CN108530451B - 一种抗癌症恶病质的化合物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗癌症恶病质的化合物及应用，属于化合物技术领域，所述化合物具有如式I所示的结构。在本发明中，所述化合物通过抑制肌肉萎缩来治疗或者缓解癌症恶病质。

Description

一种抗癌症恶病质的化合物及应用

技术领域

本发明属于化合物技术领域，具体涉及一种抗癌症恶病质的化合物及应用。

背景技术

恶病质是由某些严重慢性疾病引起的机体高消耗状态，这些疾病包括癌症、艾滋病、慢性肾衰竭、心脏病、重度创伤和重度败血症等，其中由癌症引起的恶病质称为癌症恶病质，超过一半的癌症病人都要在晚期发展为恶病质，最终25％的癌症病人死于恶病质。恶病质的主要特征是体重的大幅下降，以肌肉和脂肪的流失最为显著，机体处于营养不良和代谢紊乱状态，病人的生活质量严重下降，对癌症治疗的承受力也大幅降低(Sandri M,Semin Cell Dev Biol,2016)。

肌肉萎缩是肌细胞中过度的分解代谢即蛋白降解所导致的过程，癌症恶病质导致的蛋白降解涉及多种机制，目前研究最多的为泛素-蛋白酶体降解和细胞自噬-溶酶体降解两种方式。此过程中有关的信号通路包括合成代谢和分解代谢两个方面，前者主要是以AKT-mTOR为主的蛋白合成途径，后者主要是以SMAD-FOXO，IKK-NFκB和JAK-STAT3为主的蛋白降解途径(MiyamotoY,Clin Cancer Res,2016)。

Myostatin(GDF8)，中文名称肌生成抑制素，英文简称MSTN，于1997年被美国科学家Mcpherron等通过简并PCR的方法在小鼠中发现。MSTN是TGFβ超家族的成员，是肌肉细胞自分泌和旁分泌的细胞因子，是肌肉生长的负调控因子。MSTN能够激活TGFβ信号通路，引起SMAD的磷酸化，活化的SMAD复合物入核能够激活多种形式的蛋白降解。研究发现，MSTN在癌症恶病质中起重要作用(Gallot YS,Cancer Research,2014)。

抑制肌肉萎缩是治疗和缓解癌症恶病质的重要方法之一(Johns N Int JBiochem Cell Biol,2013)，目前治疗由癌症恶病质引起的肌肉萎缩的药物主要分为天然化合物，酶抑制剂，β肾上腺受体激动剂和多种抗细胞因子药物等(DuttV,Pharmacol Res,2015)。其中，MSTN是其中一个重要的药物靶点，因此开发MSTN的抑制剂对治疗癌症恶病质有潜在的应用价值。目前关于MSTN的抑制剂都处于临床前或临床试验阶段，主要包括几个大类：MSTN的抗体(如LY2495655，PF-06252616和MYO-029等)，MSTN膜受体-Fc(如ACE-031)，MSTN膜受体的抗体(如BYM338)，MSTN的前肽(如AMG-745)和以卵泡抑制素(MSTN的天然抑制剂)为核心的基因治疗。这些抑制剂均为蛋白或基因药物，研究难度和成本较高，给推向临床治疗带来了困难。另外，现有技术中，并未有关于新型化合物能够抑制肌肉萎缩的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗癌症恶病质的化合物，所述化合物能够通过抑制肌肉萎缩来治疗或者缓解癌症恶病质。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗癌症恶病质的化合物，具有如式I所示的结构：

本发明还提供了上述技术方案所述的化合物在制备抑制肌肉萎缩药物中的应用。

优选的，所述抑制肌肉萎缩药物为抑制肌生成抑制素启动子活性的药物。

优选的，所述抑制肌肉萎缩药物为抑制肌生成抑制素的mRNA表达量的药物。

优选的，所述抑制肌肉萎缩药物为抑制肌生成抑制素的蛋白表达量的药物。

优选的，所述抑制肌肉萎缩药物为抑制肌生成抑制素信号通路的药物。

本发明还提供了上述技术方案所述的化合物在制备抑制肿瘤引起肌肉萎缩药物中的应用。

优选的，所述抑制肿瘤引起肌肉萎缩药物为防治C26肿瘤引起的C2C12肌管细胞萎缩药物。

优选的，所述抑制肿瘤引起肌肉萎缩药物为防治C26肿瘤引起的体重下降和/或脂肪流失药物；

所述抑制肿瘤引起肌肉萎缩药物为抑制Atrogin-1和/或MuRF-1的药物。

本发明还提供了上述技术方案所述的化合物在制备降低阿霉素毒性药物中的应用。

本发明提供的化合物能够通过抑制肌肉萎缩来治疗或者缓解癌症恶病质。

本发明实施例的结果显示：本发明提供的化合物能够抑制肌肉萎缩，进而能够治疗或者缓解癌症恶病质，而且具有降低阿霉素毒性的作用。

附图说明

图1为以MSTN启动子为靶点的药物筛选模型中质粒构建流程图；

图2为化合物对MSTN启动子活性的抑制作用，以及化合物对MSTN信号通路的抑制作用；

图3为化合物在C26细胞上清引起C2C12肌管细胞萎缩体外模型中对MSTN表达及其信号通路的影响；

图4为化合物在C26细胞上清引起C2C12肌管细胞萎缩体外模型中的逆转作用；

图5-1为化合物在C26细胞上清引起C2C12肌管细胞萎缩体外模型中对蛋白质泛素化降解的抑制作用；

图5-2为化合物在C26细胞上清引起C2C12肌管细胞萎缩体外模型中对蛋白质合成的促进作用；

图6为化合物在C26细胞上清引起C2C12肌管细胞萎缩体外模型中对细胞形态的影响；

图7为化合物在C26肿瘤引起小鼠肌肉萎缩体内模型中的逆转作用；

图8为化合物在C26肿瘤和阿霉素引起小鼠肌肉萎缩体内模型中的逆转作用；

图9为化合物的核磁共振结构鉴定结果。

具体实施方式

本发明提供了一种抗癌症恶病质的化合物，具有如式I所示的结构：

在本发明中，所述化合物具有全新的分子结构。本发明提供的化合物能够通过抑制肌肉萎缩，进而能够治疗或者缓解癌症恶病质。本发明提供的化合物能够降低阿霉素毒性。

在本发明中，所述化合物的中文名称为：2-((1-(3,4-二氯苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基)氨基)丁-1-醇。

在本发明中，所述的化合物的筛选方法，优选包括以下步骤：

1)将pGL4.20载体用Xhol I和Bgl Ⅱ进行酶切，得到载体酶切产物；

2)将肌生成抑制素的启动子序列用Xhol I和Bgl Ⅱ进行酶切，得到启动子酶切产物；

3)将所述步骤1)得到的载体酶切产物和所述步骤2)得到的启动子酶切产物用T4连接酶进行连接，得到重组质粒pGL4.20-MSTNP；

4)将所述步骤3)得到的重组质粒pGL4.20-MSTNP转染至HEK293T细胞中，在DMEM完全培养基中加入5μg/ml嘌呤霉素进行抗性筛选，将筛选得到的稳定传代的细胞株接种至96孔板1～2周后，加入D-luciferin后，用活体生物发光成像系统拍摄，选择信号最强的单克隆扩大培养，得到HEK293T-MSTNP；

5)将所述步骤4)得到的HEK293T-MSTNP接种于0.1mg/ml多聚赖氨酸包被的96孔板中，贴壁后，加入分子库中的化合物作用20～28h后，弃上清，再依次加入DMEM培养基和Bright-Glo^TM试剂进行振荡反应，得到反应液读数值，以不加化合物的细胞作为对照，计算加入化合物后荧光素酶报告基因表达活性的抑制率，挑选对MSTN启动子活性抑制率超过70％的药物，并通过MTT实验排除毒性造成的荧光素酶报告基因表达活性降低，得到具有抑制MSTN启动子活性的作用的化合物。

在本发明中，所述化合物从分子库中筛选得到，并且发现所述化合物具有抑制MSTN启动子活性和信号通路的作用，然后委托美国Life Chemicals公司进行合成得到，公众可直接从该公司购买得到该化合物。

本发明对所述pGL4.20载体用Xhol I和Bgl Ⅱ进行酶切使用的体系和酶切的条件没有特殊限定，采用本领域常规的酶切体系和条件即可。

本发明对所述肌生成抑制素的启动子序列用Xhol I和Bgl Ⅱ进行酶切使用的体系和酶切的条件没有特殊限定，采用本领域常规的酶切体系和条件即可。

本发明对所述启动子酶切产物用T4连接酶进行连接使用的体系和连接条件没有特殊限定，采用本领域技术人员常规使用的即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的化合物在制备抑制肌肉萎缩药物中的应用。

本发明对所述化合物制备成药物需要的辅料没有特殊限定，采用医学上可接受的辅料即可。本发明对所述化合物制备成药物的剂型没有特殊限定。在本发明中，所述化合物的纯度为99％，在动物实验中优选采用腹腔注射给药，每次30mg/kg，隔天给药一次，共给药9次。

在本发明中，所述抑制肌肉萎缩药物优选为抑制肌生成抑制素药物。在本发明中，所述的化合物能够抑制肌生成抑制素，从而达到抑制肌肉萎缩的效果。

在本发明中，所述抑制肌肉萎缩药物优选为抑制肌生成抑制素的mRNA表达量药物。在本发明中，所述化合物能够抑制肌生成抑制素的mRNA表达量，从而达到抑制肌肉萎缩的效果

在本发明中，所述抑制肌肉萎缩药物优选为抑制肌生成抑制素的蛋白表达量药物。在本发明中，所述化合物能够抑制肌生成抑制素的蛋白表达量，从而达到抑制肌肉萎缩的效果。

本发明还提供了上述技术方案所述的化合物在制备抑制肿瘤引起肌肉萎缩药物中的应用。

本发明对所述化合物制备成药物需要的辅料没有特殊限定，采用医学上可接受的辅料即可。本发明对所述化合物制备成药物的剂型没有特殊限定。

在本发明中，所述抑制肿瘤引起肌肉萎缩药物为防治C26肿瘤引起C2C12肌管细胞萎缩药物。在本发明中，所述化合物能够防治C26肿瘤引起C2C12肌管细胞萎缩，从而达到抑制肌肉萎缩的效果。

在本发明中，所述抑制肿瘤引起肌肉萎缩药物为防治C26肿瘤引起的体重下降和/或脂肪流失药物。在本发明中，所述化合物能够抑制C26肿瘤引起的体重下降和/或脂肪流失，从而达到抑制肌肉萎缩的效果。

在本发明中，所述抑制肿瘤引起肌肉萎缩药物为抑制Atrogin-1和/或MuRF-1药物。在本发明中，所述化合物能够抑制C26肿瘤引起的Atrogin-1和/或MuRF-1上调表达，从而达到抑制肌肉萎缩的效果。

本发明对所述化合物制备成药物需要的辅料没有特殊限定，采用医学上可接受的辅料即可。本发明对所述化合物制备成药物的剂型没有特殊限定。

本发明还提供了上述技术方案所述的化合物在制备降低阿霉素毒性药物中的应用。

在本发明中，所述化合物能够降低阿霉素的毒性。

本发明对所述化合物制备成药物需要的辅料没有特殊限定，采用医学上可接受的辅料即可。本发明对所述化合物制备成药物的剂型没有特殊限定。

下面结合实施例对本发明提供的一种抗癌症恶病质的化合物及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

以MSTN启动子为靶点的药物筛选模型的建立：

在UCSC数据库里，找到小鼠MSTN的启动子序列，分别在转录起始位点上游-2000bp左右和下游翻译起始位点前的位置，设计上游引物和下游引物。利用PCR，酶切，酶连，胶回收和转化分子生物学技术，采用Promega公司的pGL4.20载体构建重组质粒pGL4.20-MSTNP，其流程图如图1，其中，MSTNP为MSTN的启动子序列，pGL4.20为Promega公司带有荧光素酶(Luciferase)的质粒。

在上下游引物中加入酶切位点和保护碱基：

上游引物P1的序列如SEQ ID No.1所示，具体序列如下所示：

5’-CCGCTCGAGAATCCCTTGCCTTCATCTG-3’，

其中，下划线为Xhol I酶切位点，其前为保护碱基，其后为MSTN转录起始位点-1958bp后的一段序列；

下游引物P2的序列如SEQ ID No.2所示，具体序列如下所示：

5’-GGAAGATCTTACCGTCCGAGAGACAACC-3’，

其中，下划线为Bgl Ⅱ酶切位点，其前为保护碱基，其后为MSTN转录起始位点+38bp前的一段序列。

HEK293T-MSTNP的制备方法包括：

1)以全基因组DNA为模板进行PCR得到MSTN的启动子序列，全基因组的DNA序列从鼠源的细胞C3H10T1/2中提取，通过胶回收纯化MSTN的启动子序列；

2)将pGL4.20载体和MSTN的启动子序列，分别用Xhol I和Bgl Ⅱ进行双酶切，通过胶回收纯化目的片段，分别得到载体酶切产物和启动子酶切产物；

3)将二者酶切产物通过T4连接酶的作用进行连接，得到重组的质粒pGL4.20-MSTNP；

4)将重组质粒转化至E.coli DH5α感受态，提取单克隆菌落扩增；

5)通过菌液PCR、双酶切和质粒测序三种方式，鉴定得到的重组的质粒；

6)将纯化的重组质粒转染至HEK293T细胞中，加入5μg/ml的嘌呤霉素进行抗性筛选；

7)大约4周过后，细胞株能够稳定传代，通过极限稀释法接种至96孔板，待单细胞长成克隆(约1-2周)，加D-luciferin至终质量浓度60μg/mL，用活体生物发光成像系统拍摄，选择信号最强的单克隆扩大培养，得到单克隆的稳定转染模型细胞株，命名为HEK293T-MSTNP。

MSTN的启动子序列如SEQIDNo.3所示，具体序列如下；

AATCCCTTGCCTTCATCTGAAGCACTTGAGGATAATTTGAAGTAAAAGGCTTGAAACAAAGAGCAAGCCCTTCTGCTTCAAGTATTAATTACCTATGAAAGGGACTACATTTAGCTACTTATATTGCTAAATTATATGCCTCAAACCCCTTTAGTTGAGAAACTAAAGATAAGAGAAGCTAAGTACTGTGCCGTCTTTGTCATCGACTTAGAAGAGGCAAAATTGAGATTTGAACTCAGGTTTATTTGACTCTTCAGTCTCAGCTCACAATGGCAGTACAGTCTAAAAAAAAAAAAAATCACAGGATCAATTTCCTCTGAGGTATATAGCAGCATGTGTAATGATAATTATGACATCGAAAAGAATTCTATGCAGAAAAATGAATTTTCCAGACAAATCTGACTTTATAGGCCTGCTCTAATATTGTCTTGTATAAAGAGGGCCAGATCACCTCAGGGTGTCTGCTTTGTGTCTGGTTTTCCTTCATCTTTAATGGTGGGCAAATCTAGTACATTATGGAAGCCCACTTTTTTTTTCCTCAAGAGATATAGATGCCTCTTAAAAATTTGATGAAAATGCATTAACTTTTCAAGCTACTGAGCTGCATTTTAGTTCACTGAGGCAGTAAATTGGGTGTATACTGTACAGGAATGGTGGTGACCTAAAAATAAATATTTGATACAAGCCACCATAGTCTCTTGGGGTGTGTGTAAGGGGAGTAATGAATTAAAATTCTAAAGACTCCTCAGCTTCCCAAACAGGAGGAGGAACTCTGTGGCCTGGAAGCGTCCTCTGTCCCTGCTGCTGTGTTTGTTCAGCTCTTTAAGAGTTCACCCCATTCGATCTTGTGGCTCCTAAAGCCAAGGGTGAAAGTTTGATCCTTGCAGAGGCCACTTAAATTCAGAGAACAAAAAGCACCATTCTCTGCCCTAGACTCTAGCCCAGATCCCTGCCAGGTGTCTGCCCTCTGGTCAAAATGAGACGCTGGCAAAGGGGTGCTAGCCTGTGACAGTATGGGAACGCAACAAAGGACACCCCTCTACATGCGACTTGCTCTTTGTGTGCTCACGGGACCTGACATCATTCACAGAGAACACAGATTGCACTTTACTGTCAGCCCTGGAAGTCTGAGTCAAACTGAAATAATGCTCCAGCGCTACTTACAAAAATCCATTATCTACTCGGCCTAAGTACAGAGCCTGGCCTCCTCGCTGACAGGATTCTGTTGGCAATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAACACTCAGTCTTTAGTCTGTATCTCTGTAATAGAAAATAGCAATACTTATAAGCTGAAATCAAGCACAGGTTTTATGTTAGTCAAAGCCATTAAGCTATCAAAAGTAAACCCATGTACACAGAAACGTCCCAGGACTGGTTTGTAATATGTCCTGACAAATAAGCCATGAAAACAAGCTCCTCAAATTACTGATGCAACTTTTTAGCAGGGTCACAAACTCAGCTTTCTTTAAATTAAGTCAGCTCTTCCTAGTTTTTACTTCTCTAATTACCCAGCACTTAACGCATATTTTTTCCCTCAAATATTTGTTTTAGTAACAAAACAGCACTCCAAGTCTTAAAGGATTAACATTTTCTATTTTAAACACAAAATCTAAATTAAAAATTACTAACTTAAATGATAGCAAGAGTTTTACAGAGATTAATAAGCTTTAAGTACAGTTTATATTAGTACACAGACTTCAATTTATCAAATGTCACATATATCTTTCATGATTTGGGGATTTATTTCATTTATGAAGTAGTCAAATGAATCAGCTTGCCCTCGACTGTAACAAAATACTGCTTGGTGACTTGTGACAGACAGGGTTTTAACCTCTGACAGCGAGATTCATTGTGGAGCAGGAGCCAATCATAGATCCTGACGACACTTGTCTCCTCTAAGTTGGAATATAAAAAGCCACTTGGAATACAGTATACGGACTCCCTGGCGTGGCAGGTTGTCTCTCGGACGGTA

注：为Xhol Ⅰ酶切位点，为Bgl Ⅱ酶切位点；为转录起始位点。

实施例2

化合物对MSTN启动子及MSTN信号通路的抑制作用：

筛选流程大致为：在多聚赖氨酸(PDL)包被过的96孔板中，接种实施例1得到的HEK293T-MSTNP至1万/孔，过夜贴壁后，直接加入0.5μl分子库中的化合物(母液浓度10mg/ml)至终浓度25μg/ml，作用24h。吸弃上清，加入50μl新鲜的DMEM培养基，再加入50μlBright-Glo^TM试剂(Promega公司)，振荡反应5min，将100μl的反应液转移至白板中在化学发光检测仪中读数。

挑选对MSTN启动子活性抑制率超过70％的药物，并对其进行毒性排除、剂量依赖性检测，最终从分子库的26000个化合物中得到候选化合物，然后委托美国Life Chemicals公司进行合成得到该化合物，将合成的化合物通过核磁共振确定其结构，核磁共振结果见图9，从图9中可以得出该公司合成的化合物为本发明保护的化合物。图2A显示化合物对HEK293T-MSTNP细胞株在32μM浓度下没有呈现毒性，而图2B则显示化合物对MSTN启动子具有明显的抑制作用，并且呈现剂量依赖性。

MSTN作为TGFβ超家族的成员，具有典型的TGFβ信号通路的特点，能够激活SMAD，然后引起下游基因表达的改变。本实验室根据文献中报道，将SMAD作为转录因子的特异性结合序列进行串联重复12次，设计并化学合成得到了SMAD结合元件(SMAD BindingElements,SBE)，通过分子克隆的方法将其连接至pGL4.20中荧光素酶序列的前面，得到了重组质粒pGL4.20-SBE，并将重组质粒转染至HEK293细胞中，通过嘌呤霉素抗性筛选得到稳定转染模型细胞株HEK293-SBE。通过外源加入MSTN激活HEK293细胞中的MSTN信号通路，使荧光素酶报告基因上调表达。在PDL包被过的96孔板中，将HEK293-SBE接种至1万/孔，过夜贴壁后，吸弃上清，更换为无血清培养基(对照组)，只含10ng/ml MSTN(模型组)，或者含有不同浓度化合物和10ng/ml MSTN(给药组)，作用24h。用上述类似的方法，通过荧光素酶报告基因检测来测定化合物对MSTN信号通路的影响。图2C显示化合物在2.5μM和5μM浓度下对MSTN信号通路的启动具有明显的抑制作用。

MSTN是一种自分泌和旁分泌的细胞因子。因此，细胞外的MSTN对其自身的分泌情况也会有影响。在多聚赖氨酸(PDL)包被过的96孔板中，接种实施例1得到的HEK293T-MSTNP至1万/孔，过夜贴壁后，吸弃上清，更换为无血清培养基(对照组)，只含10ng/ml MSTN(模型组)，或者含有不同浓度化合物和10ng/ml MSTN(给药组)，作用24h。用上述类似的方法，通过荧光素酶报告基因检测来测定化合物对MSTN作为细胞因子增强自身启动子活性的影响。图2D显示化合物在2.5μM和5μM浓度下对MSTN作为细胞因子增强自身启动子活性具有明显的抑制作用。

实施例3

Western Blot和Real Time PCR检测化合物在体外肌肉萎缩模型中对MSTN表达及其信号通路的影响：

在体外测定通过MTT的方法化合物对C2C12细胞和C26细胞的细胞毒性。处于对数生长期的C2C12细胞和C26细胞经胰酶消化后，进行细胞计数，根据细胞的生长速度，C2C12细胞在96孔板中接种5000个细胞，而C26细胞在已用PDL包被过的96孔板中接种8000个细胞，37℃培养24h使细胞贴壁；吸弃上清培养基，将化合物用完全培养基进行2倍的倍比稀释后，浓度分别为2,4,8,16,32μM，每孔加入100μl，每个浓度设三个复孔，同时设立对照组和空白组，37℃继续培养24h和48h；每孔加入20μl浓度为5mg/ml MTT，37℃继续培养4h；小心将孔内液体吸尽，每孔加入150μl DMSO，室温下低速振荡10min，酶标仪测定570nm处的吸光值；将平行孔吸光值取平均值，按照公式计算细胞的存活率：存活率＝(AT-AB)/(AC-AB)×100％，其中AB、AC、AT分别代表空白组、对照组、加药化合物组的平均吸光值。以细胞存活率为纵坐标，化合物的浓度为横坐标作细胞存活率-药物浓度曲线，结果如图3A和图3B。MTT的结果显示，在32μM的浓度下，化合物无细胞毒性，而在2.5和5μM浓度下就能够抑制MSTN的表达。

体外肌肉萎缩模型的构建有多种方式，即可以用多种不同的刺激方式。肿瘤细胞的培养上清，TNFα，IL6，MSTN，化疗药物，地塞米松等等均为常用的体外肌肉萎缩模型的诱导因子。除地塞米松外，其他均可以理解为与癌症恶病质相关的肌肉萎缩诱导因子。其中肿瘤细胞上清最能模拟体内环境，因此在本发明中，选取C26细胞上清作为体外肌肉萎缩模型的刺激剂，在体外模拟癌症恶病质引起的肌肉萎缩。

C2C12细胞是小鼠来源的成肌细胞，在2％马血清(HS)的作用下，大约4～8天会诱导成为成熟的肌管细胞。C26细胞是小鼠来源的结肠癌细胞。在C26细胞贴壁长满培养平皿后，吸弃培养基，经由PBS轻轻洗涤后，加入无血清的培养基，在培养箱中孵育24h，收集上清，1500rpm离心10min，将上清用0.22μm的滤膜过滤，分装保存在-80℃。

将C2C12细胞接种至6孔板中，待融合度至90％后，吸弃上清，加入2％HS，在两天后进行换液，在第四天吸弃上清诱导培养基。将正常对照组仍然更换为2％HS，体外肌肉萎缩模型组更换为1/6CM+2％HS，在加药组分别加入2.5μM和5μM的化合物，每两天换液一次。

大约5天后，收集各组C2C12肌管细胞。用预冷的PBS润洗3次，提取各组RNA，使用NanoDrop进行定量，取1μg RNA进行逆转录得到各组cDNA，将cDNA稀释5倍。配制SYBR Green方法的qPCR反应液，2×Master Mix 10μl,Primer 0.4+0.4μl,Rox 0.4μl,cDNA 2μl,H₂O6.8μl,共20μl。采用2步法PCR，预变性95℃1min，变性95℃15s，延伸60℃1min，共55个循环。数据处理采用2^-ΔΔCt的方法，结果见图3C。在图3C结果显示，在此模型中，经由C26上清刺激的C2C12细胞中，MSTN的mRNA表达量上调，而化合物能够显著抑制MSTN的mRNA表达量，且具有剂量依赖性。

同样的模型下，收集各组C2C12肌管细胞，用预冷的PBS润洗3次，加入适量的细胞裂解液RIPA，冰上裂解30min。于4℃，12000rpm离心20min，上清液转移至新的1.5ml EP管。用BCA试剂盒对各种细胞裂解样品进行蛋白定量，每种细胞裂解样品按照相同总蛋白量制备，与适量5×上样缓冲液混合，沸水浴中变性10min，冷却后上样进行SDS-PAGE电泳分析。电泳完毕后进行转膜，将蛋白转移至PVDF膜上，经5％脱脂奶粉封闭液封闭后，根据待检测目的蛋白分子量大小裁剪PVDF膜，用MSTN的一抗4℃孵育过夜，用TBST溶液洗膜三次，再孵育二抗，TBST溶液洗膜三次后，用显影液进行显影并拍照。WesternBlot的方法测定MSTN、P-SMAD和P-FOXO3a的表达量，结果见图3D。图3D结果显示，经由C26上清引起的C2C12细胞中，MSTN蛋白表达量上调，而化合物能够显著抑制MSTN的蛋白表达量，且具有剂量依赖性。图3E结果显示，化合物也能够抑制SMAD的磷酸化水平，同时促进下游FOXO3a的磷酸化水平。

实施例4

Western Blot检测化合物在体外肌肉萎缩模型中蛋白标志物的表达：

在实施例3建立的肌肉萎缩模型下，Western Blot方法测定MyoD、MyoG和MyHC三种蛋白标志物的表达。图4A显示，由C26上清刺激的C2C12肌管细胞发生萎缩时MyoD、MyoG和MyHC三种蛋白标志物发生了显著的表达下调。而化合物在5μM浓度下均能够显著逆转这个现象。而在化合物作用的三天后就监测三种蛋白标志物的表达，图4B显示，从第三天开始，三种蛋白标志物的表达已经开始发生变化。其上结果显示，化合物在细胞水平能够显著抑制肿瘤上清引起肌管细胞萎缩。

实施例5

Western Blot检测化合物在体外肌肉萎缩模型中对蛋白质泛素化降解的抑制作用和对蛋白质合成的促进作用

泛素-蛋白酶体降解，简称为泛素化降解，是癌症恶病质引起肌肉萎缩中蛋白降解研究最为透彻的方式。肌肉细胞涉及蛋白质降解的信号通路有多种，但最终共同终点涉及两种肌肉特异性E3泛素蛋白连接酶，其特异性靶向某些蛋白质以通过蛋白酶体降解。这两种E3连接酶分别被称为Atrogin-1和MuRF-1。Atrogin-1是肌肉萎缩的高度特异性标志物，在包括癌症恶病质在内的多种肌肉萎缩模型中均表达上调。Atrogin-1引起直接参与骨骼肌蛋白质合成的eIF3f的泛素化，因此Atrogin-1在抑制蛋白质合成和促进蛋白质降解两方面造成了肌肉萎缩。Atrogin-1引起成MyoD和肌细胞生成素MyoG的多聚泛素化直至降解，因此抑制肌管的形成。MuRF-1在多种癌症恶病质引起的肌肉萎缩模型中均表达上调，主要介导MyHC的粗丝组分和其他粗丝组分的泛素化，也可靶向细丝组分中肌钙蛋白I和肌动蛋白使其泛素化降解。

另一方面，胰岛素样生长因子1(Insulin-like Growth Factor-1，IGF-1)激活的PI3K/AKT/mTOR信号通路在肌肉中促进下游的蛋白质合成，一些文献报道表明，该信号通路受到抑制与癌症恶病质有关。

在实施例3建立的肌肉萎缩模型下，Western Blot方法，一方面测定Atrogin-1和MuRF-1的表达量，一方面测定AKT、mTOR和P70S6K的激活程度。其结果如图5。化合物能够抑制Atrogin-1和MuRF-1的表达上调，同时促进AKT、mTOR和P70S6K的磷酸化水平。

实施例6

形态学观察记录化合物在C26细胞上清引起C2C12肌管细胞萎缩体外模型中对细胞形态的影响：

本发明通过倒置显微镜和激光共聚焦显微镜检测化合物在癌症恶病质引起肌肉萎缩的体外细胞模型中对细胞形态的影响。倒置显微镜直接拍照记录C2C12肌管细胞的形态。激光共聚焦显微镜检测C2C12肌管细胞中MyHC蛋白免疫染色的形态，即免疫荧光技术，包括以下步骤：

(1)在24孔细胞培养板中，将细胞用PBS浸洗3次，每次3min；

(2)用免疫染色固定液固定细胞15min，将细胞用PBS浸洗3次，每次3min；

(3)用0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min；

(4)将细胞用PBS浸洗3次，每次3min，尽可能吸走全部PBS，加入5％BSA，室温封闭30min；

(5)吸走封闭液，不再浸洗，每孔直接滴加150μl的稀释好的MyHC(8μg/ml)一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；

(6)回收一抗，用PBS浸洗3次，每次3min；

(7)尽可能吸走全部PBS后，滴加稀释好的荧光二抗(1:2000)，湿盒中室温孵育1h，从此后面所有步骤都尽量在暗处进行；

(8)尽可能吸走全部荧光二抗，用PBS浸洗3次，每次3min；

(9)滴加适量DAPI染色液，避光孵育5min，用PBS浸洗3次，每次3min；

(10)用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在激光共聚焦显微镜下观察采集图像。

结果见图6，从图6中可以得出，化合物能够缓解C26上清引起的C2C12肌管细胞萎缩。

实施例7

化合物在C26肿瘤引起小鼠肌肉萎缩体内模型中的逆转作用：

C26小鼠结肠癌肿瘤组织的研磨液为本课题组传代保存。将液氮保存的C26肿瘤组织瘤液快速融化后，接种在BALB/C小鼠腋下，待肿瘤长至1g左右，将小鼠处死，取出完整的肿瘤，称量其重量，用生理盐水进行1:60倍的稀释，然后进行接种。

将30只体重20～22g的雄性BALB/C小鼠按照体重随机分组，共四组：健康生长组，C26肿瘤组，C26肿瘤给药组。在肿瘤接种后给药，按照30mg/kg隔天给药一次并称量体重，大概20天后，将小鼠拉颈处死，记录体重以及股四头肌、腓肠肌、白色脂肪组织和棕色脂肪组织的重量，并留取股四头肌进行病理切片分析。其结果如图7，从图7中中可以得出，化合物有效缓解了C26肿瘤引起的体重下降、肌肉萎缩和脂肪流失。病理切片分析可见，给药化合物使得股四头肌形态发生了明显改善。Western Blot方法，测定小鼠股四头肌中两种E3连接酶Atrogin-1和MuRF-1的表达，C26肿瘤组小鼠股四头肌中Atrogin-1和MuRF-1发生显著上调，给药IMB0901能够降低Atrogin-1和MuRF-1的表达量。

实施例8

化合物在C26肿瘤和阿霉素引起小鼠肌肉萎缩体内模型中的逆转作用：

动物模型同实施例7，将40只体重20～22g的雄性BALB/C小鼠按照体重随机分组，共四组：健康生长组，C26肿瘤组，C26阿霉素组和C26阿霉素给药组。在肿瘤接种后，按照25mg/kg的剂量腹腔注射化合物，大约15次；当肿瘤体积100mm3之后注射阿霉素10mg/kg，共两针，中间相隔4天。

20天后，将小鼠拉颈处死，记录体重以及股四头肌、腓肠肌、白色脂肪组织和棕色脂肪组织的重量。其结果如图8，从图8中可以得出，C26肿瘤造成了癌症恶病质症状，而阿霉素会加重症状，给药化合物后，有效缓解了症状，体重下降、肌肉萎缩和脂肪流失的症状都得到了减轻。

由以上实施例可知，本发明提供的化合物能够通过抑制肌肉萎缩，进而能够治疗或者缓解癌症恶病质，而且具有降低阿霉素毒性的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所

<120> 一种抗癌症恶病质的化合物及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgctcgaga atcccttgcc ttcatctg 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaagatctt accgtccgag agacaacc 28

<210> 3

<211> 2008

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcgagaatc ccttgccttc atctgaagca cttgaggata atttgaagta aaaggcttga 60

aacaaagagc aagcccttct gcttcaagta ttaattacct atgaaaggga ctacatttag 120

ctacttatat tgctaaatta tatgcctcaa acccctttag ttgagaaact aaagataaga 180

gaagctaagt actgtgccgt ctttgtcatc gacttagaag aggcaaaatt gagatttgaa 240

ctcaggttta tttgactctt cagtctcagc tcacaatggc agtacagtct aaaaaaaaaa 300

aaaatcacag gatcaatttc ctctgaggta tatagcagca tgtgtaatga taattatgac 360

atcgaaaaga attctatgca gaaaaatgaa ttttccagac aaatctgact ttataggcct 420

gctctaatat tgtcttgtat aaagagggcc agatcacctc agggtgtctg ctttgtgtct 480

ggttttcctt catctttaat ggtgggcaaa tctagtacat tatggaagcc cacttttttt 540

ttcctcaaga gatatagatg cctcttaaaa atttgatgaa aatgcattaa cttttcaagc 600

tactgagctg cattttagtt cactgaggca gtaaattggg tgtatactgt acaggaatgg 660

tggtgaccta aaaataaata tttgatacaa gccaccatag tctcttgggg tgtgtgtaag 720

gggagtaatg aattaaaatt ctaaagactc ctcagcttcc caaacaggag gaggaactct 780

gtggcctgga agcgtcctct gtccctgctg ctgtgtttgt tcagctcttt aagagttcac 840

cccattcgat cttgtggctc ctaaagccaa gggtgaaagt ttgatccttg cagaggccac 900

ttaaattcag agaacaaaaa gcaccattct ctgccctaga ctctagccca gatccctgcc 960

aggtgtctgc cctctggtca aaatgagacg ctggcaaagg ggtgctagcc tgtgacagta 1020

tgggaacgca acaaaggaca cccctctaca tgcgacttgc tctttgtgtg ctcacgggac 1080

ctgacatcat tcacagagaa cacagattgc actttactgt cagccctgga agtctgagtc 1140

aaactgaaat aatgctccag cgctacttac aaaaatccat tatctactcg gcctaagtac 1200

agagcctggc ctcctcgctg acaggattct gttggcaatc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aagcaacact cagtctttag tctgtatctc tgtaatagaa aatagcaata cttataagct 1320

gaaatcaagc acaggtttta tgttagtcaa agccattaag ctatcaaaag taaacccatg 1380

tacacagaaa cgtcccagga ctggtttgta atatgtcctg acaaataagc catgaaaaca 1440

agctcctcaa attactgatg caacttttta gcagggtcac aaactcagct ttctttaaat 1500

taagtcagct cttcctagtt tttacttctc taattaccca gcacttaacg catatttttt 1560

ccctcaaata tttgttttag taacaaaaca gcactccaag tcttaaagga ttaacatttt 1620

ctattttaaa cacaaaatct aaattaaaaa ttactaactt aaatgatagc aagagtttta 1680

cagagattaa taagctttaa gtacagttta tattagtaca cagacttcaa tttatcaaat 1740

gtcacatata tctttcatga tttggggatt tatttcattt atgaagtagt caaatgaatc 1800

agcttgccct cgactgtaac aaaatactgc ttggtgactt gtgacagaca gggttttaac 1860

ctctgacagc gagattcatt gtggagcagg agccaatcat agatcctgac gacacttgtc 1920

tcctctaagt tggaatataa aaagccactt ggaatacagt atacaggact ccctggcgtg 1980

gcaggttgtc tctcggacgg taagatct 2008

Claims (9)

1.一种抗癌症恶病质的化合物在制备抑制肌肉萎缩药物中的应用；

所述化合物具有如式I所示的结构：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制肌肉萎缩药物为抑制肌生成抑制素的启动子活性的药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制肌肉萎缩药物为抑制肌生成抑制素的mRNA表达量的药物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制肌肉萎缩药物为抑制肌生成抑制素的蛋白表达量的药物。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制肌肉萎缩药物为抑制肌生成抑制素的信号通路的药物。

6.一种抗癌症恶病质的化合物在制备抑制肿瘤引起肌肉萎缩药物中的应用；

所述化合物具有如式I所示的结构：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制肿瘤引起肌肉萎缩药物为防治C26肿瘤引起的C2C12肌管细胞萎缩药物。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制肿瘤引起肌肉萎缩药物为防治C26肿瘤引起的体重下降和/或脂肪流失药物；

所述抑制肿瘤引起肌肉萎缩药物为抑制Atrogin-1和/或MuRF-1的药物。

9.一种抗癌症恶病质的化合物在制备降低阿霉素毒性药物中的应用；

所述化合物具有如式I所示的结构：