CN110846281B - 一种基于外泌体的抗肿瘤疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种外泌体，其是抗原提呈细胞吞噬肿瘤细胞核形成的杂合细胞分泌。通过巨噬细胞吞噬肿瘤细胞核的策略，实现了肿瘤抗原在巨噬细胞上的内源性表达，制备的外泌体具有良好的淋巴结及肿瘤双靶向能力。

Description

一种基于外泌体的抗肿瘤疫苗
技术领域
本发明涉及一种外泌体、其制备方法和基于该外泌体的抗肿瘤免疫治疗方法，所述外泌体具有免疫激活及肿瘤微环境双效调节能力。
技术背景
恶性肿瘤的治疗手段通常有三种，分别是：手术治疗、放射治疗和化学治疗。其中，手术治疗仅限于直接切除肉眼可见的实体肿瘤来达到治疗效果，而且恶性肿瘤浸润性极强，手术治疗无法保证将所有肿瘤细胞全部去除，存在较高的肿瘤复发风险。放射治疗是使用具有细胞杀伤能力的放射线(如：α射线、β射线、γ射线等)对恶性肿瘤部位进行照射，从而杀死癌细胞。由于射线放射治疗没有特异性，在照射过程中，不可避免地对周围的组织及细胞产生一定的不利影响。化学治疗是利用具有肿瘤杀伤能力的化学药物杀伤肿瘤细胞，从而有效抑制肿瘤细胞的增殖、扩散以及转移。但绝大多数的化疗药物并没有肿瘤特异杀伤的能力，在杀伤肿瘤的同时，也会对机体正常细胞造成损伤，具有较强的副作用。
随着肿瘤生物学以及免疫学的发展，以调节自身免疫系统为主要特性的免疫疗法为肿瘤治疗开辟了一条崭新的思路。肿瘤免疫治疗是利用各种手段，激发和增强机体自身的免疫保护机制去杀伤非正常的肿瘤细胞，达到治疗肿瘤及防止复发的目的。目前，淋巴细胞的过继疗法、抗体治疗方法、肿瘤治疗性疫苗以及针对免疫检验点的阻断治疗为代表的抗肿瘤免疫治疗均取得了一定的研究进展。
肿瘤治疗性疫苗发挥肿瘤治疗作用的基本原理是通过含有肿瘤抗原的疫苗来激活患者自身的免疫系统，使得机体产生针对肿瘤细胞的特异免疫应答，并借此过程对肿瘤细胞进行特异清除。该过程从抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)对肿瘤抗原的摄取开始，经各类免疫细胞共同协作，并借助复杂的免疫因子信号网络而完成。首先肿瘤部位的肿瘤抗原会被体内巡游的APC发现，APC将通过抗原摄取和随后的抗原加工获得抗原提呈能力，同时APC会释放大量趋化因子，吸引更多APC到达注射部位进行肿瘤抗原的摄取和加工提呈。被肿瘤疫苗活化的APC进而主动归巢到淋巴结，在淋巴结内分别对CD4+T细胞和CD8+T淋巴细胞进行激活：一方面，APC能够通过表面的MHC I复合物激活CD8+T淋巴细胞，使其增殖，并进一步转化为具有肿瘤细胞杀伤作用的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)，之后CTL会迁移浸润到肿瘤部位，对肿瘤细胞进行裂解杀伤，通过细胞免疫应答实现彻底清除肿瘤细胞的目的；另一方面，APC可以通过其表面的MHC II复合物激活CD4+T淋巴细胞产生体液免疫应答，在IL-12的辅助作用下转变为Th1型辅助性T细胞，通过分泌Th1型细胞因子(如IFN-γ)，辅助CTL对肿瘤细胞发挥杀伤作用。
目前很多新型纳米肿瘤疫苗在体外实验中被证明可以实现上述细胞免疫应答，产生大量的CTL，但在动物水平上的抑瘤效果却并不理想，主要是由于在动物体内肿瘤部位存在复杂的肿瘤微环境。肿瘤微环境中存在着大量的免疫抑制类细胞，包括：肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、髓源抑制性细胞(MDSC)、调节性树突状细胞(DC-reg)及调节性T细胞(Treg)等，这些免疫抑制细胞常通过其表面免疫抑制分子(如PD-L1)或分泌大量抑制性细胞因子(如IL-10、TGF-β)，来阻碍效应淋巴细胞致敏，降低其浸润能力，并抑制浸润的效应细胞发挥杀伤作用，从而削弱机体的抗肿瘤免疫作用。
尽管有上述各种研究，但研究开发出能更高效激发机体产生特异性免疫的疫苗，例如除了可以激活体内的细胞免疫应答之外，还兼具靶向肿瘤部位及改善肿瘤免疫抑制性微环境的能力，将对其临床应用具有重要意义。
发明概述
本申请的发明人发现，使肿瘤抗原在APC上进行内源性表达，可以从根本上实现肿瘤抗原的MHC I提呈，且可同时实现APC上共刺激因子(如CD40、CD80、CD86等)的高效表达。例如，利用具有强吞噬能力的巨噬细胞去吞噬肿瘤细胞核，并对形成的“杂合”细胞给予脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激，在此基础上提取杂合巨噬细胞的外泌体，获得具有仿生APC功能的外泌体型疫苗制剂。由于肿瘤细胞核内含有完整的肿瘤细胞遗传信息，其被内吞后会利用巨噬细胞的细胞器内源性地在巨噬细胞膜上表达肿瘤抗原的MHC I复合物；培养过程中LPS的协同刺激，可进一步提升巨噬细胞表面的共刺激因子及肿瘤抗原-MHC I复合物的表达水平，同时可使巨噬细胞向具有抗肿瘤作用的M1型巨噬细胞转化。该种被激活的“杂合”细胞分泌的杂合外泌体表面携带有大量的共刺激分子、肿瘤抗原MHC I复合物及多种抗肿瘤相关的免疫激活类信号分子。这些杂合外泌体类似于纳米级别的APC，由于其具有纳米尺寸的粒径，一部分外泌体可以靶向到淋巴结处，在淋巴结内部仿生APC的功能，直接对T细胞进行激活，激发细胞免疫应答。除此之外，由于此杂合外泌体携带有一定的肿瘤信号(如黏附分子)，可以靶向识别同源的癌细胞肿瘤，通过同源肿瘤的定向趋化作用，将一部分外泌体引导到肿瘤部位。在肿瘤内部，杂合外泌体可以依靠其内部免疫激活类的信号分子，将M2型巨噬逆转为M1型巨噬，降低Treg比例，从而改善肿瘤微环境。
基于此，本发明提供一种杂合细胞，其由抗原提呈细胞吞噬肿瘤细胞核形成。优选的是，抗原提呈细胞是树突状细胞、巨噬细胞或者是B细胞。
本发明还提供一种外泌体，其是由所述的杂合细胞分泌的纳米细胞囊泡，该外泌体是一种杂合外泌体。
本发明还提供一种外泌体的制备方法，其含有以下步骤：提取肿瘤细胞的细胞核，在抗原提呈细胞培养液中加入该肿瘤细胞核，孵育后，收取所述培养液的上清液，差速离心，以收集外泌体。
本发明还提供一种药物组合物，其含有所述的杂合细胞或外泌体，以及药学上可以接受的载体，，该药物组合物例如是抗肿瘤疫苗。
本发明还提供一种药物组合物，其含有所述的外泌体和单克隆抗体，以及药学上可以接受的载体，该单克隆抗体例如是PD-1抗体、PD-L1抗体或CTLA-4抗体。
附图说明
图1小鼠巨噬细胞吞噬肿瘤细胞核形成杂合细胞的共聚焦图片
图2本发明鼠源外泌体的透射电镜图片
图3本发明鼠源外泌体的粒径分布图
图4本发明鼠源外泌体上4种蛋白分子(外泌体标志蛋白CD9、共刺激分子CD86、组织相容性复合物I、组织相容性复合物II)的表达情况
图5本发明人源外泌体的透射电镜图片
图6本发明人源外泌体上4种蛋白分子(CD86、CD40、HLA-ABC、HLA-DR)的表达情况
图7本发明鼠源外泌体皮下注射后在小鼠淋巴结及肿瘤富集情况
图8本发明鼠源外泌体信号在小鼠淋巴结及肿瘤部位随时间的变化情况
图9本发明鼠源外泌体注射48h后小鼠不同组织的外泌体信号富集情况
图10本发明鼠源外泌体在淋巴结内发挥作用的不同免疫细胞比例及饼状图展示
图11本发明鼠源外泌体激活后的巨噬细胞与T细胞相互作用示意图及T细胞增殖效果
图12本发明鼠源外泌体激活后的树突状细胞与T细胞相互作用示意图及T细胞增殖效果
图13本发明鼠源外泌体直接激活T细胞后的增殖效果
图14本发明人源外泌体直接激活人T细胞后的增殖效果
图15本发明人源外泌体激活的T细胞对于肿瘤细胞的杀伤效果
图16本发明鼠源外泌体瘤内注射后与巨噬细胞相互作用的杂合外泌体比例
图17本发明鼠源外泌体瘤内注射后对肿瘤相关巨噬细胞分型(M1/M2)的影响
图18本发明鼠源外泌体瘤内注射后肿瘤内CD4/Treg、CD8/Treg的比值
图19本发明鼠源外泌体瘤内注射后肿瘤内CTL的浸润情况
图20本发明人源外泌体刺激后对3D肿瘤细胞球中巨噬细胞分型的影响
图21本发明人源外泌体刺激后3D肿瘤细胞球中的Treg比例
图22本发明人源外泌体刺激后3D肿瘤细胞球的生长体积
图23本发明鼠源外泌体皮下注射后E.G7-OVA荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线
图24本发明鼠源外泌体皮下注射后E.G7-OVA荷瘤小鼠的生存时间曲线
图25本发明鼠源外泌体皮下注射后Muc1-B16荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线
图26本发明鼠源外泌体皮下注射后Muc1-B16肿瘤转移模型小鼠的体重变化
图27本发明鼠源外泌体皮下注射后Muc1-B16肿瘤转移模型小鼠的肺部转移斑个数统计
发明详述
外泌体(Exosomes)是一种细胞分泌的生物膜囊泡，其直径约为30～140nm，通常首先细胞膜发生向内的凹陷并脱落，形成早期内涵体；随后在细胞质中的内吞体转运复合体(ESCRT)及相关蛋白的调控下，早期内涵体的膜再次发生向内的凹陷，以内出芽的方式在早期内涵体内形成多个纳米尺寸的小囊泡，此时的内涵体被称为多囊泡体(MVB)，最后MVB在GTPase家族中的RAB酶调节下，与细胞膜进行融合，将其内的纳米囊泡释放到胞外，这些释放到胞外的小囊泡即被称为外泌体。
外泌体的分泌具有特异性，可参与细胞间遗传信息交换和信号通讯。有研究证明，DC分泌的外泌体上“继承”了大部分DC细胞本身的表面分子(如MHC分子、共刺激分子等)。近年来APC的外泌体作为一种更为天然的新型纳米人工APC体系，被广泛应用于肿瘤的免疫治疗领域。
与抗原提呈细胞相比，抗原提呈细胞的细胞外纳米囊泡即外泌体作为肿瘤治疗性疫苗的优势在于：(1)抗原提呈细胞在体外容易失活，需现做现用，而外泌体结构稳定，具有较长的保质期，-80℃可冷冻保存6个月以上；(2)抗原提呈细胞在体内易被肿瘤微环境诱导发生表型转变(如转变为免疫抑制的M2巨噬或DCreg)，丧失T细胞激活能力，而外泌体作为携带固有成分的小粒径囊泡，其携带免疫活化分子更为稳定，不会发生转化；(3)外泌体的内部可以装载化疗或光热疗药物，实现免疫治疗与其他治疗手段的联合治疗，故基于抗原提呈细胞的外泌体可构建出具有多种功能的肿瘤疫苗。
本发明提供一种杂合细胞，其由抗原提呈细胞吞噬肿瘤细胞核形成。优选的是，抗原提呈细胞是树突状细胞、巨噬细胞或者是B细胞。
在本发明的优选的实施方式中，其中所述抗原提呈细胞可以吞噬1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多的肿瘤细胞核。
在本发明的优选的实施方式中，其中离心收集对数生长期肿瘤细胞，PBS重悬，清洗两次，将细胞沉淀重悬，重悬后，细胞悬液经过处理，筛去除絮状物，将过筛后的悬浊液离心，下层沉淀即为细胞核。
本发明使用巨噬细胞等抗原提呈细胞内吞肿瘤细胞核的方式制备杂合细胞，相对于使用巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的方式更优越，肿瘤细胞表面容易高表达多种信号分子(如CD47、MHC-I分子β链等)，导致巨噬细胞无法对肿瘤细胞进行吞噬，从而造成肿瘤细胞与巨噬细胞共同生长，甚至会引发巨噬细胞发生表型转变，促进肿瘤细胞的生长。
本发明使用巨噬细胞等抗原提呈细胞内吞肿瘤细胞核的方式制备杂合细胞，与其它细胞融合方式，例如PEG融合及电融合相比，本发明所使用的方法效率更高，杂合细胞形成比例可以高达100％，且不损伤细胞活性。通常细胞融合法选择性很差，易造成巨噬细胞与巨噬细胞融合或肿瘤细胞与肿瘤细胞融合，从而造成大量非目标产物的融合细胞出现，且无论PEG融合还是电融合方法，均会对细胞活性造成损伤，最终成活的巨噬-肿瘤杂合细胞成功率低，例如为10％-30％。
在本发明的优选的实施方式中，所述杂合细胞是经由免疫调节剂激活的，所述免疫调节剂例如是脂多糖、单磷酰酯A或非甲基化胞苷酸鸟苷酸基序，脂多糖等可进一步提升巨噬细胞表面的共刺激因子及肿瘤抗原-MHC I复合物的表达水平，同时可使巨噬细胞向具有抗肿瘤作用的M1型巨噬细胞转化。该种被激活的杂合细胞分泌的杂合外泌体表面携带有大量的共刺激分子、肿瘤抗原MHC I复合物及多种抗肿瘤相关的免疫激活类信号分子。
本发明还提供一种外泌体的制备方法，其含有以下步骤：提取肿瘤细胞的细胞核，在抗原提呈细胞培养液中加入该肿瘤细胞核，孵育后，收取该培养液的上清液，差速离心，以收集外泌体。
在本发明的优选的实施方式中，所述抗原提呈细胞吞噬肿瘤细胞核，形成杂合细胞，该杂合细胞分泌外泌体，该外泌体是一种杂合外泌体。
在本发明的优选的实施方式中，其中所述的抗原提呈细胞是树突状细胞、巨噬细胞或者是B细胞，更优选的抗原提呈细胞是巨噬细胞。
在本发明的优选的实施方式中，通过巨噬细胞吞噬肿瘤细胞核的策略，成功实现了肿瘤抗原在巨噬细胞上的内源性表达。除此之外，肿瘤细胞核可以利用巨噬细胞细胞器表达肿瘤黏附分子，该类黏附因子可以指引外泌体迁移到肿瘤部位，解决了外泌体肿瘤靶向性的问题，为肿瘤微环境的改善提供了良好的前提。
在本发明的优选的实施方式中，在所述抗原提呈细胞培养液中加入有免疫调节剂，优选地，所述免疫调节剂为脂多糖、单磷酰酯A、非甲基化胞苷酸鸟苷酸基序中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明的优选的实施方式中，可利用具有强吞噬能力的抗原提呈细胞例如巨噬细胞去吞噬肿瘤细胞核，并对形成的杂合细胞给予免疫调节剂例如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激，在此基础上提取杂合巨噬细胞的外泌体，获得具有仿生APC功能的外泌体型疫苗制剂。由于肿瘤细胞核内含有完整的肿瘤细胞遗传信息，其被内吞后会利用巨噬细胞的细胞器内源性地在巨噬细胞膜上表达肿瘤抗原的MHC I复合物；培养过程中LPS的协同刺激，可进一步提升巨噬细胞表面的共刺激因子及肿瘤抗原-MHC I复合物的表达水平，同时可使巨噬细胞向具有抗肿瘤作用的M1型巨噬细胞转化。该种被激活的杂合细胞分泌的杂合外泌体表面携带有大量的共刺激分子、肿瘤抗原MHC I复合物及多种抗肿瘤相关的免疫激活类信号分子。这些杂合外泌体类似于纳米级别的APC，由于其具有纳米尺寸的粒径，一部分外泌体可以靶向到淋巴结处，在淋巴结内部仿生APC的功能，直接对T细胞进行激活，激发细胞免疫应答。除此之外，由于此杂合外泌体携带有一定的肿瘤信号(如黏附分子)，可以靶向识别同源的癌细胞肿瘤，通过同源肿瘤的定向趋化作用，将一部分外泌体引导到肿瘤部位。在肿瘤内部，杂合外泌体可以依靠其内部免疫激活类的信号分子，将M2型巨噬逆转为M1型巨噬，降低Treg比例，从而改善肿瘤微环境。
在本发明的优选的实施方式中，吞噬了肿瘤细胞核的巨噬细胞成功表达E.G7肿瘤抗原OVA，且巨噬细胞表面的T细胞识别信号MHC分子、共刺激因子以及M1型巨噬标志分子Ly-6C表达水平得到提升，囊泡表面高表达共刺激分子及T细胞识别信号MHC分子，囊泡内部含有高含量的免疫激活型细胞因子及多种趋化因子。
在本发明的优选的实施方式中，本发明的外泌体具有良好的淋巴结及肿瘤双靶向能力，淋巴结靶向是由于外泌体的纳米尺寸粒径所致，肿瘤靶向能力是由于外泌体所携带的肿瘤信号分子对于肿瘤部位存在同源趋化性。
在本发明的优选的实施方式中，靶向到淋巴结的外泌体，一部分通过被APC摄取的方式激活APC，继而激活T淋巴细胞增殖；另一部分外泌体则结合在T细胞表面，直接激活T淋巴细胞增殖。靶向到肿瘤部位的外泌体约四分之一与肿瘤相关巨噬相互作用，促使其向M1型巨噬转化；同时外泌体降低了Treg在肿瘤部位的浸润，提升了CTL的肿瘤浸润比例，有效地改善了免疫抑制性的肿瘤微环境。
在本发明的优选的实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，包含本发明所述的外泌体，所述外泌体悬浮于生理上可接受的载体中，该生理上可接受的载体例如是PBS缓冲液或者生理盐水。
在本发明的优选的实施方式中，本发明提供了一种抑制有此需要的受试者中肿瘤或癌症生长或进展的方法，包括：将有效量的本发明所述的外泌体给药于受试者。
优选地，外泌体通过静脉内注射、肌肉注射、皮下注射、鞘内注射或输注和/或器官内输注(intra-organ infusion)进行给药。例如，外泌体以每千克总体重约1.5×1010至约1.5×1013个外泌体颗粒的量进行全身给药。在一个替代实施例中，外泌体以约1.5×1010和1.5×1011个外泌体颗粒的量注射或输注入局部组织或解剖学空间(anatomical space)中而进行给药。在某些其他实施方式中，本发明还包括使用至少一种额外的抗癌剂共同治疗所述受试者。
本发明还提供一种药物组合物，其含有所述的杂合细胞或外泌体，该药物组合物例如是抗肿瘤疫苗，其用于对哺乳动物受试者中的肿瘤等疾病的预防性或治疗性处理。所述疫苗制备简便，同时具有不论哪种肿瘤的复发预防、转移抑制及治疗均可适用的通用性，且抗肿瘤效果佳。
本发明还提供一种药物组合物，其含有所述的外泌体以及单克隆抗体，所述单克隆抗体例如是PD-1抗体、PD-L1抗体或CTLA-4抗体。
在本发明的优选的实施方式中，小鼠体内实验结果证明，本发明外泌体疫苗的注射不会引发肿瘤产生及组织器官的损伤，具有良好的生物安全性。在抗肿瘤原位生长效果考察中发现，杂合外泌体疫苗对于E.G7淋巴瘤和Muc1-B16黑色素瘤均有良好的肿瘤抑制效果，显著延长了小鼠的生存期。本发明外泌体疫苗与PD-1抗体联合使用后，对Muc1-B16黑色素瘤细胞在肺脏、心脏及肾脏的转移展现了良好的预防效果，并有效地防止了Muc1-B16黑色素瘤手术切除后原位的复发及肺转移情况。
本发明的目的之一还在于在患者体内诱导针对肿瘤细胞或肿瘤的细胞毒性T细胞应答的方法。此方法包括向该患者施用有效量的本发明外泌体，特别是通过静脉内、注射或输注，优选通过输注施用。该方法的目的尤其在于诱导患者树突细胞的活化和CD8+细胞毒性T细胞应答。如上所述，获得特异性CD4+辅助T和CD8+细胞毒性T应答。
本发明的目的之一还在于在患者体内诱导如上所述针对肿瘤细胞或肿瘤的细胞毒性细胞应答的抗癌治疗方法。此方法包括向该患者施用有效量的本发明外泌体，特别是通过静脉内、注射或输注，优选通过输注施用。
本发明中，“有效量是指足以产生有益或期望的结果的量，例如肿瘤或癌症进展速率的降低。有效量可以以一次或多次给药、施用或剂量进行给药。有效量，即合适的剂量，将根据待治疗的体重、年龄、健康、疾病或病症以及给药途径而发生变化。施用于受试者的外泌体的剂量是随时间推移有效地在受试者体中实现期望的有益治疗反应的量。
本领域技术人员将能够容易地通过滴定剂量和给药持续时间来确定待给药灭活外泌体的量，以达到最佳临床反应，例如癌症进展速率和/或扩散速率的降低，和/或诱导癌症的消退。
本发明提供的药物组合物可使用本领域技术人员熟知的方法将本发明的疫苗施用于患者，例如动脉内、静脉内、经皮注射，以及鼻内、经支气管、肌肉内或口服施用。剂量和施用方法根据患者的体重和年龄及施用方法而变化；而本领域技术人员可按需要进行选择。
本文中公开的具体实施方案的范围，这些实施方案仅旨在说明本发明的几个方面。
实施例1、E.G7-巨噬杂合细胞的制备
(a)使用细胞核提取试剂(购自Solarbio)提取淋巴癌细胞E.G7-OVA(购自ATCC细胞库)来源的细胞核：
E.G7-OVA细胞培养于含10％胎牛血清蛋白(购自Gibco公司)、1％青霉素-链霉素(购自Gibco公司)、0.4mg/mLG418(购自Gibco公司)以及0.05mMβ-巯基乙醇(购自Gibco公司)的高糖1640培养基(购自Gibco公司)中。以1：5的传代比例，每两天传代一次。离心收集对数生长期肿瘤细胞，PBS(Gibco公司)重悬，清洗两次。使用细胞核提取试剂盒(购自Solarbio公司)中的Lysis buffer将细胞沉淀重悬，重悬后，细胞密度约为2×107/mL。之后，每毫升细胞悬液中加入20μL ReagentA(购自Solarbio公司)，用移液枪反复吹打混合混匀，200目筛网过筛去除絮状物。将过筛后的悬浊液700g 5min离心，下层沉淀即为细胞核。
(b)称量可溶性淀粉(购自西陇化工公司)1.2g溶于20mL无菌水，加热至溶液澄清。加入装有牛肉膏(购自北京化工厂)0.06g、蛋白胨(购自北京化工厂)0.2g、氯化钠(购自北京化工厂)0.1g的烧杯中，溶解完全，配制为6％淀粉肉汤作为小鼠腹腔巨噬细胞诱导液，每只C57小鼠(来自维通利华实验动物技术有限公司)腹腔注射1mL。3天后脱颈处死小鼠，75％酒精(购自北京化工厂)浸泡消毒5min后向小鼠腹腔内注射5mLPBS(购自Gibco公司)进行灌洗，轻揉若干次后，剪开腹部皮肤，将腹膜暴露，用注射器吸出灌洗液，收集并于1500rpm离心5min，贴壁培养12h换液，弃掉上清悬浮细胞，余下贴壁细胞即为巨噬细胞，之后使用无外泌体的DMEM完全培养基进行培养，完全培养基成分为含10％无外泌体的胎牛血清蛋白(购自Gibco公司)、1％青霉素-链霉素(购自Gibco公司)的高糖DMEM培养基(购自Gibco公司)，并使用DRAQ5染料(购自Life Technologies公司)对巨噬细胞进行细胞核染色；
(c)将(a)中提取的新鲜E.G7-OVA肿瘤细胞核使用5μg/mL的DAPI溶液(购自北京泛博生物化学有限公司)进行染色，之后按照细胞核:巨噬细胞为2:1的比例，加入到(b)中巨噬细胞无外泌体的DMEM完全培养液中，使巨噬细胞对肿瘤细胞核进行内吞，得到既包含有巨噬自身细胞核又包含有E.G7-OVA细胞核的肿瘤-巨噬杂合细胞，之后使用罗丹明-鬼笔环肽染料(购自Life Technologies公司)对杂合细胞细胞膜进行染色；
使用激光扫描共聚焦显微镜(Leica，SP5)在405nm、561nm及633nm处观察杂合细胞，如图1所示，所制备的杂合细胞内除含有巨噬细胞核之外，还可含有一个到六个数量不等的E.G7-OVA肿瘤细胞核，从左到右依次展示了巨噬细胞吞噬一个、两个、三个、四个、六个肿瘤细胞核的杂合细胞。
实施例2、B16-巨噬杂合细胞的制备
(a)使用细胞核提取试剂(购自Solarbio)提取黑色素瘤细胞Muc-B16(购自ATCC细胞库)来源的细胞核：
Muc1-B16细胞贴壁培养，完全培养基为含有胎牛血清蛋白(购自Gibco公司)、1％青霉素-链霉素(购自Gibco公司)、1μg/mL嘌呤霉素(购自Gibco公司)的1640培养基(购自Gibco公司，不含HEPES)，2～3天按照1：4比例传代一次。选取对数期细胞离心收集，PBS(购自Gibco公司)重悬，清洗两次。将2×107个细胞重悬于1mL细胞核提取试剂盒(购自Solarbio公司)中的Lysis buffer中，之后每毫升细胞悬液中加入20μL ReagentA(购自Solarbio公司)，用1mL移液枪头吹打10下，待细胞悬液变澄清，立即加入10mLPBS(购自Gibco公司)稀释裂解液，1400r/min离心5min，将下层沉淀重悬，过筛去除絮状物，即可得到分散性良好的Muc1-B16细胞核悬液。
(b)称量可溶性淀粉(购自西陇化工公司)1.2g溶于20mL无菌水，加热至溶液澄清。加入装有牛肉膏(购自北京化工厂)0.06g、蛋白胨(购自北京化工厂)0.2g、氯化钠(购自北京化工厂)0.1g的烧杯中，溶解完全，配制为6％淀粉肉汤作为小鼠腹腔巨噬细胞诱导液，每只C57小鼠(来自维通利华实验动物技术有限公司)腹腔注射1mL。3天后脱颈处死小鼠，75％酒精(购自北京化工厂)浸泡消毒5min后向小鼠腹腔内注射5mL PBS(Gibco公司)进行灌洗，轻揉若干次后，剪开腹部皮肤，将腹膜暴露，用注射器吸出灌洗液，收集并于1500rpm离心5min，贴壁培养12h换液，弃掉上清悬浮细胞，余下贴壁细胞即为巨噬细胞，之后使用无外泌体的DMEM完全培养基进行培养，完全培养基成分为含10％无外泌体的胎牛血清蛋白(购自Gibco公司)、1％青霉素-链霉素(购自Gibco公司)的高糖DMEM培养基(购自Gibco公司)；
(c)将(a)中提取的新鲜Muc1-B16细胞核按照细胞核:巨噬细胞为2:1的比例，加入到(b)中巨噬细胞无外泌体的DMEM完全培养液中，使巨噬细胞对肿瘤细胞核进行内吞，得到既包含有巨噬自身细胞核又包含有Muc1-B16细胞核的肿瘤-巨噬杂合细胞。
实施例3、4T1-巨噬杂合细胞的制备
(a)使用细胞核提取试剂(购自Solarbio)提取乳腺癌细胞4T1(购自ATCC细胞库)来源的细胞核：
4T1细胞贴壁培养，完全培养基为含有10％胎牛血清蛋白(购自Gibco公司)、1％青霉素-链霉素(购自Gibco公司)的1640培养基(购自Gibco公司，不含HEPES)，2～3天按照1：4比例传代一次。选取对数期细胞离心收集，PBS(购自Gibco公司)重悬，清洗两次。将2×107个细胞重悬于1mL细胞核提取试剂盒(购自Solarbio公司)中的Lysis buffer中，之后每毫升细胞悬液中加入20μL ReagentA(购自Solarbio公司)，用1mL移液枪吹打10下，待细胞悬液变澄清，立即加入10mL PBS(购自Gibco公司)稀释裂解液，1400r/min离心5min，将下层沉淀重悬，过筛去除絮状物，即可得到分散性良好的4T1细胞核悬液。
(b)称量可溶性淀粉(购自西陇化工公司)1.2g溶于20mL无菌水，加热至溶液澄清。加入装有牛肉膏(购自北京化工厂)0.06g、蛋白胨(购自北京化工厂)0.2g、氯化钠(购自北京化工厂)0.1g的烧杯中，溶解完全，配制为6％淀粉肉汤作为小鼠腹腔巨噬细胞诱导液，每只Balbc小鼠(来自维通利华实验动物技术有限公司)腹腔注射1mL。3天后脱颈处死小鼠，75％酒精(购自北京化工厂)浸泡消毒5min后向小鼠腹腔内注射5mL PBS(Gibco公司)进行灌洗，轻揉若干次后，剪开腹部皮肤，将腹膜暴露，用注射器吸出灌洗液，收集并于1500rpm离心5min，贴壁培养12h换液，弃掉上清悬浮细胞，余下贴壁细胞即为巨噬细胞，之后使用无外泌体的DMEM完全培养基进行培养，完全培养基成分为含10％无外泌体的胎牛血清蛋白(购自Gibco公司)、1％青霉素-链霉素(购自Gibco公司)的高糖DMEM培养基(购自Gibco公司)；
(c)将(a)中提取的新鲜4T1细胞核按照细胞核:巨噬细胞为2:1的比例，加入到(b)中巨噬细胞无外泌体的DMEM完全培养液中，使巨噬细胞对肿瘤细胞核进行内吞，得到既包含有巨噬自身细胞核又包含有4T1细胞核的肿瘤-巨噬杂合细胞。
实施例4、人源A375-巨噬杂合细胞的制备
(a)使用细胞核提取试剂(购自Solarbio)提取人源黑色素瘤细胞A375(购自ATCC细胞库)来源的细胞核：
A375细胞贴壁培养，完全培养基为含有胎牛血清蛋白(购自Gibco公司)、1％青霉素-链霉素(购自Gibco公司)的DMEM培养基(购自Gibco公司，不含HEPES)，2～3天按照1：4比例传代一次。选取对数期细胞离心收集，PBS(购自Gibco公司)重悬，清洗两次。将2×107个细胞重悬于1mL细胞核提取试剂盒(购自Solarbio公司)中的Lysis buffer中，之后每毫升细胞悬液中加入20μL ReagentA(购自Solarbio公司)，用1mL移液枪头吹打10下，待细胞悬液变澄清，立即加入10mL PBS(购自Gibco公司)稀释裂解液，1400r/min离心5min，将下层沉淀重悬，过筛去除絮状物，即可得到分散性良好的A375细胞核悬液。
(b)利用无菌采血针，使用静脉采血的方式收集健康人体外周血50mL，使用淋巴细胞分离液进行淋巴细胞的提取：将人体外周血用HBSS溶液以1:1比例稀释，贴壁加入与外周血等体积的密度梯度分离液中，2000rpm离心15min，收集第二层白膜层淋巴细胞，并加入10倍于淋巴细胞悬液体积的HBSS溶液进行清洗，随后1500rpm离心10min，清洗两次后使用HBSS重悬；之后使用人CD14磁珠分选试剂盒(购自Miltenyi公司)，按照说明书操作，进行单个核细胞的分选提取，之后使用含500U/mL人集落刺激因子(购自Invitrogen)的1640完全培养基进行培养，3-5天后获得人源巨噬细胞。
(c)将(a)中提取的新鲜A375细胞核按照细胞核:巨噬细胞为2:1的比例，加入到(b)中人源巨噬细胞无外泌体的1640完全培养液中，使巨噬细胞对肿瘤细胞核进行内吞，得到既包含有巨噬自身细胞核又包含有A375细胞核的人源肿瘤-巨噬杂合细胞。
实施例5、制备E.G7-巨噬杂合细胞来源的外泌体
对实施例1中的未进行任何荧光染料染色的杂合细胞进行培养，加入肿瘤细胞核4天后，收集杂合细胞的培养液上清，300g离心10分钟，去除残余细胞沉淀；将上清取出继续2000g离心10分钟，去除死细胞沉淀；上清取出继续10000g离心30分钟，去除细胞碎片沉淀；最后将上清取出，120000g离心2小时，去除上清，将沉淀用PBS(购自Gibco公司)重悬，得到外泌体悬液。
实施例6、E.G7-巨噬杂合细胞来源的外泌体表征
将新鲜超速离心提取的实施例5中的外泌体与等量的4％的多聚甲醛溶液混合，即将外泌体悬于2％的多聚甲醛溶液中，固定30min。之后将10μL外泌体悬液滴在封口膜上，将铜网覆盖到液滴上，保证镀层一面接触液滴，室温下铜网膜进行吸附10min。之后用镊子将铜网小心取下，用滤纸吸去铜网上残余液滴，并在提前滴加到封口膜上的PBS液滴上清洗2次，每次5min。之后将铜网取下，滤纸吸去铜网上残余液体。之后，将铜网转移到50μL的乙酸双氧铀液滴上，复染30s，之后取下铜网，滤纸轻轻将铜网上残余乙酸双氧铀液体吸干，并将铜网镀层面朝上，空气中干燥10min。之后在120kV生物透射电镜下进行观察，结果如图2所示。将超速离心提取的外泌体原液使用PBS稀释500-2000倍，使用注射器将1mL外泌体稀释液推入到纳米颗粒跟踪分析仪进样口内，经过系统检测分析，计算出稀释液中外泌体个数，并获得外泌体粒径分布图如图3所示。使用Wes全自动蛋白表达分析系统对外泌体内各种蛋白进行检测。首先将制备生物素化的标准样品ladder，同时将蛋白浓度相同的外泌体与1/5体积的Fluorescent Master Mix混合均匀制备上样样本。将ladder与样本95℃加热5min，使蛋白变性。之后分别加入到微孔板内对应样品孔内，并在微孔板对应一抗孔内加入CD9、CD86、MHC I及MHC II的一抗稀释液，在下排孔内加入对应不同一抗来源的HRP-二抗稀释液，最底排孔内加入Luminol-Peroxide混合液。之后在仪器上安装毛细管进样器，将微孔板放置在进样器之下，开启仪器进行检测分析，实验结果如图4所示。
从图2可知，所制备的外泌体为经典杯状结构；图3的粒径分布图显示外泌体的平均粒径为90nm；图4的western blotting蛋白印迹结果显示，巨噬外泌体和本发明外泌体表面均有外泌体标志蛋白CD 9的表达，与单纯巨噬细胞外泌体相比，等量的本发明外泌体上共刺激分子CD86、组织相容性复合物I、组织相容性复合物II的印迹灰度值更高，说明这三种蛋白的表达量升高。
实施例7、B16-巨噬杂合细胞来源的外泌体制备
对实施例2中的杂合细胞给予终浓度1μg/mL的脂多糖(购自Sigma公司)刺激，4天后，收集杂合细胞的培养液上清，300g离心10分钟，去除残余细胞沉淀；将上清取出继续2000g离心10分钟，去除死细胞沉淀；上清取出继续10000g离心30分钟，去除细胞碎片沉淀；最后将上清取出，120000g离心2小时，去除上清，将沉淀用PBS(购自Gibco公司)重悬，得到本发明外泌体悬液。
实施例8、4T1-巨噬杂合细胞来源的外泌体制备
对实施例3中的杂合细胞给予终浓度1μg/mL的脂多糖(购自Sigma公司)刺激，4天后，收集杂合细胞的培养液上清，300g离心10分钟，去除残余细胞沉淀；将上清取出继续2000g离心10分钟，去除死细胞沉淀；上清取出继续10000g离心30分钟，去除细胞碎片沉淀；最后将上清取出，120000g离心2小时，去除上清，将沉淀用PBS(购自Gibco公司)重悬，得到本发明外泌体悬液。
实施例9、人源A375-巨噬细胞杂合细胞来源的外泌体制备
对实施例4中的杂合细胞给予终浓度1μg/mL的脂多糖(购自Sigma公司)刺激，4天后，收集杂合细胞的培养液上清，300g离心10分钟，去除残余细胞沉淀；将上清取出继续2000g离心10分钟，去除死细胞沉淀；上清取出继续10000g离心30分钟，去除细胞碎片沉淀；最后将上清取出，120000g离心2小时，去除上清，将沉淀用PBS(购自Gibco公司)重悬，得到本发明人源外泌体(h-nc-lps-exo)悬液。
实施例10、本发明人源A375-巨噬细胞杂合细胞来源的外泌体表征
将实施例9中新鲜超速离心提取的人源外泌体与等量的4％的多聚甲醛溶液混合，即将外泌体悬于2％的多聚甲醛溶液中，固定30min。之后将10μL外泌体悬液滴在封口膜上，将铜网覆盖到液滴上，保证镀层一面接触液滴，室温下铜网膜进行吸附10min。之后用镊子将铜网小心取下，用滤纸吸去铜网上残余液滴，并在提前滴加到封口膜上的PBS液滴上清洗2次，每次5min。之后将铜网取下，滤纸吸去铜网上残余液体。之后，将铜网转移到50μL的乙酸双氧铀液滴上，复染30s，之后取下铜网，滤纸轻轻将铜网上残余乙酸双氧铀液体吸干，并将铜网镀层面朝上，空气中干燥10min。之后在120kV生物透射电镜下进行观察，结果如图5所示。
将实施例9中的人源杂合外泌体(h-nc-lps-exo)与偶联有人CD9抗体的磁珠(购自Thermo Fisher公司)共孵育，之后用磁力架将结合有外泌体的磁珠进行分离清洗获得悬液，再用0.25μg的PE标记的anti-CD86、0.25μg的PE标记的anti-CD40、0.25μg的FITC标记的anti-HLA-ABC、0.25μg的BV510标记的anti-HLA-DR荧光抗体(均购自ebioscience公司)对外泌体-磁珠悬液避光标记25min(4℃)，之后用磁力架将结合有染料-外泌体-磁珠进行分离清洗，PBS重悬后使用流式细胞仪检测。同时设置对照组未经处理的人源巨噬细胞外泌体组(h-pbs-exo)、未经脂多糖刺激的实施例9中的外泌体组(h-nc-exo)、只做脂多糖刺激的人源巨噬细胞外泌体组(h-lps-exo)进行以上步骤检测，检测结果如图6所示。
由图5可知，所制备的人源外泌体h-nc-lps-exo为经典杯状结构；从图6中可知，与h-pbs-exo和h-nc-exo相比，h-lps-exo和h-nc-lps-exo含有显著增多的共刺激分子CD86和CD40；与h-lps-exo相比，h-nc-lps-exo上与抗原提呈相关的I型主要组织兼容性复合体分子(HLA-ABC)及II型主要组织兼容性复合体分子(HLA-DR)表达量略高，这些激活类信号分子的富集有利于外泌体在体内发挥更有效的免疫激活反应。
实施例11、本发明鼠源外泌体的淋巴结-肿瘤的双靶向
使用1μM近红外荧光亲脂染料DiR(购自北京泛博生物化学有限公司)对100μL外泌体进行标记，37℃下孵育1h，之后将实施例5中制备的本发明外泌体滴加到凝胶过滤柱(购自Thermo Scientific公司)上侧，700g离心2min，游离的染料被阻隔在凝胶柱内部，下层液体即为DiR标记的杂合外泌体溶液。将3.7×109个DiR-外泌体通过皮下注射的方式注射到C57BL/6小鼠(来自维通利华实验动物技术有限公司)背部，随后在96小时内的不同时刻麻醉小鼠，利用小动物活体成像系统在750nm处对DiR-杂合外泌体在小鼠体内的分布情况进行观察，并分析不同时间荧光信号在淋巴结及肿瘤部位的变化情况。实验结果如图7及图8所示。另外，在48h时，解剖小鼠，分别取出腹股沟及腋下淋巴结、肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏，使用小动物活体成像系统检测其内荧光信号，实验结果如图9所示。
从图7中可以看到，随着时间延长，外泌体的荧光信号在腹股沟淋巴结及肿瘤处(虚线所指)逐渐发生富集。图8为小鼠腹股沟淋巴结以及肿瘤部位的荧光信号随时间变化的定量数据，从该图中可以看到，皮下注射外泌体48h之前，淋巴结及肿瘤处的荧光信号随时间延长逐渐加强，在48h时达到顶点，之后随时间延长，两部分的荧光信号均发生衰减。从图9中可以看到，小鼠腹股沟、腋下各淋巴结以及肿瘤组织均有较强的荧光信号，而小鼠各脏器中，除了肝脏内不可避免的荧光富集之外，其他脏器内荧光信号并不明显，说明本发明外泌体通过皮下注射方式给药，的确具有良好的淋巴结靶向及肿瘤靶向的双靶向能力。
实施例12、本发明鼠源外泌体在淋巴结内的作用细胞类型
将实施例5中制备的本发明外泌体用实施例11中的方法进行荧光标记，获得DiR标记的外泌体。将3.7×109个DiR-外泌体通过皮下注射的方式注射到C57BL/6小鼠(购自维通利华实验动物技术有限公司)背部，48h时处死小鼠，取出淋巴结进行研磨获得单细胞悬液，之后分别用0.25μg的Pacific Blue标记anti-F4/80、0.25μg的Alex Fluro700标记的anti-CD11b、0.25μg的Alex Fluro 488标记的anti-CD11c、0.25μg的BV605标记的anti-MHC II、0.25μg的BV510标记的anti-CD3、0.25μg的APC标记的anti-CD4、0.25μg的PE标记的anti-CD8荧光抗体(荧光抗体均购自ebioscience公司)对单细胞悬液避光标记25min(4℃)。使用500μL Stainbuffer(购自ebioscience公司)清洗2次细胞后重悬细胞，使用流式细胞仪检测，分析DiR信号阳性的细胞群体中，巨噬细胞(F4/80+CD11b+)、树突状细胞(CD11c+MHC II+)、CD4 T细胞(CD3+CD4+)、CD8 T细胞(CD3+CD8+)四种细胞类型所占比例，每个样本收集500000个细胞进行分析，结果如图10所示。
由图10可知，DiR阳性的细胞群体中，11％为F4/80和CD11b双阳的髓源巨噬细胞，37.4％为CD11c和MHC II双阳的树突状细胞，15.8％为CD4 T细胞，27.8％为CD8 T细胞。将各细胞比例通过饼状图展示，可以看到，抗原提呈细胞(巨噬细胞及树突状细胞)和T细胞(CD4及CD8)占到了92％的比例，这意味着DiR标记的外泌体进入淋巴结后，绝大多数是与抗原提呈细胞或T细胞相互作用的，而APC作为免疫应答的辅助细胞，后续会与T细胞相互作用进行免疫激活信号的传递。
实施例13、本发明鼠源外泌体的T细胞免疫激活效果
通过使用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)荧光标记方法，对T细胞增殖情况进行考察。基本原理如下：CFSE是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色剂，CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上，在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记的荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是母代细胞的一半，用流式细胞仪在488nm激发光处可对其进行分析，进而快速而准确地检测淋巴细胞的增殖情况。
(a)将实施例5中制备的本发明的由杂合细胞制备的杂合外泌体刺激72h的巨噬/树突状细胞与CFSE染色的脾细胞进行共孵育，检测T细胞增殖的效果。具体实验步骤如下：1.脾细胞染色：C57BL/6小鼠的脾细胞以0.5μM的CFSE(购自Life Technologies公司)工作浓度对细胞染色7min(37℃)，用4倍体积的冰胎牛血清终止染色，冰浴5min后离心。使用新鲜1640完全培养基重悬细胞并洗涤两次；2.预处理96孔板：96孔板提前用1μg/mL的CD3溶液(购自ebioscience公司)预处理，4℃过夜，第二天，吸去CD3溶液，用PBS(购自Gibco公司)清洗两次后待用；3.细胞共孵育：细胞计数后，将T细胞与杂合外泌体刺激后的巨噬/树突状细胞按照1：2的比例进行共孵育，一定时间后，收集细胞；4.染色及流式检测：用0.25μg的BV510标记的anti-CD3、0.25μg的eF450标记的anti-CD4、0.25μg的PE标记的anti-CD8抗体(流式抗体均来自ebioscience公司)对细胞进行染色，并利用流式细胞仪对CD3+CD8+T细胞、CD3+CD4+T细胞的分裂增殖情况进行检测。每个样本收集10000个细胞进行分析，结果如图11和图12所示。
(b)将不同浓度的外泌体与CFSE染色的T细胞进行共孵育，检测T细胞增殖效果。具体实验步骤如下：1.脾细胞染色：取C57BL/6小鼠的脾细胞以0.5μM的CFSE(购自LifeTechnologies公司)工作浓度对细胞染色7min(37℃)，用4倍体积的冰胎牛血清终止染色，冰浴5min后离心。使用新鲜培养基重悬细胞并洗涤两次。2.预处理96孔板：96孔板提前用1μg/mL的CD3(购自ebioscience公司)溶液预处理，4℃过夜，第二天，吸去CD3溶液，用PBS(购自Gibco公司)清洗两次后待用。3.外泌体与T细胞共孵育：将CFSE-T细胞种在96孔板内，之后分别加入不同剂量的杂合外泌体进行共孵育，一定时间后，收集细胞。4.染色及流式检测：用BV510标记的anti-CD3、eF450标记的anti-CD4、PE标记的anti-CD8抗体(流式抗体均购自ebioscience公司)对细胞进行染色，并利用流式细胞仪对CD3+CD8+T细胞、CD3+CD4+T细胞的分裂增殖情况进行检测。每个样本收集10000个细胞进行分析。结果如图13所示。
由图11和图12可知，本发明的由杂合细胞制备的杂合外泌体激活的巨噬细胞和树突状细胞均能引发CD8 T细胞和CD4 T细胞的大量增殖，说明外泌体在淋巴结内可以通过激活抗原提呈类细胞(如巨噬、树突状细胞)的方式来进一步激活T细胞。由图13可知，与对照组相比，高剂量(1.48×109个)的外泌体组CD8 T和CD4 T细胞的增殖率提升40％～50％，即使在低浓度(3.7×108个)刺激下，外泌体也能产生很强的CD8 T细胞增殖效果，证明外泌体在淋巴结内可直接与T细胞相互作用从而激活T细胞增殖。
实施例14、本发明人源外泌体的T细胞免疫激活效果
将实施例9中的人源外泌体与CFSE染色的人源T细胞进行共孵育，检测人源T细胞增殖效果。具体实验步骤如下：1.人外周血T细胞染色：采集健康人外周血，使用人淋巴细胞分离液从外周血中分离淋巴细胞，再使用Pan T分选磁珠(购自Miltenyi公司)按照说明书操作，进行人源T细胞的分离，之后以0.5μM的CFSE(购自Life Technologies公司)工作浓度对细胞染色7min(37℃)，用4倍体积的冰胎牛血清终止染色，冰浴5min后离心。使用新鲜培养基重悬细胞并洗涤两次。2.预处理96孔板：96孔板提前用1μg/mL的人CD3抗体(购自ebioscience公司)溶液预处理，4℃过夜，第二天，吸去CD3抗体溶液，用PBS(购自Gibco公司)清洗两次后待用。3.外泌体与T细胞共孵育：将CFSE-T细胞种在96孔板内，之后分别加入不同剂量的人源杂合外泌体进行共孵育，一定时间后，收集细胞。4.染色及流式检测：用SuperBright600标记的anti-CD3、APC标记的anti-CD4、AF700标记的anti-CD8抗体(流式抗体均购自ebioscience公司)对人T细胞进行染色，并利用流式细胞仪对CD3+CD8+T细胞、CD3+CD4+T细胞的分裂增殖情况进行检测。每个样本收集10000个细胞进行分析。结果如图14所示。
由图14可知，本发明的由人杂合细胞制备的外泌体能直接同时引发人源CD8 T细胞和CD4 T细胞的大量增殖，具有强的免疫激活效果。
实施例15、本发明人源外泌体激活的T细胞的肿瘤杀伤能力
将实施例9中的人源外泌体与人源T细胞进行共孵育，之后将增殖后的人源T细胞与A375肿瘤细胞共培养，使用LDH试剂盒(购自碧云天公司)检查肿瘤细胞杀伤效果。具体实验步骤如下：1.人外周血T细胞分离：采集健康人外周血，使用人淋巴细胞分离液从外周血中分离淋巴细胞，再使用Pan T分选磁珠(购自Miltenyi公司)按照说明书操作，进行人源T细胞的分离。2.预处理96孔板：96孔板提前用1μg/mL的人CD3抗体(购自ebioscience公司)溶液预处理，4℃过夜，第二天，吸去CD3抗体溶液，用PBS(购自Gibco公司)清洗两次后待用。3.外泌体与T细胞共孵育：将T细胞种在96孔板内，之后分别加入不同剂量的人源杂合外泌体进行共孵育，一定时间后，收集T细胞。4.T细胞与A375细胞共培养：将T细胞与A375细胞分别以2.5：1、5：1、15：1的比例(E:T)进行混合，并种于新96孔板中进行共培养，24h后使用CCK8试剂盒，按照说明书操作，使用酶标仪检测450nm处的OD值，计算肿瘤细胞杀伤率，结果如图15所示。
由图15可知，与多组对照组相比，本发明外泌体(h-nc-lps-exo)组具有最高的肿瘤细胞杀伤效率，且肿瘤杀伤效率与效应T细胞与肿瘤细胞的比例呈正相关，说明本发明外泌体不仅可以激活大量T细胞增殖，且这些T细胞具备有效识别并杀伤肿瘤细胞的能力。
实施例16、本发明外泌体在肿瘤内的作用细胞类型
(a)E.G7淋巴瘤模型的建立：选取6～8周龄雄性C57BL/6小鼠(购自维通利华实验动物技术有限公司)，在其左侧腋窝部位皮下注射5×105个E.G7淋巴瘤细胞(购自ATCC细胞库)，构建E.G7淋巴瘤模型。
(b)将实施例5中由杂合细胞制备的杂合外泌体用实施例11中的方法进行荧光标记，获得DiR(购自北京泛博生物化学有限公司)标记的杂合外泌体。将DiR-杂合外泌体通过瘤内注射的方式注射到C57BL/6小鼠(购自维通利华实验动物技术有限公司)的E.G7肿瘤内部，48h后处死小鼠，取出肿瘤组织进行研磨、红细胞裂解、清洗之后，获得单细胞悬液。再用0.25μg的Pacific Blue标记的anti-F4/80、0.25μg的Alex Fluro 700标记的anti-CD11b(均购自ebioscience公司)对单细胞悬液避光标记25min(4℃)。使用Stainbuffer(购自eboscience公司)洗2次后重悬细胞，使用流式细胞仪检测，分析DiR信号阳性的细胞群体中，巨噬细胞(F4/80+CD11b+)细胞类型所占比例，每个样本收集500000个细胞进行分析。实验结果如图16所示。
由图16可知，肿瘤细胞悬液DiR-杂合外泌体阳性的各类型细胞中，CD11b+F4/80+双阳的巨噬细胞占据了26.9％，这意味着瘤内注射的外泌体有超过1/4的数量是与肿瘤内的肿瘤相关巨噬相互作用的。
实施例17、本发明鼠源外泌体在肿瘤内的微环境改善效果
首先，选取6～8周龄雄性C57BL/6小鼠(购自维通利华实验动物技术有限公司)，第0天在其左侧腋窝部位皮下注射5×105个E.G7淋巴瘤细胞(购自ATCC细胞库)，构建E.G7淋巴瘤模型。在第7天选取肿瘤体积相近的小鼠，随机分组。我们通过瘤内注射的方式将实施例5中的杂合外泌体(nc-lps-exo)注入到体积相同的小鼠E.G7肿瘤内部，考察肿瘤内部各种免疫细胞的浸润情况，同时设置对照组PBS组、未经处理的巨噬细胞外泌体组(pbs-exo)、未经脂多糖刺激的实施例5中的外泌体组(nc-exo)、只做脂多糖刺激的巨噬细胞外泌体组(lps-exo)。隔天注射一次，每次注射剂量为3.7×109个，共注射三次。第14天时，处死小鼠，取出肿瘤组织进行研磨、裂红、清洗之后，获得单细胞悬液。之后对单细胞悬液进行染色，分析不同免疫细胞所占比例。
具体染色方案如下：
肿瘤相关巨噬细胞：使用0.25μg的Pacific Blue标记的anti-F4/80、0.25μg的APC标记的anti-Ly-6C、0.25μg的Alex Fluro 488标记的anti-CD206抗体(流式抗体均来自ebioscience公司)对肿瘤细胞悬细胞避光孵育25min(4℃)，之后stainbuffer(购自ebioscience公司)清洗两次，使用流式对细胞悬液进行检测，分析F4/80+Ly-6C+双阳(M1)及F4/80+CD206+双阳(M2)的巨噬细胞的比例，每个样本收集500000个细胞进行分析，实验结果如图17所示。
调节性T细胞：首先使用0.25μg的BV510标记的anti-CD3、0.25μg的PerCP-Cy5.5标记的anti-CD4、0.25μg的PE标记的anti-CD8、0.25μg的FTIC标记的anti-CD25抗体(流式抗体均购自ebioscience公司)对肿瘤细胞悬细胞避光孵育25min(4℃)，之后stainbuffer(购自ebioscience公司)清洗一次，加入fixation buffer(购自ebioscience公司)，避光孵育20min，之后加入permeabilizationbuffer(购自ebioscience公司)离心后，再加入AlexFluro700标记的anti-Foxp3抗体(购自ebioscience公司)避光孵育30min，之后加入permeabilization buffer洗涤，stain buffer(购自ebioscience公司)重悬，使用流式对细胞悬液进行检测，分析CD4+CD25+Foxp3+(调节性T细胞)、CD3+CD4+和CD3+CD8+的T细胞比例，每个样本收集500000个细胞进行分析，实验结果如图18所示。
细胞毒性T细胞：首先使用0.25μg的BV510标记的anti-CD3和0.25μg的eF450标记的anti-CD8抗体(流式抗体均购自ebioscience公司)对肿瘤细胞悬细胞避光孵育25min(4℃)，之后stainbuffer(购自ebioscience公司)清洗一次，加入fixationbuffer(购自ebioscience公司)，避光孵育20min，之后加入permeabilization buffer(购自ebioscience公司)离心后，再加入PE标记的anti-IFN-γ和APC标记的anti-Gzms-B抗体(购自ebioscience公司)避光孵育30min，之后加入permeabilization buffer洗涤，stainbuffer(购自ebioscience公司)重悬，使用流式对细胞悬液进行检测，分析CD3+CD8+双阳、CD8+IFN-γ+双阳和CD8+Gzms-B+双阳的T细胞比例，每个样本收集500000个细胞进行分析，实验结果如图19所示。
由图17a可知，与pbs组相比，杂合外泌体组(nc-lps-exo)肿瘤内M1型巨噬及M2型巨噬比例均有所升高，这是由于两种外泌体中均含有大量的趋化因子，可以趋化更多的巨噬细胞浸润到肿瘤内部。被趋化到肿瘤部位的巨噬细胞会在周围环境的诱导下发生分型，各组TAMs中M1型巨噬与M2型巨噬的比值(M1/M2)可以反映出肿瘤内何种类型的巨噬占据优势地位，当M1/M2数值小于1时，说明M2型巨噬占据优势地位，当M1/M2数值大于1时，说明M1型巨噬占据优势地位。各组肿瘤M1/M2的计算结果如图17b所示，从图中可以看到，与pbs-exo组M1/M2比值(0.74)相比，nc-lps-exo组的M1/M2比值大于1，说明nc-lps-exo瘤内注射后，该组肿瘤内的M1型巨噬已经占据了优势地位。此外，图18表明，经瘤内注射杂合外泌体nc-lps-exo的小鼠肿瘤内部CD4/Treg及CD8/Treg的比值发生了显著升高，说明经过杂合外泌体nc-lps-exo给药后，肿瘤内部具有免疫抑制能力的Treg细胞浸润程度减弱。由于nc-lps-exo注射组肿瘤内M1型巨噬占据优势地位，且Treg细胞浸润降低，使得免疫抑制微环境得到一定程度的改善，为效应T细胞在肿瘤的浸润提供了合适的“土壤”。图19表明，杂合外泌体nc-lps-exo组CD8 T以及CD8+IFN-r+双阳、CD8+GB+双阳的CTL在肿瘤内的比例大大提升，证明肿瘤内大量CTL充分浸润到肿瘤内部，为后续有效的肿瘤细胞杀伤奠定了良好的基础。
实施例18、本发明人源外泌体在3D肿瘤细胞球中的微环境改善效果
用人源肿瘤细胞、M2人巨噬细胞和人源T细胞制备3D细胞球对人体肿瘤微环境进行体外模拟，同时添加本发明外泌体刺激，检测3D细胞球中M1/M2型巨噬比例及Treg比例，并通过显微成像考察3D细胞球的大小。
具体步骤如下：
(a)3种细胞的制备及培养：利用无菌采血针，使用静脉采血的方式收集健康人体外周血50mL，使用实施例4(b)中的方法进行人单核细胞的提取及人巨噬细胞的诱导，之后对人源巨噬细胞添加IL-4(20ng/mL)进行刺激，将其诱导为M2型巨噬细胞；同时使用实施例4中的方法进行人外周血T细胞的分选收集；使用实施例4(a)中的DMEM完全培养基进行A375黑色素瘤的培养。
(b)琼脂糖凝胶包被96孔板：取10mL DMEM不完全培养基中加入0.15g琼脂糖，加热至100℃，1h，使琼脂糖融化。待到溶液冷却一段时间后，但没有完全凝固时，将制备的琼脂糖加入到96孔板中，等待其冷却到室温，形成凹型的细胞培养基质；
(c)3D细胞球培养及人源外泌体给药：将人源肿瘤细胞、M2人巨噬细胞和人源T细胞按700：300：300比例混合后，加入到以上预铺了基质凝胶的96孔板中，进行培养；待3D混合细胞球初具形貌后添加本发明杂合外泌体(h-nc-lps-exo)，同时设置对照组PBS组、未经处理的人源巨噬细胞外泌体组(h-pbs-exo)、未经脂多糖刺激的实施例9中的外泌体组(h-nc-exo)、只做脂多糖刺激的人源巨噬细胞外泌体组(h-lps-exo)进行刺激。
(d)M1/M2比例、Treg比例检测：取不同组3D细胞球制备成单细胞悬液，并对单细胞悬液进行染色，分析不同免疫细胞所占比例。具体染色方案如下：1.使用0.25μg的PE-Cy7标记的anti-CD11b、0.25μg的eFlour450标记的anti-CD14、0.25μg的APC标记的anti-CD163、0.25μg的PE标记的anti-CD86抗体(流式抗体均来自ebioscience公司)对细胞悬液避光孵育25min(4℃)，之后stainbuffer(购自ebioscience公司)清洗两次，使用流式对细胞悬液进行检测，分析CD14+CD11b+双阳的巨噬细胞中CD86+CD163-(M1)及CD86-CD163+(M2)的巨噬细胞的比例，每个样本收集500000个细胞进行分析，实验结果如图20所示；2.使用0.25μg的BV605标记的anti-CD3、0.25μg的PE-Cy7标记的anti-CD4、0.25μg的APC-eFlour780标记的anti-CD8、0.25μg的APC标记的anti-CD25抗体(流式抗体均购自ebioscience公司)对肿瘤细胞悬细胞避光孵育25min(4℃)，之后stainbuffer(购自ebioscience公司)清洗一次，加入fixationbuffer(购自ebioscience公司)，避光孵育20min，之后加入permeabilizationbuffer(购自ebioscience公司)离心后，再加入PE标记的anti-Foxp3抗体(购自ebioscience公司)避光孵育30min，之后加入permeabilization buffer洗涤，stainbuffer(购自ebioscience公司)重悬，使用流式对细胞悬液进行检测，分析CD4+CD25+Foxp3+(调节性T细胞)的比例，每个样本收集100000个细胞进行分析，实验结果如图21所示。
(e)3D细胞球体积变化记录及显微成像：将3D细胞球轻柔吸出后，使用4％多聚甲醛固定过夜，之后使用Hoechst(购自Solarbio公司)进行细胞核染色，室温15min后，将细胞球转移到孔板中进行荧光成像，实验结果如图22所示。
由图20可知，与pbs组相比，人源杂合外泌体组(h-nc-lps-exo)3D肿瘤细胞球内M2型巨噬比例显著下降，M1型巨噬比例升高，说明h-nc-lps-exo可以将3D细胞球内的巨噬细胞向M1型巨噬细胞诱导。此外，图21表明，人源杂合外泌体组(h-nc-lps-exo)3D肿瘤细胞球内CD25+Foxp3+的Treg比例由pbs组的8.25％降至3.89％，说明经过人源杂合外泌体h-nc-lps-exo给药后，3D细胞球内具有免疫抑制能力的Treg细胞浸润程度减弱。这是由于h-nc-lps-exo中免疫激活型细胞因子的存在，使得免疫抑制微环境得到一定程度的改善，为效应T细胞在肿瘤内发生杀伤作用提供了合适的“土壤”。从图22最终的3D细胞球图像可以看出，h-nc-lps-exo组3D细胞球直径最小，肿瘤生长抑制效果最为明显。
实施例19、本发明鼠源外泌体的动物实验效果
取6-8周的雄性C57BL/6小鼠(购自维通利华实验动物技术有限公司)，在第0天进行淋巴瘤细胞E.G7-OVA肿瘤细胞(5×105)接种，在第5天，用实施例5中制备的杂合外泌体疫苗制剂进行皮下免疫，单次外泌体单次接种量为3.7×109个，另外增加一组接受二次加强免疫的二免组(2nc-lps-exo)，在第8天进行强化疫苗接种。同时设置对照组PBS组、未经处理的巨噬细胞外泌体组(pbs-exo)、未经脂多糖刺激的实施例5中制备的杂合细胞的外泌体组(nc-exo)、只做脂多糖刺激的巨噬细胞外泌体组(lps-exo)，对照组外泌体注射剂量同为3.7×109个。之后对小鼠的荷瘤体积以及生存情况进行记录，结果如图23及图24所示。
由图23及图24可知，接种本发明杂合外泌体能够明显降低小鼠的荷瘤体积，在进行二免强化治疗后，疫苗制剂能够更有效地延缓肿瘤生长，延长小鼠的平均生存期。
实施例20、本发明鼠源外泌体与PD-1抗体联合的动物实验效果
考察本发明实施例7中制备的杂合细胞的外泌体与PD-1抗体联合疗法进行黑色素瘤恶性肿瘤的免疫治疗试验，方法如下：
取6-8周的雄性C57BL/6小鼠(购自维通利华实验动物技术有限公司)，在第0天进行Muc1-B16黑色素瘤细胞(购自ATCC)接种，接种剂量为5×105个，构建Muc1-B16黑色素瘤原位生长模型。用实施例7制备的杂合外泌体与PD-1抗体联合使用进行治疗(a-PD1+vac.)，外泌体皮下给药剂量为1.85×109个外泌体，首次免疫时间为肿瘤细胞接种后第5天，二次免疫时间为第8天，PD-1抗体(购自BioXell公司)给药采用腹腔给药方式，分别在肿瘤细胞接种后第3天、第6天、第9天、第12天进行给药，单次给药剂量为100μg。同时设置空白组(pbs)、两倍剂量杂合外泌体单独治疗组(2×vac.)以及两倍剂量PD-1抗体单独治疗组(2×a-PD1)三组对照组。之后对小鼠的荷瘤体积进行记录，结果如图25所示。
取6-8周的雄性C57BL/6小鼠(购自维通利华实验动物技术有限公司)，在第0天通过尾静脉方式进行Muc1-B16黑色素瘤细胞(购自ATCC)接种，接种剂量为1×105个，构建Muc1-B16黑色素瘤肺转移模型。用实施例7制备的杂合外泌体与PD-1抗体联合使用进行治疗(a-PD1+vac.)，外泌体皮下给药剂量为1.85×109个外泌体，首次免疫时间为第0天，即肿瘤细胞尾静脉注射当天，二次免疫时间为第3天；PD-1抗体(购自BioXell公司)单独给药组采用腹腔给药方式，分别在肿瘤细胞接种后第0天、第3天、第6天、第9天进行给药，单次给药剂量为100μg。同时设置空白组(pbs)、两倍剂量杂合外泌体单独治疗组(2×vac.)以及两倍剂量PD-1抗体单独治疗组(2×a-PD1)三组对照组。之后对小鼠的体重以及肺部转移斑点进行记录，结果如图26、图27所示。
由图25可知，当采用PD-1抗体与杂合外泌体联合治疗，该组小鼠的B16黑色素瘤生长获得了最大程度的抑制，在观测终点，8只小鼠仅有4只小鼠有较小体积的肿瘤出现，治疗效果明显优于两倍剂量的PD-1抗体组以及两倍剂量外泌体单独给药组。
由图26、图27可知，PD-1抗体与杂合外泌体联合治疗组小鼠的体重在观测期内平稳上升，小鼠肺部转移斑计数结果显示该组小鼠肺部黑色素瘤转移斑数量明显降低，且明显低于两倍剂量PD-1抗体单独给药组以及两倍剂量杂合外泌体单独给药组，说明联合治疗组的治疗效果最佳。以上结果说明杂合外泌体制剂与PD-1抗体联合使用时，对于原位肿瘤的生长及肿瘤肺转移情况均具有协同的抑制效应，其治疗效果均显著优于两倍剂量的PD-1抗体或外泌体单独给药组。
分析认为，其发挥协同作用的原因在于：在单独杂合外泌体免疫组的肿瘤内部，杂合外泌体虽然降低了M2型巨噬的比例，但并不能百分之百地消除M2型巨噬，依然残留的M2型巨噬细胞以及肿瘤细胞可以通过其表面的PD-L1分子，与浸润到肿瘤内的CTL表面的PD-1分子相结合，使CTL衰竭，丧失杀伤肿瘤的能力。而PD-1抗体的联合使用，则可以阻断PD-L1与PD-1的结合，两者相互协同，从而减少CTL的衰竭，使得CTL发挥其应有的肿瘤杀伤作用，提高肿瘤抑制效果。

Claims (15)

1.一种外泌体的制备方法，含有以下步骤：提取肿瘤细胞的细胞核，在抗原提呈细胞培养液中加入所述肿瘤细胞的细胞核，孵育后，收取该培养液的上清液，差速离心，以收集外泌体。
2.权利要求1所述的制备方法，其中所述抗原提呈细胞吞噬肿瘤细胞核形成杂合细胞。
3.权利要求1所述的制备方法，其中所述的抗原提呈细胞是树突状细胞、巨噬细胞或者是B细胞。
4.权利要求1所述的制备方法，其中在抗原提呈细胞培养液中加入有免疫调节剂。
5.权利要求4所述的制备方法，其中所述免疫调节剂是脂多糖、单磷酰酯A或非甲基化胞苷酸鸟苷酸基序。
6.一种外泌体，其由权利要求1-5中任一项所述的制备方法制备。
7.一种杂合细胞的制备方法，由抗原提呈细胞吞噬肿瘤细胞核形成，其中，抗原提呈细胞是树突状细胞或巨噬细胞。
8.权利要求7所述的杂合细胞的制备方法，其经免疫调节剂处理。
9.权利要求8所述的杂合细胞的制备方法，其中所述免疫调节剂是脂多糖、单磷酰酯A或非甲基化胞苷酸鸟苷酸基序。
10.一种外泌体，其是由权利要求7所述的制备方法制备的杂合细胞分泌的纳米囊泡。
11.一种药物组合物，其含权利要求6或者权利要求10所述的外泌体，以及药学上可以接受的载体。
12.权利要求11中所述的药物组合物，其中，所述药物组合物是抗肿瘤疫苗。
13.一种药物组合物，其含有单克隆抗体和权利要求6或者权利要求10所述的外泌体，以及药学上可以接受的载体。
14.权利要求13中所述的药物组合物，其中，所述单克隆抗体是PD-1抗体、PD-L1抗体或CTLA-4抗体。
15.权利要求6或者权利要求10所述的外泌体在制备抗肿瘤药物或诱导针对肿瘤细胞或肿瘤的细胞毒性细胞应答的药物中的应用。
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