CN1446583A - 一种肿瘤免疫治疗及预防性疫苗的组成、制备、应用方案 - Google Patents
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Abstract
本发明以抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells，APC)尤其是树突状细胞(DendriticCells，DCs)与肿瘤细胞融合形成杂交细胞，然后将此杂交细胞制成细胞提取物作为非细胞性肿瘤疫苗(Cell Free Tumor Vaccine)应用于临床肿瘤的预防免疫和生物免疫治疗。该疫苗可特异性地诱导、激活、增强生物体预防肿瘤和抗肿瘤免疫机能。对生物体新生的肿瘤和现存的肿瘤细胞发挥选择性、特异性杀伤效应。因此，该肿瘤疫苗同时具有肿瘤预防免疫和抗肿瘤免疫治疗的双重特性。
Description
一、技术领域
本发明涉及肿瘤的生物免疫治疗领域和肿瘤预防免疫领域。特别涉及通过肿瘤疫苗特异性诱导、刺激活化生物体肿瘤特异性T淋巴细胞，激发、增强生物体肿瘤预防免疫和抗肿瘤免疫功能；以及一种非细胞性肿瘤疫苗的制备及其在特异性抗肿瘤免疫治疗和肿瘤预防免疫中的应用方案。
二、技术背景一、抗肿瘤免疫的特异性识别机制
大量实验室、动物试验和临床研究资料表明：肿瘤的发生、生长、形成与生物机体的免疫系统功能缺陷有关。在正常健康生物机体，当正常细胞由于基因突变等因素开始分化为肿瘤细胞时，免疫系统会早期识别这些突变细胞，并对这些“非已”(Non-self)细胞发动免疫攻击。这种特异免疫识别机制和特异性免疫攻击效应构成正常机体的抗肿瘤免疫。
肿瘤细胞之所以能够在生物机体内失控生长、繁殖，主要原因是机体抗肿瘤免疫机制的缺陷和不完全，从而使机体处在一种对肿瘤细胞的免疫“静默”(Silence)或“耐受”(Tolerance)状态。尤其反映在机体免疫细胞不能对肿瘤细胞进行特异性免疫识别，即抗肿瘤特异性免疫识别障碍。免疫细胞对肿瘤细胞的特异性识别机制主要由MHC或HLA(主要组织相溶性复合物，人类白细胞抗原)和肿瘤多肽组成复合物形成T淋巴细胞特异性识别的第一信号；而B7(B7-1，B7-2)等其它协同刺激因子(Costimulatory Factors)构成T淋巴细胞特异性识别的第二信号。完备的上述“双信号系统”是抗肿瘤特异性免疫识别的必要先决条件。大多数肿瘤细胞的“双信号系统”缺失或不完全，因而造成肿瘤细胞的“免疫逃逸”(Escape)；致使机体抗肿瘤免疫不能有效活化，对肿瘤细胞发动免疫攻击性应答。
上述双信号系统中：MHC-I或HLA-I类分子肿瘤多肽复合物可被CD8+淋巴细胞受体(TCell Receptor；TCR)所识别；MHC-II或HLA-II类分子肿瘤多肽复合物被CD4+T淋巴细胞TCR识别，而上述T淋巴细胞的CD28受体则可与B7分子结合，继而激活CD4+和CD8+T淋巴细胞并使其增殖，诱发特异性细胞免疫效应。CD8+T淋巴细胞在抗肿瘤免疫效应中可产生直接对肿瘤细胞的特异性杀伤效应，这类细胞称为细胞毒性杀伤T细胞(Cytotoxic TLyphocytes；CTL)；而CD4+T淋巴细胞通常称为T辅助细胞(T Helper；TH)，其可通过分泌各种因子为IL-12，INF-R，IL-2等促进CTL杀伤效应和辅助B淋巴细胞产生抗肿瘤抗体。二、抗原提呈细胞(Antigen-Presenting Cells；APC)的重要作用。
APC是存在于生物体内免疫系统中一类具有重要功能的免疫细胞。APC具有摄取、加工、处理抗原并将经加工处理的抗原信息通过一定的识别机制，特异性地提呈给相应的淋巴细胞，从而诱发机体特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应。
APC在机体免疫应答过程中起着抗原特异性信号的加工、载体功能：即摄取处理、传递抗原特异性信号、介导、激发免疫系统对相应的抗原发动特异性免疫应答。
具有APC功能的细胞，广义而言，包括机体内所有的有核细胞；分布于全身各组织器官。按其提呈抗原的能力，可分为非专职性APC，如内皮细胞、纤维细胞、上皮及间皮细胞等，它们的APC功能较弱，故称非专职能APC。另外一类APC，主要是指树突细胞(Dendritic Cell，DC)、巨噬细胞和B淋巴细胞；这类细胞具有较强的抗原提呈功能，称为专职性APC(Professional APC)。
上述APC中，DC由美国学者Steinman于1973年发现，是迄今为止机体内具有最强抗原提呈功能的细胞。由于成熟的DC具有许多树突样伪足形态，因此称为树突状细胞。该类细胞的显著特征是对初始T细胞(Naive T cells)具有极强的激活能力，并使其增殖；而巨噬细胞、B淋巴细胞仅能刺激已活化的或记忆性T细胞。因此，DC细胞是机体免疫应答的始动者，在免疫应答的诱发、介导、调节、促进过程中具有十分重要的独特地位。通过调节DC的功能来改变调节机体的免疫应答；提高机体的特异性抗肿瘤免疫能力，具有极其重要的临床应用价值。三、肿瘤细胞的“免疫逃逸”机制
一般认为，在正常机体内：免疫系统具有免疫监视(Immune Surveillance)功能：其能够早期识别发生突变的正常细胞，从而予以清除，阻止其向肿瘤细胞的分化、增殖。因此，机体的免疫功能正常与否和肿瘤的发生发展具有十分密切的关系。当机体免疫功能低下或受抑制或正常免疫平衡发生紊乱时，肿瘤的发生几率增加；而在肿瘤发生后，肿瘤细胞进行性“免疫逃逸”增殖使机体免疫系统功能进一步受到抑制；二者互为因果，双方各综合因素的消长、对抗，决定着肿瘤的最后转归。
在肿瘤的发生、发展过程中，除机体自身免疫系统发生紊乱外，与肿瘤细胞本身所具有的免疫逃逸机制密切有关，其主要表现在以下方面：
1、肿瘤细胞起源于机体发生突变的正常细胞。因此，肿瘤细胞的大部分结构成分均属“自身(Self)”正常成分；而机体免疫系统并不对此类自身抗原成分产生免疫应答。
2、肿瘤细胞对其肿瘤抗原表达具有“屏蔽作用”。有些肿瘤抗原属一种多糖蛋白质复合物成分，其免疫源性很差或由于机体产生的相应抗体与肿瘤抗原结合，“封闭”了其抗原位点，从而导致机体很难对其进行免疫识别。
3、肿瘤抗原的基因型极不稳定，随机突变率高。因此，其抗原的表型改变迅速、多样，造成机体对肿瘤抗原的特异性识别、免疫应答上的障碍。
4、肿瘤细胞的“双信号”系统缺陷；多数肿瘤细胞表现为“双信号”系统成分的表达缺失或根本不表达或功能不完整，使其不能完整地将肿瘤抗原信息提呈给免疫系统，使机体抗肿瘤免疫处在一种“免疫耐受状态”，而导致抗肿瘤免疫应答功能低下或免疫无能。
5、肿瘤细胞分泌某些免疫抑制因子：如IL-10、PGE-2、TGF-β等，这些因子对APC具有明显抑制作用，使APC的抗原提呈发生困难或直接抑制T、B淋巴细胞的增殖和巨噬细胞的活化；另外，某些肿瘤可分泌FasL(Fas配体；Fas Ligand)，其与相应免疫细胞膜表面的死亡受体(Fas)结合，造成具有潜在抗肿瘤能力的免疫细胞发生“凋亡”(Apoptotic Death)，而削弱机体抗肿瘤免疫的能力。
6、肿瘤细胞在体内的增殖、生长、转移、播散极为迅速，给机体免疫系统造成沉重的“免疫负荷”，使机体抗肿瘤免疫功能相对低下，不足以彻底清除众多的肿瘤细胞而致使肿瘤失控生长。
另外，在肿瘤发生、发展过程中，一个十分值得注意的方面是：肿瘤患者机体的抗肿瘤免疫一直处在与肿瘤生长保护机制的抗争消涨之中。只不过在肿瘤细胞生长旺盛时，机体抗肿瘤免疫免疫应答功能低下，处在一种免疫“耐受”或“无能”的负平衡状态；即肿瘤患者体内具有潜在的抗肿瘤免疫能力。并且，在适当的条件下可重新恢复其功能。这是临床对肿瘤患者实施免疫治疗的理论基础和前提。
综上所述，肿瘤患者的免疫机能紊乱特征可归纳如下：
1、肿瘤患者的抗肿瘤免疫应答的“负荷超载”；
2、肿瘤患者体内微环境的免疫抑制或耐受状态；
3、肿瘤细胞本身的抗原提呈能力以及其它APC功能低下缺陷，不足以引起机体有效的抗肿瘤免疫应答；四、肿瘤免疫治疗的战略与方案：
根据机体抗肿瘤免疫功能的特殊性结合免疫学、分子生物学的最新进展以及大量的体外、动物实验研究成果，当前抗肿瘤临床免疫治疗的战略设计为：减轻肿瘤免疫负荷及解除抗肿瘤免疫抑制，耐受状态；重新激发、恢复强化患者自身的抗肿瘤免疫功能，达到新的免疫系统正平衡；充分体现肿瘤个体化特异性免疫治疗的特点。
临床上通过手术切除肿瘤可减轻肿瘤对免疫系统造成的“过度免疫负荷”，通过体外对患者APC功能的人为改变、调整即避免了肿瘤患者体内的免疫抑制微环境，又显著提高了APC的抗原提呈功能；通过在体外激活CTL并赋予其特异性识别能力，然后输回病人体内直接发挥特异性肿瘤杀伤效应。达到对“免疫耐受状态”的纠正，重新激发、强化患者自身抗肿瘤免疫机能的临床疗效。
近年来，根据以上原则，各国科学工作者对各种肿瘤免疫治疗方案(肿瘤疫苗设计)进行了大量的体外、体内研究，取得了令人满意的结果，尤其对APC中的DC在抗肿瘤治疗中的重要作用，给予了一致充分肯定。
下表列举了近年来国际上常用的主要肿瘤疫苗设计方案：
肿瘤疫苗种类及应用研究
| 肿瘤疫苗类型 | 疫苗制备方法 | 动物模型 | 临床试用 |
| 肿瘤细胞 | 死亡全肿瘤细胞肿瘤细胞溶解物 | 黑色素瘤、结肠癌等肉瘤 | 黑色素瘤、结肠癌等黑色素瘤 |
| 纯化的肿瘤抗原 | 黑色素瘤抗原热休克蛋白(HSP) | 黑色素瘤多种肿瘤 | 黑色素瘤黑色素瘤、肾癌、肉瘤 |
| 细胞因子加协同刺激因子 | 细胞因子和B7基因对肿瘤细胞的转染细胞因子基因转染APC或以肿瘤抗原刺激APC | 肾癌、肉瘤B细胞白血病、肺癌 | 黑色素瘤、肉瘤等 |
| DNA疫苗 | 肿瘤抗原基因质粒 | 黑色素瘤 | 黑色素瘤 |
| 多肽疫苗 | 肿瘤多肽或合成多肽 | 黑色素瘤等 | 黑色素瘤等 |
| 病毒疫苗 | 腺病毒、含肿瘤抗原基因的病毒±细胞因子 | 黑色素瘤、肉瘤 | 黑色素瘤 |
| DC疫苗 | DC+全肿瘤细胞或其溶解物共培养肿瘤基因(DNA)转染DC肿瘤细胞全RNA转染APC | 黑色素瘤肾癌、肺癌结肠癌肉瘤前列腺癌乳腺癌B细胞白血病 | 黑色素瘤前列腺癌 肝癌结肠癌肾癌 神经胶质细胞瘤肉瘤非霍克金氏淋巴癌瘤前列腺癌乳腺癌B细胞白血病 |
| 肿瘤/DC杂交细胞疫苗 | 肿瘤细胞+DC的融合杂交细胞 |
上述肿瘤疫苗设计方案中，DC/肿瘤融合细胞是近年来发展的一种新型肿瘤疫苗，以这种疫苗设计的临床治疗方案，目前认为是最有前景的肿瘤免疫治疗方案。这种疫苗的显著特点是：将具有最强APC功能的DC与肿瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞；该细胞同时具有肿瘤细胞产生全部肿瘤抗原的能力(包括已知和未知的)和DC细胞全面(包括MHC-I/II)提呈肿瘤抗原的能力，同时为免疫活性细胞提供完整的双信号识别系统，从而有效地激发免疫活性细胞产生对肿瘤的特异性识别杀伤效应，达到临床治疗作用。
上表所列举的各种肿瘤设计方案均经体外试验、动物试验以及临床前研究证明了其各自的有效性。但仍存在以下主要不足和局限：1、制备技术复杂：如纯化鉴定肿瘤抗原，基因重组表达肿瘤抗原；肿瘤基因转染技术等疫苗设计。2、引入病毒载体分子：如肿瘤DNA疫苗和肿瘤基因转染设计等。3、抗原提呈效率低：如RNA导入APC，肿瘤细胞或肿瘤细胞溶解物与APC或T淋巴细胞共培养(Pulse)等设计。4、抗原提呈不完全：如肿瘤DNA疫苗，肿瘤RNA疫苗设计，其不能通过MHC或HLA-II类分子对肿瘤抗原进行提呈。而肿瘤细胞及其溶解物与APCs或淋巴细胞共培养疫苗设计又不能有效通过MHC或HLA-I类分子进行肿瘤抗原提呈。5、多数为单价肿瘤疫苗设计：仅供特定个体患者肿瘤免疫治疗使用而无预防免疫方案。6、难以转为生物制药进行大规模生产。
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三、发明内容
这种肿瘤疫苗属于一种亚细胞生物活性提取物，其不含有任何完整的生物活性细胞，尤其不含有任何具有生命活性的肿瘤细胞。因此，不存在将肿瘤活性细胞引入病人机体的危险性。其基本制备程序为：1)制备APC/肿瘤细胞的杂交细胞或/和建立其杂交细胞系。2)破碎上述杂交细胞，制备细胞提取物或纯化相应组分制成肿瘤疫苗。
APC细胞或APC前体细胞可取自同一(Autologous)或不同(Allogeinic)生物个体的骨髓、外周血、皮肤、淋巴结、脾脏，经体外处理后或直接用与同一个体或不同个体的同类或不同类肿瘤细胞融合制成APC/肿瘤杂交瘤细胞。APC/肿瘤杂交细胞融合后的杂交细胞同时具有APC细胞和肿瘤细胞的双重细胞生物学特性；即杂交细胞中APC细胞部分完整高效的抗原提呈系统，如MHC(HLA)生物合成系统：摄取、酶学降解处理自身或非自身肿瘤抗原成分形成肿瘤多肽，然后对MHC(HLA)和肿瘤多肽组装形成MHC(HLA)-肿瘤多肽复合物并表达于细胞膜表面。杂交瘤细胞中的肿瘤细胞部分可持续不断合成已知和未知的全部特异性肿瘤抗原和肿瘤相关抗原，并通过上述APC细胞的抗原提呈系统提呈于细胞膜表面，形成可被肿瘤特异性T淋巴细胞识别的第一信号，即MHC(HLA)-肿瘤抗原多肽复合物。在第二信号协同刺激因子B7(B7-1和B-7)和其它有关成分的共同作用下，激活肿瘤抗原特异性T细胞(TH，CTL)，从而全面活化生物体特异性抗肿瘤免疫，对肿瘤细胞进行杀伤清除。
本发明首次表明：激活机体抗肿瘤特异性免疫并不需要以完整的APC/肿瘤杂交细胞作为疫苗，APC/肿瘤杂交细胞的提取物具有与完整杂交细胞相同的肿瘤疫苗活性。能全面激活人体抗肿瘤特异性免疫，尤其能强有效地刺激CD4+(TH)和CD8+(CTL)淋巴细胞活化，发挥对肿瘤细胞的特异性免疫杀伤效应。
本发明建立的APC/肿瘤杂交瘤细胞提取物肿瘤疫苗制备方法较现有APC/肿瘤杂交细胞的全细胞疫苗制备方法更为简便、安全、有效；适于大规模生物制药生产。现存的全细胞性肿瘤疫苗制备需在APC/肿瘤细胞融合前对肿瘤细胞进行放射性灭活处理，使肿瘤细胞丧失分化增殖能力，需要昂贵的放射性照射仪；另外，经放射线处理后的肿瘤细胞有可能产生肿瘤特异性抗原基因突变(Mutation)使肿瘤原有肿瘤特异性抗原发生改变，导致肿瘤疫苗的特异性下降；另外由于融合后的杂交瘤细胞丧失分化再增殖能力，因此肿瘤疫苗的制备产量受到限制。本发明在APC/肿瘤细胞融合前可不需对肿瘤细胞进行放射性处理及任何其它灭活处理，能使肿瘤细胞保留其良好的分化，增殖活性以及持续产生原有肿瘤特异性抗原的能力。一方面显著提高了细胞融合效率；另一方面APC/肿瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞仍可保持较好的分化增殖活性，可进行体外短期或长期连续传代培养，建立永久杂交瘤细胞系，为肿瘤疫苗制备提供丰富的细胞来源，满足大量肿瘤疫苗制备要求，适于转为生物制药大规模生产。
本发明中所述及的肿瘤疫苗的另一特征是能根据实际应用需要，灵活调整、组合疫苗制备方式，从而实现单价、多价、甚至通用肿瘤疫苗的制备。
1、单价肿瘤疫苗制备：
基本方法是APC细胞和肿瘤细胞均来源于同一生物个体。通过细胞融合技术获得APC/肿瘤杂交细胞，在体外特定条件下培养，使杂交细胞产生高水平的MHC(HLA)-肿瘤抗原多肽表达和协同刺激因子B7表达以及其它相关细胞因子(如ICAM-1，IFA-3，CD40等)表达。然后制成杂交细胞提取物肿瘤疫苗。其中预留一部分杂交细胞连续培养建立细胞系备用。由该种方法制备的疫苗具有极强的针对性，可特异性地诱发同一肿瘤患者机体产生特异性抗肿瘤免疫效应，对患者体内的肿瘤细胞进行选择性杀灭、清除。从而实现对该肿瘤患者的个体化、特异性生物免疫治疗。而由此获得的杂交细胞系既可用于该肿瘤患者的后续治疗；同时又可作为多价肿瘤疫苗制备的组成部分。
2、多价肿瘤疫苗制备：
上述单价肿瘤疫苗制备中的APC细胞和肿瘤细胞均采自同一肿瘤患者，由于T细胞特异性识别机制的限制，其疫苗具有严格的个体特异性，故在实际应用中一般仅限于某特定个体，另外在临床上常常难以获得某特定个体患者的肿瘤细胞(如术后、复发患者)，以致无法制备自体肿瘤疫苗(Autologous Tumor Vaccine)。在这种情况下：可采取以下替代方法获得单价、多价或广谱疫苗。应用于同类肿瘤或/和不同类肿瘤患者的临床免疫治疗：
1)自体APC细胞与一种或一种以上的异体同类肿瘤细胞或/和同类肿瘤细胞系融合。如黑色素细胞瘤患者自体APC细胞与多种异体黑色素细胞瘤细胞或细胞系融合，形成自体APC/多种异体黑色素细胞瘤杂交细胞，这种杂交细胞具有多种黑色素细胞瘤抗原多肽/HLA复合物，同时提呈多种黑色素瘤细胞特异性抗原。将此混合杂交瘤细胞制成细胞提取物，通过黑色素细胞瘤共同抗原交叉提呈机制(Cross Priming)激活患者黑色素细胞瘤抗原特异性T细胞，对相应病人实施免疫治疗。
2)一个或多个异体APC细胞与多种异体同类或不同类肿瘤细胞和/或肿瘤细胞系融合。
通过肿瘤共同抗原提呈机制或/和特异性肿瘤抗原交叉提呈机制，上述混合杂交细胞提取物仍可激发或部分激发患者的抗特异性肿瘤免疫效应。
由一个以上多个个体APC细胞与多个同类或不同类肿瘤细胞进行融合，可制备针对同类肿瘤的单价疫苗也可制备针对多种肿瘤的多价疫苗。
本发明中所述及的APC/肿瘤杂交细胞提取物可经过进一步纯化获得相应的单一组分或纯化组分，根据临床应用需要分别单独使用或组合使用。其主要包括但不限于下列内容：细胞膜组分、细胞浆组分、细胞核组分；HLA组分HLA-肿瘤多肽复合物、HLA-I肿瘤多肽复合物、HLA-II-肿瘤多肽复合物、热休克蛋白(Heat Shock Protein；HSP)、HSP-肿瘤多肽复合物、蛋白组分、RNA、DNA分子及其片段多肽组分、肿瘤相关抗原及其多肽组分、肿瘤特异性抗原及其多肽组分、细胞膜受体组分、各种CD分子组分等。来自多种APC/肿瘤杂交瘤细胞提取物及其各种上述组分可根据具体患者肿瘤类型组合成各种具有多价或广谱抗肿瘤的活性疫苗。
本发明中所述及的肿瘤疫苗另一特征是具有抗肿瘤免疫治疗和肿瘤预防性免疫的双重功能。根据实际需要，利用上述多价或广谱肿瘤疫苗对正常人群或某些相应肿瘤高危人群进行预防性免疫，使其处在正常生理状态下的免疫细胞获得完整的肿瘤抗原刺激；即HLA-肿瘤特异性多肽复合物和协同刺激因子等。通过特异性识别机制，接受肿瘤疫苗免疫正常机体处在静息状态的T淋巴细胞免疫系统活化并产生特异性的免疫记忆细胞(Memory cells)。上述过程与机体免疫系统初次接受某种异已抗原成分发生的效应十分类似。当对同一个体进行第二次相同肿瘤疫苗接种(二次接种或加强免疫)或该个体出现相应的肿瘤细胞生长，且该肿瘤细胞的肿瘤抗原成分可被初次肿瘤疫苗产生的特异性记忆淋巴细胞识别时，即可迅速全面诱发机体细胞免疫(记忆性T细胞)和体液免疫系统(记忆性B细胞)的抗肿瘤应答，对相应的细胞进行特异性杀伤、清除，从而阻止肿瘤细胞的继续生长、预防肿瘤形成。
免疫佐剂(Immuno-Adjuvant)属于一类非特异性免疫增强剂。这类佐剂包括：卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌(CP)、脂多糖(CPS)、弗氏佐剂(CFA和IFA)、脂质体等。当其与特异性抗原或免疫刺激物如疫苗先后或同时使用时，可增强、延长、放大机体特异性免疫应答。因此，本发明所述及的肿瘤疫苗在具体应用中强调与上述免疫佐剂配合使用，借以加强肿瘤疫苗在肿瘤预防免疫和抗肿瘤免疫治疗中的作用，进一步强化生物机体的特异性抗肿瘤免疫应答。
本发明所述及的肿瘤疫苗在实际临床应用中，可与其它各种肿瘤治疗方法同时或先后使用，如手术、化疗、放疗、各种生物因子治疗，以及其它免疫治疗如抗体治疗等。其中，本发明着重强调与特异性细胞免疫方法的联合使用。这种方案的基本设计为：以本发明所述及的肿瘤疫苗或其它肿瘤疫苗在体外IL-2等其它刺激因子的参与下与肿瘤患者自身的T淋巴细胞进行共培养，使T淋巴细胞脱离患者免疫抑制内环境在体外适当培养条件下接受肿瘤疫苗的特异性刺激活化，形成肿瘤特异性CTL并进行大量增殖，然后回输病人体内迅速直接发挥特异性肿瘤杀伤效应。在肿瘤特异性CTL回输的同时或回输前后，接种肿瘤疫苗，可加强放大延长患者机体特异性抗肿瘤免疫效应能力。
举例例一：外周血DC制备1、无菌条件下抽取人体外周血10-300ml。2、以Ficoll-Paque梯度离心分离单个核细胞并混悬在RPMI1640培养液中。3、将单个核细胞培养瓶置于37℃，CO2孵箱温育30分钟-5小时。4、吸弃非贴壁细胞。5、以培养液洗涤贴壁细胞后加入一定量的DC培养液(RPMI1640，1％-30％人血清；50-2000单位/ml的GM-CSF和IL-4)。6、在37℃，CO2培养箱中培养3-12天；收获前加入一定量的INF促进DC进一步成熟。7、收获成熟的DC混悬于培养液中备用。例二：骨髓DC制备：1、无菌、麻醉条件下按临床常规由人体髂骨穿刺抽取5-100ml骨髓。2、低速离心后，吸弃上清液，加入一定量的红细胞(RBC)沉降液，静置一定时间。3、加入RBC裂解液，破碎RBC，离心收集骨髓有核细胞。4、按一定浓度将骨髓有核细胞置于培养瓶中，加入DC培养液。5、在37℃，CO2培养箱中培养5-12天。6、收获DC细胞备用。例三：实体瘤肿瘤细胞制备1、在无菌条件下将肿瘤组织剪切为1-2mm3的小块置于PRMI1640培养液中加入一定量的胶原酶和DNA酶。2、在37℃温育30分钟-4小时。3、过滤除去块状组织后，离心收集细胞组分。4、洗涤细胞加入RBC溶解液破坏RBC。5、离心收集有核细胞后，以Ficoll-Paque分层液梯度离心收集肿瘤细胞。6、混悬肿瘤细胞于适当培养液中备用。例四：DC/肿瘤细胞融合(PEG融合)：1、将DC和肿瘤细胞按一定比例混合，离心吸弃上清液。2、在37℃温育无菌条件下缓慢加入一定量的25-55％PEG溶液，边加边混匀。3、继续缓慢加入5-10ml细胞培养液(含血清的RPMI1640)。4、洗涤离心收获融合细胞并加入细胞培养液。5、在37℃，CO2孵箱内培养2-48小时后用于进一步肿瘤疫苗制备或连续传代培养建立细胞系。例五：DC/肿瘤杂交细胞提取物疫苗制备(方法一)1、取一定量DC/肿瘤融合细胞，置于无菌试管中2、将上述试管置于-20℃以下，10分钟-2小时3、取出试管置37℃水浴中5-10分钟4、重复步骤2、3共2-5次。5、该反复冻融后的DC/肿瘤杂交细胞混合提取物可直接应用于临床肿瘤患者的免疫治疗或经进一步纯化后使用。例六：特异性抗肿瘤CTL的诱导制备方法：1、按临床常规无菌静脉采集人外周血10-100ml。2、以淋巴细胞分层液梯度，离心收集单个核细胞组分；或以细胞分离机采集外周血单个核细胞。3、将单个核细胞在适当培养液中静置30分钟-5小时，收集非附壁细胞。4、经洗涤后，将细胞混悬在含血清培养液中并加入培养瓶中。5、在培养液中加入一定量DC/肿瘤杂交细胞提取物以及IL-2等其它因子；在37℃ CO2孵箱中连续培养5-12天。6、洗涤活化增殖后的CTL备用。例七DC/肿瘤杂交细胞提取物疫苗制备(方法二)1、取一定量DC/肿瘤杂交细胞，置于匀浆器内。2、设定匀浆机转速(rpm)500-5000转/分。3、起动匀浆机，匀浆10秒-1分钟；暂停匀浆1-5分钟。重复上述过程3-10次。4、匀浆制备疫苗的全部操作应在低温、无菌条件下进行。5、制备后的疫苗保存在低温环境备用。例八：DC/肿瘤杂交细胞提取物的临床抗肿瘤免疫治疗方案：1、在无菌条件下取一定量的肿瘤疫苗(1000-100,000杂交细胞提取物)，或/和与一定量免疫试剂混合(如BCG等)对病人进行皮下淋巴结注射。2、同时以一定量的白介素如IL-2或其它细胞因子皮内或肌肉注射作为辅助综合治疗；持续注射3-10天。3、肿瘤疫苗可隔1-4周视临床情况作重复注射，加强免疫效果。4、在治疗过程中对机体各项免疫学指标进行动态监测，适时调整疫苗治疗方案。例九：DC/肿瘤杂交细胞提取物的肿瘤预防免疫方案：1、在无菌条件下取一定量的相应肿瘤疫苗(或与免疫佐剂混合，如BCG等)，对相应肿瘤的高危人群或正常人群进行皮下，淋巴结或周围组织免疫注射。2、隔14周进行加强免疫注射，共2-3次。3、监测各项免疫学指标，评价预防免疫效果。
四、发明小结
采用肿瘤患者自身APC/肿瘤细胞融合方案制备的细胞杂交性肿瘤疫苗成功的解决了肿瘤病人的特异性个体化抗肿瘤免疫治疗难题。但这种全细胞疫苗方案由于制备方法的要求较高以及只适用于某个特定肿瘤患者使用和不能满足生物制药规模生产要求等诸多缺点，使其在临床抗肿瘤免疫中的应用范围受到严格限制。
本发明以APC/肿瘤细胞杂交瘤的提取物作为一种新型的非全细胞肿瘤疫苗设计和制备方法，具有独到的特点和优越性；另外，在实际应用中的肿瘤免疫治疗方案和预防免疫方案具有理论以及实际应用上的合理性和可行性。
这种新型肿瘤疫苗将抗肿瘤免疫的个体特异性与多价、广谱肿瘤疫苗的通用性相结合，具有抗肿瘤免疫治疗和肿瘤预防性免疫的双重特性。同时，这种肿瘤疫苗的制备方法简单、灵活、使用安全并易于生物制药的规模化生产。
Claims (21)
1.一种由抗原提呈细胞(Angigen Presenting Cells，APC)尤其是树突状细(DendriticCells；DC)和肿瘤细胞经融合形成APC/肿瘤细胞杂交细胞的细胞提取物(CellExtracts)作为肿瘤疫苗的制备方法及其在肿瘤预防免疫和抗肿瘤生物免疫治疗中的应用。
2.权利要求1中的APC/肿瘤细胞杂交细胞进一步解释为具有特异性激发生物体抗肿瘤免疫的细胞；尤其指携带HLA(MHC)-特异性肿瘤抗原多肽复合物、协同刺激因子B7(Costimulatory Factor；B7-1，B7-2)和细胞粘附因子(ICAM-1、LFA-3等)；及其它与T淋巴细胞活化有关的各种成分(CD40等)。
3.权利要求1中的APC/肿瘤细胞杂交细胞进一步解释为包括具有或不具有分裂增殖功能的APC/肿瘤细胞杂交细胞；其能暂时产生或/和持续、永久产生激活肿瘤特异性T淋巴细胞所需的各种生物活性成分。
4.权利要求1中的APC/肿瘤细胞杂交细胞提取物解释为通过物理、化学、酶学、生化、生物学方法使APC/肿瘤细胞杂交细胞破裂制备成的亚细胞成分；其至少必须包含一种能够激活增强生物体特异性抗肿瘤免疫功能的亚细胞成分。
5.权利要求1中的APC/肿瘤杂交细胞提取物是指具有刺激、增强生物机体抗肿瘤免疫反应的任何已知和未知成分。例如：细胞膜成分、细胞浆内含物、细胞核成分；蛋白质分子及其片段、蛋白质多肽复合物、脂蛋白、糖蛋白、蛋白质复合物、DNA分子其片段、RNA分子等。
6.权利要求1中APC/肿瘤杂交细胞提取物进一步解释为包含细胞膜和细胞内所有可溶性成分和不可溶成分；但至少必需包含一种或一种以上足以活化生物体特异性抗肿瘤T淋巴细胞的活性成分。该类成分包括已知和未知的蛋白质、多肽、蛋白质多肽复合物、脂类；DNA分子，RNA分子及其他生物分子。
7.权利要求1中的APC/肿瘤杂交细胞提取物进一步解释为通过物理化学方法、生物学方法、免疫学方法如细胞冻融、超声破碎、微波、电磁波、激光、匀浆、离心、梯度密度离心、层析、亲和层析，沉淀、透析、超滤、酶学消化等提取纯化方法获得的单一纯化组分或多种纯化组分。
8.权利要求7中杂交细胞提取物纯化组分进一步解释为可活化生物体肿瘤特异性T淋巴的任何单一或复合组分。其主要包括下列内容：细胞膜组分，MHC(HLA)分子、MHC(HLA)-I分子、MHC(HLA)-II分子、MHC(HLA)-I-肿瘤多肽复合物、MHC(HLA)-II-肿瘤多肽复合物，HSP分子、HSP-肿瘤多肽复合物、B7蛋白、B7.1(CD80)分子、B7.2(CD86)分子、ICAM分子、LFA分子、CD40分子、各种其他CD分子、各种其他细胞粘附因子、各种细胞受体分子、多肽成分、酶成分；或任何已知和未知的肿瘤相关抗原和特异性肿瘤抗原成分等。
9.权利要求1中APC细胞解释为生物体内任何具有抗原提呈功能的细胞。其主要包括职业性抗原提呈细胞：树突状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞；非专职性抗原提呈细胞：任何具有抗原提呈功能的其它有核细胞，如上皮细胞、内皮细胞、间皮细胞、间质细胞、纤维细胞、单个核细胞、各种肿瘤细胞等。
10.权利要求2中的APC细胞进一步解释为经过改造或诱导，使原来不具有APC功能的细胞转化为具有APC功能的细胞。如各种干细胞、胚胎干细胞、血液中的各种干细胞、组织干细胞、纤维母细胞、DC前体细胞、上皮细胞、间皮细胞、内皮细胞、间质细胞前体细胞、间质细胞、肿瘤细胞等。
11.权利要求1中的APC细胞可通过体外与特异性肿瘤抗原成分共培养(Pulse)，在各种辅助生物因子的共同作用下，使其具有针对相应肿瘤抗原的特异性抗原提呈功能。
12.权利要求1中的APC细胞进一步解释为经过分子生物学方法，细胞生物学方法改造或诱导使原来不具有APC功能的细胞或APC前体细胞转变成为具有APC功能的细胞。如基因或重组基因对细胞的转染；RNA导入，或以特异性蛋白成分交联于细胞膜表面分子，或肿瘤特异性多肽负载其细胞表面上的HLA(MHC)分子；或以一种或一种以上的细胞因子诱导刺激等方法。
13.权利要求1中的肿瘤细胞进一步解释为存在于生物体未经改造或诱导处理，或经过改造或诱导处理的肿瘤细胞，从而增强其肿瘤抗原提呈能力或肿瘤免疫源性以刺激特异性抗肿瘤免疫应答。
14.权利要求1中的APC/肿瘤融合杂交细胞制备的特征是在APC和肿瘤细胞融合前，可对肿瘤细胞进行射线、药物等灭活处理，使其丧失增殖能力；或无需对肿瘤细胞进行放射性灭活或其它灭活处理，从而保证在形成融合细胞后，仍保持杂交细胞持续产生原始肿瘤抗原和有效的肿瘤抗原提呈能力以及细胞分裂增殖活性。
15.权利要求1中的细胞融合技术解释为任何使两个生物活性细胞形成另一新杂交细胞的物理、化学、生物学技术和方法；其包括电融合、PEG融合、微波细胞融合、受体介导融合等方法。APC/肿瘤杂交细胞的融合方式主要包括以下种类：
a)自体APC细胞与自体肿瘤细胞融合形成的杂交细胞
b)自体APC细胞与异体肿瘤细胞或肿瘤细胞系融合形成的杂交细胞
c)自体APC细胞与来自多个异体的肿瘤细胞或肿瘤细胞系融合形成的杂交细胞
d)异体APC细胞与异体肿瘤细胞或肿瘤细胞系融合形成的杂交细胞
e)多个异体APC细胞与多个异体肿瘤细胞或肿瘤细胞系融合形成的混合杂交细胞
16.权利要求1中的APC/肿瘤杂交细胞提取物至少含有一种或一种以上的APC/肿瘤杂交细胞成分，即杂交细胞提取物可来自一种APC/肿瘤细胞杂交细胞，也可来自多种APC/肿瘤杂交细胞。
17.权利要求1中的APC细胞和肿瘤细胞可分别来自同一人类或非人类生物个体，亦可来自不同的人类或非人类生物个体。
18.APC/细胞与肿瘤细胞融合后，需在体外进行适当时间(30分钟以上)培养借以保证杂交细胞特异性提呈肿瘤抗原生物学过程的完成。APC/肿瘤细胞杂交细胞可在体外进行连续传代培养，建立永久杂交细胞系作为肿瘤疫苗来源。
19.该肿瘤疫苗引入生物体内的途径包括：皮下皮内注射，淋巴结周围注射、淋巴结内注射、肌肉注射、静脉注射、胸腔注射、腹腔注射、脊髓鞘内注射肿瘤周围局部注射、肿瘤内注射、全身多点注射等。上述引入途径可视具体情况单独使用或联合使用。
20.该肿瘤疫苗引入生物体内的方式包括：单独使用或与其它一种或一种以上免疫佐剂如卡介苗(BCG)、QS-21、HSP、ISCOMS、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂；或与一种或一种以上的细胞因子、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素12(IL-12)、γ-干扰素(INF γ)、GM-CSF联合使用；或与经体外培养、刺激、诱导、活化、增殖后具有特异性肿瘤杀伤效应的细胞毒性T淋巴细胞(Cytoxicity T Cells；CTL)的回输治疗联合使用；或与抗肿瘤特异性抗体治疗或其它增强免疫功能的抗体如抗CD40抗体、抗CD28抗体联合使用等。
21.本发明中的肿瘤及肿瘤细胞解释为包括良性、恶性肿瘤的任何原发性及继发性和转移的肿瘤和肿瘤细胞。这些肿瘤、肿瘤细胞的组织来源可为上皮组织、间叶组织、血液组织等；例如：各种癌、肉瘤、神经胶质瘤、母细胞瘤、纤维瘤，各种肺癌、肠癌(大肠癌、结肠癌、直肠癌等)；各种肝癌；各种胃癌；各种肾癌；前列腺癌；各种乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌；各种皮肤癌、黑色素细胞瘤；各种鼻咽癌；各种食道癌等。
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