CN104922106B

CN104922106B - 青蒿琥酯在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用

Info

Publication number: CN104922106B
Application number: CN201510267405.6A
Authority: CN
Inventors: 李晓娟; 曾祥周; 王铿; 张悦阳; 陶磊; 刘叔文
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2015-05-22
Publication date: 2018-02-02
Anticipated expiration: 2035-05-22
Also published as: CN104922106A

Abstract

本发明涉及青蒿琥酯在制备抗破骨细胞分化药物中的应用。本发明经过试验证明，青蒿琥酯能够直接显著抑制体外RANKL诱导破骨前体细胞分化形成破骨细胞，抑制破骨细胞吸收骨质；体内对破骨细胞激活导致骨破坏的经典模型‑卵巢切除骨质疏松小鼠的骨丢失具显著改善作用，具有方便服用、经济有效等优点，青蒿琥酯对破骨细胞生成、破骨活性的具有直接而显著地抑制作用特点，使其可以作为一个破骨细胞分化抑制剂类药物，用于破骨细胞分化抑制剂所治疗疾病；作为活性药物前体，用于破骨细胞抑制剂类药物研发。

Description

青蒿琥酯在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物领域，特别是青蒿琥酯的一种新的药物分类用途。

背景技术

骨代谢的稳定需要破骨细胞(Osteoclasts,OCs)介导的骨吸收和成骨细胞(Osteoblasts,OBs)介导的骨形成作用间的动态平衡和偶联，在健康个体中，二者维持功能平衡，而平衡一旦打破则可能导致骨骼疾病的发生。

破骨细胞是体内唯一负责骨吸收的细胞。它可由破骨前体细胞经过激活后分化形成具有功能的成熟的破骨细胞。由于分化成熟的破骨细胞可吸收骨质，其过度激活会造成骨质丢失、骨质疏松，引发骨折疼痛，继发反应性骨增生，甚至残疾。破骨细胞过度活化相关的疾病不少，经典的有绝经后骨质疏松，此外比较重要的还有肿瘤转移骨破坏、炎症相关骨破坏(类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、牙周炎等)等。另有糖尿病[刘海叶，刘泽，邓伟民.糖尿病引发骨质疏松症的机制及防治.中国骨质疏松杂志.2008年7月第14卷第7期]、结肠炎[周锋利，王文仙，王玉刚，韦欣.溃疡性结肠炎患者骨质疏松及相关危险因素分析.现代医药卫生.2005年04期]等多种疾病骨质疏松亦显著增加。破骨细胞活化相关骨破坏病人数量庞大，仅原发性骨质疏松(主要包含绝经后骨质疏松等)全世界就有上亿病人。

破骨细胞过度活化相关骨破坏疾病种类多样，病因也非常多样化，甚至一个疾病都会有多种发病相关因素，而其中一些又属于病因不明确或多元化病因的难治性疾病。但是直接针对破骨细胞，抑制破骨细胞分化形成的药物，可跨越疾病病因，直接改善相关的疾病骨破坏症状，并有效减轻病人骨折、疼痛等相关的痛苦。因此，破骨细胞分化抑制剂近些年成为一类药物，可用于绝经后骨质疏松等多种破骨细胞过度活化相关骨破坏疾病。

虽然，目前通过改善激素水平、抗炎等不同途径，治疗上述疾病的多种药物最终能够改善疾病，但是现在临床能够直接针对破骨细胞的破骨细胞抑制剂很少。另外，尽管有些药物能够针对病因譬如抗炎治疗骨破坏疾病如类风湿性关节炎，理论上具有直接或间接抑制破骨细胞生成和炎症性骨破坏的可能性，但事实上很多常用药物反而被报导能够诱导破骨细胞形成、或加重骨质疏松。譬如治疗类风湿性关节炎的两个常用代表药物：糖皮质激素(如地塞米松)、甲氨蝶呤均能抑制外周或病变关节炎症因子包括TNFα的产生，但两个药却都能引起骨破坏。糖皮质激素(如地塞米松)能体外促进诱导破骨细胞生成，体内在动物和病人都容易引骨质疏松；甲氨蝶呤使用后也会促进破骨细胞形成、引起骨破坏；并有SCI论文报道，例如：[King TJ等(2012)Methotrexate Chemotherapy Promotes OsteoclastFormation in the Long Bone of Rats via Increased Pro-Inflammatory Cytokinesand Enhanced NF-kappaB Activation.Am J Pathol 181:121-9]；[Kaji H等(1997)Dexamethasone stimulates osteoclast-like cell formation by directly acting onhemopoietic blast cells and enhances osteoclast-like cell formationstimulated by parathyroid hormone and prostaglandin E2.J Bone Miner Res 12:734-41]。

而目前常用的破骨细胞抑制剂是双磷酸盐类(如唑来膦酸)和RANKL的抑制剂Denosumab(地诺单抗)。这两种破骨细胞抑制剂最初均作为治疗绝经后骨质疏松的药物被批准上市(引文1:Deeks ED,Perry CM.Zoledronic acid:a review of its use in thetreatment of osteoporosis.Drugs Aging.2008；25(11):963-86.doi:10.2165/0002512-200825110-00007.引文2:Medical Coverage Policy|Denosumab https://www.bcbsri.com/sites/default/files/polices/denosumab.pdf)，近年都被批准增加了新的临床适应症-肿瘤转移骨破坏。然而，双磷酸盐类多数需要注射给药、容易引发颌骨坏死等严重不良反应；而针对破骨细胞激活因子RANKL的生物抗体制剂地诺单抗，需皮下注射给药，价格更为昂贵。因此，临床需要更多可方便服用、经济有效的破骨细胞抑制剂类药物。

靶向抑制破骨细胞(OCs)分化被认为是逆转骨破坏最有效的治疗策略，目前已经成为该领域的一个研究热点。破骨细胞起源于骨髓单核-巨噬细胞谱系细胞，在体内必须依赖于一些诱因诱导分化发育为多核的成熟破骨细胞，最后被活化。目前认为最直接活化破骨细胞的内源性分子是成骨细胞或骨髓基质细胞分泌的激活核因子NF-κB受体的配体(receptor activation of nuclear factor NF-κB ligand,RANKL)。RANKL通过和破骨细胞膜上激活核因子NF-κB受体(receptor activation of nuclear factor NF-κB，RANK)结合，募集形成肿瘤坏死因子相关受体6(tumor neerosis factor receptor-associatedfactor 6，TRAF6)和c-Src酪氨酸激酶(c-Src tyrosine kinase，c-Src)复合体，激活下游信号通路(NF-κB、MAPK和Ca²⁺通路)通过胞内信号传导途径激活核转录因子核因子κB(nuelear factor kappa B，NF-κB)、激活蛋白1(activator protein l，AP-1)和活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T cells cl，NFATc1)，激活破骨细胞相关基因表达，例如抗酒石酸碱性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)，金属基质蛋白酶9(tartrate resistant acid phosphatase，MMP-9)，整合素β3(integrinβ3)和组织蛋白酶K(cathepsin K)，促进破骨细胞分化，增强骨吸收活性，抑制其凋亡，最终导致破骨细胞数量增多、功能亢进。参见文献[Li X,He L,Hu Y,et al.Sinomenine suppressesosteoclast formation and Mycobacterium tuberculosis H37Ra-induced bone lossby modulating RANKL signaling pathways[J].PLoS One,2013,8(9):e74274.]。

青蒿琥酯是从中国传统药物菊科艾属植物黄花蒿中分离出的一种有抗疟作用的成分，是作为临床上有效的抗疟药。如果能挖掘出青蒿琥酯的新作用，扩大其临床应用，将节省大量时间和金钱，也能造福广大病患者。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供青蒿琥酯在制备抗破骨细胞分化类药物制剂中的应用。

本发明的目的是这样实现的：青青蒿琥酯在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用。

所述的抗破骨细胞分化类药物为抗绝经后骨质疏松药物。

所述的抗破骨细胞分化类药物为治疗双磷酸盐、地诺单抗临床适应症的药物。

所述的抗破骨细胞分化类药物为口服剂型或外用剂型。

所述的抗破骨细胞分化类药物包括活性成分青蒿琥酯和医学上可接受的药用辅料。

本发明经过试验证明，青蒿琥酯能够显著抑制体外RANKL诱导破骨前体细胞RAW264.7细胞和BMMs细胞形成破骨细胞，直接抑制破骨细胞的分化形成，抑制破骨细胞骨吸收功能，治疗改善卵巢切除骨质疏松小鼠的骨破坏，可用于治疗绝经后骨质疏松，具有方便服用、经济有效等优点。青蒿琥酯对破骨细胞生成、破骨活性的具有直接而显著地抑制作用特点，使其可以作为一个破骨细胞分化抑制剂类药物，用于破骨细胞分化抑制剂所治疗疾病；还可作为活性药物前体用于破骨细胞抑制剂类药物研发。

附图说明

图1是本发明实验例1青蒿琥酯对RAW264.7细胞的细胞生存作用试验结果

图2是本发明实验例2青蒿琥酯对破骨前体Raw264.7细胞分化成破骨细胞的影响的实验结果，其中：RANKL为激活核因子NF-κB受体的配体，Art为青蒿琥酯(注：与空白对照组比较，^###P<0.001；与RANKL组比较，^***P<0.001)；

图3是本发明实验例3青蒿琥酯对小鼠骨髓巨噬细胞(BMMs)分化成破骨细胞的影响的实验结果，其中：RANKL为激活核因子NF-κB受体的配体，M-CSF为巨噬细胞集落刺激因子，Art为青蒿琥酯(注：与空白对照组比较，^###P<0.001；与RANKL组比较，^**P<0.01，^***P<0.001)；

图4是本发明实验例4青蒿琥酯对破骨细胞破骨活性的影响的实验结果，其中：RANKL为激活核因子NF-κB受体的配体，Art为青蒿琥酯(注：与空白对照组比较，^###P<0.001；与RANKL组比较，^***P<0.001)；

图5是本发明实验例5青蒿琥酯对实验性去卵巢骨质疏松小鼠模型骨破坏影响的实验结果，其中：Sham为假手术，VOX为去卵巢，Vehicle为溶剂，Art为青蒿琥酯，Zol为唑来膦酸；

图6是本发明实验例5青蒿琥酯对去卵巢骨质疏松模型小鼠相关骨参数的影响的实验结果，其中：RANKL为激活核因子NF-κB受体的配体，OPG为护骨素，Sham为假手术，OVX为去卵巢，Art为青蒿琥酯，Zol为唑来膦酸(注：与假手术组比较，^###P<0.001；与去卵巢组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001)；

图7是本发明实验例5青蒿琥酯对去卵巢骨质疏松模型小鼠血清TRAP、RANKL等破骨细胞相关指标的影响的实验结果，其中：Sham为假手术，VOX为去卵巢，Art为青蒿琥酯，Zol为唑来膦酸(注：与假手术组比较，^###P<0.001；与去卵巢组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001)。

具体实施方式

本发明是青蒿琥酯在制备抗破骨细胞分化类药物的应用。抗破骨细胞分化类药物可以治疗包括但不限于：绝经后骨质疏松、肿瘤转移骨破坏等已知的破骨细胞抑制剂类药物如双磷酸盐、地诺单抗被批准治疗的临床适应症。

该破骨细胞分化类药物为口服剂型或外用剂型，包括活性成分青蒿琥酯和医学上可接受的药用辅料。

以下通过细胞实验或动物实验对青蒿琥酯的抗破骨细胞分化效果进行验证。

一、青蒿琥酯对破骨细胞生成及破骨活性的影响

实验例1.青蒿琥酯对RAW264.7细胞的细胞生存作用：

RAW264.7细胞1×10⁴或1×10³每孔种植于96孔板中，过夜后加入药物青蒿琥酯，浓度为3.125μM、6.25μM、12.5μM。每组3个复孔。分别孵育8h、24h、48h、7d后，去上清，每孔加入0.5mg/ml的MTT 100μl，置37℃培养箱中孵育4h后，弃去上清液，加DMSO 150μl，振荡10分钟后，用Genios Pro型Tecan酶标仪在450nm测定吸光度。

由图1可见，体外浓度≤12.5μM对RAW264.7细胞生存均无明显影响。

实验例2.对破骨前体Raw264.7细胞分化成破骨细胞的影响：

选用生长状态良好的RAW264.7细胞按1×10³/ml密度接种于96孔板，并加入含10％FBS、100U/ml青霉素G和100μg/ml链霉素的DMEM培养基100μl/well，于37℃、5％CO₂培养箱孵育。细胞过夜稳定后，除阴性对照组(Control组)外，阳性对照组(RANKL组)及药物组均加RANKL，终浓度为100ng/ml，药物组同时加入青蒿琥酯1.56μM、3.125μM、6.25μM和12.5μM(分别为Art1.56μM组、Art 3.125μM组、Art 6.25μM组和Art 12.5μM组)，每组3个复孔。每2天换液1次。在诱导第4d行TRAP染色，在显微镜下观察拍照，并按TRAP阳性大于3个核的为破骨细胞进行计数。如图2。

实验例3.对小鼠骨髓巨噬细胞(BMMs)分化成破骨细胞的影响：

取C57BL/6小鼠股骨和胫骨，剥离肌肉后剪去两端，用注射器吸取冰预冷的a-MEM反复冲洗股骨、胫骨骨髓腔，冲出骨髓，直至骨髓腔发白，37℃、5％CO₂培养箱放置30分钟后取上清悬液。细胞按2×10⁵/ml密度接种于96孔板，除阴性对照组(Control组)外，阳性对照组(RANKL组)及药物组均加入M-CSF和RANKL，终浓度均为50ng/ml，药物组同时加入青蒿琥酯1.56μM、3.125μM、6.25μM和12.5μM(分别为Art1.56μM组、Art 3.125μM组、Art 6.25μM组和Art 12.5μM组)，每组3个复孔。每2天换液1次。在诱导第4d行TRAP染色，在显微镜下观察拍照，并按TRAP阳性并且大于5个核的为破骨细胞进行计数。如图3。

结合实验例1的细胞生存实验结果，选用1.56μM、3.125μM、6.25μM和12.5μM，浓度的青蒿琥酯干预，发现青蒿琥酯能够显著抑制体外RANKL诱导RAW264.7细胞和BMMs细胞形成破骨细胞。提示青蒿琥酯体外能抑制破骨细胞的生成。

实验例4.对破骨细胞破骨活性的影响：

同上述实验例2中破骨细胞生成实验方案接种Raw264.7细胞于包被有人工骨片的Osteo Assay 96孔板培养，于诱导第7天洗去细胞，在40×Nikon倒置光学显微镜光镜观察拍照，通过Image-Pro Plus软件计算每孔中骨吸收面积百分比。如图4。

实验结果证明：1.56μM、3.125μM、6.25μM和12.5μM，浓度的青蒿琥酯能显著降低破骨细胞在骨片上形成的骨凹陷面积，对于破骨细胞的骨吸收活性有抑制作用。

综合上述结果，青蒿琥酯体外能抑制破骨细胞的生成、活化和破骨活性。

二、青蒿琥酯对破骨细胞相关卵巢切除骨质疏松小鼠Micro-CT骨破坏、骨参数、破骨细胞相关指标等表达的影响

实验例5.青蒿琥酯对实验性去卵巢骨质疏松小鼠模型骨破坏影响

雌性10周龄C57BL/6小鼠40只，随机分为2组：假手术组8只，卵巢切除组32只。以10％水合氯醛溶液80μl/只的剂量腹腔注射麻醉，由背侧入，完整摘除双侧卵巢，止血缝合。假手术组只切除少量脂肪组织。术后肌注青霉素生理盐水2万U/kg，连用3天，饲养一周后，将去卵巢小鼠随机分为4组。(l)假手术组(sham组)：给予等量的注射用生理盐水；(2)去卵巢小鼠组(OVX+Vehicle组或简称OVX组)：给予等量的注射用生理盐水；(3)青蒿琥酯30mg/kg组(OVX+Art30mg/kg组或简称Art30mg/kg组)：灌胃给予青蒿琥酯30mg/kg；(4)青蒿琥酯5mg/kg组(OVX+Art5mg/kg组或简称Art5mg/kg组)：灌胃给予青蒿琥酯5mg/kg；(5)阳性药对照组(OVX+Zol0.1mg/kg组或简称Zol0.1mg/kg组)：皮下注射给予唑来膦酸钠100μg/kg。阳性药每周1次给药，其余各组每天1次。连续给药12周后。摘眼球取血，制备血清样品，通过ELISA试剂盒检测血清中RANKL、OPG、ALP和TRAP5b水平。处死后，取小鼠右后肢，浸泡于福尔马林中，用ZKKS小动物Micro-CT扫描仪进行CT扫描，3D建模及相关骨参数分析。

通过MicroCT分析小鼠的影像学特征，可见青蒿琥酯能逆转骨质疏松所致骨密度下降过程，保护骨基质。与破骨细胞抑制剂的阳性对照双磷酸盐类药物唑来膦酸表现出一致的作用，如图5。

通过骨参数分析，发现青蒿琥酯能显著升高骨质疏松小鼠骨矿物质密度、骨体积分数、骨小梁数量，降低骨小梁分离度。提示青蒿琥酯可能通过抑制破骨细胞所致的骨密度下降和骨小梁破坏，从而保护骨质疏松所致的骨破坏(图6)。

青蒿琥酯能显著降低TRAP酶活力(反映破骨细胞活性)，降低RANKL含量，RANKL/OPG比值，升高OPG含量和ALP酶活性，提示青蒿琥酯可抑制破骨细胞分化和活性，从而保护卵巢切除骨质疏松所致骨破坏，如图7。

Claims

1.青蒿琥酯在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的青蒿琥酯在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用，其特征在于：所述的抗破骨细胞分化类药物为通过抗破骨细胞分化治疗绝经后骨质疏松药物。

3.根据权利要求1所述的青蒿琥酯在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用，其特征在于：所述的抗破骨细胞分化类药物为通过抗破骨细胞分化治疗双磷酸盐、地诺单抗临床适应症的药物。

4.根据权利要求1所述的青蒿琥酯在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用，其特征在于：所述的抗破骨细胞分化类药物为口服剂型或外用剂型。

5.根据权利要求1所述的青蒿琥酯在制备抗破骨细胞分化类药物中的应用，其特征在于：所述的抗破骨细胞分化类药物包括活性成分青蒿琥酯和医学上可接受的药用辅料。