CN1128621C - 人参二醇组皂甙及其组合物在制备治疗血液病的药物中的应用 - Google Patents

人参二醇组皂甙及其组合物在制备治疗血液病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

一种组合物，是由人参二醇组皂甙与药用载体和/或药用赋形剂组成，本发明是将该组合物应用与血液病的治疗，尤其是应用于难治性血液病的治疗。本发明提供的组合物，对造血细胞具有刺激增殖作用，对再障性贫血患者的造血祖细胞具有刺激增殖作用，对白血病祖细胞有增殖的抑制和刺激作用，有较强的促进化疗药杀伤白细胞的作用。该组合物应用于血液病的治疗，疗效优于现有治血液病的药物，且无毒副作用，价格较低，为血液病的治疗提供了新途径，并拓展了人参皂甙尤其是人参二醇组皂甙的临床应用范围。

Description

人参二醇组皂甙及其组合物在制备治疗血液病的药物中的应用
本发明涉及血液病临床治疗，主要是把人参皂甙中的人参二醇组皂甙及其组合物应用于血液病的临床治疗。
目前国内外对难治性血液病，因其病因复杂尚无特殊疗法，长期用强的松和雄激素的常规疗法有众所周知的副作用，而重组生长因子疗法价格昂贵，无法常规使用，且对很多难治性血液病无效。人参作为抗衰老强壮剂和补气血药物已有千余年历史，人参提取物即人参总皂甙，对神经、心血管、内分泌、免疫和抗肿瘤的实验研究已有不少报道，但对血液方面的实验研究很少，尤其是人参二醇组皂甙及其组合物，也未见有这方面的临床报道。
本发明的目的是提供一种含人参皂甙，尤其是人参二醇组皂甙的组合物，应用于血液病的临床治疗。
本发明提供的组合物，是由人参皂甙，尤其是人参二醇组皂甙和药用载体和/或药用赋形剂组成，应用于血液病的治疗。
本发明将人参皂甙，尤其是人参二醇组皂甙及其组合物，应用于血液病的治疗，疗效优于现有的常规药物，且在治疗中无毒副反应，本发明提供的组合物，对造血细胞具有刺激增殖作用，对再生障碍性贫血患者的造血祖细胞具有刺激增殖作用，对白血病祖细胞有增殖的抑制和刺激的双向作用，有较强的促进化疗药杀伤白血病细胞的作用。
本发明提供的人参皂甙，尤其是人参二醇组皂甙的组合物，克服了现有治疗血液病药物存在的毒副作用大，价格昂贵等不足之处，为血液病治疗提供了新的途径，拓展了人参皂甙的临床应用范围。同时减轻了患者因毒副作用带来的痛苦，尤其因为该组合物成本较低，也减轻了血液病患者的经济负担。
本发明通过以下实施例作进一步说明。
实施例1：人参二醇组皂甙组合物的一种配方
处方：  人参二醇粉  30克
        糊      精  470克
        制      成  1000粒
制备：取人参须根粗粉(20目筛)适量，以适当浓度乙醇进行渗漉提取至无色，收集提取液，静置24小时以上，取上清液回收乙醇至无醇味，将药液浓缩至适当浓度，上柱，以柱层析分离法进行分离提取，以低度乙醇进行分离，收集分离提取液，经真空干燥数小时后，得结晶状，淡黄色人参二醇精品。称取精品30克，碾成极细粉，过80目筛，与糊精混合均匀，装入胶囊即可，每粒胶囊0.5克(含人参二醇纯品30毫克)。质量标准符合卫生部药品卫生标准规定和中国药典95版。
实施例2：人参二醇组皂甙对小鼠骨髓造血祖细胞作用研究
人参作为药用已有几千年的历史，其有效成分主要是由20多种单体皂甙组成的人参总皂甙，各成分的药理作用不尽相同。人参皂甙按单体皂甙元所含羟基量不同分为人参二醇组皂甙(Pananxadiol Saponin；PDS)，人参三醇组皂甙(Panaxtrol Saponin；PTS)两大类。本研究采用造血祖细胞体外培养技术，比较PDS对小鼠骨髓造血祖细胞(简称CFU-E、BFU-E)和粒单系祖细胞(简称CFU-GM)的作用。
材料与方法
1、动物：NIH小鼠，雄性，体重18-22克。
2、PDS按实施例1方法制备。
3、CFU-E、BFU-E、CFU-GM按唐佩弦《造血细胞培养技术》培养。
4、PDS体外刺激试验：将PDS工作液加入小鼠骨髓造血祖细胞CFU-E、BFU-E、CFU-GM培养体系中，终浓度分别为1、5、10、20、50μg/ml，设立对照组，培养7天后观察结果。
5、实验结果用t检验方法，分析PDS组与对照组之间的差异。
结果：
(1)PDS对小鼠骨髓CFU-E的作用
表1显示将不同PDS加入8份小鼠骨髓培养CFU-E的情况，结果表明当PDS浓度为1、5、10和20ug/ml时CFU-E集落产率明显高于对照组(p＜0.05)，提高率分别为26.1％、58.5％、29.0％和25.8％。
表1 PDS对小鼠骨髓CFU-E的作用
    浓度(ug/ml)     CFU-E/0.5×105    提高率(％)    P值
        0             38.6±8.4        —                          —1             48.5±8.8        26.1±3.3     ＜0.055             61.3±10.2       58.5±6.1     ＜0.0110            49.8±8.8        29.0±2.2     ＜0.0520            48.6±9.3        25.8±3.0     ＜0.0550            43.8±7.1        13.5±2.1     ＞0.05
(2)PDS对小鼠骨髓BFU-E的作用
表2显示将不同浓度的PDS加入8份小鼠骨髓培养BFU-E情况，结果表明当PDS浓度为1、5、10和20ug/ml时BFU-E集落产率明显高于对照组(p＜0.05)，提高率分别为27.0％、64.7％、36.7％和29.4％，高浓度不抑制。
表2 PDS对小鼠骨髓BFU-E的作用
  浓度(ug/ml)     BFU-E/0.5×105   提高率(％)    P值
    0               8.5±2.5         —                      —1              10.8±2.6        27.0±3.1    ＜0.055              14.0±5.9        64.7±5.8    ＜0.0110             11.6±2.7        36.7±4.1    ＜0.0120             11.0±2.7        29.4±2.4    ＜0.0550              9.8±2.4        15.3±1.9    ＞0.05
(3)PDS对小鼠骨髓CFU-GM的作用
表3显示将不同浓度的PDS加入8份小鼠骨髓培养CFU-GM情况，结果表明PDS浓度为1、5、10、20和50ug/ml时，CFU-GM集落产率明显高于对照组(p＜0.05)，提高率分别为32.3％、54.0％、38.2％、36.5％和28.6％。
表3 PDS对小鼠骨髓CFU-GM的作用
   浓度(ug/ml)     CFU-GM/2×105   提高率(％)    P值
     0              49.8±8.4        —                        —1              65.9±10.3      32.3±3.1     ＜0.055              76.7±10.4      54.0±6.1     ＜0.0110             68.8±9.8       38.2±4.1     ＜0.0120             68.0±8.5       36.5±3.5     ＜0.0550             63.8±9.8       28.6±2.6     ＜0.05
本实验结果表明：PDS体外对小鼠骨髓CFU-E、BFU-E、CFU-GM均有明显的刺激增殖作用，与对照组相比分别提高58.5％、64.7％和54.0％，且高浓度不抑制。
实施例3 人参二醇对正常人骨髓造血祖细胞的作用
材料与方法
1、标本：取非血液病患者正常肋骨骨髓，骨髓涂片为正常髓象。
2、红系祖细胞(CFU-E、BFU-E)，粒单祖细胞(CFU-GM)培养方法与
实施例1相同。
3、多向祖细胞(CFU-Mix)培养：取IMDM混合培养体系中含4×105/ml骨髓单个核细胞、0.3％琼脂、25％人AB型血清、10-5mol/L 2-ME和L-谷氨酰胺，每ml培养体系含重组的造血生长因子如下：红细胞生成素(EPO)2U、粒/单-集落刺激因子(GM-CSF)20ng，以0.25ml/孔(四个复孔)接种至培养板上，置于37℃，含5％CO2饱和湿度的培养箱孵育，于14天后计数CFU-Mix集落。
4、PDS对CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-Mix刺激试验：将PDS工作液加入培养体系中，终浓度分别为2.5、10、20、50、100和200ug/ml时，并设立无PDS的对照组，于培养7、14天后观察结果。
5、数据统计分析处理用t检验。
结果：
(1)PDS对正常人骨髓CFU-E的作用
表1显示将不同浓度的PDS加入10份正常人骨髓标本培养CFU-E的结果。当PDS浓度为2.5、10、20、50、100和200ug/ml时，CFU-E集落产率明显高于对照组，具有显著性差异。提高率分别为24.8％、25.3％、33.9％、54.9％、44.0％、32.4％。
表1 PDS对正常人骨髓CFU-E的增殖作用(n＝10)浓度(ug/ml)     CFU-E/0.5×105    提高率(％)    P值
 0.0           115.2±20.6          —                    —
 2.5           143.8±20.8        24.8±4.1    ＜0.05
10.0           144.3±29.6        25.3±3.9    ＜0.05
20.0           154.3±28.2        33.9±5.1    ＜0.01
50.0           178.5±30.2        54.9±6.3    ＜0.01100.0           165.9±22.4        44.0±3.2    ＜0.01200.0           152.5±25.2        32.4±5.0    ＜0.05
(2)PDS对正常人骨髓BFU-E的增殖作用
表2显示将不同浓度的PDS、加入10份正常人骨髓标本培养BFU-E结果。当PDS浓度为2.5、10、20、50、100和200ug/ml时，BFU-E集落产率均明显高于对照组，具有显著差异。提高率分别为26.5％、28.1％、30.4％、48.7％、42.3％、和35.6％。
表2 PDS对正常人骨髓BFU-E的增殖作用(n＝10)浓度(ug/ml)     BFU-E/0.5×105    提高率(％)     P值
0.0            21.5±2.8            —                      —
2.5            27.2±3.1          26.5±3.1     ＜0.0510.0            27.5±2.9          28.1±4.2     ＜0.0520.0            28.0±2.5          30.4±4.1     ＜0.0150.0            32.0±3.0          48.7±5.1     ＜0.01100.0            30.7±2.7          42.3±4.6     ＜0.01200.0            29.2±2.4          35.6±4.1     ＜0.01
(3)PDS对正常人骨髓CFUGM的增殖作用(n＝10)
表3显示将不同浓度的PDS加入10份正常人骨髓标本培养CFU-GM结果。当PDS浓度为10、20、50、100、和200ug/ml时，CFU-GM集落产率均明显高于对照组，具有显著差异。提高率分别为15.2％、25.9％、27.6％、27.3％和27.1％。
表3 PDS对正常人骨髓CFU-GM的增殖作用(n＝10)浓度(ug/ml)     CFU-GM/2×105      提高率(％)      P值
0.0            165.9±18.6           —                       —
2.5            173.1±19.5         4.3±2.1       ＞0.0510.0            182.8±22.1         15.2±8.5      ＜0.0520.0            208.7±23.4         25.9±4.1      ＜0.0150.0            211.7±26.3         27.6±4.2      ＜0.01100.0            211.2±25.9         27.3±3.9      ＜0.01200.0            210.8±22.9         27.1±3.8      ＜0.01
(4)PDS对正常人骨髓CFU-Mix的增殖作用
表4显示将不同浓度的PDS加入8份正常人骨髓标本培养CFU-Mix结果。PDS浓度为10、20、50ug/ml时，CFU-Mix集落产率明显高于对照组，具有显著差异。提高率分别为22.4％、48.9％和31.6％。
表4 PDS对正常人骨髓CFU-Mix的增殖作用(n＝8)
    浓度(ug/ml)    CFU-Mix/1×105   提高率(％)     P值
      0.0             9.8±1.8           —                   —2.5            11.3±2.0        15.3±1.7     ＞0.0510.0            12.0±1.9        22.4±1.9     ＜0.0520.0            14.6±2.0        48.9±3.9     ＜0.0150.0            12.9±1.6        31.6±2.8     ＜0.01100.0            11.2±1.7        14.3±1.6     ＞0.01200.0            11.0±1.4        12.2±1.3     ＞0.01
本研究结果表明：1、PDS对正常人骨髓红系、粒系、巨核系三种系列的造血祖细胞均有明显的刺激增殖作用，这种增殖效应类似于造血生长因子。2、根据以前的研究结果应用高浓度的造血生长因子培养造血祖细胞时即使再增加该生长因子浓度也不能提高集落产率，PDS则能与生长因子起协同作用而显著地提高集落产率。这种协同作用在临床上可能更有意义，因为绝大多数血液病患者体内并不缺乏造血生长因子，有的患者还高于正常人。3、10-50ug/ml浓度的PDS是体外刺激造血祖细胞增殖的恰当浓度，同时也可为临床试验用药剂量提供参考。
实施例4 人参二醇组皂甙对再生障碍性贫血患者造血祖细胞的体外增殖作用
病例：30例诊断为再生障碍性贫血(AA)患者，诊断标准按中华血液学杂志，1987：8(8)封四和463《再生障碍性贫血诊断与疗效标准》。其中男17例，女13例，中位年龄32岁(7-66)，急性再障(AAA)8例，慢性再障(CAA)22例。又按祖细胞集落数，患者外围血单个核细胞(PBMNC)对正常CFU-GM的抑制试验及红系祖细胞对甲睾的敏感性分为雄激素反应型(AA1)15例，免疫介导型(AA2)8例及干细胞缺少型(AA3)7例三种类型。
药物：PDS按常规提取，用培养基配成1mg/ml工作液，正压过滤，4℃保存备用。
造血祖细胞培养法：PDS以25μg/ml为终浓度加入再障患者骨髓体外培养体系中，并设立不加PDS的对照组。
结果：(1)PDS对雄激素反应型再障(AA1)15例骨髓CFU-E、BFU-E和CFU-GM的作用，结果表明PDS组CFU-E、BFU-E和CFU-GM集落产率均明显高于对照组(p＜0.05)，提高率分别为38.1％、47.6％和23.8％(见表1)。
表1
  集落值    对照组        PDS       提高率(％)           P值
  CFU-E    31.0±5.4   42.8±7.2    38.1±4.2          ＜0.01BFU-E     2.1±0.6    3.1±0.7    47.6±4.3          ＜0.01CFU-GM   54.3±8.5   67.2±11.0   23.8±2.1          ＜0.05
(2)PDS对免疫介导型再障(AA2)8例骨髓CFU-E、BFU-E和CFU-GM的作用，结果表明：PDS组CFU-E、BFU-E和CFU-GM集落产率与对照组相比无明显差异(p＞0.05)，提高率分别为13.3％、11.1％和12.9％(见表2)。
表2
  集落值     对照组        PDS        提高率(％)        P值
  CFU-E    10.5±3.4    11.9±3.6    13.3±1.4         ＞0.05BFU-E     0.9±0.4     1.0±0.4    11.1±1.1         ＞0.05CFU-GM   23.2±5.1    26.2±5.8    12.9±1.3         ＞0.05
(3)PDS对干细胞缺少型再障(AA3)7例骨髓CFU-E、BFU-E和CFU-GM的作用，结果表明：PDS组CFU-E、BFU-E和CFU-GM集落产率与对照组相比无明显差异(p＞0.05)，提高率分别为3.8％、0％和6.0％(见表3)。
表3
  集落值     对照组       PDS         提高率(％)       P值
  CFU-E     2.6±0.9    2.7±1.0      3.8±0.4        ＞0.05BFU-E        0           0             0             —CFU-GM    5.0±1.3    5.3±1.5      6.0±0.5        ＞0.05
本实验结果表明：PDS对再障患者的造血祖细胞也有刺激增殖作用。而免疫介导型因存在抑制系统，干细胞缺少型因祖细胞太少，均使PDS的作用不能表达。当其病情好转时，PDS体外试验亦趋向敏感。
实施例5 人参二醇组皂甙及其组合物对难治性血液病的疗效观察
病例：慢性再障性贫血(CAA)23例，其中男11例，女12例，年龄11-72岁，中数患病时间6(1-13)年。过去治疗药物包括：中药、雄性激素、肾上腺糖皮质类激素、HGF、环胞菌素A以及输血和抗生素等支持治疗。17例经以上治疗无效，另6例血红蛋白和白细胞有上升，但血小板仍处于低水平。
血小板减少性紫癜(ITP)：33例，病程2.5(1-8)年。成人组男9例，女19例，中数年龄43(22-71)岁。儿童组5例均为男性，年龄8(6-13)岁。多数患者均经糖皮质激素治疗初期有反应，以后无效。儿童病例均经强的松、长春新碱及硫唑嘌呤等单独或联合治疗均无效。
治疗结果：(1)再生障碍性贫血期17例，治疗有效率70.6％(12/17)。治疗前平均血小板31.6×109/L，血红蛋白51.3g/L和白细胞2.8×109/L；人参二醇组皂甙治疗后提高到64.7×109/L，90.3g/L和4.06×109/L，具有显著差异(p＜0.01)，血小板、血红蛋白和白细胞的提高率分别为144.0％、20.1％和36.3％。其中基本治愈5例、缓解4例、进步3例、无效5例(5例中2例治疗前靠输血维持，治疗后已经一年未再输血，血象已有上升，但是未到“进步”标准)。
(2)再障性贫血恢复期(再障治疗后血红蛋白和白细胞有上升，但血小板仍低下者)6例，本组有效率为100％(6/6)。其中基本治愈4例、缓解1例、进步1例。4例经人参二醇组皂甙治疗后血小板达到正常，而血红蛋白和白细胞也较原水平升高，1例血小板由治疗前15.0×109/L升至96.0×109/L。
(3)血小板减少性紫癜33例，治疗有效率为84.8％(28/33)。
成人组：28例，治疗前平均血小板为36.2×109/L，人参二醇组皂甙治疗后提高到82.4×109/L，提高率为127％，经统计学分析具有显著差异(p＜0.01)。其中基本治愈和显效10例、良效9例、进步7例、无效2例，有效率为92.8％(26/28)，显效中1例同时伴有HbsAg阳性，经人参二醇组皂甙治疗8个月后，乙肝三系转阴、血小板达到正常，随访二年10个月未复发，符合治愈标准。
儿童组：5例，治愈有效率为40％(2/5)，其中显效和良效各1例、、无效3例。
(4)56例中由乙型肝炎诱发的再生障碍性贫血和血小板减少性紫癜17例，治愈有效率为88.2％(15/17)。均有HbsAg阳性或其他抗体阳性，其中再生障碍性贫血7例，经人参二醇组皂甙治疗：其中基本治愈2例、进步3例、无效2例，有效率71.4％(5/7)；血小板减少性紫癜10例，经人参二醇组皂甙治疗：其中基本治愈和显效6例、良效3例、进步1例，有效率达100％。17例中有2例经人参二醇组皂甙治疗后，HbsAg从阳性转为阴性。
本研究结果表明：人参二醇组皂甙具有刺激造血祖细胞增殖的类生长因子作用。临床应用获得令人满意的疗效，总有效率为82.1％(46/56)。体内疗效与体外实验结果相符合。CAA和成人ITP在血液病中均为多发病和难治性疾病，病因复杂。人参二醇组皂甙能使CAA和ITP外周血明显上升，尤以血小板升高明显。28例成人ITP经人参二醇组皂甙治疗，有效率为98.2％。ITP系自身免疫性疾病，人参二醇皂甙可能增加正常免疫力或抑制自身抗体。17例乙型肝炎引起的CAA和ITP有HbsAg阳性或其他抗体阳性，15例获得良好疗效，其中2例HbsAg由阳性转阴性。提示人参二醇对免疫系统有良好的作用。
实施例6 人参二醇组皂甙对人CD34+造血干/祖细胞的作用
材料和方法
1.取外科手术无血液病患者的肋骨，用常规方法分离，获得骨髓单个核细胞。
2.取单个核细胞用免疫磁珠单克隆抗体标记法获得CD34+细胞，经流式细胞仪分析纯度高达90％以上。
3.PDS的提取方法与实施例1相同。
4.造血祖细胞培养：CD34+细胞1×104/ml，培养体系含白介素-3(IL-3)、GM-CSF、EPO。37℃5％CO2培养14天。观察BFU-E、CFU-E、CFU-E、CFU-E和CFU-Mix集落数。以不加PDS组为对照。结果见表7表7        PDS对CD34+造血干/祖细胞的增殖作用( X±SD n＝5)PDS    BFU-E        提高率      CFU-E        提高率        CFU-GM      提高率     CFU-Mix     提高率(μg/ml)              (％)                      (％)                      (％)                   (％)0     28.6±2.1                69.0±3.1                 56.0±2.1               28.1±1.85     56.0±4.3   95.8±8.0    110.0±5.0   59.4±4.1    62.0±4.2   10.1±0.9   47.2±2.2   67.2±8.310     70.1±7.0   145.0±10.4  128.3±6.8   85.9±7.1    68.4±5.5   21.4±1.8   49.3±3.1   75.4±5.920     78.0±7.8   172.0±12.1  154.0±8.1   123.1±11.4  83.1±9.1   48.2±5.3   64.0±5.5   127.0±1.850     68.1±5.9   186.0±10.1  146.0±7.9   111.1±9.8   140.6±8.8  151.0±11.2 60.2±5.9   113.5±9.8100     43.1±4.4   50.1±8.7    112.0±5.6   62.3±5.6    98.2±7.6   75.0±8.7   54.0±6.0   92.1±7.8
以前的研究仅能针对较晚期的造血祖细胞。而随着造血干细胞的分离纯化方法进展，CD34+造血干/祖细胞是目前所能研究的最早期的造血细胞，已显示出巨大的临床应用价值，CD34+造血干/祖细胞移植已成为根治恶性血液病及某些实体瘤的方法，可重建造血功能，还可用于遗传病和肿瘤的基因治疗。本研究观察PDS对造血干/祖细胞的增殖作用。结果显示PDS不但刺激较晚期的造血祖细胞增殖，而且对CD34+细胞形成各类定向造血祖细胞集落具有明显的作用。PDS促进CD34+细胞形成BFU-E、CFU-E、CFU-GM和CFU-Mix集落数分别增加186.0±10.1％、123.1±11.4％、151.0±11.2％和127.0±1.8％，提高率显著高于PDS对较晚期的造血祖细胞。提示PDS不但具有促进CD34+细胞增殖，而且能够诱导其定向分化的双向作用，并且对越早期的造血细胞，作用越明显。这些结果提示对于骨髓移植和化疗后的病人应用PDS治疗可与造血生长因子起协同作用，对提高疗效和恢复造血将是很有效的，对于难治性血液病，病变在干/祖细胞阶段者则能通过促进早期CD34+造血干/祖细胞增殖和分化而恢复造血功能。
5-50μg/ml的PDS浓度是刺激CD34+细胞集落形成的最佳浓度，当浓度高达100μg/ml时不但没有出现抑制现象，而且仍能提高集落数，也说明PDS质量和纯度良好。
实施例7 人参二醇刺激造血祖细胞增殖的作用机理研究
PDS如何促使造血祖细胞增殖的作用机理尚未明了。转录因子c-Fos、c-Jun和GATA-2在血细胞生成中起重要作用，它们的主要功能是介导造血细胞对生长因子的反应，参与细胞增殖及分化有关基因的调控。由于PDS刺激造血的作用类似于生长因子，故借鉴研究生长因子的方法，探讨PDS在造血细胞内的信号传递途径。
材料和方法
1、人细胞株培养和PDS刺激处理 选用人粒系细胞株HL-60、红系细胞株K562、巨核系细胞株CHRF-288和Meg-01作靶细胞。常规培养在含10％小牛血清的IMDM培养基中，分为2组：实验组分别加PDS 5ug/ml，对照组不加PDS，培养1个月，细胞作饥饿处理，去血清孵育24小时，然后分别加入PDS 25ug/ml，细胞与药物作用2小时后，提取核蛋白。
2、提取核蛋白 核蛋白提取方法按Dinam报道的加以改良，细胞经冷PBS洗涤后，悬浮在缓冲液A中，含蛋白酶抑制剂：抑蛋白酶肽(Leupeptin)、木瓜蛋白酶抑制肽(antipain)、亮抑制肽(aprotinin)和胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)(Sigma)，均为10μg/ml浓度，经振荡后破碎细胞膜，收集细胞核，悬浮在缓冲液C中，超声粉碎器破碎细胞核，离心沉淀12000rpm，20分钟，取上清，测定蛋白浓度。
3、蛋白免疫印迹分析(Western Blot)10ug核蛋白加入SDS凝胶加样缓冲液25ul煮沸后，经SDS-PAGE胶电泳分离后。将蛋白条样用电转移到硝酸纤维滤膜上，加特异性抗人c-Fos、c-Jun和GATA-2抗体(Santa Cruz)0.5ug/ml，室温结合反应1小时，加辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000稀释)，ECL发光剂(Amersham)作用1分钟，曝光1-10分钟，显影后用光密度扫描仪分析结果，同样实验重复三遍。结果     PDS处理细胞后核内c-Fos、c-Jun和GATA-2转录因子含量
1.c-Fos：HL-60、K562、CHRF-288和Meg-01四株细胞经PDS刺激处理后，Western Bolt显示核蛋白与c-Fos抗体结合反应带，经光密度扫描分析处理后，四株细胞的C-FOS转录蛋白含量高于未经处理的细胞为1.5-2.0倍。
2.c-Jun：HL-60、K562、CHRF-288和Meg-01四株，HL-60细胞表达c-Jun，且PDS刺激处理前后无变化。而K562、CHRF-288和Meg-01三株细胞表达很低，PDS处理后明显增加，经光密度扫描分析处理后，三株细胞的c-Jun转录蛋白含量高于未经处理的细胞，为2.0-3.0倍。
3.GATA-2：HL-60、K562、CHRF-288和Meg-01四株细胞经PDS刺激处理后，Western Bolt显示核蛋白与GATA-2抗体结合反应带，CHRF-288和Meg-01二株细胞的GATA-2转录蛋白含量是未经处理的细胞1.4-1.8倍。
生长因子、细胞因子和其他细胞外信号分子可诱导细胞增殖、分化以及功能和行为的改变。这种细胞对外环境的反应具有重要的生物学意义，需要经过一系列复杂的信号传递和基因调控程序，包括信号分子与表面受体和配体的结合，进而触发特定的细胞内信号传递途径，并启动基因转录和表达。因此，细胞内信号传递途径作为连结细胞表面和细胞核内目的基因的桥梁。
经PDS刺激处理后，HL-60、K562、CHRF-288和Meg-01细胞的c-Fos蛋白含量高于未经处理细胞。K562、CHRF-288和Meg-01细胞的c-Jun表达明显增加。而GATA-2仅在PDS处理的巨核细胞CHRF-288和Meg-01蛋白含量高于未经处理细胞。这些结果提示PDS分别通过诱导c-Fos、c-Jun和GATA-2转录调控蛋白而刺激造血细胞增殖，从分子水平证明PDS的类生长因子效应。红系、粒系和巨核系三种系列细胞核内转录调控蛋白本身表达高低的不同，以及对PDS的敏感性程度不同，这是由于系列的特异性所致。

Claims (3)

1.人参二醇组皂甙及其组合物在制备治疗血液病的药物中的应用，其特征是：该组合物包括人参二醇组皂甙、药用载体和/或药用赋形剂，以及该组合物在制备治疗血液病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的人参二醇组皂甙及其组合物在制备治疗血液病的药物中的应用，其特征是：该组合物主要是在制备治疗原发性血细胞、血小板减少症及继发性血细胞、血小板减少症的药物中的应用。
3.如权利要求1和2所述的人参二醇组皂甙及其组合物在制备治疗血液病的药物中的应用，其特征是：该组合物还在制备因造血细胞缺乏引起的相关的疾病及症状的药物中的应用。
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