CN109432116A - 黄芪皂苷ⅲ在制备肿瘤免疫治疗药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄芪皂苷Ⅲ在制备肿瘤免疫治疗药物中的新用途。本发明实施例证明黄芪皂苷Ⅲ分别通过促进C57小鼠CD8⁺T细胞表达IFN‑γ和促进C57小鼠NK细胞分化，在不同层面上增强免疫细胞的免疫应答，进而杀伤B16细胞、LLC细胞等肿瘤细胞。因此黄芪皂苷Ⅲ可以应用于制备肿瘤免疫治疗药物。

Description

黄芪皂苷Ⅲ在制备肿瘤免疫治疗药物中的用途

技术领域

本发明涉及黄芪皂苷Ⅲ的新用途，特别是涉及黄芪皂苷Ⅲ在制备肿瘤免疫治疗药物中的用途。

背景技术

近年来，在肿瘤治疗领域，人们越来越多地致力于利用自身免疫系统来抵御肿瘤，这种通过调动机体免疫系统，抑制和杀伤肿瘤细胞的方法称为肿瘤免疫治疗。肿瘤免疫治疗是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向，其中包括细胞免疫疗法、肿瘤疫苗，以及免疫检查点抑制剂等研究热点，并已取得了很多具有应用前景的研究成果。中药及天然药物中的天然小分子是科研工作者研究和开发肿瘤免疫活性剂的研究热点，这些化合物往往通过促进人体的免疫应答进而杀伤肿瘤细胞达到预防和治疗肿瘤的作用。

黄芪皂苷Ⅲ(Astragaloside Ⅲ)是从传统中药黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge.)中分离得到的天然皂苷类成分，具有调节肌体免疫功能，抗衰老，促进骨髓造血机能，大鼠肾毒血清性肾炎，防治大鼠肾毒血清性肾炎的作用。目前研究表明，黄芪皂苷III不具有细胞毒性。然而黄芪皂苷Ⅲ是否能够在肿瘤免疫治疗中发挥作用还没有得到充分研究。

发明内容

本发明的目的在于提供黄芪皂苷Ⅲ在制备肿瘤免疫治疗药物中的新用途。本发明人在研究中意外地发现，黄芪皂苷Ⅲ能够激活免疫细胞,进而对肿瘤细胞进行杀伤，并基于此完成了本发明。具体技术方案如下：

本发明第一方面提供了黄芪皂苷Ⅲ在制备肿瘤免疫治疗药物中的用途。

在本发明第一方面的一种具体实施方式中，所述肿瘤选自黑色素瘤和肺癌。

本发明所述黄芪皂苷Ⅲ通过增强CD8⁺T细胞和NK细胞的免疫应答，杀伤肿瘤细胞。

本发明第二方面提供了一种用于肿瘤免疫治疗的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含黄芪皂苷Ⅲ。

在本发明第二方面的一种具体实施方式中，所述肿瘤选自黑色素瘤和肺癌。

在本发明第二方面的另一种具体实施方式中，其中所述黄芪皂苷Ⅲ是以黄芪皂苷Ⅲ的单体形式提供的，或是以包含黄芪皂苷Ⅲ的黄芪提取物的形式提供的。黄芪皂苷Ⅲ可以通过商业途径购得；本文中所说的黄芪皂苷Ⅲ的黄芪提取物可以采用已知的制备方法来制备，本发明在此不进行限定。

在本发明第二方面的另一种具体实施方式中，所述药物组合物还包含任选的药学可接受的载体和/或赋形剂，选自溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和抗氧化剂。

在本发明第二方面的另一种具体实施方式中，所述药物组合物配制为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、注射剂、乳剂、混悬剂或酊剂中的任意一种剂型。

如本文使用的，术语“治疗”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对已经罹患肿瘤进行处理，以期对所述疾病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地，如本文使用的，术语“预防”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对可能罹患肿瘤或者对本发明所述肿瘤具有罹患风险的动物个体采用本发明的药物进行处理，以期对所述疾病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。

可采用制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本发明药物组合物的原料的有效成分，与一种或更多种药学可接受的载体混合，然后形成所需的剂型，来制备本发明的药物组合物。

如本文所用的，“药学上可接受的”表示当以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用，从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物，更特别地用于人，或者被登录在药典上。

本发明药物组合物中可用的“药学上可接受的载体”可以是药物制剂领域中任何常规的载体，特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的载体包括药学领域常规的溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂、和抗氧化剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。

如本文使用的，术语“药物组合物”具有其一般含义。此外，本发明的“药物组合物”还可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本发明的药物组合物的原料的有效成分，任选地与一种或更多种药学可接受的载体混合，然后形成所需的剂型，来制备本发明的药物组合物。根据本发明的药物组合物，其为可以适用于口服给药、胃肠外给药或局部给药、外用给药的药物制剂。本发明的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。具体地说，根据本发明的药物组合物，所述的药物剂型包括但不限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、注射液、注射用粉剂、透皮贴剂、软膏剂、凝胶剂、栓剂、口服溶液、口服混悬液、注射用乳剂、口服乳剂等、缓释片剂、控释片剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

用于口服施用的剂型可包括例如片剂、丸剂、硬或软胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、散剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、小丸剂、酏剂等，并不限于此。除了活性成分外，这些制剂还可包含稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐、钙盐和聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。必要时，其还可包含药用添加剂，例如崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等。片剂可根据常用的混合、造粒或包衣的方法制备。

用于肠道外施用的剂型可包括例如注射剂、药用滴剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂、乳膏、喷雾剂、混悬剂、乳剂、栓剂、贴剂等，并不限于此。

根据本公开的药物组合物可口服或非肠道例如经直肠、经局部、经皮肤、经静脉内、经肌内、经腹膜内或经皮下施用。

如本文使用的，术语“个体”或者“动物个体”具有其一般含义，并且在本文中可以指罹患或可能罹患本发明所述肿瘤的个体或动物个体，还可以指为了某种目的例如为了科学研究目的而使用的个体或动物个体。具体地说，所述的个体例如是动物个体，特别是哺乳动物个体，例如人、猪、狗、猫、牛、羊、马、大鼠、小鼠、家兔、豚鼠、猴等。更具体地说，本发明所述的个体是人。

活性成分黄芪皂苷Ⅲ的药学可接受的剂量，即施用剂量，可以根据待治疗对象的年龄、性别和体重、待治疗的具体疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、施用途径和诊断者的判断而改变。考虑这些因素确定施用剂量在本领域技术人员的水平范围内。一般的剂量可以是0.01-1000mg/kg/日，具体地1-100mg/kg/日。然而，本公开的范围不以任何方式受限于所述施用剂量。

本发明实施例证明黄芪皂苷Ⅲ可以通过增强CD8⁺T细胞及NK细胞的免疫应答杀伤B16细胞、LLC细胞等肿瘤细胞，在肿瘤免疫治疗中发挥作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为黄芪皂苷Ⅲ促进CD8⁺T细胞表达IFN-γ。

图2为黄芪皂苷Ⅲ增加小鼠体内NK细胞的分化。

图3为黄芪皂苷Ⅲ通过NK细胞杀伤B16细胞的效果。

图4为黄芪皂苷Ⅲ通过CD8⁺T细胞杀伤B16细胞的效果。

图5为黄芪皂苷Ⅲ通过CD8⁺T细胞杀伤LLC细胞的效果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：黄芪皂苷Ⅲ激活CD8⁺T细胞免疫应答

本发明中采用B16细胞作为第二信使，研究T细胞通路中CD8⁺T细胞的激活。

实验材料：8周雄性C57小鼠(购自军事医学研究所)，小鼠B16黑色素瘤细胞(简称B16细胞，)，anti-mouse CD3(BD)，IL-2(R&D)，PE anti-mouse CD8(BD)，APC anti-mouseIFN-g(BD)，胎牛血清(Gibico)，1640培养基(Sigma)，丙二醇甲醚醋酸酯(PMA,Sigma)，钙离子载体(ionomycin，Sigma)，黄芪皂苷Ⅲ(sigma)

实验内容：

1、脾单细胞悬液制备：颈椎脱臼处死小鼠，取脾，采用200目滤网破碎组织，收集细胞于1640培养液中，1400r/min离心细胞弃去上清，加入红细胞裂解液(sigma)5mL，室温裂解5分钟，加入1640培养液终止裂解，混匀后1400r/min离心弃去上清，加入含有10％胎牛血清的1640培养液1mL悬浮细胞备用。

2、使用anti-mouse CD3(5μg/ML，BD)进行包被培养板。

3、取对数生长期B16细胞，制备单细胞悬液，按照终浓度1×10⁵/mL B16细胞与终浓度1×10⁶/mL脾细胞共培养。同时设置两个实验组，即对照组和黄芪皂苷Ⅲ组，其中对照组采用含10％胎牛血清的1640培养液培养细胞，黄芪皂苷Ⅲ组在与对照组相同培养液中加入终浓度为100nM的黄芪皂苷Ⅲ。培养条件为：5％CO₂培养箱，37℃培养48小时，更换新鲜的含10％胎牛血清的1640培养液培养24小时，再加入PMA(终浓度50ng/mL)和ionomycin(终浓度1mg/mL)刺激4小时。

4、使用4％多聚甲醛(sigma)固定细胞，使用PE anti-mouse CD8(使用PBS，200倍稀释)进行胞外染色，APC anti-mouse IFN-γ(PBS稀释200倍)进行胞内染色。通过流式细胞仪进行检测并记录。

实验结果:

细胞因子IFN-γ等有助于肿瘤的免疫治疗，这类细胞因子会刺激NK、NKT、CTL(CD8⁺T细胞)增强对肿瘤细胞的杀伤，并且会刺激辅助性T细胞(Th)表达IL-2和IL-12等细胞因子进一步增强免疫细胞对肿瘤或外源物质的杀伤与清除。CD8⁺T被激活后，会表达大量的IFN-γ。全脾细胞被肿瘤细胞刺激同时加入黄芪皂苷Ⅲ，按照以上实验方案共培养细胞后，使用流式细胞仪检测，圈选CD8阳性的细胞亚群分析其表达IFN-γ能力。

如图1所示，加入黄芪皂苷Ⅲ后分析CD8⁺T所表达IFN-γ效果。

通过流式细胞仪分析，发现IFN-γ表达阳性细胞的比例明显增加。表明黄芪皂苷Ⅲ可以促进CD8⁺T细胞表达IFN-γ，说明黄芪皂苷Ⅲ激活CD8⁺T细胞的免疫应答。

实施例2：黄芪皂苷Ⅲ促进小鼠体内NK细胞分化

实施例1的结果显示黄芪皂苷Ⅲ可以促进T细胞中IFN-γ的表达，由此可知，此化合物可以促进IL-2以及IL-12等细胞因子的表达。这些细胞因子会促进NK细胞的分化，有助于对肿瘤细胞的杀伤。因此设计以下实验，验证黄芪皂苷Ⅲ在NK细胞分化程度上的作用。使用anti-mouse NK1.1抗体静脉注射小鼠，对小鼠体内的NK1.1进行屏蔽，再通过灌胃给药的方式对小鼠进行干预。

实验材料：8周雄性C57小鼠，anti-mouse NK1.1(BD)，APC anti-mouse NK1.1(BD)，FITC anti-mouse CD3(BD)，黄芪皂苷Ⅲ

实验内容：

1、选择8-10周龄、雄性C57小鼠随机分为对照组和黄芪皂苷Ⅲ组，每组10只。

2、使用anti-mouse NK1.1(1mg/kg体重)对两组小鼠进行尾静脉注射，每天注射一次，持续5天，第5天每组小鼠中随机抽取3只小鼠，处死小鼠，取脾制备单细胞悬液，流式细胞仪检测脾细胞中NK1.1⁺细胞比例。

3、注射5天后，对黄芪皂苷Ⅲ组小鼠进行溶解于生理盐水黄芪皂苷Ⅲ(终浓度为1mg/mL，给药剂量为50mg/kg体重)灌胃处理；对照组小鼠进行生理盐水灌胃处理，每天一次，持续3天。

4、以实施例1所述的方法处死小鼠并取脾制备单细胞悬液，并使用anti-mouseNK1.1标记小鼠脾细胞，并使用流式细胞仪进行检测。

实验结果：

使用静脉注射anti-mouse NK1.1清除小鼠体内的NK细胞。注射抗体清除后，灌胃10mg/Kg黄芪皂苷Ⅲ治疗持续3天，处死小鼠，取脾检测全脾细胞中NK细胞和NKT细胞的比例。图2中的对照组结果表明，使用抗体清除小鼠体内的NK细胞后，CD3⁺NK1.1⁺的NKT细胞和NK1.1⁺CD3^-的NK细胞基本清除；而黄芪皂苷III组结果表明，经黄芪皂苷Ⅲ灌胃后，小鼠体内NK细胞明显增多，说明黄芪皂苷III在体内实现了增加NK和NKT两种细胞的表达量。黄芪皂苷Ⅲ能够促进小鼠体内的NK细胞比例上升，进而说明黄芪皂苷Ⅲ能够增强NK细胞分化。

实施例3：黄芪皂苷Ⅲ通过NK细胞和CD8⁺T细胞的免疫应答杀伤肿瘤细胞

以上两个实验表明，黄芪皂苷Ⅲ能够在细胞因子表达和细胞分化水平上，增强免疫细胞在肿瘤免疫过程中的应答效果。本实验将肿瘤细胞与NK细胞或CD8⁺T细胞进行共培养，检测肿瘤细胞的存活率，用以反映黄芪皂苷Ⅲ通过免疫细胞免疫应答杀伤肿瘤细胞的情况。

由于B16细胞具有贴壁性的特点，只有在杀伤后存活的肿瘤细胞才会保持贴壁性，需要胰蛋白酶消化才能脱落。本实验通过使用CFSE标记B16细胞，通过流式细胞仪检测CFSE标记的细胞的荧光强度，反映肿瘤细胞存活率。

实验材料：8周龄C57小鼠，B16细胞，Lewis鼠源性肺腺癌细胞(简称LLC细胞，实验室自养)，CFSE染料(sigma)，IL-2(R&D)，胎牛血清，1640培养液，胰蛋白酶(Gibico)，NKcells isolate kit，CD8⁺T cells isolate kit(美天旎)，黄芪皂苷Ⅲ。

实验内容：

NK细胞和B16细胞共培养实验：

1、按照1×10⁶/mL浓度制备小鼠全脾细胞单细胞悬液,培养条件：含10％胎牛血清的1640培养基，20pg/mL(终浓度)IL-2，5％CO₂培养箱，37℃培养48小时。

2、使用NK cell isolate kit对小鼠NK细胞进行富集。

3、将B16细胞进行CFSE(37℃，终浓度4μM)标记，并按照1×10⁵/mL浓度培养。

4、共设置三个实验组：肿瘤对照组、NK对照组和黄芪皂苷Ⅲ组；其中，肿瘤对照组为CFSE标记的B16细胞单独培养；NK对照组为将富集后的NK细胞按照1×10⁶/mL浓度与B16细胞共培养；黄芪皂苷Ⅲ组为以终浓度为100nM的黄芪皂苷Ⅲ处理48小时后的NK细胞，按照1×10⁶/mL浓度，与B16细胞共培养，三组细胞的培养条件均为10％胎牛血清的1640培养基培养。

5、共培养6小时后，去除培养孔中的悬浮细胞。

6、胰蛋白酶(0.05％)消化贴壁的B16细胞，流式细胞仪检测细胞存活率。

实验结果：

被CFSE标记的肿瘤细胞与NK细胞共同培养，被NK细胞杀伤的肿瘤细胞会解除贴壁状态漂浮在培养液中，收集被胰酶消化下的肿瘤细胞检测其荧光信号强度，具有荧光信号为存活下来的肿瘤细胞，通过检测荧光强度的变化，判断杀伤效果。荧光计数越低说明存活的肿瘤细胞数目越少。NK对照组和黄芪皂苷Ⅲ组的荧光计数结果分别与肿瘤对照组进行对比。如图3所示，流式细胞仪检测的基线为肿瘤对照组。其中A图显示了肿瘤细胞与NK细胞共培养后(NK对照组)，肿瘤细胞的存活情况；B图为肿瘤细胞与经过黄芪皂苷Ⅲ处理后的NK细胞共培养后(黄芪皂苷Ⅲ组)，肿瘤细胞的存活情况。实验结果表明，黄芪皂苷Ⅲ的处理，增强了NK细胞杀伤B16肿瘤细胞的能力。

CD8⁺T细胞和B16细胞共培养实验：

采用同样的方法，使用CD8⁺T cells isolate kit富集CD8⁺T(CTL)细胞，与B16细胞共培养后检测B16细胞存活率，其余操作与上述NK细胞和B16细胞共培养实验相同。共分为三组细胞，分别为CTL对照组、黄芪皂苷Ⅲ组和肿瘤对照组。CTL对照组为B16细胞与CTL细胞共培养；黄芪皂苷Ⅲ组为黄芪皂苷Ⅲ处理过的CTL细胞与B16细胞共培养；肿瘤对照组为CFSE标记的B16细胞单独培养。CTL对照组和黄芪皂苷Ⅲ组中CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤效果(肿瘤细胞荧光计数结果)分别与肿瘤对照组进行对比。在实验过程中，由于需要使用肿瘤细胞作为第二信使信号的传导，肿瘤细胞浓度的变化会影响CD8⁺T细胞的激活程度，因此选择2个不同的肿瘤细胞浓度。结果如图4所示，其中A图中肿瘤细胞浓度为1×10⁶/mL，B图中肿瘤细胞浓度为1×10⁵/mL。从图4中可以看出，肿瘤细胞对CD8⁺T细胞的敏感程度随浓度增大而增加。

通过以上两个实验发现，黄芪皂苷Ⅲ不仅仅能够增加NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，同时也会增加CD8⁺T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。而且CD8⁺T细胞对B16细胞的杀伤效果与肿瘤细胞所提供的信号有与肿瘤细胞浓度有明显关系。

CD8⁺T细胞和LLC细胞共培养实验

为了验证黄芪皂苷Ⅲ对其他贴壁肿瘤细胞的杀伤效果，使用1×10⁶/mL浓度的LLC细胞与CD8⁺T进行共培养实验。实验共分为三组，分别为CTL对照组、黄芪皂苷Ⅲ组和肿瘤对照组。CTL对照组为LLC细胞与CTL细胞共培养；黄芪皂苷Ⅲ组为黄芪皂苷Ⅲ处理过的CTL细胞与LLC细胞共培养；肿瘤对照组为CFSE标记的LLC细胞单独培养。CTL对照组和黄芪皂苷Ⅲ组中CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤效果(肿瘤细胞荧光计数结果)分别与肿瘤对照组进行对比。结果如图5所示，结果表明黄芪皂苷Ⅲ同样可以促进CD8⁺T细胞对LLC细胞的杀伤作用。

上述实验表明，仅仅将免疫细胞(NK细胞或CD8⁺T细胞)和肿瘤细胞共培养，免疫细胞对肿瘤的杀伤作用并不明显，而黄芪皂苷Ⅲ处理过的免疫细胞与肿瘤细胞共培养后，肿瘤细胞存活率明显下降，说明黄芪皂苷Ⅲ提高了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

结合实施例1至实施例3的实验，说明黄芪皂苷的抗肿瘤机制是通过对免疫细胞中NK细胞和CD8⁺T细胞进行刺激，提高NK细胞和CD8⁺T细胞的免疫应答。两类细胞对肿瘤免疫应答的提升，会导致肿瘤细胞死亡。因此说明，黄芪皂苷Ⅲ可以提高免疫细胞杀伤肿瘤细胞的作用，从而能够用于肿瘤免疫治疗。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.黄芪皂苷Ⅲ在制备肿瘤免疫治疗药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自黑色素瘤和肺癌。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述黄芪皂苷Ⅲ通过增强CD8⁺T细胞和NK细胞的免疫应答，杀伤肿瘤细胞。

4.一种用于肿瘤免疫治疗的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含黄芪皂苷Ⅲ。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤包含黑色素瘤和肺癌。

6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述黄芪皂苷Ⅲ以单体形式提供或者以包含黄芪皂苷Ⅲ的植物提取物形式提供。

7.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含任选的药学可接受的载体和/或赋形剂。

8.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物配制为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、注射剂、乳剂、混悬剂或酊剂中的任意一种剂型。