CN109953996A - 野黄芩苷在预防或治疗疾病的药物及调节剂中的应用、药物和调节剂 - Google Patents

野黄芩苷在预防或治疗疾病的药物及调节剂中的应用、药物和调节剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了野黄芩苷在预防或治疗疾病的药物及调节剂中的应用、药物和调节剂，涉及医药技术领域。本发明公开了野黄芩苷在制备预防或治疗疾病的药物中的应用，该疾病是由TNF与TNFR2的相互作用所引起或介导的。本发明的研究显示，野黄芩苷能够选择性地抑制TNF诱导的WEHI‑13v细胞死亡，且能明显抑制TNF诱导的Tregs增殖，并且伴随TNFR2和Foxp3在Tregs中的表达下调。这表明野黄芩苷可以用于治疗或预防由TNF与TNFR2的相互作用所引起或介导的相关疾病，本发明为预防或治疗TNF与TNFR2的相互作用所引起或介导的相关疾病提供了一种新的思路或手段。

Description

野黄芩苷在预防或治疗疾病的药物及调节剂中的应用、药物 和调节剂
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及野黄芩苷在预防或治疗疾病的药物及调节剂中的应用、药物和调节剂。
背景技术
CD4+Foxp3+调节性T细胞(Tregs)对维持免疫稳态至关重要，有利于治疗自身免疫性疾病。另一方面，它们也促进肿瘤生长和免疫逃避，以抑制抗肿瘤免疫反应。因此，在治疗阶段调节Treg以治疗一些疾病至关重要，如自身免疫性疾病，移植物抗宿主病和癌症。因此，了解Treg功能的调节是对Treg活性进行上调或下调从而达到治疗目的的先决条件。
TNF是一种多效的细胞因子，在免疫、炎症、细胞生长调节、肿瘤发生和自身免疫等中有多种功能。TNF通过结合TNFR1和 TNFR2两种不同的膜受体而激活并发挥作用。由于TNFR2在自然发生的Treg上表达的密度高于TNFR1，而且TNF能够通过TNFR2功能性刺激Tregs的扩张，TNF和TNFR2的相互作用对于治疗疾病至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供野黄芩苷在制备预防或治疗疾病的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供野黄芩苷在制备用于调节细胞增殖或死亡的调节剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种预防或治疗疾病的药物。
本发明的另一目的在于提供一种用于调节细胞增殖或死亡的调节剂。
本发明是这样实现的：
肿瘤坏死因子α(TNF-α)能通过肿瘤坏死因子受体II(TNFR2)，一个优先表达在Treg上的TNF受体之一，可以激活Tregs。 TNF-TNFR2相互作用在Treg功能中起着至关重要和决定性的作用，如果没有TNFR2的表达，Treg极少或没有抑制活性。TNF-TNFR2 相互作用对促进Treg增殖具有治疗作用，因此TNFR2可作为重要的标记物或靶点，通过针对TNFR2从而激活或抑制Treg的活性。
本发明的研究显示，野黄芩苷能够选择性地抑制TNF诱导的 WEHI细胞死亡，且能明显抑制TNF诱导的Tregs增殖，并且伴随 TNFR2和Foxp3在Tregs中的表达下调。这表明野黄芩苷可以用于治疗或预防由TNF与TNFR2的相互作用所引起或介导的相关疾病，例如用于治疗或预防由TNF与TNFR2的相互作用导致表达TNFR2 的细胞出现增殖或死亡所引起或介导的疾病。本发明为预防或治疗 TNF与TNFR2的相互作用所引起或介导的相关疾病提供了一种新的思路或手段。
基于此，本发明提出以下：
一方面，本发明提供了野黄芩苷或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗疾病的药物中的应用，所述疾病是由TNF与TNFR2的相互作用所引起或介导的。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述疾病是由TNF与 TNFR2的相互作用并导致表达TNFR2的细胞出现增殖或死亡所引起或介导的。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，表达TNFR2的细胞选自如下类型的细胞：调节性T淋巴细胞、内皮细胞、小胶质细胞、神经细胞、心肌细胞、少突胶质细胞、骨髓源性抑制细胞以及间充质干细胞。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述野黄芩苷通过阻断 TNF与TNFR2的相互作用以抑制调节性T淋巴细胞增殖进而起到预防或治疗所述疾病的作用。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述疾病选自：癌症、移植物抗宿主病和自身免疫性疾病。此外，其他一些由于TNF蛋白质表达异常导致的疾病，如糖尿病、动脉粥样硬化、感染性疾病、退行性病变等，也包括在内。
另一方面，本发明提供了野黄芩苷或其药学上可接受的盐在制备用于调节细胞增殖或死亡的调节剂中的应用，所述细胞为表达 TNFR2的细胞，所述细胞的增殖或死亡是由TNF与TNFR2的相互作用所引起或介导的。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，调节细胞增殖或死亡是指抑制细胞增殖或死亡。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述野黄芩苷通过阻断 TNF与TNFR2的相互作用以起到抑制细胞增殖或死亡的作用；
进一步地，在本发明的一些实施方案中，表达TNFR2的细胞选自如下类型的细胞：调节性T淋巴细胞、内皮细胞、小胶质细胞、神经细胞、心肌细胞、少突胶质细胞、骨髓源性抑制细胞以及间充质干细胞。
另一方面，本发明提供了野黄芩苷或其药学上可接受的盐作为 TNFR2的抑制剂的用途。
另一方面，本发明提供了野黄芩苷或其药学上可接受的盐作为TNFR2的抑制剂在制备一种用于抑制TNFR2的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了野黄芩苷或其药学上可接受的盐作为 TNFR2的抑制剂在制备一种用于抑制由TNF与TNFR2的相互作用的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了野黄芩苷或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗调节性T淋巴细胞激活相关的疾病的药物中的应用，其中，所述野黄芩苷或其药学上可接受的盐通过抑制TNFR2来预防或治疗调节性T淋巴细胞激活相关的疾病。
另一方面，本发明提供了一种预防或治疗疾病的药物，所述疾病是由TNF与TNFR2的相互作用所引起的，所述药物含有作为活性成分的野黄芩苷或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的辅料。
另一方面，本发明提供了一种用于调节细胞增殖或死亡的调节剂，所述调剂节含有野黄芩苷或其药学上可接受的盐，所述细胞为表达TNFR2的细胞，所述细胞的增殖或死亡是由TNF与TNFR2的相互作用所引起或介导的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1.TNF经由TNFR2诱导WEHI-13var细胞死亡。(A) Wehi-13var细胞表面TNFR1和TNFR2的表达。孵育24小时后收获细胞，其分别用PE-TNFR1或PE-TNFR2抗体或其同种型对照进一步标记。通过流式细胞仪分析TNFR1或TNFR2在WEHI-13var细胞上的表面表达。(B)TNF诱导的Wehi-13var细胞死亡由TNFR2介导。在存在或不存在TNFR1抗体或TNFR2抗体的情况下，用TNF处理 Wehi-13var细胞。对照组仅用培养基处理。TNFR2抗体显著阻断TNF 诱导的细胞死亡，而TNFR1抗体没有效果。**P<0.01，***P<0.001。
图2.CHI008特异性抑制TNF诱导的Wehi-13var细胞死亡。(A) 在TNF(100pg/ml)和放线菌素D(0.5μg/ml)的存在下，通过 WEHI-13var细胞筛选11种不同的中药注射液(CHIs，10μl/ml)，在 TNF刺激前，用CHI预处理细胞1小时。共孵育24小时后，将TNF 加CHIs组的细胞活力与单独的TNF组进行比较。与其他CHI相比， CHI008对TNF诱导的Wehi-13var细胞死亡具有强烈的抑制作用。 (B)在TNF(25pg/mL)和AcD存在下，用不同浓度(2.5-10μl/ml) 的CHI008处理Wehi-13var细胞，对照组用培养基处理。24小时后，将给药组的细胞活力与对照组进行比较。(C)Wehi-13var细胞的图像显示对照组和给药组组的细胞数量。给药组用TNF(25pg/ml)或 TNF加CHI008(10μl/ml)处理。(d)共培养24小时，在存在或不存在CHI008(10μl/ml)的情况下比较TNF(25pg/ml)加AcD(0.5μg/ ml)组和AcD单独组。***P<0.001。所示数据代表至少三个具有相似结果的独立实验(N＝3，平均值±SEM)。
图3.CHI008在体外抑制TNF诱导的Treg的扩增和Treg上 TNFR2表达的上调。通过MACS从正常C57BL/6J小鼠的淋巴结和脾中纯化CD4+T细胞。用CFSE标记细胞，并在IL-2(10ng/mL) 或IL-2+TNF(各10ng/mL)存在下，仅用培养基或用CHI008(20μl/ml) 培养。72小时后，基于CFSE表达和Foxp3表达，通过FACS分析 Tregs的增殖和Foxp3+细胞的比例。(A)在IL-2存在下，TNF优先刺激Tregs的增殖。(B)CHI008阻断TNF介导的Tregs增殖。(C) CHI008降低培养的CD4+T细胞中Tregs上的Foxp3表达。(D)Tregs 中TNFR2+细胞比例的典型FACS图。(E)CD4+Foxp3+Tregs中 TNFR2+细胞比例的总结。(F)Tregs上TNFR2表达的平均荧光强度 (MFI)的总结(通过在Foxp3+细胞上的圈门)(N＝3，平均值±SEM)。与“TNF+IL-2”组相比，**p<0.01，***p<0.001。所示数据是具有类似结果的至少三个单独实验的代表。
图4.CHI008中的主要化合物野黄芩苷特异性抑制TNF诱导的 Wehi-13var细胞死亡(A)野黄芩苷的化学结构。(B)在TNF(25 pg/mL)和AcD存在下，用浓度范围(12.5-200μM)的野黄芩苷处理 Wehi-13var细胞，对照组用培养基处理。24小时后，将处理组的细胞活力与对照组进行比较。(C)在存在或不存在野黄芩苷(50μM) 的情况下比较TNF(25pg/ml)加AcD(0.5μg/ml)组和AcD单独处理组。***P<0.001。所示数据代表至少三个具有相似结果的独立实验 (N＝3，平均值±SEM)。
图5.野黄芩苷在体外抑制TNF诱导的Tregs扩增和Tregs上 TNFR2上调表达。淋巴细胞在IL-2(10ng/mL)或IL-2+TNF(各 10ng/mL)存在下培养，单独培养基或用野黄芩苷(25-50μM)培养 72小时。(A)Tregs的典型FACS分析。所示数据是具有类似结果的至少三个单独实验的代表。FACS图中的数字显示了各个象限中细胞的比例。(B)CD4+细胞中CD4+Foxp3+细胞比例的总结。(C)Tregs 上Foxp3表达的平均荧光强度(MFI)总结。(D)Tregs中TNFR2+ 细胞比例的典型FACS图。(E)CD4+Foxp3+Tregs中TNFR2+细胞比例的总结。(F)Tregs上TNFR2表达的平均荧光强度(MFI)的总结 (通过在Foxp3+细胞上的圈门)(N＝3，平均值±SEM)。与“TNF+IL-2”组相比，**p<0.01，***p<0.001。所示数据是具有类似结果的至少三个单独实验的代表。
图6.野黄芩苷抑制LPS处理小鼠Tregs的扩增。向C57BL/6J小鼠注射200μgLPS(i.p)或生理盐水，并在LPS刺激后立即用或不用野黄芩苷(25或50mg/kg/d)进行治疗。将野黄芩苷溶解在生理盐水中。LPS处理后24小时处死所有小鼠，收集脾脏和淋巴结。通过FACS分析Foxp3在淋巴细胞中的比例和Tregs上TNFR2表达，对Foxp3+ 细胞进行圈门。(A)淋巴细胞中Tregs的比例。数字显示圈门细胞的比例。显示了典型的FACS图。(B)Foxp3+细胞比例的总结。数字显示各个象限中阳性细胞的比例。(C)Tregs中TNFR2+细胞的比例。显示了典型的FACS图。(D)CD4+Foxp3+亚群中TNFR2表达的平均荧光强度(MFI)的汇总数据。与单独的LPS组相比，*p<0.05， **p<0.01，***p<0.001。
图7.CHI008在体外对淋巴细胞的半抑制浓度(IC50)。从正常 C57BL/6J小鼠的淋巴结中获得淋巴细胞，在IL-2(10ng/mL)的存在下，分别将不同浓度的CHI008(0-80μl/ml)与淋巴细胞于体外共培养。3天后，使用MTT测量淋巴细胞的活性。在体外CHI008对淋巴细胞的IC50为30.62μl/ml。
图8.野黄芩苷在体外对4T1细胞的抑制作用。分别将不同浓度的野黄芩苷(0-100μM)与4T1细胞于体外共培养。24h后，使用 MTT测量4T1细胞的活性。在体外100μM野黄芩苷能显著抑制4T1 细胞的生长。
图9.野黄芩苷在体外降低4T1细胞TNFR2的表达。分别将不同浓度的野黄芩苷(0-50μM)与4T1细胞于体外共培养。24h后，使用流式细胞术测量4T1细胞TNFR2的表达。在体外12.5，25和50μM 野黄芩苷均能显著抑制4T1细胞TNFR2的表达。50μM野黄芩苷抑制效果最好。
图10.野黄芩苷在体外降低4T1细胞TNFR2的表达。分别将不同浓度的野黄芩苷(0-50μM)与4T1细胞于体外共培养。24h后，使用Western Blotting测量4T1细胞TNFR2的表达。在体外25和50 μM的野黄芩苷均能显著抑制4T1细胞TNFR2的表达。
图11.野黄芩苷抑制小鼠4T1肿瘤模型中肿瘤的生长。给Balb/c 小鼠皮下注射4T1细胞，待肿瘤长至5mm左右，开始注射野黄芩苷 (50mg/kg/day)。在肿瘤接种第20天，野黄芩苷能够明显抑制肿瘤大小。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
TNF经由TNFR2诱导Wehi-13var细胞死亡
WEHI-13var是一种纤维肉瘤细胞系，它在放线菌素D (AcD；0.5μg/ml)的存在下对TNF诱导的细胞死亡极其敏感，通常用于TNF生物测定。在TNF生物测定中，AcD的存在是标准方案，其旨在提高细胞对TNF的敏感性。TNF通过结合其两种功能不同的受体TNFR1和TNFR2来发挥作用。为了鉴定WEHI-13var细胞上表达哪种TNF受体，我们通过FACS测量了TNFR1和TNFR2在 WEHI-13var的表达。结果显示，WEHI-13var细胞的TNFR2表达水平较高，用PE抗小鼠TNFR2抗体标记，TNFR2的表达与同型对照相比超过50％。然而，用PE抗小鼠TNFR1标记的结果表明TNFR1 在细胞上表达极少(图1A)。此外，为了研究哪个TNF受体对TNF 诱导的细胞死亡负责，我们用TNF刺激细胞，同时用TNFR1或 TNFR2抗体与之共培养24小时。用MTT检测细胞活力。结果表明 TNFR2，而非TNFR1，是TNF诱导细胞死亡的原因，TNFR2的阻断显著消除了TNF对Wehi-13var的细胞毒性(图1B)。因此，我们假设TNF诱导的WEHI-13var细胞死亡是通过TNFR2而非TNFR1。因此，WEHI-13var细胞系和TNF可作为一个稳定的系统，来筛选有效化合物可以通过TNFR2或TNFR2信号通路从而抑制TNF诱导的细胞死亡。
实施例2
CHI008特异性抑制TNF诱导的Wehi-13var细胞死亡
中药注射剂(CHIs)是在中国开发并经中国药监局批准的注射剂，其由几种特定化合物组成，并已完成安全性评估。我们筛选了 11种CHIs，通过TNF生物测定评估其对WEHI-13var细胞的影响。将CHI(10μl/ml)预处理细胞1小时，然后用鼠源重组TNF(25pg/ml) 刺激细胞。共培养24小时后，将用CHI和TNF共处理的细胞活性与TNF组进行比较。结果表明，AcD(0.5μg/ml)存在下，CHI008(其主要成分是野黄芩苷)显著抑制由TNF(25pg/mL)诱导的WHEI-13var 细胞死亡(图2A)。同时，CHI008(2.5-10μl/ml)对TNF诱导的 Wehi-13var细胞死亡的抑制作用呈剂量依赖性(图2B)，用 10μl/mlCHI008处理后，近70％的细胞死亡受到抑制。此外，用TNF (25pg/ml)处理的Wehi-13var细胞在CHI008(10μl/ml)的存在或不存在下，通过显微镜下观察发现Wehi-13var对TNF非常敏感，而 CHI008对TNF诱导的细胞死亡具有明显的抑制作用(图2C)。此外， AcD也具有细胞毒性，其可诱导约30％的Wehi-13var细胞死亡(图2D)。然而，CHI008仅特异性地抑制TNF诱导的Wehi-13var细胞死亡，而不是AcD诱导的细胞死亡。
实施例3
CHI008在体外抑制TNF诱导的Treg增殖和TNFR2表达
我们检测了CHI008在体外试验中对TNF诱导的Tregs增殖的作用。正常小鼠脾脏和淋巴结的CD4+T细胞用MACS分离。IL-2用来培养细胞以维持其存活。TNF优先刺激Tregs的增殖，导致超过50％的Tregs复制增殖(图3A)。如图3B-D所示，20μl/ml的CHI008抑制TNF诱导的Treg增殖，抑制率为30％(p<0.01)。通过CHI008 处理，培养的CD4+T细胞中基于每个细胞的Foxp3表达(MFI)也显著降低，抑制率为26.1％(图3D，p<0.01)。在体外研究中使用CHI008的浓度高于IC50(图7)。TNFR2的表面表达水平与Tregs 的免疫抑制功能相关。TNF优先刺激上调TNFR2在Tregs上的表达。如图3E-G所示，与单独IL-2培养相比，TNF处理后TNFR2在Tregs 上的表达上调超过2倍。CHI008抑制TNF诱导的TNFR2+Treg上调和TNFR2表达。因此，CHI008可以抑制TNF诱导的TNFR2在Treg 上的表达。
实施例4
野黄芩苷特异性抑制TNF诱导的Wehi-13var细胞死亡
野黄芩苷是一种分离于灯盏花素的黄酮类化合物，它是正式列入中国药典的CHI008的主要成分(图3A)。为了研究野黄芩苷对 Wehi-13var细胞的作用，以不同浓度梯度(12.5-200μM)的野黄芩苷处理细胞。与之前报道相同，野黄芩苷显著抑制TNF诱导的 Wehi-13var细胞死亡(图3B)。在这个浓度范围内，野黄芩苷对 Wehi-13var细胞没有明显的细胞毒性(补充图2)。同时，与TNF刺激组相比，野黄芩苷对AcD诱导的细胞死亡没有抑制作用(图3C)。在这种情况下，我们可以得出结论，野黄芩苷特异性抑制TNF诱导的细胞死亡。
实施例5
野黄芩苷在体外抑制TNF诱导的Treg和TNFR2表达的上调
我们接着探索了在体外试验中，野黄芩苷对TNF诱导Tregs增殖的作用。因此，取C57BL/6J小鼠的淋巴结，并将淋巴细胞与IL-2 一起培养以维持细胞存活。用药组给予两种不同浓度的野黄芩苷(25 或50μM)。在TNF的存在下，Treg的增殖约为2倍(图5A)。如图 5A-B所示，50μM的野黄芩苷显著抑制TNF诱导的Treg增殖 (p<0.05)。同时，野黄芩苷剂量依赖性地抑制TNF处理后每个细胞的Foxp3表达(MFI)增加(图5C，p<0.05-0.001)。在此项体外研究中，野黄芩苷的浓度没有明显的细胞毒性，其中野黄芩苷的半致死量高于100μM(补充图3)。此外，与单独的IL-2培养相比，TNF上调Tregs上TNFR2的表达。然而，野黄芩苷剂量依赖性地抑制TNF 诱导的TNFR2+Treg上调和TNFR2的表达(图5D-F，p<0.01)。因此，野黄芩苷可以抑制TNFR2+Treg的比例以及TNFR2在经TNF处理后Treg上的表达。
实施例6
野黄芩苷抑制LPS诱导的小鼠Tregs的体内扩增
之前我们的研究证明，TNF-TNFR2相互作用是脂多糖(LPS) 诱导小鼠Treg增殖的原因。该模型用于检测在体内试验中，野黄芩苷是否具有抑制TNF诱导的Tregs增殖的能力。如图6A-B所示，在 LPS刺激24小时后，脾脏CD4+T细胞中Foxp3+细胞的比例从9.28％增加至15.1％(p<0.05)。类似地，与对照组相比，LPS刺激后淋巴细胞中的Foxp3+细胞的比例也增加(图6B)。淋巴细胞中Tregs上 TNFR2的表达显著增加(图6C-D，p<0.01)。经LPS处理后立即给药野黄芩苷(50mg/kg/day)，它完全抑制LPS诱导的Treg增殖(图 6A-B)。此外，野黄芩苷完全抑制了LPS诱导的TNFR2在Treg上的表达上调(图6C-E)。因此，野黄芩苷在体外和体内试验均有抑制 TNFR2介导的Tregs活化和增殖。
实施例7
野黄芩苷在体外对4T1细胞的抑制作用
我们探索了野黄芩苷在体外对4T1细胞的抑制作用。分别将不同浓度的野黄芩苷(0-100μM)与4T1细胞于体外共培养。24h后，使用MTT测量4T1细胞的活性。将用野黄芩苷处理的细胞活性与 meidum组进行比较。结果表明，100μM野黄芩苷能显著抑制4T1 细胞的生长(图8)。
实施例8
野黄芩苷在体外降低4T1细胞TNFR2的表达
接着我们探索了野黄芩苷在体外对4T1细胞TNFR2表达的影响。分别将不同浓度的野黄芩苷(0-50μM)与4T1细胞于体外共培养。24h后，使用流式细胞术测量4T1细胞TNFR2的表达。将用野黄芩苷处理的细胞TNFR2表达量与未处理的细胞进行比较。结果表明，在体外12.5，25和50μM野黄芩苷均能显著抑制4T1细胞TNFR2 的表达。50μM野黄芩苷抑制效果最好(图9)。
实施例9
野黄芩苷在体外降低4T1细胞TNFR2的表达
同时我们分别将不同浓度的野黄芩苷(0-50μM)与4T1细胞于体外共培养。24h后，使用Western Blotting测量4T1细胞TNFR2 的表达。将用野黄芩苷处理的细胞TNFR2表达量与未处理的细胞进行比较。结果表明，在体外25和50μM野黄芩苷均能显著抑制4T1 细胞TNFR2的表达(图10)。
实施例10
野黄芩苷抑制老鼠4T1肿瘤模型中肿瘤的生长
基于前面的结果，我们想探索野黄芩苷是否具有抗肿瘤的效果。我们给Balb/c小鼠皮下注射4T1细胞，待肿瘤长至5mm左右，开始腹腔注射野黄芩苷(50mg/kg/day)。每天测量老鼠肿瘤体积，体积计算公式＝长×宽2÷2。将用野黄芩苷治疗组的肿瘤体积与未处理组的肿瘤体积进行比较。结果表明，在肿瘤接种第20天，野黄芩苷能够明显抑制肿瘤大小(图11)。
从上述结果可以看出，Wehi-13var提供了一种具有特异性、稳定性和灵敏度的检测TNF的生物测定法。放线菌素D(AcD)是一种在TNF生物测定法中广泛使用的用来增加TNF细胞毒性的药物，在 AcD的存在下，WEHI-13var对TNF诱导的细胞死亡极为敏感。结果表明，TNF和Wehi13-var细胞可以被认为是一个稳定的筛选系统，被我们首先用于TNFR2拮抗物的筛选，并且可以确定，筛选出的中药注射液(CHIs)或化合物对TNFR2的表达、TNFR2+Foxp3+Treg 的比例和Tregs的增殖有抑制作用。因此，这种TNF生物检定法和 WEHI-13var细胞系统可作为有效稳定的系统用来筛选TNFR2调节剂。
中药注射液(CHIs)在中国发展并用于治疗一些疾病，包括高血压、肾病综合征、冠状动脉疾病、类风湿性关节炎、骨折、糖尿病和宫颈神经退行性疾病。这些新型的CHIs改变了传统的给药方式而仍然保留中药的特点。野黄芩苷是从灯盏花(Erigeron breviscapine(vant)Hand Mass)中分离出来的一种类黄酮化合物，是在中国药典中被正式列出的CHI008的主要成分。近年来，野黄芩苷的研究机理在多种疾病治疗方面取得了重大进展，包括在心血管和脑血管疾病、神经退行性疾病、炎症和癌症等。本发明结果表明，筛选出的CHIs 和野黄芩苷对TNF诱导的细胞死亡具有抑制作用，且对AcD诱导的细胞死亡没有作用。同时，CHIs在体外实验中能够抑制TNFR2的表达和Treg的数量，而野黄芩苷在体内和体外试验中对Treg均有抑制作用。
CD4+Foxp3+Treg细胞是有效的免疫抑制细胞，在维持体内平衡和抑制自身免疫反应方面起着不可或缺的作用。然而，它也可以促进肿瘤细胞的侵袭和逃逸。TNF作为一种多效细胞因子，可以通过 TNF-TNFR2的相互作用刺激Tregs的增殖，而TNFR2的表达与增强Treg的稳定性和抑制功能有关。虽然第一个TNFR2抑制剂被确定为沙利度胺，但近期的研究主要集中在以TNFR2为靶向的生物制剂上，它们对受体有较高的靶向特异性和结合效能。但是，由于TNFR2的接触面积较大，小分子化合物可能难以阻断TNF-TNFR相互作用。研究表明，TNFR2在T淋巴细胞中主要有三条信号通路，其中包括 IKK/NFκB,MAPK(Erk1/2,p38,JNK),和PI3K/Akt信号通路。因此，研究针对Treg信号通路的主要组成部分进而调节Treg活性的靶向小分子抑制剂的作用是有意义的。
近年来，野黄芩苷研究机理在各种疾病治疗中有较大的进展。据报道，在慢性心肌梗死大鼠模型中，长期给予野黄芩苷可以抑制心脏成纤维细胞的增殖和胶原的产生，其机制包括抑制p38MAPK和 ERK1/2磷酸化。在LPS诱导的急性肺损伤的小鼠模型中，野黄芩苷(50mg/kg)可以显著下调LPS诱导的TNF水平。LPS诱导的TNF可以刺激Tregs的增殖，我们的研究结果表明在这种剂量下，野黄芩苷对Tregs的数量有抑制作用，并显著抑制TNFR2的表达。此机理可能是通过抑制TNF-TNFR2相互作用进而抑制Tregs的增殖。同时，野黄芩苷是NF-κB激活和核转移的有效抑制剂，NF-κB有助于抑制基质金属蛋白酶(MMP-2，-9，和-14)的表达，从而促进肿瘤的转移。因此，研究野黄芩苷是否通过抑制TNFR2或TNFR2相关信号通路，从而抑制肿瘤浸润调节性T细胞进而发挥抗肿瘤作用是有意义的。
TNFR2除了表达于抑制性Treg细胞外，还表达于经过TCR刺激后的CD4+Foxp3-Teffs细胞。尽管与Tregs相比，TNFR2的表达在 Teff中要低得多，但是TNFR2靶向药物的应用应仔细评估。另外， TNFR2还表达于其他细胞类型，包括内皮细胞、小胶质细胞和特定的神经细胞亚型，心肌细胞，少突胶质细胞，骨髓源性抑制细胞和间充质干细胞。TNFR2靶向剂如野黄芩苷有可能通过作用于TNFR2，从而调节这些细胞的增殖、死亡或活性等生理特征。
除了TNFα外，还有一种名为淋巴毒素的细胞毒素(LNα)，主要由活化的T淋巴细胞产生，功能与TNF类似。当L-929、L-M和 WEHI-13var等敏感细胞中存在TNF/LN且有一种或多种代谢抑制剂如放线霉素D、丝裂霉素C或emetine添加时，细胞毒性的敏感性显著增加。这些抑制剂的主要功能为转录酶阻滞剂，其中最常用的为 AcD。我们的结果表明，在AcD的存在下，WEHI-13var对TNF诱导的细胞死亡极为敏感，其细胞毒性由TNFR2介导，因为TNFR2 被阻断后细胞存活率增加。同时，筛选的CHIs和野黄芩苷无法抑制 AcD诱导的细胞死亡，为它们作用于TNF-TNFR2提供了更多证据。由于LNα同源体也可以与TNFR2结合[51]，因此研究野黄芩苷是否可以通过抑制LNα-TNFR2，进而抑制LNα诱导的WEHI-13var细胞毒性和Tregs的增殖是有意义的。
最后，我们的研究清楚地表明，WEHI-13var和TNF可被认为是一种稳定的可用于筛选靶向针对TNFR2药物制剂的筛选系统。同时，野黄芩苷可以抑制TNF诱导的Treg增殖、TNFR2和Foxp3在Tregs 上的表达。肿瘤浸润Tregs作为免疫抑制细胞有利于肿瘤的生长和逃逸，因此野黄芩苷通过阻断TNF-TNFR2相互作用，进而抑制Treg 的增殖可以进一步应用于研究癌症免疫治疗和其他疾病的治疗。
上述实施例所述涉及的材料与方法如下：
(1)小鼠和试剂
野生型(WT)C57BL/6J(8-12周龄)雌鼠由澳门大学动物设施提供。动物研究方案经澳门大学动物研究伦理委员会批准。 RPMI-1640(1X)，胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶-EDTA(0.25％)磷酸盐缓冲盐水(1X)，Pen Step，HEPES(1M)和台盼蓝(0.4％)购自Thermo FisherScientific(美国)。抗体购自BD Pharmingen(San Diego，CA)，包括PerCP-Cy5.5抗小鼠CD3(145-2C11)，FITC抗小鼠CD3(145-2C11)，FITC抗小鼠TCRb(H57-597)组成。PE抗小鼠CD120b/TNFR2(TR75-89)，PerCP-Cy5.5抗小鼠CD4(RM4-5)。购自eBioscience的抗体包括PE-Cy7抗小鼠CD4(GK1.5)和APC 抗小鼠/大鼠Foxp3染色组(FJK-16s)。从BD Pharmingen购买重组小鼠IL-2和TNF。Bay 11-7082(Cat#：B5556)和来自沙门氏菌的脂多糖(LPS)(Cat#：L9764)购自Sigma-Aldrich。所有中草药注射剂均购自珠海和上海的医院，野黄芩苷(纯度≥98％)购自成都曼思特生物科技有限公司。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)和DMSO得自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。
(2)细胞系和细胞培养
WEHI-13var和4T1细胞购自American Type Culture Collection (Manassas，USA)。WEHI-13var细胞在含有10％FBS，1％L-谷氨酰胺，1％HEPES和1％Pen step的RPMI-1640中培养。4T1细胞在含有 10％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％Pen step的RPMI-1640中培养。细胞培养箱维持CO2浓度为5％，温度为37℃。
(3)TNF生物测定
将WEHI-13var细胞以1.5×104个/孔接种于96孔板中。孵育过夜后，将含有或不含其他CHI或野黄芩素的2倍稀释的TNF溶于含有 25mM HEPES，3％FBS和0.5μg/ml放线菌素D的最终浓度的 RPMI-1640培养基中。对照组只使用培养基。培养18-20小时后，向每个孔中加入10μL MTT(5mg/mL)并避光温育4小时。温育后，除去培养基，然后向每个孔中加入100μL二甲基亚砜(DMSO)以溶解甲瓒蓝晶体。使用1420Multilabel counter victor(PerkinElmer， Waltham，MA，USA)在570nm处读取吸光度值。细胞活力表示为样品和空白对照组之间的吸光度值的比率。
(4)细胞纯化和体外细胞培养
从小鼠脾脏，腋窝淋巴结，腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结获得淋巴细胞。通过使用CD4(L3T4)微珠(Miltenyi Biotec，130-097-145) 和MS柱(Miltenyi Biotec)从淋巴细胞中纯化CD4+T细胞。MACS 纯化的CD4+细胞用CFSE标记，细胞(5×104细胞/孔)在96孔板中培养，然后在存在或不存在CHI008(20μl/ml)的情况下用IL-2或 IL-2加TNF刺激3天。通过CFSE稀释测定评估Tregs的增殖，并用 FACS分析CD4+亚群中Foxp3+细胞的比例和Tregs上TNFR2表达的比例。在另一些实验中，在存在或不存在野黄芩苷(25-50μM)的情况下，用IL-2或IL-2加TNF刺激淋巴细胞。通过FACS分析Foxp3 和TNFR2的表达。
(5)体内给予LPS和野黄芩苷
向野生型C57BL/6J小鼠腹膜内注射0.2mL生理盐水或200μg LPS。用药组小鼠在LPS处理后立即用野黄芩素(25mg/kg或50mg/kg) 处理。野黄芩苷溶解在生理盐水中。24小时后，处死小鼠。收集脾脏，腋窝，腹股沟和肠系膜区域的淋巴结用于FACS分析。
(6)流式细胞术
在阻断FcR后，将细胞与适当稀释的抗体一起温育，最后悬浮在FACS缓冲液中用于后续分析。由BD FACSCanto II和BD FACSAriaTMFusion流式细胞仪进行实验数据采集。使用FlowJo软件 (Tree Star Inc.，Ashland，OR)进行数据分析。
(7)统计分析
确定每组的平均值±标准偏差(SD)。统计分析采用单向方差分析(单向ANOVA)和Tukey检验，或双向方差分析(双向ANOVA)。当P<0.05时，差异被认为是统计学上显着的，并且除非P<0.001，否则显示出确切的P值。从图中可视地确定浓度依赖性。用GraphPad Prism7.0进行所有统计学分析。
(8)本发明所涉项目由澳门科技发展基金(FDCT)研究基金 014/2015/A1，201/2017/A3和澳门大学研究基金 MYRG2016-00023-ICMS-QRCM和MYRG2017-00120-ICMS资助。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.野黄芩苷或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病是由TNF与TNFR2的相互作用所引起或介导的。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疾病是由TNF与TNFR2的相互作用导致表达TNFR2的细胞出现增殖或死亡所引起或介导的；
优选的，表达TNFR2的细胞选自如下类型的细胞：调节性T淋巴细胞、内皮细胞、小胶质细胞、神经细胞、心肌细胞、少突胶质细胞、骨髓源性抑制细胞以及间充质干细胞；
优选的，所述野黄芩苷通过阻断TNF与TNFR2的相互作用以抑制调节性T淋巴细胞增殖进而起到预防或治疗所述疾病的作用；
优选的，所述疾病选自：癌症、移植物抗宿主病和自身免疫性疾病。
3.野黄芩苷或其药学上可接受的盐在制备用于调节细胞增殖或死亡的调节剂中的应用，其特征在于，所述细胞为表达TNFR2的细胞，所述细胞的增殖或死亡是由TNF与TNFR2的相互作用所引起或介导的；
优选的，调节细胞增殖或死亡是指抑制细胞增殖或死亡。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述野黄芩苷通过阻断TNF与TNFR2的相互作用以起到抑制细胞增殖或死亡的作用；
优选的，表达TNFR2的细胞选自如下类型的细胞：调节性T淋巴细胞、内皮细胞、小胶质细胞、神经细胞、心肌细胞、少突胶质细胞、骨髓源性抑制细胞以及间充质干细胞。
5.野黄芩苷或其药学上可接受的盐作为TNFR2的抑制剂的用途。
6.野黄芩苷或其药学上可接受的盐作为TNFR2的抑制剂在制备一种用于抑制TNFR2的药物中的用途。
7.野黄芩苷或其药学上可接受的盐作为TNFR2的抑制剂在制备一种用于抑制由TNF与TNFR2的相互作用的药物中的用途。
8.野黄芩苷或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗调节性T淋巴细胞激活相关的疾病的药物中的应用，其中，所述野黄芩苷或其药学上可接受的盐通过抑制TNFR2来预防或治疗调节性T淋巴细胞激活相关的疾病。
9.一种预防或治疗疾病的药物，其特征在于，所述疾病是由TNF与TNFR2的相互作用所引起的，所述药物含有作为活性成分的野黄芩苷或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的辅料。
10.一种用于调节细胞增殖或死亡的调节剂，其特征在于，所述调剂节含有野黄芩苷或其药学上可接受的盐，所述细胞为表达TNFR2的细胞，所述细胞的增殖或死亡是由TNF与TNFR2的相互作用所引起或介导的。
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