CN116139260A - 一种wt1肿瘤疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种WT1肿瘤疫苗及其制备方法与应用,与传统的WT1肿瘤疫苗相比,其采用外泌体为载体运输抗原,其中外泌体选用植物外泌体与肿瘤外泌体杂交制成,相比单一的植物外泌体或肿瘤外泌体来说,其具有更高的树突细胞靶向能力,可以有效的提升树突细胞对于抗原的摄取能力,使得抗原可以进行高效的淋巴迁移和淋巴结归巢,进而诱导大量特异性的肿瘤杀伤性T淋巴细胞的增殖,从而显著增强了WT1肿瘤疫苗的临床防治疗效;同时将采用WT1多肽与肿瘤细胞裂解物多肽和/或肿瘤新生抗原混合制成复合抗原,其与单一的WT1多肽相比,复合抗原在联合刺激淋巴结内初始T淋巴细胞更能诱导出强有力的杀伤性T淋巴细胞,从而进一步提高了WT1肿瘤疫苗的临床防治疗效。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其是涉及一种WT1肿瘤疫苗,并进一步涉及了该疫苗的制备方法与应用。
背景技术
近年来,伴随着免疫学和肿瘤发生发展分子机制研究的不断深入,肿瘤免疫疗法正成为肿瘤治疗研究热点,成为第四种疗法;与传统化疗、手术疗法、放疗等疗法相比,肿瘤免疫疗法是通过激发机体免疫系统,调动肿瘤宿主防御机制,刺激初始T细胞诱导杀伤性T淋巴细胞大量增殖对肿瘤细胞进行溶解,从而达到治疗的目的,该疗法具有较好的安全性,较低的毒副作用等特点。
肿瘤免疫疗法具体包括细胞因子疗法、免疫细胞疗法、基因疗法、分子靶向疗法、抗体治疗和肿瘤疫苗技术等。自从Steinman发现树突状细胞(DC)是最强的抗原呈递细胞以及Wilm和Call等人发现几乎所有肿瘤都表达WT1蛋白且具有原癌作用以来,肿瘤治疗性疫苗研发已成为免疫抗肿瘤研究中的重中之重。
肿瘤疫苗技术是通过输送天然或基因工程产生的抗原至淋巴结,抗原到达淋巴结的副皮质区后刺激初始T细胞诱导大量的特异性杀伤性T淋巴细胞增殖。通常情况下,皮下注射或肌肉注射疫苗的淋巴结归巢主要有两种方式:一是被动迁移入淋巴管后随淋巴液流入淋巴结,一般为粒径较小的疫苗分子;另外一种即是抗原呈递细胞吞噬后靶向淋巴结,也是抗原淋巴结归巢的主要方式,通常适用于粒径较大疫苗分子。
树突状细胞(DC)作为抗原呈递细胞,其在未摄取抗原之前是未成熟阶段,表现为迁移能力差和摄取能力强,一旦吞噬了抗原后变成为成熟状态,具有极强的淋巴迁移和淋巴结归巢作用。因此,就需要肿瘤疫苗的抗原具有良好的DC靶向性和合适的粒径。
WT1肿瘤疫苗是一种具有预防性治疗作用的广谱肿瘤疫苗,其是采用WT1多肽作为抗原,通过注射使机体产生相应的抗体,从而加强对癌症细胞的早期杀伤作用,起到抑癌的效果,可以预防包括白血病、消化道肿瘤、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌等20多种肿瘤。
但是传统的WT1肿瘤疫苗均采用单一的WT1多肽作为抗原,其对于DC的靶向性差,治疗效果不理想。
因此,有必要提供一种新的技术方案以克服上述缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可有效解决上述技术问题的WT1肿瘤疫苗及其制备方法与应用。
为达到本发明之目的,采用如下技术方案:
一种WT1肿瘤疫苗,该肿瘤疫苗由如下重量份原料组成:复合抗原:10~20份;外泌体:80~90份。
优选的,所述复合抗原由WT1多肽与肿瘤细胞裂解物多肽和/或肿瘤新生抗原混合制成。
优选的,所述WT1多肽在复合抗原中的质量占比为30~60%。
优选的,所述外泌体由植物外泌体与肿瘤细胞外泌体杂交制成,其粒径为150~200nm。
优选的,所述植物外泌体与肿瘤细胞外泌体的质量比为(1~3):1。
优选的,所述植物外泌体来源于香芹叶、马鞭草、柠檬草中的一种或多种。
进一步的,本发明还提供了一种制备如上所述的WT1肿瘤疫苗的方法,具体为:采用微电转法,使用电脉冲作用于外泌体,使外源性抗原进入外泌体中,从而得到装载有肿瘤疫苗抗原的外泌体,即WT1肿瘤疫苗。
同时本发明还提供了如上所述的WT1肿瘤疫苗在制备治疗癌症药物中的应用;其中所述癌症为表达WT1分子的恶性黑色素瘤、肾癌、脑胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌及妇科肿瘤。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、本发明的WT1肿瘤疫苗,与传统的WT1肿瘤疫苗相比,其采用外泌体为载体运输抗原,其中外泌体选用植物外泌体与肿瘤外泌体杂交制成,相比单一的植物外泌体或肿瘤外泌体来说,其具有更高的树突细胞靶向能力,可以有效的提升树突细胞对于抗原的摄取能力,使得抗原可以进行高效的淋巴迁移和淋巴结归巢,进而诱导大量特异性的肿瘤杀伤性T淋巴细胞的增殖,从而显著增强了WT1肿瘤疫苗的临床防治疗效;同时将采用WT1多肽与肿瘤细胞裂解物多肽和/或肿瘤新生抗原混合制成复合抗原,其与单一的WT1多肽相比,复合抗原在联合刺激淋巴结内初始T淋巴细胞更能诱导出强有力的杀伤性T淋巴细胞,从而进一步提高了WT1肿瘤疫苗的临床防治疗效。
2、本发明的WT1肿瘤疫苗,其制备方法简单,原料简单,适合中试放大和工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例3中香芹叶、马鞭草及柠檬草外泌体的粒径分布图;
图2为本发明实施例3中香芹叶、马鞭草及柠檬草外泌体的电位分布图;
图3为本发明实施例3中香芹叶、马鞭草及柠檬草外泌体的形态检测图;
图4为本发明实施例7中WT1肿瘤疫苗可高效被DC摄取的结果图;
图5为本发明实施例8中WT1肿瘤疫苗A可以促进BMDC成熟的结果图;
图6为本发明实施例9中WT1肿瘤疫苗可显著提高朗格汉斯细胞迁移能力的效果图;
图7为本发明实施例9中WT1肿瘤疫苗可显著提高淋巴结内CD8+T淋巴细胞比例的结果图;
图8为本发明实施例10中WT1肿瘤疫苗对小鼠乳腺癌肿瘤模型的治疗效果结果图。
具体实施方式
为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的部分实施例,而不是全部实施例。
本发明提供的一种WT1肿瘤疫苗,该肿瘤疫苗由如下重量份原料组成:复合抗原:10~20份;外泌体:80~90份。
其中,所述复合抗原由WT1多肽与肿瘤细胞裂解物多肽和/或肿瘤新生抗原混合制成;所述WT1多肽在复合抗原中的质量占比为30~60%。
上述的WT1多肽选购自日本肿疡医学研究所(简称TIMO);氨基酸序列为(CMTWNQMNL)。
所述肿瘤细胞全裂解物包含肿瘤细胞所有抗原信息,本实施例中的肿瘤细胞全裂解物来源于恶性黑色素瘤、肾癌、脑胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌及妇科肿瘤中的一种或多种的组合,采用反复冻融法、血清饥饿法、紫外照射法、高温法等制得,制备方法参考现有技术。
所述肿瘤新生抗原(Neoantigen)是源于肿瘤细胞中的突变基因的表达,是一类肿瘤特异性抗原,并不存在于正常的组织器官当中;本实施例中的肿瘤新生抗原的制备方法为通过高通量测序技术鉴定出恶性黑色素瘤、肾癌、脑胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌或妇科肿瘤中肿瘤细胞的突变基因,利用AI算法和质谱技术分析肿瘤Neoantigen的基因序列;经过湿实验验证后,将基因序列翻译并扩大抗原得到,具体步骤参考现有技术。
所述外泌体由植物外泌体与肿瘤细胞外泌体杂交制成,其粒径为150~200nm。
其中,所述植物外泌体与肿瘤细胞外泌体的质量比为(1~3):1;所述植物外泌体来源于香芹叶、马鞭草、柠檬草中的一种或多种,采用超速离心法结合梯度离心法或免疫共沉淀等方法制备,粒径为150~200nm。
具体的,外泌体是起源于多泡体的纳米级脂质膜细胞外囊泡(EV),在许多生理和病理过程中都起着重要作用,通过充当各种内源性货物分子(例如RNA,蛋白质,和脂质)的运载工具,实现了细胞间通讯。
本实施例中的肿瘤细胞外泌体来源于黑色素瘤、肾癌、脑胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌或妇科肿瘤中的一种或多种的组合,其由肿瘤细胞分泌,采用超速离心法制备,粒径为70~120nm,具体步骤参考现有技术。
进一步的,本发明还提供了一种制备如上所述的WT1肿瘤疫苗的方法,具体为:采用微电转法,使用电脉冲作用于外泌体,使外源性抗原进入外泌体中,从而得到装载有肿瘤疫苗抗原的外泌体,即WT1肿瘤疫苗;其中电击条件为电压400V,电容175μF电转2s。
同时本发明还提供了如上所述的WT1肿瘤疫苗在制备治疗癌症药物中的应用;其中所述癌症为表达WT1分子的恶性黑色素瘤、肾癌、脑胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌及妇科肿瘤等。
实施例1制备肿瘤细胞全裂解物
制备恶性黑色素瘤/肾癌/脑胶质瘤/前列腺癌/胰腺癌/卵巢癌/乳腺癌的肿瘤细胞全裂解物,具体步骤:分别取小鼠恶性黑色素肿瘤细胞系B16、肾癌肿瘤细胞系Renca、脑胶质瘤细胞系GL261、前列腺癌肿瘤细胞系RM-1、胰腺癌肿瘤细胞系Pan02、乳腺癌肿瘤细胞系4T1及卵巢癌细胞系ID8使用RPMI1640+10%FBS+100ug/mLStr-Pen培养,取2×106cells/mL密度的肿瘤细胞放入液氮中15min、37℃水浴锅中5min,反复3~5个循环,再超声处理进一步降低肿瘤抗原裂解物的粒径。超声频率为400W,工作3s,停3s,共超声10分钟。使用0.25μm的滤膜过滤。
实施例2制备肿瘤新生抗原
制备恶性黑色素瘤/肾癌/脑胶质瘤/前列腺癌/胰腺癌/卵巢癌/乳腺癌的肿瘤细胞新生抗原,具体步骤为:首先基于高通量测序技术鉴定出肿瘤细胞的突变基因,然后利用现在公开生物信息数据库(NCBI、GO、KEGG)等,收集上述关键抗原相关的基因序列、密码子、开放阅读框和单核苷酸多态性信息。然后根据临床具体肿瘤相关研究,选择最佳的突变蛋白抗原。
实施例3植物(香芹叶、马鞭草及柠檬草)外泌体的制备及表征
采用差速离心法分别提取3种植物外泌体。具体步骤如下:取鲜植物叶片,洗净,切块后榨汁。将新鲜汁液按照1∶1(v/v)加入预冷1×PBS,第一步低速4000×g、4℃离心1h去除汁液中碎渣,取上清;第二步中速10000×g、4℃离心1h除去细胞碎片等,取上清;第三步将上清在高速120000×g、4℃离心2h,弃上清,沉淀用适量PBS分散重悬即得植物外泌体。
使用马尔文纳米粒度仪检测本发明实施例中植物外泌体粒径和电位的测定。结果如图1所示。植物外泌体的粒径在150~200nm,这对提高体内DC靶向性具有一定促进意义。由图2所示,植物外泌体的Zeta电位约为-25~-20mV,这对提高植物外泌体的稳定性具有一定的保障意义。使用透射电镜观察装载复合肿瘤疫苗抗原植物外泌体的外观形态,结果如图3所示,外泌体的形态较为均一,整体呈现规则的圆形或近似圆形。
实施例4制备WT1肿瘤疫苗A(选用WT1多肽与肿瘤细胞全裂解物混合的复合抗原)
制备WT1肿瘤疫苗A(选用WT1多肽与肿瘤细胞全裂解物混合的复合抗原)方法,具体步骤为:肿瘤细胞全裂解物按照1∶1的比例加入WT1多肽蛋白一起超声处理。超声频率为400W,工作3s,停3s,共超声10分钟。使用0.25μm的滤膜过滤。
外泌体载复合抗原:具体步骤为:采用电转法制备,将200mL的马鞭草叶外泌体解冻后加入肿瘤疫苗复合抗原,加入电转仪中,设置好电转条件后进行电转操作。其中电击条件为电压400V,电容175μF电转2s.
实施例5制备WT1肿瘤疫苗B(选用WT1多肽与肿瘤新生抗原混合的复合抗原)
制备WT1肿瘤疫苗B(选用WT1多肽与肿瘤新生抗原混合的复合抗原)方法,具体步骤为:肿瘤新生抗原按照1∶2的比例加入WT1多肽蛋白一起超声处理。超声频率为400W,工作3s,停3s,共超声10分钟。使用0.25μm的滤膜过滤。
外泌体载复合抗原:具体步骤为:采用电转法制备,将200mL的香芹叶外泌体解冻后加入肿瘤疫苗复合抗原,加入电转仪中,设置好电转条件后进行电转操作。其中电击条件为电压400V,电容175μF电转2s.
实施例6小鼠原代骨髓来源树突状细胞(BMDC)提取分离
小鼠原代骨髓来源树突状细胞(BMDC)提取分离具体步骤为:6~8周龄小鼠处死浸泡75%酒精,剪去胫骨与腓骨肌肉、神经与筋膜等,去除肌肉暴露胫骨;暴露股骨,分离股骨和胫骨。暴露骨髓腔,冲洗骨髓细胞过筛网,收细胞悬液,1800rpm离心5min,去上清,获小鼠骨髓细胞的骨髓前体混合细胞。红细胞裂解后细胞培养于1640+10%FBS+20ng/mLGM-CSF+10ng/mLIL-4+100ug/mL Str-Pen。DC为悬浮或半贴壁生长,隔天换液至培养第7天,吹打收获未成熟的BMDC。
实施例7DC摄取WT1肿瘤疫苗的研究。
细胞爬片使用0.01%浓度赖氨酸浸泡5min后置于24孔细胞培养板中,细胞密度约为3×104cells/孔的未成熟原代BMDC添加到孔板中,蛋白浓度为5mg/mL的DiI标记WT1肿瘤与细胞共孵育12h。取出细胞爬片PBS润洗2次,使用4%多聚甲醛固定2h,PBS润洗后使用DAPI标记细胞核30min,PBS润洗后使用FITC偶联鬼笔环肽标记细胞骨架1.5h后封片剂封片,使用共聚焦显微镜观察。结果如图4所示,DiI荧光信号出现在细胞内部,说明WT1肿瘤疫苗被DC摄取。
实施例8WT1肿瘤疫苗A促进BMDC成熟的研究
细胞爬片使用0.01%浓度赖氨酸浸泡5min后置于24孔细胞培养板中,添加实施例中WT1肿瘤疫苗A的全培(1640+10%FBS+20ng/mLGM-CSF+10ng/mLIL-4+100ug/mLStr-Pen)稀释离心后的BMDC(细胞密度约为3×104cells/孔)并进行培养12h。然后,PBS小心清洗细胞2次,使用4%多聚甲醛固定2h,PBS润洗后使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记细胞核30min,PBS润洗后分别使用PEanti-mouseCD86和FITCanti-mouseCD80标记细胞表面共刺激分子1h,封片剂封片后使用共聚焦显微镜观察。如图5所示,WT1肿瘤疫苗A给药组的FITC和PE荧光强度显著高于PBS对照组,说明本发明实施例中的WT1肿瘤疫苗A可以促进BMDC成熟,这对提高DC体内淋巴迁移和淋巴结归巢有重要意义。
实施例9WT1肿瘤疫苗A靶向体内DC并归巢至腘窝淋巴结的研究
小鼠足皮下注射20μL后,对小鼠皮下注射PBS稀释的PE-CD207抗体用于特异标记朗格汉斯细胞。在不同时间点使用小动物活体成像技术对小鼠腘窝淋巴结附近进行荧光拍照,分析朗格汉斯细胞自皮下向淋巴迁移和淋巴结归巢的速度和程度。如图6所示,对照组的淋巴附近以及淋巴结内的荧光强度显著低于给药组,说明香芹叶外泌体被朗格汉斯细胞摄取后提高了朗格汉斯细胞的迁移能力。此外,不同浓度的WT1肿瘤疫苗提高体内朗格汉斯细胞迁移效果与浓度呈现一定的正相关效果,进一步验证了朗格汉斯细胞的淋巴迁移与淋巴结归巢是注射香芹叶外泌体的贡献。
为进一步阐明WT1肿瘤疫苗A的免疫效果及激发抗原特异性淋巴细胞反应的能力,使用流式细胞术检测给药后小鼠脾脏淋巴细胞激活情况。具体为:本发明所述的WT1肿瘤疫苗A和生理盐水对照大腿肌肉注射至C57BL/6小鼠,12小时后取出腘窝淋巴结,无菌研磨和1640培养基过滤后使用CD8+流式抗体进行避光孵育30min,PBS洗去未标记上抗体后使用流式细胞仪上样分析CD8+T细胞比例。如图7所示,对照组淋巴结内CD8+T淋巴细胞比例显著低于柠檬草外泌体组,因此,WT1肿瘤疫苗A可以有效的提高CD8+T淋巴细胞的数量,这对助力肿瘤免疫治疗具有重要作用。
实施例10WT1肿瘤疫苗A对小鼠乳腺癌模型的药效评价
肿瘤模型的建立:30只磁性6周龄C57BL/6小鼠,按照实验动物伦理要求进行饲养,自由饮水和饮食。小鼠背部皮肤去毛后使用酒精消毒,将预先计数好的4T1细胞按每只小鼠0.2mL体积悬液接种于小鼠背部去毛皮下处。荷瘤操作完成后于第7天开始每隔1天记录小鼠背部皮下肿瘤体积,肿瘤长至约100-300mm3,随机分为5组,每组6只。
动物分组及给药:5组荷瘤小鼠依次为生理盐水对照组,WT1肿瘤疫苗A组,只载4T1细胞抗体多肽的DC疫苗组。第7天进行第一次给药:足皮下给予20μL的香芹叶外泌体。每隔1天记录小鼠皮下肿瘤大小变化。第14天进行第二次给药,与第一次保持一致。第28天为实验终点,记录小鼠体重、肿瘤大小和体积以及进行HE病理切片观察等。
实验结果如图8所示,生理盐水组中的荷瘤小鼠的肿瘤体积不断增大,四组疫苗荷瘤小鼠的肿瘤体积在14天后均有一定程度的下降,说明疫苗具有一定的治疗效果。相比较看,高剂量给药组的荷瘤小鼠肿瘤体积增长幅度最小,且每个时间点的肿瘤体积也显著小于其他组,说明高剂量给药组的治疗效果最好。同时也能看出不同浓度疫苗(除抗原多肽外辅料总浓度)的治疗效果有一定正相关趋势,说明本发明实施例中的基于WT1肿瘤疫苗A在体内形成了很多的疫苗,同时具有很好的治疗效果。
Claims (9)
1.一种WT1肿瘤疫苗,其特征在于:该肿瘤疫苗由如下重量份原料组成:复合抗原:10~20份;外泌体:80~90份。
2.根据权利要求1所述的一种WT1肿瘤疫苗,其特征在于:所述复合抗原由WT1多肽与肿瘤细胞裂解物多肽和/或肿瘤新生抗原混合制成。
3.根据权利要求2所述的一种WT1肿瘤疫苗,其特征在于:所述WT1多肽在复合抗原中的质量占比为30~60%。
4.根据权利要求1所述的一种WT1肿瘤疫苗,其特征在于:所述外泌体由植物外泌体与肿瘤细胞外泌体杂交制成。
5.根据权利要求4所述的一种WT1肿瘤疫苗,其特征在于:所述植物外泌体与肿瘤细胞外泌体的质量比为(1~3):1。
6.根据权利要求5所述的一种WT1肿瘤疫苗,其特征在于:所述植物外泌体来源于香芹叶、马鞭草、柠檬草中的一种或多种。
7.一种制备如权利要求1~6任一一项所述的WT1肿瘤疫苗的方法,其特征在于:采用微电转法,使用电脉冲作用于外泌体,使外源性抗原进入外泌体中,从而得到装载有肿瘤疫苗抗原的外泌体,即WT1肿瘤疫苗。
8.如权利要求1~6任一一项所述的WT1肿瘤疫苗或采用如权利要求7所述的方法制备的WT1肿瘤疫苗在制备治疗癌症药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:所述癌症为表达WT1分子的恶性黑色素瘤、肾癌、脑胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌及妇科肿瘤。
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