CN107582566A - 通过多胺化合物调控自身免疫性疾病的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供通过多胺化合物调控自身免疫性疾病的方法和组合物。具体地，本发明提供经过多胺化合物处理的巨噬细胞以及相应的细胞制剂，以及通过上调体内精氨酸酶水平的组合物或者下调体内精氨酸水平的组合物。本发明的制剂和组合物可用于治疗多发性硬化，能通过显著减少炎性细胞浸润，下调促炎性的细胞因子水平来抑制炎症反应，从而减轻中枢神经系统的炎症细胞浸润与脱髓鞘程度，降低多发性硬化发病率和减轻病情。

Description

通过多胺化合物调控自身免疫性疾病的方法和组合物

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域，更具体地，本发明涉及多胺化合物调控自身免疫的方法和组合物。

背景技术

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种典型的中枢神经系统(centralnervous system，CNS)白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫病，是由T细胞介导的免疫耐受紊乱进而导致神经髓鞘和轴索发生炎性损害,主要由于免疫细胞穿越血脑屏障后引起的炎症、脱髓鞘、神经胶质过多症等造成神经信号传导受阻。病变呈多灶性，累及白质、视神经、脊髓传导束、脑干和小脑。患者常伴有疲劳、肢体无力、痉挛状态、感觉障碍、疼痛、小脑共济失调、震颤、视力障碍、眼肌麻痹、自主神经功能障碍及心理障碍，涵盖了从脊髓到大脑皮质的中枢神经系统损伤所导致的各种症状，并伴随着病情加重和缓解的反复发作过程。

流行病学调查显示MS在全球的患者超过200万例，北美洲约有40万例患者，在我国约有6.5万例患者，女性患者多于男性患者，通常多发于20～40岁年龄段的人群,正值对社会和家庭起主要贡献的时期，对个人和社会都带来严重的经济负担，并且25年后大约有50％的患者会永久瘫痪。因为其发病率较高，慢性病程并倾向于年轻人罹患，所以已经成为最重要的神经系统疾病之一。

到目前为止，该病的诱因及发病机制仍然不明确，研究推测，该病可能是由于遗传易感个体在受到环境因素作用下发生的神经免疫过程。多发性硬化名称中的多发性除了暗示基因环境诱发的多样性，同时也表明了在发病过程中复杂多样的细胞类群参与其中。

目前对于多发性硬化的治疗仍是亟待解决的难题，近年来的治疗实验大多基于抗炎和免疫抑制药物，只能一定程度上缓解疾病的症状，并不能使疾病得到治愈。现在经过FDA批准可用于治疗MS的药物主要有促肾上腺皮质激素(1978年)，免疫调节剂干扰素IFN.β1b(Betaseron，1993年)、IFN.β1a(Avonex，1996年；Rebif，1997年)、glatiramer acetate(Copaxone，1997 年)，主要用于复发型MS治疗。米托蒽醌(Mitoxantrone，2000年)用于进展型MS的治疗，具有延缓病程进展的作用。单克隆抗体那他珠单抗(Natal izumab)为获FDA批准的第6个MS治疗药物。

但是，所有这些药物都有显著的局限性，临床对照研究证明，促肾上腺皮质激素、甲泼尼龙、泼尼松、环磷酰胺和干扰素对改善临床和MRI病损作用良好。其中皮质类固醇激素长期使用副作用大，不能改变病程，而且对于病残程度及恶化率并无作用。在抗炎因子的干预下，患者从每次发作中恢复的速度加快。但在急性恶性型MS，大部分患者抗炎治疗是无效的；少数患者疗效仅能维持1个月余。目前，米托蒽醌是用于进展型或恶化型MS的治疗药物，但长期使用造成严重的骨髓抑制，胃肠道出血、粘膜炎和胃炎。而其他各种免疫抑制剂如环磷酰胺、甲氨蝶呤、他汀类药物等也具有一定的副作用。

因此，本领域迫切需要开发新的有效治疗多发性硬化的药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一类新的有效治疗多发性硬化的药物及其治疗方法。

在本发明的第一方面，提供了一种组合物，所述组合物含有：

(a)巨噬细胞；(b)多胺化合物，其中所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺、或其组合；和(c)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的巨噬细胞来自人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的巨噬细胞是自体或异体的。

在另一优选例中，所述的组合物中，(a)巨噬细胞和(b)多胺化合物的之比为：1×10⁵-1×10⁷个巨噬细胞：2-50×10^-9摩尔的多胺化合物；较佳地,2×10⁵-5×10⁶个巨噬细胞：5-40×10^-9摩尔的多胺化合物；更佳地，5×10⁵-2×10⁶个巨噬细胞：10-30×10^-9摩尔的多胺化合物。(即在2毫升液体中，巨噬细胞数量为1×10⁵-1×10⁷个(较佳地2×10⁵-5×10⁶个,更佳地5×10⁵-2×10⁶个)，而亚精胺浓度为2-50μM，较佳地为5-40μM，更佳地10-30μM)。

在另一优选例中，所述的组合物为液体剂型。

在另一优选例中，所述的组合物为细胞制剂。

在本发明的第二方面，提供了一种组合物，所述的组合物含有：(i)巨噬细胞，其中所述的巨噬细胞是经多胺化合物处理的，其中所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合；和(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的经多胺化合物处理的是用以下步骤进行处理：

(1)将所述的巨噬细胞与所述的多胺化合物进行接触，从而制得所述经多胺化合物处理的巨噬细胞。

在另一优选例中，在步骤(1)中，在2-50μM，较佳地5-40μM,更佳地10-30μM浓度下，进行接触。

在另一优选例中，所述的接触时间为8-48小时，较佳地16-24小时。

在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：

(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的巨噬细胞；

(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的多胺化合物，其中所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合；

或者所述的试剂盒包括：

(a2)A容器，以及位于所述A容器中的巨噬细胞，其中所述的巨噬细胞是经多胺化合物处理的，其中所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有说明书。

在另一优选例中，所述说明书记载了选自下组的一个或多个说明：

(a)用多胺化合物处理巨噬细胞的方法；

(b)将经多胺化合物处理的巨噬细胞进行施用的方法；

(c)将经多胺化合物处理的巨噬细胞用于治疗选自下组的疾病：多发性硬化、自身免疫性肠炎。

在本发明的第四方面，提供了一种多胺化合物的用途，所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合，并且所述的多胺化合物用于调控巨噬细胞的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。

在另一优选例中，所述的“调控巨噬细胞”包括：通过下调NF-κB通路抑制M1型巨噬细胞的炎症因子的分泌；通过上调I型精氨酸酶(arginase 1)促使巨噬 细胞向抑炎性巨噬细胞转变继而发挥免疫调节作用。

在本发明的第五方面，提供了本发明第一方面和第二方面所述的组合物、或第三方面所述的试剂盒的用途，它们被用于(a)制备治疗和预防多发性硬化的药物；和/或(b)制备降低体内微环境中精氨酸浓度的药物。

在本发明的第六方面，提供了一种多胺化合物的用途，所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合，并且所述的多胺化合物用于制备上调(或促进)精氨酸酶的促进剂。

在另一优选例中，所述的上调包括：促进精氨酸酶的表达，和/或提高精氨酸酶的活性。

在另一优选例中，所述的上调包括：促进巨噬细胞中精氨酸酶的表达，和/或提高巨噬细胞中精氨酸酶的活性。

在另一优选例中，所述的上调精氨酸酶的促进剂还用于治疗多发性硬化。

本发明的第七方面，提供了一种制备经调控的巨噬细胞的方法，包括

(a)提供巨噬细胞；

(b)在体外，将所述的巨噬细胞与多胺化合物接触，其中所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合，从而制得经多胺化合物处理的巨噬细胞。

本发明的第八方面，提供了一种精氨酸酶的用途，用于制备治疗多发性硬化的药物或药物组合。

本发明的第九方面，提供了一种治疗多发性硬化方法，包括步骤：

给需要治疗的对象施用按照本发明第七方面所述方法制备的巨噬细胞，或施用含有巨噬细胞和多胺化合物的组合物。

本发明的第十方面，提供了一种降低体内微环境中精氨酸水平的方法，包括步骤：

给需要治疗的对象施用多胺化合物，其中，所述的多胺化合物选自下组：腐 胺、亚精胺、精胺或其组合。

本发明的第十一方面，提供了一种上调体内精氨酸酶的方法，包括步骤：

给需要治疗的对象施用多胺化合物，其中，所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了亚精胺治疗EAE小鼠临床评分及发病统计。(A、B)对照组和亚精胺治疗组EAE评分。(B)统计对照组和亚精胺治疗组EAE小鼠的发病情况。*p<0.05，T检验。

图2显示了EAE小鼠病理学检测。在免疫后第18天，分别取出对照组和亚精胺治疗组EAE小鼠的脊髓。用H&E和Luxol fast blue染色进行脊髓炎症浸润及脱髓鞘病理学分析。

图3显示了EAE小鼠免疫学特性分析检测。在免疫后第18天，分别取出对照组和亚精胺治疗组EAE小鼠的脊髓。免疫荧光染色分析浸润的CD4⁺T细胞和CD11b⁺巨噬细胞。

图4显示了EAE小鼠单核细胞分析检测。在免疫后第18天，分别取出对照组和亚精胺治疗组EAE小鼠的脊髓。(A)脊髓中单核细胞浸润数目统计。(B)脊髓中T细胞，B细胞，巨噬细胞的浸润细胞数量统计。(C)CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞，B细胞和巨噬细胞在脾脏细胞中的分布比例及(D)绝对数量统计。*p<0.05；**p<0.01。

图5显示了EAE小鼠中CNS辅助性T细胞亚群分析。(A)流式细胞仪分析对照组和亚精胺治疗组EAE小鼠中CNS和外周脾脏细胞的Th1、Th17和Treg细胞亚群的比例。(B)统计分析两组EAE小鼠CNS的Th1、Th17和Treg细胞亚群的绝对数量。*p<0.05；**p<0.01。

图6显示了EAE小鼠自身反应性T细胞的MOG增殖反应和细胞因子表达水平。在免疫后18天分别从对照组和亚精胺治疗组的EAE小鼠中分离出脾脏细 胞，并对其加以MOG或者ConA刺激。(A)用[³H]参入标记检测刺激后的脾脏细胞增殖反应。(B)MOG刺激48h后细胞培养上清的细胞因子的表达水平。*p<0.05；**p<0.01。

图7显示了亚精胺干预T细胞过继转移模型。(A)分出第10天EAE小鼠脾脏细胞，在抗原MOG刺激存在的条件下，加入亚精胺干预，三天后分出致病性T细胞，过继转移给辐照后的受体小鼠，每天评分。(B)分别从对照组和亚精胺治疗组分出第15天的EAE脾脏细胞，在MOG刺激3天后分出致病性T细胞，过继转移给辐照后的受体小鼠，每天评分。

图8显示了流式细胞分析亚精胺治疗和对照组EAE小鼠脾脏中抗原递呈细胞的分化比例。

图9显示了亚精胺治疗巨噬细胞去除EAE模型。(A)流式细胞仪分析脊髓和脾脏细胞中CD11b⁺细胞在给予氯磷酸盐脂质体48小时后的比例变化。(B)使用相同的剂量和给药方式分别于第3，7，9，11天静脉给予EAE小鼠氯磷酸酸盐脂质体。然后在第11天给予亚精胺治疗，观察四组临床评分。(C)用[³H]参入标记检测刺激后的脾脏细胞增殖反应。

图10显示了亚精胺治疗EAE小鼠巨噬细胞抑制T细胞增殖反应。(A)用[³H]参入标记检测刺激CD4T细胞和对照组或者亚精胺治疗组巨噬细胞共培养的增殖反应及炎症因子的分泌。(B)用[³H]参入标记检测刺激对照组或者亚精胺治疗组EAE的CD4T细胞和巨噬细胞共培养的增殖反应及炎症因子的分泌。(C)抑炎因子表达的检测。(D)用[³H]参入标记检测刺激CD4T细胞和对照组或者亚精胺治疗组巨噬细胞在不同抗原浓度条件下共培养的增殖反应。*p<0.05；**p<0.01。

图11显示了亚精胺治疗后EAE小鼠巨噬细胞极化状态分析。(A)流式细胞分析两组EAE小鼠CD11b⁺巨噬细胞中共刺激分子的表达水平。(B)多功能悬液芯片分析两组EAE小鼠CD11b⁺巨噬细胞中炎症因子的表达水平。(C)荧光定量分析两组EAE小鼠CD11b⁺巨噬细胞中M1/M2基因的表达水平。

图12显示了亚精胺干预后巨噬细胞对EAE小鼠的保护作用。(A)分出经过亚精胺干预后EAE小鼠的脾脏巨噬细胞对受体EAE的治疗作用，以及治疗后受体小鼠(B)致病性T细胞增殖能力降低(C)炎症因子分泌水平降低(D)中枢神经系统淋巴细胞浸润数目降低。*p<0.05；**p<0.01。

图13显示了巨噬细胞的免疫抑制性由arginase 1所介导。(A)免疫印迹 检测经过亚精胺处理后的脾脏巨噬细胞的arginase1的表达水平。(B)nor-NOHA逆转了亚精胺处理后骨髓巨噬细胞对T细胞的增殖能力的抑制作用。(C)nor-NOHA逆转了亚精胺处理后脾脏巨噬细胞对EAE小鼠的治疗作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，用多胺化合物对巨噬细胞进行处理，可以显著调节巨噬细胞的亚型并在自身免疫疾病中具有免疫抑制功能。此外，经亚精胺处理的巨噬细胞中的I型精氨酸酶(arginase I)的表达显著上调。据此，申请人开发了新的通过巨噬细胞来治疗多发性硬化等自身免疫性疾病的药物和方法。此外，还提供了通过下调体内精氨酸水平的组合物来治疗多发性硬化等自身免疫性疾病的药物和方法。在此基础上完成了本发明。

具体地，在多发性硬化的动物模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(EAE)中，通过施用经亚精胺处理的巨噬细胞或者通过上亚精胺调体内精氨酸酶水平或者下调体内精氨酸水平后，经多胺类化合物(如亚精胺)处理，动物模型体内的炎性细胞浸润减少，促炎性的细胞因子水平得到下调，因而炎症反应受到抑制，从而中枢神经系统的炎症浸润与脱髓鞘程度减轻，发病率明显降低并且病情明显减轻。

此外，还观察到：经亚精胺处理的巨噬细胞能通过抑制NF-κB信号通路：影响IκB的磷酸化和降解，同时抑制转录激活所需的p65的磷酸化(ser536)，从而抑制作为T细胞激活所需的“第二信号”的众多炎症因子和共刺激分子的基因转录，来达到抑制致病性T细胞的激活，继而抑制巨噬细胞的抗原递呈能力，使EAE小鼠体内的促炎性M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，从而达到通过调控EAE小鼠体内的巨噬细胞极化来缓解EAE病理症状，具体表现为中枢神经系统的炎症浸润与脱髓鞘程度减轻，发病率明显降低并且病情明显减轻。因此，经过亚精胺处理的巨噬细胞具有免疫抑制功能，对EAE具有显著的预防和治疗作用。

另一方面，在经亚精胺处理的巨噬细胞中，I型精氨酸酶(arginase I)的表达上调，继而削弱T细胞的CD3ξ链，影响T细胞共刺激信号；同时高表达的精氨酸1酶可通过耗竭微环境里精氨酸来降低精氨酸水平，阻碍T细胞的激活和增殖。

因此，本发明提供了新的通过多胺化合物(如亚精胺)和巨噬细胞等新的治疗多发性硬化等自身免疫性疾病的治疗手段。

巨噬细胞

巨噬细胞是机体内天然免疫系统中的重要组成部分之一。来源于骨髓系前体细胞的单核细胞在外周循环过程中进行分化，当定居到外周组织后逐渐分化成熟为组织巨噬细胞或者驻留巨噬细胞。通常而言，巨噬细胞的功能受到多种因素的调控，例如病原体的侵入，体内坏死细胞的残留，周围细胞分泌的细胞因子等的刺激，都将会导致巨噬细胞的吞噬能力，细胞因子及趋化因子的分泌能力，抗原加工递呈能力等发生明显变化，这种变化过程即为巨噬细胞的激活过程。

作为异质性和可塑性极强的巨噬细胞，由于其组织分布、分化程度和外来激活因子的多样性使得巨噬细胞具有复杂的表性可变性和功能多样性，因此巨噬细胞同样具典型的极化现象。根据细胞因子和对微生物的反应性的不同，巨噬细胞接受不同的激活信号，根据功能的不同大致分为两类：经典激活的巨噬细胞(classical activated macrophages,M1)及替代激活的巨噬细胞(alternatively activated macrophages,M2)。

在优选例中，所述的巨噬细胞来自哺乳动物，包括(但并不限于)：人、非人哺乳动物(如啮齿动物(例如大鼠、小鼠)、家畜、狗)等。

多胺化合物

如本文所用，术语“多胺”和“多胺化合物”可互换使用，指一类含有两个或更多个氨基的化合物。在本发明中，合适的多胺化合物没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：腐胺(putresc ine)，亚精胺(spermidine)，和精胺(spermine)、或其组合。

优选的多胺为精氨酸代谢的产物，例如腐胺、亚精胺、精胺、或其组合。

如本文所用，术语“亚精胺”指一种胺类物质，由其带正电荷的特性使其可以与众多带负电荷的蛋白或核酸结合，参与调节各种细胞生物学事件，如细胞增殖、细胞凋亡、自噬，细胞迁移等。可用于本发明的亚精胺等多胺化合物可以是合成的、或天然的(如提取的)。

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)

一种典型的中枢神经系统(central nervous system，CNS)白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫病，是由T细胞介导的免疫耐受紊乱进而导致神经髓鞘和轴索发生 炎性损害,主要由于免疫细胞穿越血脑屏障后引起的炎症、脱髓鞘、神经胶质过多症等造成神经信号传导受阻。病变呈多灶性，累及白质、视神经、脊髓传导束、脑干和小脑。患者常伴有疲劳、肢体无力、痉挛状态、感觉障碍、疼痛、小脑共济失调、震颤、视力障碍、眼肌麻痹、自主神经功能障碍及心理障碍，涵盖了从脊髓到大脑皮质的中枢神经系统损伤所导致的各种症状，并伴随着病情加重和缓解的反复发作过程。

流行病学调查显示MS在全球的患者超过200万例，北美洲约有40万例患者，在我国约有6.5万例患者，女性患者多于男性患者，通常多发于20～40岁年龄段的人群,正值对社会和家庭起主要贡献的时期，对个人和社会都带来严重的经济负担，并且25年后大约有50％的患者会永久瘫痪。因为其发病率较高，慢性病程并倾向于年轻人罹患，所以已经成为最重要的神经系统疾病之一。

实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)

EAE一种由同种型、同种异型或异种异型动物神经脑组织或其中多肽成分诱导的一种以特异性致敏的T细胞介导为主伴随有中枢神经系统内出现单个核细胞浸润以及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病。由于EAE具有与人类多发性硬化相似的免疫学及病理学特征，所以已经作为人MS的动物模型，被广泛运用并为人们研究治疗多发性硬化提供重要的科研工具。EAE的发病和恢复机制也同样是目前研究自身免疫疾病的热点。EAE通常是由注射中枢神经系统的主要抗原或者是主要的肽段诱发易感动物的自身免疫性疾病的发生。主要抗原有髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(myel in ol igodendrocyte glycoprotein，MOG)、髓磷脂相关糖蛋白(myel in assoc iated glycoprotein，MAG)等。这种由自身抗原诱导激活T细胞引发的EAE叫主动免疫EAE(active EAE),同时，也可通过接受EAE动物的致敏T细胞而诱导发生(即过继转移,pass ive EAE)。制备模型主要选用的动物有B6，C3H/HeJ，SJL/J，B10PL，PL/J小鼠，Hartley，Strainl3豚鼠及新西兰白兔等，均能诱导出EAE。EAE作为人类MS的动物模型已被广泛应用，为研究和防治MS疾病提供了重要信息。

精氨酸与I型精氨酸酶(Arginase 1)

精氨酸酶的活性是调控精氨酸向鸟氨酸转换并进入尿素循环的重要因素之一。精氨酸是体内的半必须氨基酸，正常细胞可通过自身胞内代谢产生，也可以通过吸收细胞外的精氨酸维持自身正常代谢。通过对精氨酸的消耗也是机体进化过程 中调控免疫反应的方式之一。在一些生物niche或者简单微生物中，通过对精氨酸的剥夺可以控制机体的生长，这种通过氨基酸饥饿方式控制生长是进化过程中的自然法则之一。肿瘤细胞由于缺少精氨基琥珀酸合酶，所以在肿瘤细胞生长过程中精氨酸的需求依赖于胞外的精氨酸含量，这种特质叫精氨酸营养缺陷型。因此，精氨酸的代谢途径可以作为治疗精氨酸依赖性肿瘤的靶点，如肝细胞癌、膀胱癌、淋巴瘤等等。在哺乳动物中的髓系细胞中，例如巨噬细胞，可以利用精氨酸饥饿方法控制T淋巴细胞的增殖，抑制T细胞的功能，下调IFN-γ的分泌。因此有研究报道，通过加强髓系细胞中arginase 1的活性可以抑制免疫反应进程而缓解慢性免疫疾病。

辅助性T细胞(T helper cells,Th cells)

T细胞一旦激活，可以分化出不同的专属效应细胞，其中辅助性T细胞传统上分为Th1和Th2两种亚型。Th1负责清理细胞内病原体，Th2主要识别外来感染。研究人员先后发现一群分泌IL-17的致病性T细胞和一群表达FOXP3的调节性T细胞(Treg)，其中Treg能够抑制B细胞的免疫球蛋白的生成，在自身免疫性疾病的恢复中发挥重要作用。随着研究的深入以及动物模型的建立，已然证明T淋巴细胞受体(T cell receptor,TCR)可能识别巨噬细胞和星形细胞的主要有组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)和抗原的结合物。这种相互作用使得T细胞活化增殖，激活包括B细胞，巨噬细胞，树突状细胞等引发细胞免疫连锁反应，同时分泌杀伤性细胞因子(IFN-b、IFN-g、IL-17)。这些细胞免疫反应伴随着血脑屏障功能的破坏，导致少突胶质细胞和髓鞘的损伤。这些研究发现表明T细胞是介导自身免疫反应的主要功能细胞之一，也是能够使炎症持续存在的潜在机制。

药物组合物和给药方式

本发明还提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物可以是治疗性的或预防性的。

本发明的药物组合物包括有效量的本发明的经多胺化合物处理过的巨噬细胞，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

优选的组合物为液体制剂，尤其是当活性成分为巨噬细胞时。在制备这些组合物时，通常将活性成分(巨噬细胞)与液态赋形剂混合，形成药物组合物。

当活性成分为多胺化合物时，在制备这些组合物时，通常将活性成分(多胺化合物)与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。 当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。

配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮内、或局部给药。

对于含细胞的组合物，优选形式为液态剂型。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明经多胺化合物处理过的巨噬细胞施用于人，其中该安全有效量通常为10⁵-10¹¹细胞/人/次，更佳地为10⁶-10⁹细胞/人/次。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

此外，本发明的经多胺化合物处理过的巨噬细胞还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)：免疫调节剂干扰素IFN-β1b、IFN-β1a、glatiramer acetate、米托蒽醌、单克隆抗体那他珠单抗、促肾上腺皮质激素、甲泼尼龙、泼尼松、环磷酰胺、甲氨蝶呤、免疫球蛋白、他汀类药物、等各类药物。

本发明的主要优点包括：

1.经过亚精胺处理的巨噬细胞可有效地降低致病性T细胞的激活程度，从而达到预防或治疗自身免疫疾病，如降低多发性硬化的发生以及缓解多发性硬化进展过程。

2.通过上调体内精氨酸酶水平或者下调体内精氨酸水平的方式，可预防和治疗多发性硬化，从而达到降低多发性硬化的发生以及缓解多发性硬化进展过程。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

EAE动物模型的建立：

EAE模型的建立和给药:免疫当天(第0天)，每只小鼠背部给予200μl乳化好的抗原皮下两点注射免疫，每侧100μl，同时每只小鼠给予PT 200μl，尾静脉注射。免疫第2天，每只小鼠再次给予PT 200μl，尾静脉注射。预防治疗：在免疫当天，处理组小鼠每只腹腔给药亚精胺50mg/kg，持续给药观察；疾病治疗：EAE小鼠开始发病，即第11天，小鼠尾巴开始出现无力下垂时给药，处理组小鼠每只腹腔给药亚精胺50mg/kg，持续给药观察实验；对照组小鼠注射相应的PBS溶液。本课题中，除了最初的验证亚精胺功效实验外，全部采用治疗方式，即第11天开始给药治疗。

EAE临床评分标准：0分：无异常表现，正常；1分：尾部无力下垂，瘫痪；2分：后肢受累无力，跛行；3分：后肢完全瘫痪；4分：双后肢完全瘫痪并前肢受累；5分：死亡(80)。

实施例2

巨噬细胞过继转移EAE模型实验:

①巨噬细胞过继转移模型建立

首先对供体野生型C57BL/6小鼠诱导EAE模型，在疾病开始出现症状时(第12天)给予亚精胺治疗，在免疫第17天后，取出两组EAE小鼠的脾脏细胞，并用CD11b microbeads(Miltenyl Biotech)分选出CD11b+巨噬细胞。并将两组分选出来的巨噬细胞分别以1x10⁷个细胞/ml的浓度以及PBS对照从尾静脉打入同批诱导的野生型EAE小鼠体内(此时受体EAE小鼠是免疫后的第10天)，然后每天观察这三组受体小鼠的疾病发生发展情况，并计分。

②巨噬细胞过继转移分子机制确立

诱导供体野生型C57BL/6小鼠EAE模型，在诱导后第12天给予亚精胺治疗，在免疫第17天后，取出两组EAE小鼠的脾脏细胞，并用CD11b microbeads(Mi ltenyl Biotech)分选出CD11b+巨噬细胞。并将分选出来的两组脾脏巨噬细胞各分为两组，一组为正常培养基培养处理，另外一组加入100μM的nor-NOHA孵育过夜处理。12小时过后，分别将四组巨噬细胞分别以2x10⁶个细胞/只的浓度以及PBS对照从尾静脉打入同批诱导的野生型EAE小鼠体内(此时受体EAE小鼠是免疫后的第10天)，然后每天观察这五组受体小鼠的疾病发生发展情况，并计分。

实施例3

T细胞过继转移建立EAE模型:

EAE模型不仅可以通过用抗原直接免疫，也可以通过过继转移致病性T细胞建模成功。在这里，我们首先对供体野生型C57BL/6小鼠诱导EAE模型，10天后，我们分离出EAE小鼠的脾脏细胞，并在体外用一组用20μg/ml MOG 35-55刺激培养三天，另外一组用20μg/mlMOG 35-55加上10μM亚精胺处理三天。72小时后，分出CD4+T细胞，并尾静脉给予受体小鼠3×10⁶个细胞/只，受体小鼠受过400cGy的半致死剂量的辐照。每只小鼠并于T细胞过继转移的第0天和第2天给予PT 200μl PT处理，以确保打开血脑屏障。然后每天观察受体小鼠的疾病发生发展情况，并计分。

另外，可以从主动免疫的EAE小鼠或者接受亚精胺治疗过后的EAE小鼠分出脾脏细胞，两组分别用20μg/ml MOG 35-55刺激培养72小时，过后同样分出致病性T细胞，过继转移给接受过辐照的受体小鼠，然后每天观察受体小鼠的疾病发生发展情况，并计分。

实施例4

巨噬细胞去除模型建立:

为了选择性去除巨噬细胞，在第7，9，11，13天给予EAE小鼠腹腔注射输注1mg氯膦酸脂质体，亚精胺治疗组仍是疾病开始时，即第11天后开始给药。依然每天观察并记录小鼠的疾病发生发展情况，并于第15到18天之间取材进行病理检测。

实施例5

观察给予亚精胺干预后对EAE模型的疾病发展:

用C57BL/6小鼠诱导经典的EAE疾病模型，并于诱导后第一天腹腔给予亚精胺。

结果：如图1A所示，对照组小鼠在免疫后第9天开始发病，而亚精胺处理组小鼠延迟2天即在第11天才开始发病，随后的疾病发展也较对照组小鼠缓慢，临床评分明显低于对照组。

于EAE小鼠开始发病当天再给予亚精胺治疗。

结果：亚精胺对其亦有显著地治疗作用，具体表现为临床病症评分的下降(图1B)；进一步统计治疗前后两组小鼠的发病率，发现经亚精胺处理后，EAE小鼠的发病率也明显低于对照组(图1C)。

实施例6

观察给予亚精胺干预处理后EAE模型的病理特征:

在免疫后的第18天，取出亚精胺治疗组及对照组的脊髓，用Luxol fast blue染色和H&E染色进行病理分析。

结果：未经治疗的对照组，脊髓髓鞘形态遭到破坏，周围的蓝色部分有明显的空泡状缺失，出现了严重的脱髓鞘现象，同时伴有大量的炎症细胞浸润。而经过亚精胺治疗后，脊髓的髓鞘形态保持完整，并且未见明显炎症细胞的浸润(图2)。

实施例7

亚精胺对EAE疾病中细胞亚型的影响分析:

在免疫后第18天，分别取出对照组和亚精胺治疗组EAE小鼠的脊髓。免疫荧光染色分析浸润的CD4⁺T细胞和CD11b⁺巨噬细胞。

结果：经过亚精胺治疗后，炎症T细胞和巨噬细胞的浸润都有明显的下降(图3)。

通过对亚精胺处理组及对照组EAE小鼠脊髓采用percoll进行单个核细胞的分离检测。

结果：亚精胺处理组小鼠的单个核细胞浸润数量显著低于对照组(图4中A)。

同时，采用流式细胞仪分析检测各个细胞亚群的变化，其中亚精胺处理组中的CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞和巨噬细胞的浸润低于对照组，这与免疫荧光的结果相吻合(图4中B)；经过亚精胺干预后，脾脏中浸润的T细胞亚群和浸润的单核巨噬细胞亚群的比例和数量都得到显著下调(图4中C、4中D)。

实施例8

亚精胺对EAE小鼠体内辅助性T细胞亚群的影响:

采用流式细胞仪技术分别分析了亚精胺治疗组和对照组中EAE体内，位于外周淋巴系统脾脏中和浸润入中枢神经系统中的Th1、Th17和Treg细胞亚群的比例,并统计分析两组EAE小鼠CNS的Th1、Th17和Treg细胞亚群的绝对数量。*p<0.05；**p<0.01。

结果：尽管中枢神经系统中浸润的Th1和Th17细胞数量在治疗组中有所下降，但两组EAE小鼠的T细胞亚群在所有CD4⁺T细胞中的比例没有明显区别(图5A,5B)。

实施例9

观察亚精胺对EAE疾病中自身反应性T细胞的MOG反应性和细胞因子分泌:

在免疫后18天分别从对照组和亚精胺治疗组的EAE小鼠中分离出脾脏细胞，并对其加以MOG或者ConA刺激。用[³H]参入标记检测刺激后的脾脏细胞增殖反应。

结果显示，在相同浓度的抗原刺激下，与对照组EAE小鼠相比，亚精胺处理组小鼠的脾脏T细胞的免疫反应性明显降低，而且这种差异是具有抗原特异性的，因为对于ConA的刺激，两组没有发现显著差异(图6中A)。

在体外用MOG抗原(20ug/ml)分别刺激亚精胺处理组和对照组的EAE小鼠体内的脾脏细胞，刺激48小时候收集细胞上清。

结果显示：其中经MOG刺激后分泌的致炎因子IFN-γ,IL-17,IL-2和IL-6在亚精胺处理组中明显下调(图6中B)。

实施例10

亚精胺的治疗效果不依赖于T细胞直接作用:

首先，分出主动免疫EAE小鼠第10天的脾脏淋巴细胞，在体外用抗原肽MOG重新激活，在此过程中加入亚精胺，三天后，分出致病抗原特异性CD4⁺T细胞并使用尾静脉输入相同数量的CD4⁺T细胞以转移到辐照后的受体小鼠中，每天评分。

结果：无论是否经过亚精胺体外干预，分出的致病性T细胞均能诱导出典型EAE疾病病症。两组分别于诱导后第7天发病，13天后达到病程高峰期，且两组的评分并无差异(图7A)。

分别从对照组和亚精胺治疗组分出第15天的EAE脾脏细胞，在MOG刺激3天后分出致病性T细胞，过继转移给辐照后的受体小鼠，每天评分。

结果：和(图7A)一致(图7B)。

实施例11

亚精胺干预EAE小鼠中抗原递呈细胞的功能变化:

采用流式细胞分析技术分析亚精胺治疗和对照组EAE小鼠脾脏中抗原递呈细胞的分化比例。

结果：在两组小鼠脾脏细胞中，CD11b⁺巨噬细胞的比例明显下调，而CD11c⁺树突状细胞和CD19⁺B细胞的比例没有明显变化(图8)。

实施例12

亚精胺的治疗效果依赖于巨噬细胞的存在:

给予小鼠1毫克氯磷酸酸盐脂质体，48小时后利用流式细胞仪分析小鼠脊 髓和脾脏细胞中CD11b⁺细胞的比例变化。

结果：小鼠脾脏和中枢神经系统已去除了70％-80％的巨噬细胞(图9A)。

使用相同的剂量和给药方式分别于第3、7、9、11天静脉给予EAE小鼠氯磷酸酸盐脂质体。然后在第11天给予亚精胺治疗，观察四组临床评分。

结果：由于外周脾脏中的巨噬细胞大量去除，向中枢神经系统中浸润的细胞数量相应降低，由此EAE的发病有所减轻。与此同时，再给予亚精胺治疗后，由于缺少功能靶向细胞，并不能进一步缓解EAE(图9B)。

利用[³H]参入标记检测抗原刺激后的脾脏细胞增殖反应。

结果：T细胞反应频率的趋势和相应的临床评分一致(图9C)。

实施例13

亚精胺干预后EAE小鼠中巨噬细胞的免疫抑制功能:

首先，于免疫后第15天分别从亚精胺治疗组和对照组EAE小鼠体内分出脾脏巨噬细胞，并和从EAE小鼠体内分出的致病性CD4⁺T细胞在MOG抗原的刺激下共培养，72小时候采用[H3]标记的胸腺嘧啶参入法测T细胞的反应频率，48小时收集共培养体系的上清，用多功能悬液芯片技术分析其炎症因子的产生情况。

结果：在EAE小鼠体内，由于受到亚精胺的治疗的影响，其相应的巨噬细胞功能已发生转变，体现于从亚精胺治疗小鼠体内分出的巨噬细胞能过降低特异性T细胞的增殖水平，并且相应的炎症因子，IL-1β，IL-12，IL-2和TNF-α水平都明显低于对照组(图10A)。

相反，若是分别分离出亚精胺治疗组和对照组EAE小鼠体内的CD4⁺T细胞并和相同的脾脏巨噬细胞共培养，则T细胞反应频率并不因其经过亚精胺处理而产生变化，同样促炎因子的分泌也不受到影响(图10B)。

同时分析了共培养条件下抑炎因子IL-10和TGF-β的分泌情况，结果显示在不同处理条件下并无改变(图10C)。

将经过亚精胺干预后的EAE小鼠来源的巨噬细胞以0:1、0.5:1、1:1、2:1的比例与正常EAE来源的CD4+T细胞混合培养，在抗原MOG的刺激下，同样亚精胺来源的巨噬细胞能够递呈MOG抗原，并剂量依赖的抑制特异性T细胞的增殖(图10D)。

实施例14

亚精胺治疗后EAE小鼠体内巨噬细胞活化状态的改变:

将亚精胺治疗组和对照组中的脾脏巨噬细胞和脊髓中浸润的巨噬细胞分离出来，用流式细胞分析检测CD11b⁺细胞的CD80和CD86；

结果：B7分子在脾脏和脊髓的巨噬细胞中的表达都在治疗组中得到下调(图11A)。

从亚精胺治疗组和对照组中分离出脾脏巨噬细胞，并用LPS刺激24小时后收集细胞上清，利用多功能悬液芯片分析炎症因子的表达情况。

结果：促炎因子IL-1β，IL-12，IL-6和TNF-α的表达量经过亚精胺的干预后都得到了显著的下调，而IL-10和TGF-β的含量并没有明显改变(图11B)。

将亚精胺治疗组和对照组EAE小鼠体内的脾脏巨噬细胞分出来，利用荧光定量分析两组EAE小鼠CD11b⁺巨噬细胞中M1/M2基因的表达水平。

结果：Il6,Il1b和Il12表达量明显下调，而一些M2特异性基因Arg1,Retnla和Ym1表达量明显上调(图11C)。

实施例15

亚精胺干预后巨噬细胞对EAE小鼠的治疗作用:

于诱导第15天后，从亚精胺治疗组和对照组中分离出脾脏巨噬细胞，以1x10⁷个细胞的剂量通过尾静脉注射的方式分别在免疫后第10天打入两组正常MOG免疫的EAE小鼠体内，并用PBS注射组作为对照，观察这三组的临床表现。

结果：与注射PBS的受体EAE小鼠相比，接受来自对照组来源的脾脏巨噬细胞注射的受体小鼠其临床病症有所轻微加重，而接受亚精胺治疗组的脾脏巨噬细胞注射的受体EAE小鼠，其临床病症的严重程度明显轻于其他两组受体小鼠(图12中A)。

检测接受不同来源巨噬细胞的受体EAE小鼠对自身特异性抗原的细胞反应频率和炎症因子表达水平。

结果：在相同浓度的抗原刺激下，接受来自经过来自亚精胺干预的巨噬细胞的EAE小鼠组对自身特异性抗原的细胞反应频率(图12中B)和炎症因子IL-1β,IL-12和IL-17的表达明显低于对照受体EAE小鼠(图12中C)。同时，治疗后的EAE小鼠中枢神经系统中浸润的淋巴细胞数量也显著降低(图12中D)。

实施例16

亚精胺通过Arginase 1介导巨噬细胞的免疫抑制作用:

从EAE小鼠中分出脾脏淋巴细胞然后用抗原MOG刺激，并加以亚精胺干预，24小时候分出巨噬细胞用免疫印迹法检测I型精氨酸酶(arginase 1)的表达含量。

结果：亚精胺能够上调I型精氨酸酶的表达(图13A)。

同时采用了I型精氨酸酶的抑制剂，N^w-hydroxy-nor-L-arginine(竞争性底 物类似物)去抑制掉巨噬细胞中的I型精氨酸酶活性，观察亚精胺是否还能调控巨噬细胞的免疫抑制功能。首先，在体外诱导成熟的骨髓巨噬细胞，并用亚精胺或者亚精胺加上nor-NOHA预处理24小时后，然后在CD3/28的刺激下和T细胞共培养。48小时候采用[H3]标记的胸腺嘧啶参入法测T细胞的反应频率。

结果：经过抑制剂nor-NOHA的孵育后，本来经过亚精胺处理能够抑制T细胞增殖的效果被完全去除了，证明了I型精氨酸酶在巨噬细胞介导免疫抑制作用中的重要作用(图13B)。

于诱导第15天后，从亚精胺治疗组和对照组中分离出脾脏细胞，然后用亚精胺和nor-NOHA加亚精胺在MOG存在条件下孵育过夜，然后同样以1x10⁷巨噬细胞的剂量通过尾静脉注射的方式分别在免疫后第10天打入四组正常MOG免疫的EAE小鼠体内，并用PBS注射组作为对照，观察这五组的临床表现。

结果：经过抑制剂nor-NOHA的处理后，再接受亚精胺治疗组的脾脏巨噬细胞注射的受体EAE小鼠，其临床病症不能再具有改善作用，说明由于亚精胺调控起来的精氨酸酶1介导的巨噬细胞免疫抑制活性被去除(图13C)。

讨论

多胺，自然界中广泛存在的中间代谢产物，包括腐胺、亚精胺和精胺，除了对于细胞的生长增殖，胞内核酸、蛋白质的生物合成、修饰蛋白激酶等生物学调节功能有关联外，对于调控炎症反应也发挥了一定的作用。本案例中，给予EAE小鼠亚精胺治疗后能够缓解病理症状，表现为中枢神经系统的炎症浸润与脱髓鞘程度减轻，发病率明显降低，进一步研究证明，这种缓解作用是通过调控EAE小鼠体内的巨噬细胞极化实现的。具体而言，首先亚精胺能够通过下调巨噬细胞中NF-κB的活性进而降低其下游的炎症因子的表达量，抑制巨噬细胞的抗原递呈能力，使EAE小鼠体内的促炎性M1型细胞向M2型细胞转化，再间接对T细胞的增殖、功能造成影响，使得免疫环境从炎症激活状态转化到免疫抑制状态，疾病得到恢复。其次，经过亚精胺的干预后，脾脏巨噬细胞的arginase 1的表达量得到上调，进一步通过下调TCR量和氨基酸剥夺作用抑制了自身反应性的致病T细胞的增殖与功能。因此，本发明进一步证实，从亚精胺处理的EAE小鼠中分离获得的脾脏巨噬细胞具有免疫抑制功能，对EAE小鼠有显著的治疗作用。

本发明中，不仅证实了多胺类物质之一亚精胺对多发性硬化的动物模型EAE有显著的治疗效果，并清晰了亚精胺在调控巨噬细胞极化过程中的作用和其潜在分子机制。同时经过亚精胺干预过后的巨噬细胞由于其免疫功能的转变，对EAE小鼠具有细胞治疗的作用，这种单独用药处理或者将来的联合用药 方式为人们进一步寻找和发现多发性硬化的药物候选研究对象提供了生物学依据。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，所述的组合物含有：(a)巨噬细胞；(b)多胺化合物，其中所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺、或其组合；和(c)药学上可接受的载体。

2.一种组合物，其特征在于，所述的组合物含有：(i)巨噬细胞，其中所述的巨噬细胞是经多胺化合物处理的，其中所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合；和(ii)药学上可接受的载体。

3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(a1)第一容器，以及位于所述第一容器中的巨噬细胞；

(b1)第二容器，以及位于所述第二容器中的多胺化合物，其中所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合；

或者所述的试剂盒包括：

(a2)A容器，以及位于所述A容器中的巨噬细胞，其中所述的巨噬细胞是经多胺化合物处理的，其中所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合。

4.一种多胺化合物的用途，其特征在于，所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合，并且所述的多胺化合物用于调控巨噬细胞的组合物。

5.如权利要求1或2所述的组合物、或权利要求3所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于(a)制备治疗和预防多发性硬化的药物；和/或(b)制备降低体内微环境中精氨酸浓度的药物。

6.一种多胺化合物的用途，其特征在于，所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合，并且所述的多胺化合物用于制备上调精氨酸酶的促进剂。

7.一种制备经调控的巨噬细胞的方法，其特征在于，包括：

(a)提供巨噬细胞；

(b)在体外，将所述的巨噬细胞与多胺化合物接触，其中所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合，从而制得经多胺化合物处理的巨噬细胞。

8.一种精氨酸酶的用途，其特征在于，用于制备治疗多发性硬化的药物或药物组合。

9.一种治疗多发性硬化方法，其特征在于，包括步骤：

给需要治疗的对象施用按照权利要求7所述方法制备的巨噬细胞，或施用权利要求1或2所述的组合物。

10.一种降低体内微环境中精氨酸水平的方法，其特征在于，包括步骤：

给需要治疗的对象施用多胺化合物，其中，所述的多胺化合物选自下组：腐胺、亚精胺、精胺或其组合。