CN113244219B - 土木香内酯在制备治疗肿瘤恶病质疾病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明首次公开了土木香内酯在制备治疗肿瘤恶病质疾病的药物中的新用途，所述恶病质疾病包括肿瘤恶病质，包括不限于肿瘤组织导致的肌肉萎缩、脂肪减少和炎症反应等，其中肿瘤包括消化道相关癌症、肝癌、肺癌和结肠癌等。本发明还提出了一种用于治疗恶病质疾病的组合物。本发明发现土木香内酯具有抗肿瘤恶病质的显著作用，有利于恶病质改善，具广泛应用前景。

Description

土木香内酯在制备治疗肿瘤恶病质疾病的药物中的应用
技术领域
本发明涉及中药单体成分药物领域，具体涉及一种土木香内酯及其同分异构体异土木香内酯在治疗肿瘤恶病质疾病的药物中的应用。
背景技术
恶病质是一种系统性和进行性的消耗综合征，伴随消瘦、炎症、疲劳等全身机能衰竭的现象，多由癌症和其他严重慢性疾病(如慢性肺阻、慢性心力衰竭、艾滋病等)等引起，其中由肿瘤引起的恶病质被称之为肿瘤恶病质。肿瘤恶病质(Cancer cachexia)是各种恶性肿瘤患者的主要并发症，是导致众多肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤恶病质的防治已成为恶性肿瘤多学科综合治疗的重要组成部分，正受到越来越多的关注。肿瘤恶病质是由肿瘤细胞分泌物及机体释放的细胞因子共同引起的以全身代谢紊乱、进行性肌肉及脂肪消耗、体重下降、炎症反应以及全身脏器进行性衰竭为特征的一种消耗综合征，最主要的特征是骨骼肌萎缩所带来的病人体重的明显下降。在晚期肿瘤患者中，肿瘤恶病质的发生率高达50％-80％，其中乳腺癌和白血病患者发生率为40％，肺癌、结肠癌和前列腺癌患者发生率为50％，而胃癌和胰腺癌患者发生率高达80％，约20％的肿瘤患者直接死于由恶病质引起的心肺功能衰竭，故肿瘤恶病质是导致众多肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤恶病质的发生不仅削弱了化疗、放疗的效果，缩短生存期，同时也会严重影响患者的生存质量。恶病质是一种全身性的代谢紊乱综合征，其主要的临床症状是病人消瘦，包括体重下降、肌肉组织的损失伴随或不伴随着脂肪组织的损失以及系统性炎症反应。其中肿瘤恶病质是最主要的类型，在临床上尚缺乏有效的治疗药物。
肿瘤恶病质发病机制十分复杂，缺乏有效的治疗手段，目前仅有甲地孕酮被美国药品监督管理局批准用于改善肿瘤恶病质患者的食欲。刺激食欲结合加强患者营养摄入的治疗手段在临床上对肿瘤恶病质患者有一定的改善作用，但还是难以达到非常有效的治疗目的。
临床试验中也尝试了多种针对细胞因子的抗体，包括IL-1α、IL-6、TNF-α、myostatin等的特异抗体，但是结果发现抑制其中一种因子不能完全阻止恶病质的进程。Infliximab(TNFα的单克隆抗体)和Clazakizumab(IL-6的单克隆抗体)，分别被应用于胰腺肿瘤恶病质与非小细胞肺癌肿瘤恶病质的临床治疗研究，对患者的体重减少、骨骼肌萎缩及生活质量并没有明显改善。此外，胃饥饿素受体激动剂、选择性雄性激素受体(AR)激动剂、肾上腺素β受体阻滞剂和anti-myostatin多肽等都是研究的热点。近期原本最有希望的处于临床研究阶段的新药是Anamorelin(阿拉莫林，一种胃饥饿素受体激动剂)和Enobosarm(一种选择性AR激动剂)，但是目前该2种药物的III期临床研究均以失败告终。
总之，由于肿瘤恶病质是各种恶性肿瘤患者的主要并发症，不仅削弱了化疗、放疗的效果，缩短生存期，同时也会严重影响患者的生存质量。虽然肿瘤恶病质治疗的重要性已经获得了共识，但由于肿瘤恶病质的发病机制尚有诸多不明之处，肿瘤恶病质的治疗方法和新药的研发尚无突破性的进展，临床治疗成效有限，目前尚没有任何一个被批准作为特异性针对肿瘤恶病质的药物上市应用
土木香内酯(Alantolactone)是一种植物多萜类化合物，来自于多种菊形科植物，比如土木香(Inula helenium L.)根和大旋复花(Inula grandis chrenk)叶，其分子式是C15H20O2，分子量为232.31。土木香内酯具有多种药理活性。有研究表明，土木香内酯有显著的治疗关节炎作用，能抑制p-P65NF-κB的水平，降低炎症因子IL-6和TNF-α的水平；另外土木香内酯具有抗肿瘤活性，据报道它能够靶向p-stat3，抑制MDA-MB 231生长，也能够显著抑制GBM的生长。中国专利文献CN102973554A公开了土木香提取物土木香内酯治疗溃疡性结肠炎的功效。至目前有关土木香内酯在治疗肿瘤恶病质方面的作用尚未见有相关报道。
发明内容
本发明研究发现并首次提出，土木香内酯呈浓度依赖性缓解肌肉萎缩，其机制主要有激活TORC1通路，促进肌细胞蛋白合成；下调E3泛素化连接酶MuRF-1的表达，缓解肌肉细胞内蛋白降解；上调MyoG、MyoD和MHC的表达水平，促进肌细胞分化和生长。并且，土木香内酯呈浓度依赖性缓解脂肪降解，其机制主要有下调激素敏感性脂肪酶HSL的磷酸化水平，减少脂肪动员，抑制甘油三酯的分解；抑制AMP依赖性的蛋白激酶AMPKα的磷酸化，降低HSL的磷酸化水平，缓解脂解，同时缓解AMPKα磷酸化激活导致的能量过度消耗。通过全新的分子作用机制，缓解肌肉细胞内蛋白降解，促进肌细胞分化和生长，减少脂肪降解，缓解能量过度消耗，在体外能够逆转肿瘤引发的肌管细胞萎缩和脂肪细胞的降解，在体内能逆转肿瘤引发的肌肉组织萎缩，缓解脂肪组织的降解，抑制炎症反应，并抑制体重降低，具有显著的抗肿瘤恶病质的作用，有利于恶病质的改善。
本发明提出了一种土木香内酯包括式(1)所示的土木香内酯和/或如式(2)所示的同分异构体异土木香内酯在制备治疗抗肿瘤恶病质疾病的药物中的应用，即土木香内酯在制备治疗抗肿瘤恶病质疾病的药物中的新用途。
本发明中，所述土木香内酯包括如结构式1所示的化合物，其分子式是C15H20O2，分子量为232.318；以及土木香内酯的同分异构化合物异土木香内酯(结构式2)。
Figure GDA0003838927140000031
土木香内酯单体化合物在市场上已经有商业化供应，如上海甄准生物有限公司，包括但不限于来源于植物提取分离纯化的单体化合物，或者半合成或者全合成的单体化合物。
本发明中，所述土木香内酯可以植物提取物的形式提供。所述植物提取物包括菊科的多种植物，包括但不限于土木香、藏木香或大旋复花的提取物。通常提取方法是植物根经水蒸气蒸馏发获得含土木香内酯和异土木香内酯内酯为主的精油，进一步用柱层析将两种化合物分离纯化。比如文献报道的制备方法。
本发明还提出了土木香内酯包括如式(1)化合物以及如式(2)所示的同分异构体异土木香内酯有相同的效果及用途，进一步包括以这两个化合物为主要组分直接从土木香、藏木香等提取的挥发油，以及土木香、藏木香等提取的挥发油的亚硫酸钠加成物，具有相似效果及用途。
本发明提出有效量的土木香内酯包括如式(1)化合物以及如式(2)所示的同分异构体异土木香内酯在制备治疗恶病质疾病的药物中的应用；优选地，所述土木香内酯的用量为成人0.01μg-100mg/千克体重/天；优选地，成人为0.55mg/千克体重/天；更优选地，成人为1.10mg/千克体重/天。
本发明中，所述“土木香内酯”是指包括单一成分土木香内酯和/或异土木香内酯、包括式(1)所示的土木香内酯和如式(2)所示的土木香内酯的同分异构化合物异土木香内酯，或包括所述土木香内酯以及其它药学上可接受的成分所构成的组合物或复合物或混合物或亚硫酸钠加成物，其可以与其他药物联合作用。
具体地，例如，式(1)土木香内酯与式(2)异土木香内酯等混合组成的混合物土木香或者藏木香挥发油以及藏木香挥发油亚硫酸钠加成物。在实施例6中，土木香或者藏木香挥发油以及藏木香挥发油亚硫酸钠加成物体外明显缓解肌萎缩。
本发明还提出了土木香内酯包括式(1)和/或式(2)在制备抑制或治疗肌肉萎缩的药物或抑制剂中的应用。
其中，所述肌肉萎缩为恶病质疾病引起的肌肉萎缩。所述土木香内酯包括式(1)和/或式(2)可作为对肌管细胞萎缩有明显的缓解作用，且呈浓度依赖性关系的调控剂。
本发明还提出了土木香内酯包括式(1)土木香内酯和/或式(2)异土木香内酯在制备增肥、或保持或增加体重的药物中的应用。
本发明还提出了土木香内酯在制备抑制或缓解脂肪细胞脂解、体重丢失或减少的药物中的应用。
其中，所述脂肪细胞脂解、体重丢失或减少由恶病质疾病导致。在一具体实施方式中，所述土木香内酯可作为缓解C26肿瘤恶病质小鼠体重丢失的调控剂。
其中，所述土木香内酯可作为对脂肪细胞脂解有明显的缓解作用，且呈浓度依赖性关系的调控剂。
本发明中，所述恶病质疾病包括肿瘤恶病质。其中，所述肿瘤恶病质包括肿瘤组织导致的肌肉萎缩，肿瘤组织导致的脂肪减少，肿瘤组织导致的炎症反应，以及消化道相关癌症、肝癌和肺癌、结肠癌导致的肿瘤恶病质。
其中，所述肿瘤为实体肿瘤。
本发明中，所述药物可用于人类和/或动物，包括宠物。
本发明中，所述恶病质疾病包括肿瘤恶病质。
本发明中，所述肿瘤恶病质为肿瘤组织导致的肌肉萎缩、脂肪减少、炎症反应等，其中的肿瘤包括消化道相关癌症、肝癌、肺癌和结肠癌等。
本发明中，所述肿瘤为实体肿瘤。还包括其他肿瘤。
本发明中，所述药物可用于人和/或动物。
在一具体实施方案中，所述土木香内酯在细胞恶病质模型及动物恶病质模型中起显著有效作用。
本发明还提供一种用于治疗恶病质疾病的组合物，所述组合物含有有效量的土木香内酯包括式(1)土木香内酯和/或式(2)异土木香内酯，或还含有其他药学上可接受的成分。
本发明中，所述组合物包括用于人类和/或动物包括宠物的药物。
本发明中，所述组合物的产品剂型包括胶囊剂、片剂、口服制剂、微囊制剂、注射剂、软膏剂、喷雾剂或栓剂。如在实施例5中，土木香内酯直接溶解于玉米油给小鼠灌胃，缓解C26肿瘤小鼠恶病质症状。
本发明中，所述组合物的给药方式为注射、口服、胃肠外、吸入式喷雾或透皮给药。
本发明中，所述组合物中，所述土木香内酯占所述组合物总干重0.001-100wt％；优选地，为藏木香挥发油；更优选地，为土木香挥发油。
本发明中，所述组合物进一步包括蛋白质源、脂肪源和/或糖类源成分。
所述组合物的产品形式，可包括但不限于药物组合物。
本发明还提出了一种治疗恶病质疾病的方法，其特征在于，所述土木香内酯的用量为成人0.01μg-100mg/千克体重/天；优选地，成人为0.55mg/千克体重/天；更优选地，成人为1.1mg/千克体重/天。所述土木香内酯包括式(1)土木香内酯和/或式(2)异土木香内酯。
本发明中，“其他药学上可接受的成分”是指包括但不限于与土木香内酯没有拮抗作用的药物或其他成分，也可以是药学上允许或可接受的任意一种或多种辅料或其他载体。
本发明中，“恶病质”是指包括但不限于实体肿瘤诱发的恶病质。
本发明中，“实体肿瘤”是指包括但不限于原发性或继发性实体肿瘤如消化道相关癌症、肝癌和肺癌。
本发明中，肌肉萎缩为包括但不限于肿瘤恶病质诱发的肌肉萎缩。
本发明中，脂肪降解为包括但不限于肿瘤恶病质引发的脂肪降解。
本发明中，土木香内酯或其与其它药学上可接受的成分构成的组合物或复合物或混合物等的给药方式包括但不限于：注射、口服、胃肠外、吸入式喷雾或透皮给药。
本发明中各英文及缩写的含义如下：
Alantolactone：土木香内酯；FBS：胎牛血清；HS：马血清；DMEM培养液：含氨基酸和葡萄糖的培养液；PBS缓冲液：磷酸缓冲盐溶液；DMSO：二甲基亚砜。
在实施方案中，本发明提供土木香内酯包括式(1)土木香内酯、式(2)异土木香内酯的新应用，发现土木香内酯通过全新的分子作用机制，缓解肌肉细胞内蛋白降解，促进肌细胞分化和生长，减少脂肪降解，缓解能量过度消耗，在体外能够逆转肿瘤引发的肌管细胞萎缩和脂肪细胞的降解，在体内能逆转肿瘤引发的肌肉组织萎缩，缓解脂肪组织的降解，抑制炎症反应，并抑制体重降低，具有显著的抗肿瘤恶病质的作用，有利于恶病质的改善。
本发明有益效果还包括：本发明首次提出了土木香内酯包括式(1)土木香内酯、式(2)异土木香内酯在抗肿瘤恶病质相关领域的作用功效，提供了土木香内酯包括式(1)土木香内酯、式(2)异土木香内酯的新用途，尤其是治疗恶病质引起的肌肉萎缩、脂肪降解以及系统性炎症反应。本发明通过体内外实验首次发现土木香内酯包括式(1)土木香内酯、式(2)异土木香内酯抑制肿瘤恶病质引起的肌肉萎缩，首次发现土木香内酯包括式(1)土木香内酯、式(2)异土木香内酯可有效抑制肿瘤炎症因子IL-6的分泌，说明土木香内酯包括式(1)土木香内酯、式(2)异土木香内酯具有抗肿瘤恶病质的作用，能够应用于肿瘤恶病质及其相关病症的治疗，是一种理想的肿瘤恶病质治疗药物。
附图说明
图1是实施例1中土木香内酯对C2C12肌管细胞的活力影响实验结果。
图2是实施例2中对照组的H&E染色图。
图3是实施例2中模型组的H&E染色图。
图4为实施例2中实验组1的H&E染色图。
图5为实施例2中实验组2的H&E染色图。
图6为实施例2中实验组3的H&E染色图。
图7为实施例2中实验组4的H&E染色图。
图8是实施例2中土木香内酯缓解由C26培养液诱导的C2C12肌管细胞萎缩统计结果图。
图9是实施例2中土木香内酯在C2C12细胞肌萎缩模型中的蛋白免疫印迹实验结果。
图10是实施例3中土木香内酯对3T3-L1脂肪细胞的活力影响实验结果。
图11是实施例4中对照组的油红O染色图。
图12是实施例4中C26模型组的油红O染色图。
图13是实施例4中实验组1的油红O染色图。
图14是实施例4中实验组2的油红O染色图。
图15是实施例4中实验组3的油红O染色图。
图16是实施例4中实验组4的油红O染色图。
图17是实施例4中土木香内酯缓解3T3-L1脂肪细胞脂解的甘油检测实验结果。
图18是实施例4中土木香内酯缓解3T3-L1脂肪细胞脂解的甘油三酯检测实验结果。
图19是实施例4中土木香内酯在3T3-L1细胞脂解模型中的蛋白免疫印迹实验结果。
图20是实施例5中小鼠荷瘤体重图。
图21是实施例5中小鼠去瘤体重图
图22是实施例5中小鼠肿瘤体积变化图。
图23是实施例5中小鼠肿瘤重量图。
图24是实施例5中小鼠肿瘤解剖图。
图25是实施例5中小鼠腓肠肌重量图。
图26是实施例5中小鼠腓肠肌解剖图。
图27是实施例5中小鼠腓肠肌的蛋白免疫印迹实验结果。
图28是实施例5中小鼠附睾脂肪重量图。
图29是实施例5中小鼠附睾脂肪解剖图。
图30是实施例5中小鼠血清TNF-α浓度的图。
图31是实施例5中小鼠血清IL-6浓度的图。
图32是异土木香内酯、土木香挥发油、藏木香挥发油以及藏木香挥发油亚硫酸氢钠加成物缓解小鼠结肠癌细胞(C26)诱导的小鼠成肌细胞(C2C12)萎缩实验的统计结果图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
本发明提供土木香内酯治疗肿瘤恶病质及相关病症治疗的新用途。
本发明中，所采用的药效学试验方法，是本领域技术人员所熟知的方法。
本发明中，所采用的C2C12细胞(小鼠成肌细胞)、3T3-L1细胞(小鼠脂肪细胞)和C26细胞(小鼠结肠癌细胞)是从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库购买获得。BALB/c小鼠是通过上海灵畅生物科技有限公司购买获得的。
土木香内酯，购自上海甄准生物科技有限公司。
FBS(胎牛血清)，购自Biological Industries。
Horse serum(马血清)，购自Gibco。
高糖DMEM培养基，购自Hyclone。
RPMI-1640培养基，购自Hyclone。
无酚红高糖DMEM培养基，购自Hyclone。
P/S双抗(青霉素-链霉素混合液)购自Hyclone。
地塞米松，购自Sigma–Aldrich。
IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)广谱的磷酸二酯酶抑制剂，购自Sigma–Aldrich。
人重组胰岛素，购自上海今迈生物。
甘油检测试剂盒，购自北京普利莱基因技术有限公司。
实施例1土木香内酯对小鼠肌管细胞(C2C12)活力影响实验
采用MTT法检测C2C12细胞的存活率。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。三联液(10％SDS+5％异丁醇+0.01％浓盐酸，水溶液)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
通过以上方法可评价药物对小鼠成肌细胞(C2C12)的活力影响。具体方法如下：
将4×104/mL的C2C12细胞接种于24孔板中，培养体系为高糖DMEM培养液中加入10％FBS和1％双抗，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中。待细胞生长密度达100％时，将培养体系换成诱导分化液(含有2％HS和1％双抗的高糖DMEM培养液)，每48h换液一次，诱导分化5到6天后肌管分化成熟。按以下浓度0.625、1.25、2.5、5和10μM加入土木香内酯配制在2％HS分化液中，每孔1mL分化液，作用于分化成熟的C2C12肌管细胞48h。48h后，每孔吸走400uL培液，加入50uL的MTT(5mg/mL，PBS溶解)，放置细胞培养箱中4h，然后每孔加入250uL的三联液，放置细胞培养箱中过夜后，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值。
细胞活力(％)＝(ODdrug-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)×100％
结果与结论：请参照附图1，附图1是不同浓度土木香内酯作用下C2C12肌管细胞的存活率。如表1所示，当土木香内酯浓度为0.625μM时，存活率为108.54％；当土木香内酯浓度为1.25μM时，存活率为109.50％；浓度为2.5μM时，存活率为101.27％；浓度为5μM时，存活率为99.00％，浓度为10μM时，存活率为84.26％。
以上结果说明，土木香内酯对用于C2C12肌肉细胞的最大安全浓度为5μM。
表1是实施例1中土木香内酯对C2C12肌管细胞的活力影响统计结果，对应附图1。
表1土木香内酯对C2C12肌管细胞存活力影响结果表
土木香内酯(μM) 存活率(％)
0.625 108.54
1.25 109.50
2.5 101.27
5 99.00
10 84.26
实施例2土木香内酯缓解小鼠结肠癌细胞(C26)诱导的小鼠成肌细胞(C2C12)萎缩实验
采用直径测量法评价小鼠成肌细胞(C2C12)分化后的肌管直径。实验使用的染色方法为苏木精—伊红染色法，简称H&E染色法。苏木精染液为碱性，带正电荷，很容易以离子键结合细胞核中带负电荷且呈酸性的脱氧核糖核酸(DNA)而染蓝色；伊红为酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，很容易与细胞质中蛋白质的氨基正电荷结合而染红色。染色后的细胞置于高倍显微镜下采图样，利用image J软件可统计肌管细胞直径。
采用蛋白免疫印迹实验评价小鼠成肌细胞(C2C12)中相关蛋白质水平的的变化。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
通过以上方法可评价药物对C2C12细胞肌萎缩模型的作用。具体方法如下：将4×104/mL的C2C12细胞接种于24孔板中，培养体系为高糖DMEM培养液中加入10％FBS和1％双抗，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中。待细胞生长密度达100％时，将培养体系换成诱导分化液(含有2％HS和1％双抗的高糖DMEM培养液)，每48h换液一次，诱导分化5到6天后肌管分化成熟。另外，将C26细胞接种于T75瓶子中，培养液体系为含有10％FBS和1％双抗的高糖DMEM培养液，置于5％CO2、37℃恒温恒压细胞培养箱中。细胞传代时将600万细胞加入20mL的培养液中，放置培养箱中48h后，获取的上清液离心(4000rpm，10min)，再取得的上清液即为C26培养液。将C26培养液和2％HS分化液按照1:1比例混合，作为肌管细胞C2C12萎缩诱导液。除对照组加2％HS分化液以外，其余各组均加入等量的肌萎缩诱导液，一组作为模型组，其余组作为给药实验组，实验组中分别加入0.125、0.25、0.5和1μM的土木香内酯。
表2是实施例2中土木香内酯对由小鼠结肠癌细胞(C26)培养液诱导的C2C12肌管细胞肌萎缩逆转实验的给药方案。
表2实施例2中成肌细胞(C2C12)萎缩实验的给药样品
Figure GDA0003838927140000091
其中，序号对应附图的编号，μM指的是μmol/L。
肌管直径测量方法如下：
作用48h后，用固定液(无水乙醇：甲醛：冰醋酸＝20:2:1)固定1h以上，利用苏木精—伊红染色法进行染色，并置于高倍显微镜下随机采集图像，每孔大约采集20个视野图片，利用image J统计肌管直径。按如下公式计算肌萎缩逆转率：
肌萎缩逆转率＝(给药组肌管平均值-模型组肌管平均值)/(对照组肌管平均值-模型组肌管平均值)X100％
蛋白质免疫印迹方法如下：
蛋白样品制备：作用48h后，除去细胞培养液，用37℃预热的PBS洗涤3遍，加入胰酶完全消化后，用含有10％FBS的培养液终止消化，用移液枪吹打收集细胞，再用冰PBS洗3次。按比例(一个6孔板加入100uL)加入含1％磷酸蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，至于冰上裂解30min，每隔10min弹匀一次。裂解完成后，裂解液离心(13000RPM，4℃，30min)，吸取上清获得蛋白上清液。蛋白上清液进行BCA定量，用超纯水5倍稀释蛋白上清液(即按5μL蛋白上清液加入20μL超纯水中)，另用超纯水配制浓度为2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/mL的蛋白质标准品，再设置一个超纯水对照作为调零孔，总体积也为25μL。将BCA蛋白定量试剂盒中的A液和B液按100:1的比例配制BCA工作液，向上述蛋白样品、蛋白标准品和调零孔中分别加入200μL的BCA工作液，37℃水浴避光反应反应30min，每孔取200μl于562nm下检测OD值。以标准品的蛋白浓度为纵坐标，以标准品蛋白OD值作为纵坐标建立标准曲线，利用标准曲线计算样品的蛋白浓度。上样体系为20μg、20μl，根据蛋白浓度和上样体系分装蛋白，于100℃金属浴中加热变性10min，立即于冰上冷却10min，反复两次，-80℃保存或直接上样。
蛋白电泳：根据目的分子量配制合适的胶浓度和Marker，胶凝固后置于装有1x电泳缓冲液的电泳槽中，拔出梳子并赶除气泡后按顺序上样，上样前样品需涡旋均匀。先用70V恒压跑胶直至样品压成一条线且Marker已开始分开，然后改变电压为110V直至分子量25KD的Marker跑出胶底边为止。
转膜：配制适量转膜缓冲液，将大小适中的PVDF膜放入无水甲醇中活化30s，然后将膜放入配制好的转膜缓冲液中。从中间轻轻撬开两块玻璃板，切去无用部分并将胶小心取出，按照黑胶白膜及三明治规则，依次以黑面夹板——海绵——二层滤纸——胶——PVDF膜——二层滤纸——海绵——白面夹板的顺序夹好，每个步骤都赶尽气泡。放入电泳槽，接通电源，冰上250mA恒流转膜1h。
免疫反应：转膜结束后按照目的条带位置裁剪PVDF膜，置于TPBS配制的5％牛奶中，在侧晃摇床上室温封闭1h以上，除去封闭液，用TPBS将条带按10min，10min，10min洗三遍。用TPBS配制5％BSA作为一抗稀释液，按1：1000的比例稀释一抗，4℃于侧晃摇床上孵育过夜。除去一抗，用TPBS将条带按10min，10min，10min洗三遍。用TPBS配制5％牛奶作为二抗稀释液，按1：5000的比例稀释对应的二抗，在侧晃摇床上室温孵育条带1-2h，用TPBS将条带按10min，10min，10min洗三遍。1:1混合ECL试剂盒中的A液和B液，均匀敷在PVDF膜上，适当反应后将膜放入Bio-Rad显影仪中曝光，记录结果。
结果与结论：请参照附图2-9。附图2-7是土木香内酯缓解C26细胞培液诱导的C2C12肌管细胞萎缩的HE染色代表性图片，附图8是肌管直径统计结果图，附表3为肌管直径统计结果表。如图2-8和表3所示，土木香内酯对肌管细胞萎缩有明显的逆转作用，且呈浓度依赖性关系。当土木香内酯浓度为0.125μM时，逆转率为27.76％；当土木香内酯浓度为0.25μM时，逆转率为41.68％；浓度为0.5μM时，逆转率为51.87％；浓度为1μM时，逆转率为72.10％。
表3是土木香内酯缓解由C26培养液诱导的C2C12肌管细胞萎缩的统计结果，对应附图2-7。
表3土木香内酯对C2C12肌管细胞肌萎缩的逆转率
土木香内酯(μM) 肌萎缩逆转率(％)
0.125 27.76
0.25 41.68
0.5 51.87
1 72.10
附图9是土木香内酯在C2C12细胞肌萎缩模型中的蛋白免疫印迹实验结果。结果显示在C26细胞培养液的刺激下C2C12肌管细胞中p-stat3被激活，表达量上调，土木香内酯能呈浓度梯度性降低p-stat3的表达；同时，p-stat3的上调也激活了E3泛素化连接酶MuRF-1的表达，但这种表达的上调也被土木香内酯所抑制；由于p-stat3的上调，MHC、MyoD和MyoG的表达水平明显下降，而土木香内酯能缓解MHC、MyoD和MyoG的减少，且这种缓解是呈浓度依赖性的。另外，土木香内酯还能逆转由于C26细胞培养液造成的p-AKT和TORC1的减少。
以上结果说明，说明土木香内酯对肌肉细胞肌萎缩有明显的缓解作用，且呈浓度依赖性关系。
实施例3土木香内酯对小鼠脂肪细胞(3T3-L1)活力影响实验
采用MTT法检测3T3-L1细胞的存活率。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。三联液(10％SDS+5％异丁醇+0.01％浓盐酸，水溶液)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
通过以上方法可评价药物对小鼠脂肪细胞(3T3-L1)的活力影响。具体方法如下：
预先在96孔板中加入100μL的0.5％明胶，置于细胞培养箱中2h以上，除去明胶，将3×104/mL的3T3-L1细胞接种于96孔板中，培养液体系包括10％FBS和1％双抗的高糖DMEM培养基，置于5％CO2、37℃细胞培养箱中。每2-3天更换新鲜的培养液，培养7天后进行第一次分化。第一次分化的培养体系为DMEM培养液中添加0.5mM IBMX、5mg/ml胰岛素和1μM地塞米松，分化至少72h；第二次分化的培养体系为DMEM培养液中添加5mg/ml胰岛素，分化至少72h；第三次分化直接更换新鲜的DMEM培养液，分化72h，分化成功后明显可见细胞内含有大量油滴。将0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50和100μM土木香内酯配制在DMEM培养液中，作用于分化成熟的3T3-L1脂肪细胞48h。48h后，每孔吸走80uL培液，加入10uL的MTT(5mg/mL，PBS溶解)，放置细胞培养箱中4h，然后每孔加入50uL的三联液，放置细胞培养箱中过夜后，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值。
细胞活力(％)＝(ODdrug-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)×100％
结果与结论：请参照附图10。附图10是不同浓度土木香内酯作用下3T3-L1细胞的存活率。如表4所示，当土木香内酯浓度为0.39μM时，存活率为101.57％；当土木香内酯浓度为0.78μM时，存活率为101.67％；浓度为1.56μM时，存活率为102.23％；浓度为3.12μM时，存活率为105.07％；浓度为6.25μM时，存活率为105.80％；浓度为12.5μM时，存活率为106.17％；浓度为25μM时，存活率为104.27％；浓度为50μM时，存活率为10.33％；浓度为100μM时，存活率为4.57％。
以上结果说明，说明土木香内酯对用于3T3-L1脂肪细胞的最大安全浓度为25μM。
表4是实施例3中土木香内酯对3T3-L1脂肪细胞的活力实验统计结果，对应附图10。
表4.土木香内酯对3T3-L1细胞存活力的影响结果表
Figure GDA0003838927140000121
Figure GDA0003838927140000131
实施例4土木香内酯缓解由C26培养液诱导的3T3-L1脂肪细胞脂解的实验结果
采用油红O脂肪染色法评价细胞内脂肪含量。油红O为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色。
采用甘油检测评价细胞内脂肪含量。甘油激酶将甘油磷酸化为3-磷酸甘油；3-磷酸甘油被甘油磷酸氧化酶氧化产生过氧化氢；在过氧化氢酶的作用下生色底物转化为苯醌亚胺，其光密度值和甘油浓度成正比。
采用甘油三酯检测评价细胞内脂肪含量。脂肪酶分解血清中的甘油三酯为甘油；甘油激酶将甘油磷酸化为3-磷酸甘油；3-磷酸甘油被甘油磷酸氧化酶氧化产生过氧化氢；在过氧化氢酶的作用下生色底物转化为苯醌亚胺，其光密度值和甘油浓度成正比，进而和甘油三酯的含量成正比。
采用蛋白免疫印迹实验评价小鼠脂肪细胞细胞(3T3-L1)中相关蛋白质水平的变化。
通过以上方法可评价药物对细胞脂解模型的作用。具体方法如下：预先在96孔板中加入100μL的0.5％明胶，置于细胞培养箱中2h以上，除去明胶，将3×104/mL的3T3-L1细胞接种于96孔板中，培养液体系包括10％FBS和1％双抗的高糖DMEM培养基，置于5％CO2、37℃细胞培养箱中。每2-3天更换新鲜的培养液，培养7天后进行第一次分化。第一次分化的培养体系为DMEM培养液中添加0.5mM IBMX、5mg/ml胰岛素和1μM地塞米松，分化至少72h；第二次分化的培养体系为DMEM培养液中添加5mg/ml胰岛素，分化至少72h；第三次分化直接更换新鲜的DMEM培养液，分化72h，分化成功后明显可见细胞内含有大量油滴。另外，将C26细胞接种于T75瓶子中，培养液为含有10％FBS和1％双抗的高糖DMEM培养基，置于5％CO2、37℃细胞培养箱中。传代时6×106细胞/瓶传代，待48h后细胞汇合度为100％，向T75瓶子中加入15mL无酚红高糖DMEM培养液培养48h后，取上清，4000rpm离心10min，取上清。将C26上清和无酚红高糖DMEM培养液1:1混合，作为脂解诱导液。除对照组加无酚红高糖DMEM培养液以外，其他各组均加入等量的脂解诱导液，一组作为模型组，其余组作为给药实验组。向给药组细胞中分别加入2.5、5、10和20μM土木香内酯。
表5是实施例4中土木香内酯对由C26培养液诱导的3T3-L1脂肪细胞脂解逆转实验的给药方案。
表5实施例4中小鼠前脂肪细胞(3T3-L1)脂解实验的给药样品
Figure GDA0003838927140000141
油红O染色：作用48h后，将0.5％油红O染料(异丙醇配制)同蒸馏水3:2稀释，混匀后用0.42μm滤头过滤，作为染色剂。弃去细胞培液，用4％中性甲醛固定细胞1h以上，用吸泵吸净固定液，用PBS洗3遍，放置于室温通风处晾干20min，加入油红O染色液染色30min后除去，用PBS洗2遍后再用60％异丙醇洗去浮色，蒸馏水下洗2遍后置于倒高倍置显微镜下观察并拍摄照片。
甘油和甘油三酯检测方法如下：作用48h后，利用北京普利莱基因技术有限公司的甘油检测试剂盒和甘油三酯检测试剂盒分别检测脂肪细胞上清中甘油和脂肪细胞中的甘油三酯含量。
蛋白质免疫印迹方法如下：蛋白样品制备：作用48h后，除去细胞培养液，用37℃预热的PBS洗涤3遍，加入胰酶完全消化后，用含有10％FBS的培养液终止消化，用移液枪吹打收集细胞，再用冰PBS洗3次。按比例(一个6孔板加入100uL)加入含1％磷酸蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，至于冰上裂解30min，每隔10min弹匀一次。裂解完成后，裂解液离心(13000rpm，4℃，30min)，吸取上清获得蛋白上清液。蛋白上清液进行BCA定量，用超纯水5倍稀释蛋白上清液(即按5μL蛋白上清液加入20μL超纯水中)，另用超纯水配制浓度为2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/mL的蛋白质标准品，再设置一个超纯水对照作为调零孔，总体积也为25μL。将BCA蛋白定量试剂盒中的A液和B液按100:1的比例配制BCA工作液，向上述蛋白样品、蛋白标准品和调零孔中分别加入200μL的BCA工作液，37℃水浴避光反应反应30min，每孔取200μl于562nm下检测OD值。以标准品的蛋白浓度为纵坐标，以标准品蛋白OD值作为纵坐标建立标准曲线，利用标准曲线计算样品的蛋白浓度。上样体系为20μg、20μl，根据蛋白浓度和上样体系分装蛋白，于100℃金属浴中加热变性10min，立即于冰上冷却10min，反复两次，-80℃保存或直接上样。
蛋白电泳：根据目的分子量配制合适的胶浓度和Marker，胶凝固后置于装有1x电泳缓冲液的电泳槽中，拔出梳子并赶除气泡后按顺序上样，上样前样品需涡旋均匀。先用70V恒压跑胶直至样品压成一条线且Marker已开始分开，然后改变电压为110V直至分子量25KD的Marker跑出胶底边为止。
转膜：配制适量转膜缓冲液，将大小适中的PVDF膜放入无水甲醇中活化30s，然后将膜放入配制好的转膜缓冲液中。从中间轻轻撬开两块玻璃板，切去无用部分并将胶小心取出，按照黑胶白膜及三明治规则，依次以黑面夹板——海绵——二层滤纸——胶——PVDF膜——二层滤纸——海绵——白面夹板的顺序夹好，每个步骤都赶尽气泡。放入电泳槽，接通电源，冰上250mA恒流转膜1h。
免疫反应：转膜结束后按照目的条带位置裁剪PVDF膜，置于TPBS配制的5％牛奶中，在侧晃摇床上室温封闭1h以上，除去封闭液，用TPBS将条带按10min，10min，10min洗三遍。用TPBS配制5％BSA作为一抗稀释液，按1：1000的比例稀释一抗，4℃于侧晃摇床上孵育过夜。除去一抗，用TPBS将条带按10min，10min，10min洗三遍。用TPBS配制5％牛奶作为二抗稀释液，按1：5000的比例稀释对应的二抗，在侧晃摇床上室温孵育条带1-2h，用TPBS将条带按10min，10min，10min洗三遍。1:1混合ECL试剂盒中的A液和B液，均匀敷在PVDF膜上，适当反应后将膜放入Bio-Rad显影仪中曝光，记录结果。
结果与结论：请参照附图11-18。附图11-16是土木香内酯缓解C26细胞培液诱导的3T3-L1成熟脂肪细胞脂解的油红O染色代表性图片，如图11-16所示，正常对照组细胞中有大量脂滴堆积，脂滴较大，着色深且明亮；C26细胞培液单独作用后，细胞内脂滴显著变小且含量急剧减少；而在C26细胞培液作用下同时孵育土木香内酯时，随着土木香内酯浓度增加，细胞内油红O着色的脂肪滴含量也逐渐增多。
附图17和附图18分别是甘油检测结果和甘油三酯检测结果。
如图17和附图18显示，20μM土木香内酯抑制C26细胞培养液造成的3T3-L1成熟脂肪细胞甘油释放，5、10和20μM土木香内酯梯度减少了细胞内甘油三酯的分解。
附图20是土木香内酯在3T3-L1细胞脂解模型中的蛋白免疫印迹实验结果。结果显示在C26细胞培液的刺激下3T3-L1脂肪细胞中p-p65和p-stat3被激活，水平升高，土木香内酯能呈浓度梯度性降低p-p65和p-stat3的表达水平；C26细胞培液激活HSL(激素敏感性酯酶)的磷酸化，p-HSL水平升高，参与脂解进程，随着土木香内酯浓度升高，p-HSL水平降低；C26细胞培液激活AMPKα(AMP依赖的蛋白激酶α亚型)的磷酸化，p-AMPKα水平升高，能量代谢加剧，随着土木香内酯浓度升高，p-AMPKα水平降低。
以上结果说明，说明土木香内酯对脂肪细胞脂解有明显的缓解作用，且呈浓度依赖性关系。
实施例5土木香内酯治疗肿瘤恶病质动物模型实验结果
将C26细胞接种于T75培养瓶中，培养液为含有10％FBS和1％双抗的1640培养基，，置于5％CO2、37℃培养箱中扩大培养。1000rpm、3min离心收集细胞，并用冰PBS缓冲液洗去培养液，共2次，最终用PBS配制成1×107/ml的细胞悬液。100uL细胞悬液接种在BALB/c小鼠腋下保种。待肿瘤体积达到大约800mm3时解剖出肿瘤，每1g肿瘤加入3.5ml冰生理盐水，用组织匀浆器匀浆肿瘤组织得到肿瘤组织悬液。小鼠按体重分组，分为健康对照组、C26肿瘤模型组、土木香内酯5mg/kg和土木香内酯10mg/kg给药组，每组8只，各组小鼠体重均值相等。模型组和给药组每只小鼠腋下皮下接种100uL的C26肿瘤组织悬液。接种后第二天即开始给药。土木香内酯直接溶解于玉米油中，腹腔注射，每日一次，5mg/kg和10mg/kg给药组小鼠每天给予5mg/kg和10mg/kg土木香内酯，对照组和C26肿瘤模型组给予等量的玉米油。每天监测小鼠的体重和肿瘤体积。13天后结束实验，处死小鼠后取得腓肠肌、附睾脂肪、肿瘤以及血清等样本。
结果与结论：请参照附图21至31。
附图21-24是实验期间小鼠的荷瘤体重、去瘤体重、肿瘤体积和肿瘤实拍图。如图所示，健康组小鼠体重在持续增长；而C26肿瘤模型组小鼠荷瘤体重增加比对照组缓慢，给药组小鼠体重增加介入对照组和C26模型组之间。C26模型组小鼠去瘤体重从第9天开始逐渐下降，至第13天明显下降，与对照组相比有显著性差异p<0.01)；土木香内酯5mg/kg和土木香内酯10mg/kg给药组小鼠去瘤体重从第11天开始下降，至第13天明显高于C26模型组小鼠，差异都显著。土木香内酯对C26肿瘤体积有一定的抑制作用(p<0.05)，但对肿瘤重量的影响无统计学意义。
附图25、26是小鼠腓肠肌重量和腓肠肌实拍图，如图所示，C26肿瘤模型组小鼠腓肠肌重量显著低于健康组，且差异有统计学意义(p<0.05)，土木香内酯组腓肠肌重量都大于C26肿瘤模型组，虽然且有统计学意义(p<0.05)。
附图27是小鼠腓肠肌组织蛋白质免疫印记实验结果。结果显示C26肿瘤激活p-p65和p-stat3，其表达量上调，土木香内酯能降低p-p65和p-stat3的表达水平；同时，p-p65和p-stat3的上调也激活了E3泛素化连接酶MuRF-1的表达，但这种表达的上调也被土木香内酯所抑制；由于p-stat3和p-p65的上调，MHC、MyoD和MyoG的表达水平明显下降，而土木香内酯能缓解MHC、MyoD和MyoG的减少。另外，土木香内酯还能逆转由于C26肿瘤诱导的p-AKT和TORC1的减少。
附图28和29是小鼠附睾脂肪重量和附睾脂肪实拍图，如图所示，C26肿瘤模型组小鼠附睾脂肪重量显著小于健康组，且差异有统计学意义(p<0.01)，土木香内酯组附睾脂肪重量虽略高于C26肿瘤模型组，但无统计学意义。
附图30是小鼠血清炎症因子TNF-α含量检测。结果显示C26肿瘤模型组小鼠血清TNF-α含量显著高于健康组，且差异有统计学意义(p<0.05)，土木香内酯组TNF-α含量与C26肿瘤模型组，无统计学意义。
附图31是小鼠血清炎症因子IL-6含量检测。结果显示C26肿瘤模型组小鼠血清IL-6含量显著高于健康组，且差异有统计学意义(p<0.01)，土木香内酯组IL-6浓度明显低于C26肿瘤模型，且差异显著(p<0.05)。
以上结果说明，土木香内酯缓解C26肿瘤恶病质小鼠体重丢失、抑制肌肉组织萎缩和炎症反应。
实施例6异土木香内酯、土木香挥发油、藏木香挥发油以及藏木香挥发油亚硫酸氢钠加成物缓解小鼠结肠癌细胞(C26)诱导的小鼠成肌细胞(C2C12)萎缩实验
采用直径测量法评价小鼠成肌细胞(C2C12)分化后的肌管直径。实验使用的染色方法为苏木精—伊红染色法，简称H&E染色法。苏木精染液为碱性，带正电荷，很容易以离子键结合细胞核中带负电荷且呈酸性的脱氧核糖核酸(DNA)而染蓝色；伊红为酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，很容易与细胞质中蛋白质的氨基正电荷结合而染红色。染色后的细胞置于高倍显微镜下采图样，利用image J软件可统计肌管细胞直径。
通过以上方法可评价药物对C2C12细胞肌萎缩模型的作用。具体方法如下：将4×104/mL的C2C12细胞接种于24孔板中，培养体系为高糖DMEM培养液中加入10％FBS和1％双抗，置于5％CO2、37℃恒温培养箱中。待细胞生长密度达100％时，将培养体系换成诱导分化液(含有2％HS和1％双抗的高糖DMEM培养液)，每48h换液一次，诱导分化5到6天后肌管分化成熟。另外，将C26细胞接种于T75瓶子中，培养液体系为含有10％FBS和1％双抗的高糖DMEM培养液，置于5％CO2、37℃恒温恒压细胞培养箱中。细胞传代时将600万细胞加入20mL的培养液中，放置培养箱中48h后，获取的上清液离心(4000rpm，10min)，再取得的上清液即为C26培养液。将C26培养液和2％HS分化液按照1:1比例混合，作为肌管细胞C2C12萎缩诱导液。除对照组加2％HS分化液以外，其余各组均加入等量的肌萎缩诱导液，一组作为模型组，其余组作为给药实验组，实验组中分别加入不同浓度的土木香内酯(式1)、异土木香内酯(式2)、土木香挥发油、藏木香挥发油以及藏木香挥发油亚硫酸氢钠加成物。
表6是实施例6中土木香内酯对由小鼠结肠癌细胞(C26)培养液诱导的C2C12肌管细胞肌萎缩逆转实验的给药方案。
表6实施例6中成肌细胞(C2C12)萎缩实验的给药样品
Figure GDA0003838927140000181
其中，序号对应附图的编号，μM指的是μmol/L。
表7实施例6中成肌细胞(C2C12)萎缩实验的给药样品成分
Figure GDA0003838927140000191
肌管直径测量方法如下：
作用48h后，用固定液(无水乙醇：甲醛：冰醋酸＝20:2:1)固定1h以上，利用苏木精—伊红染色法进行染色，并置于高倍显微镜下随机采集图像，每孔大约采集20个视野图片，利用image J统计肌管直径。按如下公式计算肌萎缩逆转率：
肌萎缩逆转率＝(给药组肌管平均值-模型组肌管平均值)/(对照组肌管平均值-模型组肌管平均值)X100％
结果与结论：请参照附图32。附图32是肌管直径统计结果图，附表8为肌管直径统计结果表。如图32和表8所示，异土木香内酯、土木香挥发油、藏木香挥发油以及藏木香挥发油亚硫酸氢钠加成物对肌管细胞萎缩有明显的逆转作用，且呈浓度依赖性关系。土木香内酯作为阳性对照组，浓度为1.25μM和2.5μM时，逆转率为55.10％和57.08％；异土木香内酯浓度为1.25、2.5、5和10μM时，逆转率分别为21.23％、22.04％、41.8％0和58.74％；；土木香挥发油含有42.20％的土木香内酯和26.26％的异土木香内酯，浓度为1.25、2.5、5和10μM时，逆转率分别为35.75％、50.28％、51.09％0和73.69％；藏木香挥发油含有48.7％的土木香内酯和26.80％的异土木香内酯，浓度为1.25、2.5和5μM时，逆转率分别为33.48％、52.38％和56.10％；藏木香挥发油亚硫酸氢钠加成物只含具有α,β不饱和内酯结构成分的亚硫酸钠加成物，浓度为1.25、2.5、5和10μM时，逆转率分别为12.18％、30.12％、32.26％和43.03％。
表8异土木香内酯、土木香挥发油、藏木香挥发油以及藏木香挥发油亚硫酸氢钠加成物缓解由C26培养液诱导的C2C12肌管细胞萎缩的统计结果，对应附图2-7。
表8异土木香内酯、土木香挥发油、藏木香挥发油以及藏木香挥发油亚硫酸氢钠加成物对C2C12肌管细胞肌萎缩的逆转率
Figure GDA0003838927140000201
以上结果说明，说明土木香内酯对肌肉细胞肌萎缩有明显的缓解作用，且呈浓度依赖性关系。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (13)

1.式（1）所示的土木香内酯和/或如式（2）所示的同分异构体异土木香内酯在制备治疗肿瘤恶病质疾病的药物中的应用；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.如权利要求1所述式（1）所示的土木香内酯和/或如式（2）所示的同分异构体异土木香内酯在制备抑制或治疗肌肉萎缩的药物或抑制剂中的应用，所述肌肉萎缩由肿瘤恶病质疾病引起。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物可用于人和/或动物。
4.如权利要求1所述式（1）所示的土木香内酯和/或如式（2）所示的同分异构体异土木香内酯在制备抑制或缓解脂肪细胞脂解、体重丢失或减少的药物中的应用，所述脂肪细胞脂解、体重丢失或减少由肿瘤恶病质疾病导致。
5.如权利要求1-4之任一项所述的应用，其特征在于，所述土木香内酯的用量为0.01μg-100mg/千克体重/天。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还含有其他药学上可接受的成分。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物可用于人类和/或动物。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的产品剂型包括胶囊剂、片剂、口服制剂、注射剂、软膏剂、喷雾剂或栓剂。
9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为注射、口服、吸入式喷雾或透皮给药。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物中，所述土木香内酯占所述组合物总干重0.001-100wt%。
11.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物进一步包括蛋白质源、脂肪源和/或糖类源成分。
12.如权利要求1、2或4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤恶病质包括肿瘤组织导致的肌肉萎缩，肿瘤组织导致的脂肪减少，肿瘤组织导致的炎症反应，以及消化道相关癌症、肝癌和肺癌、结肠癌导致的肿瘤恶病质。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为实体肿瘤。
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