項10に記載の方法。
- 前記樹状細胞が、自己血清の存在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによって産生され、前記自己血清が前記組織培養への添加前に熱不活性化されていない請求項10に記載の方法。
- コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含む請求項1、2、3、4、5、6、7、または8に記載の方法。
- コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含む請求項9に記載の方法。
- コントロール抗原を負荷した抗原提示細胞をさらに含む請求項10、11、または12に記載の方法。
- ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが少なくとも2種以上の腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、またはコントロール抗原を負荷した抗原提示細胞を含み、
第1の時点で前記ワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第1サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、
前記免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で前記免疫前細胞を保存する段階、
前記ワクチンで前記患者を免疫する段階、
その後の少なくとも1時点で前記患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、
個別かつ同時に外因性抗原の不在下で前記免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、
前記免疫前細胞および前記免疫後細胞の増殖量を測定する段階、
前記免疫後細胞の増殖量を前記免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、
1以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。 - ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが2種以上のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された1種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、
第1の時点で前記ワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第1サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、
前記免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で前記免疫前細胞を保存する段階、
前記ワクチンで前記患者を免疫する段階、
その後の少なくとも1時点で前記患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、
個別かつ同時に外因性抗原の不在下で前記免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、
前記免疫前細胞および前記免疫後細胞の増殖量を測定する段階、
前記免疫後細胞の増殖量を前記免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、
1以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。 - ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが少なくとも2種以上のワクチン接種のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された1種の独特の作用剤を含み、前記ベクターが前記哺乳動物において抗原提示細胞を標的とし、
第1の時点で前記ワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第1サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、
前記免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で前記免疫前細胞を保存する段階、
前記ワクチンで前記患者を免疫する段階、
その後の少なくとも1時点で前記患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、
個別かつ同時に外因性抗原の不在下で前記免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、
前記免疫前細胞および前記免疫後細胞の増殖量を測定する段階、
前記免疫後細胞の増殖量を前記免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、
1以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。 - ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが少なくとも2種以上の腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、またはコントロール抗原を含むワクチン接種用ベクターを含み、前記ベクターが前記哺乳動物において抗原提示細胞を標的とし、
第1の時点で前記ワクチン投与前に患者から末梢血単核細胞の第1サンプルを単離して、免疫前細胞を形成する段階、
前記免疫前細胞の増殖完全性を維持する条件下で前記免疫前細胞を保存する段階、
前記ワクチンで前記患者を免疫する段階、
その後の少なくとも1時点で前記患者から末梢血単核細胞の免疫後サンプルを単離して、免疫後細胞を形成する段階、
個別かつ同時に外因性抗原の不在下で前記免疫前細胞および免疫後細胞を培養する段階、
前記免疫前細胞および前記免疫後細胞の増殖量を測定する段階、
前記免疫後細胞の増殖量を前記免疫前細胞の増殖量と比較する段階を含み、
1以上である免疫前細胞の増殖量に対する免疫後細胞の増殖量の比が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。 - ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも2種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、
第1の時点で患者を前記ワクチンで免疫する段階、
免疫後の少なくとも1時点で前記患者の前記作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、
少なくとも2種の作用剤に対する正の免疫学的反応が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。 - ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが2種以上のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された1種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、
第1の時点で患者を前記ワクチンで免疫する段階、
免疫後の少なくとも1時点で前記患者の前記作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、
少なくとも2種の作用剤に対する正の免疫学的反応が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。 - ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも2種以上の作用剤を含むワクチン接種用のベクターを含み、
第1の時点で患者を前記ワクチンで免疫する段階、
免疫後の少なくとも1時点で前記患者の前記作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、
少なくとも2種の作用剤に対する正の免疫学的反応が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。 - ワクチンのin vivo抗腫瘍有効性を予測する方法であって、前記ワクチンが2種以上のベクターを含み、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された1種の独特の作用剤であり、
第1の時点で患者を前記ワクチンで免疫する段階、
免疫後の少なくとも1時点で前記患者の前記作用剤に対する免疫学的反応を測定する段階を含み、
少なくとも2種の作用剤に対する正の免疫学的反応が、前記患者における前記ワクチンの有効な抗腫瘍活性を肯定的に予測する方法。 - 前記抗原提示細胞が、樹状細胞である請求項16、17、20、または21に記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、CD34+造血前駆細胞由来の樹状細胞である請求項24に記載の方法。
- 前記樹状細胞が、異種血清成分の不在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによって産生される請求項25に記載の方法。
- 前記樹状細胞が、自己血清の存在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養することによって産生され、前記自己血清が前記組織培養への添加前に熱不活性化されていない請求項25に記載の方法。
- 2種以上の免疫反応から対象の臨床転帰を予測する方法であって、
(a)臨床反応によって分類された以前に治療された対象と比較する個別のグループとしてその対象を同定する段階、
(b)すべてのプロファイルの対に関して、第2のプロファイルと比較した第1のプロファイルの順序を(a)上位、(b)下位、(c)同位、または(d)未決定として判定することによってすべてのプロファイルを半順序付けする段階であって、半順序付けが、各変数に関して第1のプロファイルが上位または同位であり、少なくとも1つの変数に関して第1のプロファイルが上位である場合、第1のプロファイルを上位とすることを含む段階、
(c)すべての対の半順序付けに適合するすべての順位を算出する段階であって、2つの順序付けされた対象のうち上位である対象に高い順位が付与される段階、
(d)順位を平均することによって各プロファイルに関してスコアを求める段階、および
(e)その平均スコアが対象のプロファイルのスコアにもっとも類似しているグループを選択することによって臨床転帰を予測する段階を含む方法。 - CD34樹状細胞を産生する方法であって、異種血清成分の不在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養する段階を含む方法。
- CD34樹状細胞を産生する方法であって、自己血清の存在下で組織培養においてCD34造血前駆細胞を培養する段階を含み、前記自己血清が前記組織培養への添加前に熱不活性化されていない方法。
- 腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも2種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含むワクチンであって、前記抗原提示細胞がCD34造血前駆細胞の組織培養から単離されたCD34樹状細胞であり、前記組織培養が異種血清成分を含まないワクチン。
- 腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも2種以上の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含むワクチンであって、前記抗原提示細胞がCD34造血前駆細胞の組織培養から単離されたCD34樹状細胞であり、前記組織培養が自己血清を含み、前記自己血清が前記組織培養への添加前に熱不活性化されていないワクチン。
- 2種以上のワクチン接種用ベクターを含むワクチンであって、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された1種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、前記抗原提示細胞がCD34造血前駆細胞の組織培養から単離されたCD34樹状細胞であり、前記組織培養が異種血清成分を含まないワクチン。
- 2種以上のワクチン接種用ベクターを含むワクチンであって、それぞれのベクターが腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された1種の独特の作用剤を負荷した抗原提示細胞を含み、前記抗原提示細胞がCD34造血前駆細胞の組織培養から単離されたCD34樹状細胞であり、前記組織培養が自己血清を含み、前記自己血清が前記組織培養への添加前に熱不活性化されていないワクチン。
- 哺乳動物において抗原提示細胞を標的とする、腫瘍抗原、腫瘍抗原由来ペプチド、およびコントロール抗原からなるグループから選択された少なくとも2種以上のベクターを含むワクチン。
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