EA023864B1 - Применение мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством и/или лучевой терапией для лечения метастазов в головном мозге - Google Patents

Применение мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством и/или лучевой терапией для лечения метастазов в головном мозге Download PDF

Info

Publication number
EA023864B1
EA023864B1 EA201270264A EA201270264A EA023864B1 EA 023864 B1 EA023864 B1 EA 023864B1 EA 201270264 A EA201270264 A EA 201270264A EA 201270264 A EA201270264 A EA 201270264A EA 023864 B1 EA023864 B1 EA 023864B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
brain
cells
astrocytes
paclitaxel
temozolomide
Prior art date
Application number
EA201270264A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201270264A1 (ru
Inventor
Исаия Дж. Фидлер
Сун-дзин Ким
Original Assignee
Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=42938154&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA023864(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем filed Critical Борд Оф Риджентс, Дзе Юниверсити Оф Техас Систем
Publication of EA201270264A1 publication Critical patent/EA201270264A1/ru
Publication of EA023864B1 publication Critical patent/EA023864B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4188—1,3-Diazoles condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. biotin, sorbinil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/10—X-ray therapy; Gamma-ray therapy; Particle-irradiation therapy
    • A61N5/1077—Beam delivery systems
    • A61N5/1084—Beam delivery systems for delivering multiple intersecting beams at the same time, e.g. gamma knives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/08—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к применению мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, или лучевой терапией или как лучевой терапией, так и цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, для предупреждения распространения метастазов в головной мозг или лечения метастазов в головном мозге.

Description

Предшествующий уровень техники
Метастазирование в головной мозг является одной из самых трудных проблем, с которыми сталкивается онкология.
Метастатические опухоли устойчивы к большинству химиотерапевтических средств. Лечениями метастаза в головной мозг являются в основном лучевая терапия всего головного мозга и сфокусированная лучевая терапия, вместе с хирургической резекцией опухолей в меньшем числе случаев. Большинство химиотерапевтических схем включает 2-3 таких средств, как цисплатин, циклофосфамид, этопозид, тенипозид, митомицин, иринотекан, винорелбин, этопозид, ифосфамид, темозоломид и фторурацил (5РИ). Их назначают в комбинации с лучевой терапией. Эффект этих химиотерапий на продление срока жизни существует, как правило, менее года. Довольно новой химиотерапией опухолей головного мозга является темозоломид, используемый вместе с облучением всего головного мозга. Результаты являются предварительными, но темозоломид, как представляется, оказывает некоторый ограниченный эффект на степень реакции по сравнению с облучением самим по себе и, как представляется, обладает некоторой клинической активностью в комбинации с облучением в испытаниях фазы II.
Несмотря на значительные усилия, ограниченные варианты лечения, имеющиеся в наличие для метастаза в головной мозг, оставались слабыми и к тому же часто больше паллиативными, чем терапевтически эффективными. Такое состояние дел осознавали в течение длительного периода, но до сих пор значительные достижения не реализованы. Соответственно, существует огромная и существующая в настоящий момент медицинская потребность в новых терапевтических подходах и лекарственных средствах, эффективных при лечении метастаза в головной мозг.
В представленном ниже описании обсуждаются антагонисты рецепторов эндотелина относительно метастаза в головной мозг. Эндотелин-1 (в дальнейшем ЕТ-1), вазоактивный пептид, продуцируется в основном в эндотелиальных, васкулярных гладкомышечных и эпителиальных клетках. ЕТ-1 проявляет свой физиологический эффект через посредство двух сопряженных с белком О рецепторов с высоким сродством, рецепторов эндотелина-А (в дальнейшем ЕТА) и эндотелина-В (в дальнейшем ЕТВ). Антагонисты рецепторов эндотелина (ЕРА) являются широко известным классом соединений, способных к ингибированию этих рецепторов эндотелина (в дальнейшем ЕТР). Внутри этого класса существуют подклассы антагонистов, специфичных по отношению к ЕТА или ЕТВ, и подклассы, эффективные против них обоих (с двойной специфичностью). Один член подкласса с двойной специфичностью, бозентан, разрешен в настоящее время для применения при лечении артериальной легочной гипертензии.
Некоторые ЕРА были исследованы в отношении применения для лечения рака [№1коп ТВ.. е! а1., РНаке 3, гапбот17еб, сопйойеб 1па1 оГ айикейап ίη райейк \νί11ι иоите1а51айс, Ногтопе-геГгаеЮгу ргок!а1е сапсег. Сапсег, 2008 Иоу 1; 113(9): 2376-2378; СЫарроп А.А., е! а1. РНаке, Ι/ΙΙ к1ибу оГ айикейап, ап ЕТА гесерЮг айадойй, ίη сотЫпайоп етйН рас1йахе1 апб сагЬор1айп ак йгк1-1ше Шегару ίη абуапсеб поп-кта11 се11 1ипд сапсег. Сйп Сапсег Рек, 2008 Маг 1; 14(5): 1464-1469]. В этих исследования почти совершенно исключались пациенты с активным метастазированием в головной мозг [там же]. Такое исключение сделано согласно общей точке зрения, что существующие метастазы в головной мозг не будут реагировать на лечение, и поэтому коэффициент заболеваемости и симптомы вследствие этих метастазов могли бы маскировать эффекты исследуемого лечения на первичную опухоль [Сагбеп С.Р., е! а1., ЕНдШййу оГ райейк \\ЙН Ьгат те1ак1акек Гог рНаке I 1па1к: йте Гог а геййпк? ТНе Бапсе! Опсо1оду, Уо1. 9, 1ккие 10, Радек 1012-1017, ОйоЬег 2008 бог10.1016/§1470-2045(08)70257-2]. Эта стандартная стратегия для разработки клинического испытания используется для акцентирования на общем ожидании, что терапии, эффективные против первичных опухолей и даже опухолей, развившихся в результате метастазирования в не являющиеся головным мозгом места, будут неуспешными в воздействии на опухоли, развившиеся в результате метастазирования в головной мозг.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к применению мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, или лучевой терапией или как лучевой терапией, так и цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, для предупреждения распространения метастазов в головной мозг или лечения метастазов в головном мозге.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к применению мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида.
В следующем варианте осуществления изобретения мацитентан применяется в комбинации с лучевой терапией.
В еще одном варианте осуществления изобретения лучевая терапия представляет собой лучевую терапию всего головного мозга или стереотаксическую радиохирургию.
Настоящее изобретение также относится к применению мацитентана в комбинации как с лучевой терапией, так и с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, для предупреждения распространения метастазов в головной мозг или лечения метастазов в головном мозге, в частности, где предупреждение распростране- 1 023864 ния метастазов включает снижение риска и/или степени распространения метастазов в головной мозг.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: ίη νίίτο культуру клеток рака молочной железы ΜΌΑ-ΜΒ-231 (Т) и мышиных астроцитов (А) оценивали с помощью сканирующей электронной микроскопии. Несомненен прямой контакт между астроцитами (с удлиненными отростками-ножками) и опухолевыми клетками.
Фиг. 2: при сокультивированиях астроцитов и метастатических раковых клеток выявлялся перенос красителя между подвергнутыми сокультивированию клетками.
Фиг. 3: культивирование клеток рака молочной железы человека ΜΌΑ-ΜΒ-231 или клеток рака легкого человека РС14Вг4 с астроцитами (но не с фибробластами 3Т3) снижало относительный показатель апоптоза (увеличивало устойчивость) опухолевых клеток, подвергнутых инкубации в течение 72 ч с паклитакселом (5 нг/мл), на 58,3±8,9% (среднее значение±среднеквадратическое отклонение, Р<0,01) и 61,8±6,7% (среднее значение±среднеквадратическое отклонение, Р<0,05) соответственно (показатель апоптоза сопоставляли с использованием критерия Стьюдента).
Фиг. 4: клетки рака легкого человека РС14Вг4 культивировали сами по себе или с астроцитами (для прямого межклеточного контакта) в среде, содержащей ассоциированный с Р-гликопротеином адриамицин (200 нг/мл), паклитаксел (5 нг/мл), винбластин (3 нг/мл), винкристин (8 нг/мл) и диссоциированный от Р-гликопротеина 5-РИ (500 нг/мл) или цисплатин (2,4 мкг/мл).
Фиг. 5: опосредуемая астроцитами защита метастатически распространяющихся в головной мозг клеток от индуцируемой цитотоксической химиотерапией гибели клеток не длится дольше 72 ч после утраты прямого контакта между астроцитами и метастатически распространяющимися в головной мозг клетками.
Фиг. 6: условия определения профилей экспрессии генов позволяли проводить различия между мышиной и человеческой мРНК.
Фиг. 7: 1069 генов в клетках ΜΌΑ-ΜΒ-231 и 594 гена в клетках РС14Вг4 характеризовались дифференциальной экспрессией. Β результате двухгенного множественного сопоставления выявлена увеличенная экспрессия нескольких генов, которые, как хорошо известно, связаны с противодействием апоптозу и выживанием: глутатион-§-трансфераза 5 (Ο8ΤΑ5), ВСЬ2Ь1, ΤΑίδΤ.
Фиг. 8: экспрессия нескольких противоапоптозных генов и генов выживания была подтверждена на уровне белка с помощью анализа с использованием Вестерн-блоттинга.
Фиг. 9: относящиеся к транскрипции генов данные были собраны из экспериментов с использованием двух циклов сокультивирования.
Фиг. 10: увеличенная экспрессия ΕΤΑ-Κ в клетках рака молочной железы человека ΜΌΑ-ΜΒ-231, подвергнутых сокультивированию с астроцитами, но не с фибробластами (3Т3).
Фиг. 11: экспрессия рАКТ клетками рака молочной железы человека ΜΌΑ-ΜΒ-231, подвергнутыми сокультивированию с астроцитами/таксолом.
Фиг. 12: АСТ-064992, добавленный к клеткам рака молочной железы человека ΜΌΑ-ΜΒ-231 сам по себе или вместе с астроцитами или фибробластами 3Т3, не вызывал какие-либо поддающиеся измерению цитотоксические эффекты.
Фиг. 13: АСТ-064992, добавленный к клеткам рака легкого РС14 сам по себе или вместе с астроцитами или фибробластами 3Т3, не вызывал какие-либо поддающиеся измерению цитотоксические эффекты.
Фиг. 14А-О: иммуноокрашивание на ΕΤΑΚ и ΕΤΒΚ в нескольких ίη νίνο экспериментальных моделях метастатического рака головного мозга выявляет относительно высокую экспрессию, специфически связанную с опухолями, но не с нормальными тканями головного мозга.
Фиг. 15: лечение комбинацией паклитаксела и АСТ-064992 клеток рака молочной железы человека ΜΌΑ-ΜΒ-231, сокультивированных с астроцитами или с фибробластами 3Т3.
Фиг. 16: лечение комбинацией паклитаксела и АСТ-064992 клеток рака легкого человека ΡΟ4Βτ4, сокультивированных с астроцитами или с фибробластами 3Т3.
Фиг. 17: добавление АСТ-064992 к сокультурам астроцитов и опухолевых клеток ингибировало экспрессию фактора выживания рАКТ и рМАРК.
Фиг. 18: фиксации и окрашиванию для визуализации метастазов в головной мозг подвергали срезы головного мозга групп, подвергнутых лечению контролем (носителем) (фиг. 18А); темозоломидом (ΤΜΖ) 10 мг/кг перорально, ежедневно (фиг. 18В); АСТ-064992 50 мг/кг, перорально, ежедневно (фиг. 18С); комбинацией ΤΜΖ+ΑΟΓ-064992 (фиг. 180) или комбинацией ΤΜΖ+ΑΟΓ-064992, при большем увеличении (фиг. 18Е).
Фиг. 19: фиксации и окрашиванию для визуализации метастазов в головной мозг подвергали срезы головного мозга групп, подвергнутых лечению: А. контролем (инъецируемым с использованием раствора носителя); В. паклитакселом (8 мг/кг, вводимым внутрюшинно один раз в неделю); С. АСТ-064992 (50 мг/кг, вводимым перорально один раз в день); и Ό. Комбинацией АСТ-064992 и паклитаксела.
Фиг. 20: репрезентативные срезы головного мозга из четырех групп, подвергнутых лечению, окрашивали на ΟΌ31 (маркер эндотелиальных клеток) и Κί67 (маркер клеточной пролиферации): А. контрольные мыши; В. мыши, подвергнутые лечению лишь паклитакселом; С. мыши, подвергнутые лече- 2 023864 нию лишь АСТ-064992; Ό. мыши, подвергнутые лечению паклитакселом и АСТ-064992.
Фиг. 21: срезы головного мозга из различных групп, подвернутых лечению, исследовали посредством ίη кйи бИТР-мечения концов в месте разрыва цепей с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы (ТиМЕЬ): А. Контрольные мыши; В. мыши, подвергнутые лечению паклитакселом; С. мыши, подвергнутые лечению АСТ-064992; Ό. мыши, подвергнутые лечению комбинацией АСТ-064992 плюс паклитаксел.
Фиг. 22: срезы головного мозгов мышей из четырех групп, подвергнутых лечению, подвергали иммуноокрашиванию для выявления совместной локализации ЕТАК (красного) и фосфосерина (зеленого), приводившей к оранжево-желтому цвету. А. Головной мозг от контрольных мышей. В. Головной мозг мышей, подвергнутых лечению паклитакселом. С. Головной мозг мышей, подвергнутых лечению АСТ064992 самим по себе. Ό. Головной мозг мышей, подвергнутых лечению комбинацией АСТ-064992 + паклитаксел.
Фиг. 23 демонстрирует исследование выживания в случае лечения АСТ064992 и таксолом экспериментального метастаза в головной мозг клеток рака молочной железы человека МЭА231.
Подробное описание настоящего изобретения
Определения.
Используемое в настоящем описании единственное число при использовании совместно с термином включающий в формуле изобретения и/или описании может означать один, но оно также соответствует значению один или несколько, по крайней мере один и один или более чем один. Более того, термины имеющий, содержащий и включающий являются равноценными, и квалифицированный в данной области техники специалист знает, что эти термины являются терминами с возможностью расширения.
Используемый здесь термин лечение относится к назначению субъекту терапевтически эффективного медицинского вмешательства, такого как химиотерапия, чтобы у субъекта отмечалось улучшение параметров, относящихся к раку. Улучшением является любое наблюдаемое или измеряемое улучшение, включающее изменения размера злокачественной опухоли, снижение скорости роста злокачественной опухоли или субъективных или объективных показателей боли, сопровождающей злокачественную опухоль. Таким образом, квалифицированный в данной области техники специалист понимает, что лечение может улучшить состояние пациента, но может не быть полным излечением заболевания.
Используемый здесь термин эффективное количество или терапевтически эффективное количество относится к количеству, которое приводит к ослаблению или исключению симптомов заболевания или состояния.
Используемый здесь термин имеющаяся опухоль, развившаяся в результате метастазирования в головной мозг, относится к состоящей из множества клеток опухоли головного мозга и метастазу в головной мозг, окруженному и инфильтрированному ОРАР-положительными астроцитами. Существует два клинически отличных типа имеющихся опухолей, развившихся в результате метастазирования в головной мозг: микрометастазы, которые являются слишком маленькими, чтобы быть визуализированными радиологическим способом, и видимые метастазы, которые являются такими опухолями, которые являются достаточно большими, чтобы быть различимыми с помощью клинического радиологического способа, такого как магнитно-резонансная томография, компьютерная томография или позитронноэмиссионная томография. Эти метастатические очаги отличны от метастатических раковых клеток в системном кровотоке и единичных раковых клеток, проникающих из сосудов в ткань головного мозга или латентно находящихся в ней [см. в целом Шйаппа А. Шуес & бсГГгсу Ро11агб, Мюгоепупоптеп1а1 геди1абоп оГ те1ак1а515, ΝηΙ Кеу Сапсег 9, 239-252 (Аргб 2009) | бог10.1038/пгс2618]. Как здесь используется, микрометастаз предпочтительно определяют как группу конфлюэнтных раковых клеток, имеющую максимальную ширину от больше 0,2 мм и/или содержащую больше 200 клеток до 2 мм. Предпочтительнее микрометастаз определяют как группу конфлюэнтных раковых клеток с максимальной шириной от 0,2 до 2 мм. См. Тйе АбСС Сапсег 81адшд Мапиа1 апб Напбйоок, 7'1' еб. (2010), Ебде, 8.В.; Вугб, Ό.Κ.; СотрЮп, С.С.; Ρήΐζ, А.О.; Огеепе, Р.Ь.; ТгоШ, А. (Ебк.), Ι8ΒΝ: 978-0-387-88440-0. Альтернативным предпочтительным определением микрометастаза является группа по крайней мере из 1000 конфлюэнтных раковых клеток и с самым большим размером по ширине от по крайней мере 0,1 мм вплоть до 1 мм. Микрометастазы являются, как правило, невидимыми при ЯМР-томографии с использованием стандартных контрастных веществ или при других клинических методах визуализации. Однако в случае некоторых раков радиоактивные антитела, направленные против селективных опухолевых антигенов (например, Нег2 в случае метастазирования рака молочной железы), позволят визуализировать микрометастаз. Другие непрямые способы выявления включают просачивание контрастного вещества в места метастазирования в головной мозг вследствие индуцируемого УЕОР пропотевания жидкости через сосуды [Уапо 8; е1 а1. (2000), Ехргеккюп оГ уакси1аг епбо1йейа1 дго\\1й ГасЮг ίκ песеккагу Ьи1 по! киГйшей Гог ргобисйоп апб дгоМй оГ йгаш те1ак1а515. Сапсег гекеагсй 2000; 60(17): 4959-4967]. Для выявления микрометастазов могут также применяться более чувствительные способы визуализации. Например, объем циркулирующий крови можно визуализировать с помощью ЯМР, используя альтернативное контрастное вещество И8РЮ (Мо1бау 1гоп, Вюра1, ХУогсеЧег, МА, продаваемое как Мо1бау ΙΟΝ™), для выявления мик- 3 023864 рометастазов Циан Υίη 1.. е! а1. Νοηίηναβίνο ипащпд о£ (Нс £ипсйопа1 ейес18 о£ апИ-УЕОР Легару оп 1итог се11 ехЕауазаНоп апй гедюпа1 Ыоой уо1ите ίη ап ехрег1теп1а1 Ъгат те1а81а818 тойе1. СПп Ехр Ме1а81а818. 2009; 26(5): 403-414. ЕриЪ 2009 Маг 11].
Используемый здесь термин опосредуемая астроцитом защита относится к способности астроцита к уменьшению цитотоксичности химического вещества по отношению к другому типу клеток при прямом физическом контакте с астроцитом. Этот физический контакт включает астроциты, соединенные с раковыми клетками, в частности, через посредство соединения в виде нексуса (ОЭС).
Используемый здесь термин индуцируемая цитотоксической химиотерапией гибель клеток относится к индукции апоптоза или некротической гибели клеток с помощью цитотоксического химического вещества. Большинство используемых для лечения химиотерапевтических средств действуют с уничтожением быстро делящихся опухолевых клеток таким образом.
Используемый здесь термин антагонист рецепторов эндотелина относится к классу соединений, признанных в данной области техники в качестве таковых, и, в частности, к соединению, которое, после подвергания Анализу для определения 1С50 по отношению к ЕТА или ЕТВ, описанному в настоящем патенте, характеризуется 1С50, равной или меньшей 1 мкМ, по отношению к ЕТА, по отношению к ЕТВ или по отношению и к ЕТА, и к ЕТВ. ЕКА представляет собой лекарственное средство, которое препятствует взаимодействию рецепторов эндотелина с ЕТ-1 или не позволяет ЕТК реагировать на связанный ЕТ1. Существуют два основных вида ЕКА: селективные ЕКА, такие как ситаксентан, амбрисентан и атрасентан, которые воздействуют на рецепторы ЕТА и ЕКА с двойной специфичностью, такие как бозентан, которые воздействуют на оба рецептора ЕТА и ЕТВ. Приводимые в качестве примеров члены класса соединений ЕКА можно найти в патентной литературе, приведенной в [НАМ Миске 8та11-то1еси1е епйо1йе1ш гесер!ог аШадошвЮ: А ге\ае\у о£ раЮпОпд асйуйу асговв Легареийс агеаз, Шгидв 2009, 12: 366-375]. Репрезентативные ЕКА, которые уже были исследованы в ходе клинических испытаний на людях или разрешены для медицинского применения, включают ситаксентан, тезосентан, клазосентан, амбрисентан, бозентан, мацитентан (также известный как АСТ-064992) и/или атрасентан.
Используемый здесь термин антагонист ЕТА относится к соединению, которое, после подвергания Анализу для определения 1С50 по отношению к ЕТА или ЕТВ, описанному в настоящем патенте, характеризуется 1С50, равной или меньшей 1 мкМ, по отношению к ЕТА.
Используемый здесь термин антагонист ЕТВ относится к соединению, которое, после подвергания Анализу для определения 1С50 по отношению к ЕТА или ЕТВ, описанному в настоящем патенте, характеризуется 1С50, равной или меньшей 1 мкМ, по отношению к ЕТВ.
Используемый здесь термин антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью или ЕКА с двойной специфичностью относится к соединению, которое, после подвергания Анализу для определения 1С50 по отношению к ЕТА или ЕТВ, описанному в настоящем патенте, характеризуется 1С50, равной или меньшей 1 мкМ, по отношению к ЕТА, и 1С50, равной или меньшей 1 мкМ, по отношению к ЕТВ. ЕКА с двойной специфичностью включают бозентан и мацитентан.
Используемый здесь термин цитотоксическое химиотерапевтическое средство относится к веществу, индуцирующему апоптоз или некротическую гибель клеток. Примеры цитотоксических химиотерапевтических средств, которые могут использоваться в комбинации с ЕКА в соответствии с настоящим изобретением, включают:
алкилирующие агенты (например, мехлоретамин, хлорамбуцил, циклофосфамид, ифосфамид, стрептозоцин, кармустин, ломустин, мелфалан, бусульфан, дакарбазин, темозоломид, тиотепу или алтретамин);
лекарственные средства на основе платины (например, цисплатин, карбоплатин или оксалиплатин); являющиеся антиметаболитами лекарственные средства (например, 5-фторурацил, капецитабин, 6меркаптопурин, метотрексат, гемцитабин, цитарабин, флударабин или пеметрексед);
противоопухолевые антибиотики (например, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, актиномицин-Ό, блеомицин, митомицин-С или митоксантрон);
митотические ингибиторы (например, паклитаксел, доцетаксел, иксабепилон, винбластин, винкристин, винорелбин, виндезин или эстрамустин) и ингибиторы топоизомеразы (например, этопозид, тенипозид, топотекан, иринотекан, дифломотекан или эломотекан).
Суперсенсибилизацию или суперсенсибилизировать определяют как относительное увеличение гибели клеток, вызванной цитотоксическим химиотерапевтическим средством(ами), при физическом контакте с астроцитами по сравнению с таковой, наблюдаемой в клетках либо в отсутствие астроцитов, либо без прямого физического контакта с астроцитами.
Термин одновременно или одновременный, при ссылке на терапевтическое применение, означает в настоящем изобретении, что рассматриваемое терапевтическое применение заключается во введении двух или более активных ингредиентов одним и тем же способом и в одно и то же время.
Термин отдельно или отдельный, при ссылке на терапевтическое применение, означает в настоящем изобретении, что рассматриваемое терапевтическое применение заключается во введении двух или более активных ингредиентов в примерно одно и то же время по крайней мере двумя отличными
- 4 023864 способами.
Под терапевтическим введением в течение периода времени подразумевается в настоящем изобретении введение двух или более ингредиентов в различные моменты времени и, в частности, способ введения, в соответствии с которым полное введение одного из активных ингредиентов завершается до начала введения другого или других. Таким образом, можно вводить один из активных ингредиентов в течение нескольких дней, недель или месяцев до введения другого активного ингредиента или ингредиентов. В этом случае не имеет место одновременное введение.
Описание
В паренхиме головного мозга роль астроцитов в поддержании гомеостаза является общепризнанной. Астроциты окутывают каждый кровеносный сосуд специализированными синаптическими нервными окончаниями и устанавливают связь с другими клетками головного мозга, такими как нейроны. Эта уникальная структура позволяет астроцитам переносить необходимые питательные вещества, такие как глюкоза и аминокислоты, из кровотока к получающим помощь нейронам, и недавно было установлено, что гликолиз в астроцитах регулирует нейронную активность, так называемая нейрон-астроцитная метаболическая связь. В патологических условиях, таких как гипоксия, ишемия и дегенеративные заболевания, астроциты станут активированными и будут экспрессировать белок, названный СТАР. Установлено, что СРАР-реагирующие астроциты защищают нейроны от различных проблем и спасают нейроны от эксайтотоксичности, вызванной накоплением глутамата.
Активированные астроциты могут также предохранять нейроны от апоптоза, вызываемого этанолом, перекисью водорода, и катализируемой медью цитотоксичности цистеина.
Клинические метастазы в головной мозг обычно окружены и инфильтрированы активированными (СРАР-положительными) астроцитами [УокЫтше Т., е( а1. (1985), 1ттипоЫ81осЬеш1са1 81ибу о£ те1а81абс Ъгат (итоге \νί(1ι аЧгоргоЮт (СТАР), а дНагересШс рго1еш. Пккие агсНПесШге апб 1Пе опщп о£ Ыооб уе:гее15.1. Ыеигокигд. 62: 414-418]. Авторы настоящего изобретения подтвердили, что это явление воспроизводится в описанной ниже модели с использованием ксенотрансплантации.
Согласно этому представлены различные варианты осуществления настоящего изобретения.
1) Во-первых, настоящее изобретение относится к антагонисту рецепторов эндотелина для применения для предупреждения или лечения метастазов в головной мозг в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, лучевой терапией или с тем и с другим.
2) В соответствии с один основным подвариантом варианта осуществления 1) антагонист рецепторов эндотелина будет служить для применения в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством.
3) В соответствии с один подвариантом варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будет включать (и, в частности, представлять собой) алкилирующий агент.
4) В частности, алкилирующий агент варианта осуществления 3) будут выбирать из группы, состоящей из мехлоретамина, хлорамбуцила, циклофосфамида, ифосфамида, стрептозоцина, кармустина, ломустина, мелфалана, бусульфана, дакарбазина, темозоломида, тиотепы и алтретамина.
5) В соответствии с другим подвариантом варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будет включать (и, в частности, представлять собой) лекарственное средство на основе платины.
6) В частности, лекарственное средство на основе платины варианта осуществления 5) будут выбирать из группы, состоящей из цисплатина, карбоплатина и оксалиплатина.
7) В соответствии с еще одним подвариантом варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будет включать (и, в частности, представлять собой) являющееся антиметаболитом лекарственное средство.
8) В частности, являющееся антиметаболитом лекарственное средство варианта осуществления 7) будут выбирать из группы, состоящей из 5-фторурацила, капецитабина, 6-меркаптопурина, метотрексата, гемцитабина, цитарабина, флударабина и пеметрекседа.
9) В соответствии с дальнейшим подвариантом варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будет включать (и, в частности, представлять собой) противоопухолевый антибиотик.
10) В частности, противоопухолевый антибиотик варианта осуществления 9) будут выбирать из группы, состоящей из даунорубицина, доксорубицина, эпирубицина, идарубицина, актиномицина-Э, блеомицина, митомицина-С и митоксантрона.
11) В соответствии с другим подвариантом варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будет включать (и, в частности, представлять собой) митотический ингибитор.
12) В частности, митотический ингибитор варианта осуществления 11) будут выбирать из группы, состоящей из паклитаксела, доцетаксела, иксабепилона, винбластина, винкристина, винорелбина, виндезина и зстрамустина.
13) В соответствии с еще одним подвариантом варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будет включать (и, в частности, представлять собой) ингибитор топоизомеразы II.
- 5 023864
14) В частности, ингибитор топоизомеразы II варианта осуществления 13) будут выбирать из группы, состоящей из этопозида, тенипозида, топотекана, иринотекана, дифломотекана и эломотекана.
15) В предпочтительном подварианте варианта осуществления 2) цитотоксическое химиотерапевтическое средство будут выбирать из группы, состоящей из паклитаксела, доксорубицина, винбластина, винкристина, 5-фторурацила, цисплатина, циклофосфамида, этопозида, тенипозида, митомицина-С, иринотекана, винорелбина, ифосфамида и темозоломида (и, в частности, из пакситаксела и темозоломида).
16) В частности, цитотоксическое химиотерапевтическое средство варианта осуществления 15) будут выбирать из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида.
17) В соответствии с предпочтительным подвариантом варианта осуществления 16) антагонист рецепторов эндотелина варианта осуществления 16) будут выбирать из группы, состоящей из бозентана, мацитентана и смеси мацитентана и бозентана (и будет исключительно представлять собой мацитентан).
18) Настоящее изобретение также относится к антагонисту рецепторов эндотелина для применения в комбинации по крайней мере с одним из цитотоксических химиотерапевтических средств, упомянутых в одном из вариантов осуществления 2)-17), и с лучевой терапией.
19) В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления этого изобретения, антагонист рецепторов эндотелина, применяемый в вариантах осуществления 1)-18), будет включать (и, в частности, представлять собой) антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью.
20) В частности, антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью варианта осуществления 19) будут выбирать из группы, состоящей из бозентана, мацитентана и смеси бозентана и мацитентана.
21) В особенно предпочтительном варианте осуществления антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью варианта осуществления 20) будет представлять собой мацитентан.
22) В соответствии с одним подвариантом вариантов осуществления 1)-21) антагонист рецепторов эндотелина и цитотоксическое химиотерапевтическое средство будут вводиться отдельно.
23) В соответствии с другим подвариантом вариантов осуществления 1)-21) антагонист рецепторов эндотелина и цитотоксическое химиотерапевтическое средство будут вводиться одновременно.
24) В соответствии с еще одним подвариантом вариантов осуществления 1)-21) антагонист рецепторов эндотелина и цитотоксическое химиотерапевтическое средство будут вводиться в течение периода времени.
25) В соответствии с еще одним основным подвариантом варианта осуществления 1) антагонист рецепторов эндотелина будет служить для применения в комбинации с лучевой терапией (в соответствии с чем эта лучевая терапия предпочтительно является лучевой терапией всего головного мозга или стереотаксической радиохирургией).
26) В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления этого изобретения антагонист рецепторов эндотелина, применяемый в варианте осуществления 25), будет включать (и, в частности, представлять собой) антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью.
27) В частности, антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью варианта осуществления 26) будут выбирать из группы, состоящей из бозентана, мацитентана и смеси бозентана и мацитентана.
28) В особенно предпочтительном варианте осуществления антагонист рецепторов эндотелина с двойной специфичностью варианта осуществления 27) будет представлять собой мацитентан.
29) В другом основном варианте этого изобретения антагонист рецепторов эндотелина для применения с цитотоксическим химиотерапевтическим средством в соответствии с одним из вариантов осуществления 2)-23) будет служить для применения вместе с лучевой терапией (в соответствии с чем эта лучевая терапия предпочтительно является лучевой терапией всего головного мозга или стереотаксической радиохирургией).
30) Другим основным вариантом этого изобретения, комбинируемым с любым одним или несколькими из вышеприведенных вариантов осуществления 1)-29), является антагонист рецепторов эндотелина для применения при лечении имеющейся опухоли, развившейся в результате метастазирования в головной мозг, у субъекта, причем имеющаяся опухоль, развившаяся в результате метастазирования в головной мозг, представляет собой микрометастатическую опухоль, такую как микрометастатическая опухоль, выбираемая из группы, состоящей из опухоли вследствие микрометастазирования рака легкого, рака молочной железы, рака ободочной кишки, меланомы или карциномы почек в головной мозг.
31) Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования опосредуемой астроцитами защиты подвергшейся метастазированию в головной мозг клетки, который включает применение эффективного количества антагониста рецепторов эндотелина к подвергшейся метастазированию в головной мозг клетке и астроциту для ингибирования опосредуемой астроцитами защиты.
32) Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу варианта осуществления 31), который дополнительно включает применение эффективного количества по крайней мере одного цитотоксического химиотерапевтического средства к клетке метастаза в головной мозг.
33) Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу варианта осуществления 31), который дополнительно включает подвергание клетки метастаза в головной мозг лучевой терапии (в соответствии
- 6 023864 с чем эта лучевая терапия предпочтительно является лучевой терапией всего головного мозга или стереотаксической радиохирургией).
34) Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу варианта осуществления 31), который дополнительно включает применение эффективного количества по крайней мере одного цитотоксического химиотерапевтического средства к клетке метастаза в головной мозг и подвергание клетки метастаза в головной мозг лучевой терапии (в соответствии с чем эта лучевая терапия предпочтительно является лучевой терапией всего головного мозга или стереотаксической радиохирургией).
35) Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу производства лекарственного средства для применения в соответствии с любым из вышеприведенных вариантов 1)-34) и любыми их комбинациями. Предпочтительно лекарственное средство, произведенное вышеприведенным способом, дополнительно помещают в промышленную упаковку с инструкций в отношении выполнения одного или нескольких вариантов 1)-34) и любых их комбинаций.
36) Настоящее изобретение, кроме того, относится к антагонисту рецепторов эндотелина для применения для снижения риска и/или уменьшения степени распространения метастазов в головной мозг, в том числе микрометастаза в головной мозг, в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, лучевой терапией или с тем и с другим, в соответствии с любым одним или несколькими из вариантов 1)-34) и любыми их комбинациями.
Экспериментальная часть
Эксперимент 1. Иммунофлуоресцентный анализ метастаза в головной мозг.
Материалы и методы.
Экспериментальные метастазы в головной мозг были порождены посредством инъекции клеток аденокарциномы легкого человека РС14Вг4 во внутреннюю сонную артерию бестимусных мышей (81).
Спустя 5 недель мышей умерщвляли и образцы тканей подвергали обработке в соединении ОСТ в случае замороженных срезов, как описано ранее (82). Делали срезы тканей (8-10 мкм), их монтировали на положительно заряженные предметные стекла и высушивали на воздухе в течение 30 мин. Фиксацию тканей выполняли, используя протокол, состоящий из трех последовательных погружений в ледяные растворы ацетона, смеси 50:50 (об./об.) ацетон: хлороформ и ацетона (каждое в течение 5 мин). Затем образцы трижды промывали РВ8, инкубировали с раствором для блокирования белков, содержащим 5% нормальной лошадиной сыворотки и 1% нормальной козьей сыворотки в РВ8, в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем инкубировали с кроличьим поликлональным антителом против СРАР (Вюсаге МеФсак Сопсогй, СА) в разведении 1:400 в течение 18 ч при 4°С. Образцы промывали четыре раза РВ8 в течение 3 мин в случае каждой промывки, а затем инкубировали в течение 1 ч с козьим антителом против Су5 кролика (1аскзоп 1ттипоКе5еагсЬ ЬаЪогакопез, ^езк Сгоуе, РА) в разведении 1:1500. Контрольные образцы метили с использованием той же самой концентрации подобранного по изотипу контрольного антитела и козьего антитела против Су5 кролика. Все образцы промывали, а затем подвергали короткой инкубации с красителем для нуклеиновых кислот 8у!ох зеленым (Еидепе, ОК). Покровные стекла заделывали с использованием раствора глицерина в РВ8, содержащего 0,1 моль/л пропилгалата (8щта). для минимизации выцветания флуоресцентных красителей. Конфокальные изображения были получены в системе лазерного сканирующего микроскопа 2е155 Ь8М 510 (Саг1 2е155, 1пс., Т1югп\уооФ ΝΥ), оснащенной микроскопом с электроприводом Ахюр1ап, аргоновым лазером, гелий-неоновым лазером, программным обеспечением для контроля и получения изображений Ь8М 510 и подходящими фильтрами (СЬгота ТесЬпо1оду Согр., ВгаШеЪого, УТ).
комбинированных изображений были создано с помощью программного обеспечения РЬоЮЧюр (АйоЪе 8у51етз, 1пс., Моипкаш Мете, СА).
Результаты.
Результаты истекали из цветных изображений (не продемонстрированных) прореагировавших иммуногистохимически образцов. Опухолевые клетки были окружены и инфильтрированы СРАРположительными (красными) астроцитами. Это эксперимент подтвердил предшествующие данные наблюдений инфильтрации астроцитами в клинических образцах метастазов в головной мозг. Такая же инфильтрация СРАР-положительными астроцитами наблюдалась при использовании сингенной мышиной модели. При иммуногистохимическом анализе карциномы легких Льюиса у мышей (3ЬЬ) в головном мозге мыши С57, делящиеся клетки 3ЬЬ (РСNА-положительные, синие) были инфильтрированы и окружены активированными астроцитами (СРАР-положительными, коричневыми). Вместе эти эксперименты обосновывали модель с использованием ксенотрансплантатов клеток человека на мышах, которая воспроизводила явление, наблюдаемое в клинических образцах человека и в сингенной мышиной модели. Поэтому одним аспектом настоящего изобретения является ш νί\Ό модель с использованием клеток человека для метастазирования в головной мозг мышей, которая применима, например, при изучении явления развившегося в результате метастазирования в головной мозг рака у людей.
Эксперимент 2. Исследования с использованием сканирующей электронной микроскопии.
После установления того, что мышиные астроциты взаимодействуют ш νί\Ό с опухолевыми клетками человека при образовании метастаза в головном мозге таким же образом, как это наблюдается в первичных клинических образцах от людей, авторы настоящего изобретения исследовали взаимодейст- 7 023864 вия этих двух типов клеток ίη νίίτο в простейшей системе с использованием сокультивирования. Не было точно известно, приведет ли к какому-либо межклеточному взаимодействию такая система, гораздо меньше физиологически соответствующая ш νίνο ситуации, описанной выше. Поэтому неожиданным было обнаружение, что межклеточные взаимодействия между линиями метастатических раковых клеток человека и мышиными астроцитами достигается ш νίίτο.
Материалы и методы.
Линии клеток и условия культивирования. Линия клеток рака молочной железы человека, ΜΌΆ-231 (83), метастатически распространяющийся в головной мозг вариант линии клеток аденокарциномы легкого человека РС14Вг4 (δί) и мышиные фибробласты ΝΙΗ 3Т3 поддерживали в виде монослойных культур в минимальной поддерживающей среде полной среды Игла (СМЕМ), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (РВ8; НуС1опе, Ьодап, ИТ), Ь-глютамином-пируватом, заменимыми аминокислотами, двукратным раствором витаминов и пенициллином-стрептомицином (СШСО/Шуйгодеп. СагНЪаб, СА). Все используемые для культуры тканей реагенты не содержали эндотоксин, что определено с помощью анализа с использованием лизата амебоцитов ЬтШиз (Аз5ос1а1е оГ Саре Соб, \Уооб51ю1е, МА), а линии клеток не содержали следующие патогены мышей: Мусор1азта зрр, хантавирус, вирус гепатита, минутвирус, аденовирус (МАЭ1, МАЭ2), цитомегаловирус, вирус оспы мышей, повышающий уровень лактатдегидрогеназы вирус, вирус полиомы и вирус Сендай (анализ которых проведен РезеагсЬ Ашта1 Э1адпозбс ЕаЪогаЮгу, ИптуетзДу оГ Мкзопп, Со1итЫа, МО). Используемые в этом исследовании клетки были из замороженного стока, и все эксперименты проводили в рамках 10 ш уйго пассажей после оттаивания.
Выделение и поддержание мышиных астроцитов. Новорожденных мышей, гомозиготных по чувствительному к температуре большому Т-антигену 8У40, (мышей Н-2КЪЛзА58; гибридов СВА/сахС57ВЬ/10; СЬаг1ез Р|уег ЬаЪогаЮпез, ХУНттЦоп, МА) подвергали эвтаназии в камере с углекислым газом, и обычным образом подготавливали кожу к хирургическому вмешательству (84). Стерильные микропинцеты (РоЪо/ 8игдюа1 ЕШгитеШ Со., ОабЬегзЪигд, МИ) использовали, чтобы сдвинуть кожу с черепа, а микроножницы использовали для создания дугового разреза сзади от отверстия левого уха до отверстия правого уха. Другой разрез делали по срединной линии головного мозга, и череп разделяли для обеспечения доступа в полость черепа. Зрительные нервы обрезали, и головной мозг извлекали с использованием пинцета с тупыми концами и помещали в 100-мм холодный как лед забуференный фосфатом солевой раствор (РВ8). Целые неокортексы рассекали, и гиппокамп и внутренние структуры удаляли с оставлением лишь корковых слоев. Оболочки головного мозга удаляли, и корковые слои измельчали с помощью скальпеля и подвергали расщеплению в течение 30 мин при 37°С в модифицированной Дульбекко поддерживающей среде (ЭМЕМ), содержащей 0,1% коллагеназы (150 Е/мл; ХУогШйщЮп Вюсйенйса1 Согр., Ьаке^ооб, N6) и 40 пг/мл дезоксирибонуклеазы (8щта СЬетюа1 Со., 8ί. Ьошз, МО). Корковую ткань затем растирали в порошок в ЭМЕМ, содержащей 10% РВ8, и фильтровали через 50-пм стерильную сетку. Результирующую суспензию одиночных клеток высевали в 75-см2 матрасы для культивирования тканей, которые были предварительно покрыты 5 мкг/мл мышиного ламинина (8щта). Клеткам позволяли расти в течение 7 дней в ЭМЕМ, содержащей 10% РВ8 и добавки (см. выше), в атмосфере, содержащей 8% углекислого газа (для создания надлежащего рН при 33°С). В этот момент времени астроглиальные клетки образовывали конфлюирующий монослой с нейронами, олигодендроцитами и фибробластами, растущими наверху. Эти загрязняющие клетки удаляли посредством встряхивания при вращении матрасов в течение ночи при 250 об/мин в теплой комнате. Результирующие культуры состояли из более чем 95% астроцитов, что определено по иммунореактивности с антителами, направленными против ОРАР. Эти культуры наращивали, процедуру повторяли, и процент астроцитов в этих культурах, как определено, превышал 99%.
Получение с помощью сканирующей электронной микроскопии изображений подвергнутых культивированию опухолевых клеток и астроцитов. Клетки рака молочной железы человека МОА-МВ-231 и мышиные астроциты высевали в ЭМЕМ, содержащей 5% РВ8, на стерилизованные покровные стекла в 24-луночных планшетах с плотностью 2,4х104. Спустя 48 ч покровные стекла извлекали и фиксировали в течение 1 ч при комнатной температуре в растворе, содержащем 3% глутаральдегида/2% параформальдегида/7,5% сахарозы в 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,3). Затем образцы промывали 0,1 М какодилатным буфером и после фиксировали в течение 1 ч с помощью 1% забуференного какодилатом раствора тетроксида осмия, содержащего 7,5% сахарозы. Образцы промывали 0,1 М какодилатным буфером, а затем дистиллированной водой и один за другим обрабатывали в течение 30 мин в темноте Мбйрогепрофильтрованным 1% раствором дубильной кислоты в воде, промывали дистиллированной водой и МШ1роге-профилырованным 1% раствором уранилацетата в воде в течение 1 ч в темноте. Образцы тщательно промывали дистиллированной водой, обезвоживали благодаря ряду растворов этанола в возрастающих концентрациях, а затем перемещали на 5 мин каждый раз в ряд ступенчато возрастающих концентраций гексаметилдисилазана, и допускали их высыхание на воздухе в течение ночи. Образцы монтировали на угольные вставки с удвоенной толщиной (Теб Ре11а, 1пс., Кеббшд, СА), которые были предварительно вставлены в алюминиевые оправы для образцов (Е1ес1гоп Мюгозсору 8шепсез, Ρί. ХУазИтЦоп, РА). Затем образцы покрывали в вакууме, используя испаритель Ва1/ег МЕЭ 010 (ТесЬпоЛабе ЕиегпаОопак МапсйезЮг, ΝΗ), платиновым сплавом на толщину 25 нм и затем тотчас же покрывали в вакууме
- 8 023864 углеродом. Образцы перемещали в эксикатор для исследования позднее. Образцы исследовали, используя сканирующую электронную микроскопию 18М-5910 (ХЕОЬ, 1пс., РеаЬобу, МА), при ускоряющем напряжении = 5 кВ.
Результаты.
Результаты представлены на фиг. 1. Ιη νίΐτο культуру клеток рака молочной железы МОА-МВ-231 (Т) и мышиных астроцитов (А) оценивали с помощью сканирующей электронной микроскопии. Несомненен прямой контакт между астроцитами (с удлиненными отростками-ножками) и опухолевыми клетками. Один астроцит может контактировать с множеством опухолевых клеток. Эти контакты, как представляется, являются полностью сформированными нексусами что-то вроде тех, которые наблюдаются между астроцитами и нейронами центральной нервной системы. Схожие результаты отмечены при использовании линий клеток меланомы, рака молочной железы и рака легкого (не представленные данные).
Эксперимент 3. Исследования нексусов.
Для дальнейшей валидации функционального характера нексусов, продемонстрированных на фиг. 1, авторы настоящего изобретения выполнили эксперименты по переносу красителя, чтобы выяснить, являются ли функциональными нексусы, подобные структурам, наблюдаемым в эксперименте 2.
Материалы и методы.
Соединение в виде нексуса. Соединение в виде нексуса между реципиентными опухолевыми клетками (МОА-МВ-231) и донорными клетками (астроцитами, клетками 3Т3, МОА-МВ-231) исследовали с помощью проточной цитометрии, в случае которой определялся перенос красителя. Вкратце, реципиентные клетки (300000 клеток/лунку) засевали в 6-луночный планшет и культивировали в течение ночи. В этот момент времени донорные клетки метили в течение 45 мин 1 мкг/мл зеленым кальцеином-АМ (Мо1еси1аг РгоЬек) с последующей тщательной отмывкой. Донорные клетки (60000 клеток/лунку) подвергали сокультивированию в течение 5 ч с реципиентными клетками либо напрямую, либо в камере с трансвелом (Тгап8№е11-Воубеп СЬашЬег, с составляющим 0,4 нм размером пор; СоЧаг. Согшпд. ΝΥ). Клетки собирали, промывали, фиксировали в этиловом спирте и исследовали с помощью проточной цитометрии. Образование нексусов рассчитывали как процент сдвинутого пика ФИТЦ (§9-811).
Результаты.
Как продемонстрировано на фиг. 2, при сокультивировании астроцитов и метастатических раковых клеток выявлялся перенос красителя между подвергнутыми сокультивированию клетками. Используемая авторами настоящего изобретения система с использованием сокультивирования, таким образом, приводит к образованию активных нексусов между мышиными астроцитами и линиями метастатических раковых клеток человека. Контрольные эксперименты с использованием трансвела показывают, что нексус является подлинным межклеточным взаимодействием. Поэтому вторым аспектом настоящего изобретения является ίη νίΙΐΌ система с использованием сокультивирования мышиных астроцитов и метастатических клеток человека, которая применима, например, при исследовании явления взаимодействия метастатически распространяющихся в головной мозг раковых клеток человека с астроцитами в манипулируемой ех νί\Ό ситуации.
Эксперимент 4. Анализы защиты от химиотерапии.
Моделирование устойчивости к химиотерапии метастаза в головной мозг является и будет основным применением вышеприведенных и ίη νί\Ό системы с использованием модели, и νίΙΐΌ системы с использованием сокультивирования клеток. Поскольку система с использованием сокультивирования на основе клеток является более податливой экспериментальному манипулированию, ее в дальнейшем оценивали для определения, воспроизводит ли система с использованием культивирования на основе клеток наблюдаемую ίη νί\Ό устойчивость к химиотерапии метастазов в головной мозг.
Материалы и методы.
Ιη νίΐ го исследование защиты от химиотерапии с использованием сокультивирования. В астроциты и фибробласты ΝΙΗ 3Т3 трансфицировали гены ОРР, как описано ранее (§5, §6). Опухолевые клеткимишени, астроциты или фибробласты 3Т3 получали из 60-70% конфлюэнтной культуры посредством подвергания короткому (2-минутному) воздействию 0,25% трипсина в растворе 0,1% ЕОТА/РВ8. Клетки выбивали посредством отрывистого обстукивания матрасов для культивирования и ресуспендировали в СМЕМ. Мышиные астроциты, фибробласты 3Т3 и опухолевые клетки высевали сами по себе или в виде сокультуры в составляющем 1:2 соотношении опухолевых клеток и астроцитов/клеток 3Т3 в каждую лунку диаметром 35 мм стерильного 6-луночного планшета для культивирования тканей. Клеткам позволяли прикрепляться в течение ночи во влажном инкубаторе при 37°С в атмосфере, состоящей из 6,4% углекислого газа плюс воздух. Затем культуры промывали и инкубировали с новой СМЕМ (в качестве отрицательного контроля) или со средой, содержащей различные концентрации ТАХОЬ® (паклитаксела; ΝΟί 0015-3476-30, ВгМоРМуею §цшЬЬ, РгшсеЮщ Νί) и других химиотерапевтических средств (см. ниже). Спустя 72 ч меченные ОРР астроциты или клетки ΝΙΗ 3Т3 сортировали, и апоптозную фракцию опухолевых клеток определяли посредством окрашивания иодидом пропидия и анализа с использованием РАС§ (клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) (см. ниже). Для определения, является ли прямой контакт между опухолевыми клетками и астроцитами (или фибробластами, служащими в качестве контроля) необходимым условием для вызова индукции устойчивости к химиотерапии, было выпол- 9 023864 нено исследование с использованием сокультивирования, используя камеру Тгап5\ус11-Воуйсп. т.е. засева опухолевых клеток в камеру, а иммортализованных астроцитов (или фибробластов) в лунку. После инкубации в течение 72 ч относительный показатель апоптоза опухолевых клеток определяли, как описано ниже.
Во втором ряде ίη νίίτο исследований авторы настоящего изобретения определили, является ли опосредуемая астроцитами индукция устойчивости опухолевых клеток к химиотерапевтическим средствам кратковременной или долговременной. Клетки рака легкого человека РС14Вг4 подвергали сокультивированию либо с астроцитами, либо с фибробластами 3Т3 в среде самой по себе или в среде, содержащей 5 нг/мл паклитаксела. Спустя 72 ч астроциты или клетки 3Т3 отделяли от опухолевых клеток с помощью РАС8, и относительный показатель апоптоза опухолевых клеток определяли во множестве лунок посредством окрашивания иодидом пропидия, как описано ниже. Из параллельных лунок извлекали оставшиеся в живых опухолевые клетки, и их пересевали на отличные монослои из астроцитов или клеток 3Т3. Эти сокультуры содержали опухолевые клетки, сначала подвергнутые сокультивированию с астроцитами, а затем либо с астроцитами, либо с клетками 3Т3, или опухолевые клетки, сначала подвергнутые культивированию с клетками 3Т3, а затем либо с клетками 3Т3, либо с астроцитами. При втором цикле в сокультуры затем вносили среды, содержащие 5 нг/мл паклитаксела. Спустя 72 ч относительный показатель апоптоза опухолевых клеток определяли посредством окрашивания иодидом пропидия и анализа с использованием РАС8.
Подготовка к окрашиванию иодидом пропидия и анализу с использованием РАС8. Супернатантные среды, содержащие плавающие клетки, собирали из каждой чашки в 15-мл коническую центрифужную пробирку. Прикрепленные клетки собирали посредством подвергания клеток короткому воздействию 0,25% трипсина в растворе, содержащем 0,1% ΕΌΤΑ/ΡΒ8. Клетки объединяли с соответствующими супернатантными средами. Образцы осаждали с помощью центрифугирования при 100 хд в течение 5 мин. Осадки ресуспендировали в 10 мл НВ88 и далее осаждали при 100хд в течение 5 мин. Образцы ресуспедировали с помощью вортекса и клетки фиксировали в 1 мл 1% параформальдегида в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем образцы переносили в микроцентрифужные пробирки из полипропилена и подвергнутые фиксации клетки промывали в 1 мл РВ8, а затем осаждали при 10000хд в течение 1 мин. Осадки ресуспендировали с помощью вортекса и клетки фиксировали в течение ночи в 1 мл этилового спирта при -20°С. Впоследствии клетки встряхивали и осаждали с использованием микроцентрифуги при 10000хд в течение 1 мин. Затем образцы встряхивали и осадки ресуспендировали и окрашивали в 300 раствора иодида пропидия (50 мкг/мл; каталожный № Р4864, 81дта), содержащего РНКазу (15 мкг/мл; каталожный № А7973, Рготеда, МаЙ15оп, ΑΙ), в течение 20-30 мин при 37°С. Наконец, образцы переносили в 5-мл пластмассовые пробирки для культивирования для анализа с использованием РАС8, используя цитометр СоиЙег ЕР1С8 (Весктап СоиЙег, 1пс., Ри11епоп, СА). Относительный показатель апоптоза определяли с помощью сопоставления показатель апоптоза опухолевых клеток/показатель апоптоза опухолевых клеток и иммортализованных астроцитов или опухолевых клеток и фибробластов ΝΙΗ 3Т3х100 (%) (§7).
Результаты.
Культивирование клеток рака молочной железы человека МЭА-МВ-231 или клеток рака легкого человека РС14Вг4 с астроцитами (но не с фибробластами 3Т3) снижало относительный показатель апоптоза (т.е. увеличивало устойчивость к химиотерапевтическим средствам) опухолевых клеток, подвергнутых инкубации в течение 72 ч с паклитакселом (5 нг/мл), на 58,3±8,9% (среднее значение±среднеквадратическое отклонение, Р<0,01) и 61,8±6,7% (среднее значение±среднеквадратическое отклонение, Р<0,05) соответственно (показатель апоптоза сопоставляли с использованием критерия Стьюдента) (фиг. 3). Это снижение зависело от прямого контакта между опухолевыми клетками и астроцитами. Авторы настоящего изобретения основывают этот вывод на данных, показывающих, что, когда опухолевые клетки и астроциты были разделены полупроницаемой мембраной (ТгапъетеИ-Воуйеп СйатЬег, мембраной с составляющим 0,4 пм размером пор; Со51аг, Согшпд, ΝΥ), эффект защиты астроцитами от химиотерапевтических средств не отмечался. Сокультивирование опухолевых клеток с фибробластами 3Т3 не защищало опухолевые клетки от химиотерапии (фиг. 3). Сокультивирование опухолевых клеток человека с альтернативным контролем, используя фибробласты, выделенные от мыши Н-2кЬЭ5А58, также не защищало опухолевые клетки от химиотерапевтических средств (не представленные данные). Аналогичные результаты были отмечены при использовании стандартных анализов на основе МТТ (3{4,5-диметилтиазол-2-ил}-2,5-дифенилтетразолий бромида) для определения степени цитотоксичности (не представленные данные) [Согу А.Н., О\уеп Т.С., ВагПгор кА., Согу Ю. (Му, 1991) И5е о! ап ациеои5 5о1иЬ1е 1е1гахо1шт/Гогтахап а55ау Гог се11 дгоМй а55ау5 т сийиге. Сапсег Соттишсайопз 3 (7): 207-212.]
Эти данные обосновывают описанную здесь систему с использованием сокультивирования на основе клеток в качестве системы, воспроизводящей явление устойчивости метастаза в головной мозг к химиотерапии. Неожиданная способность системы с использованием сокультивирования к воспроизводству устойчивости к химиотерапии, таким образом, делает ее полностью подходящей для применения при исследовании механизма устойчивости к химиотерапии и возможных терапевтических вмешательств для
- 10 023864 аннулирования устойчивости к химиотерапии у имеющегося метастаза в головной мозг ίη νίνο.
Для расширения этих первоначальных экспериментов авторы настоящего изобретения проверили несколько дополнительных химиотерапевтических средств, типичных представителей основных классов лекарственных средств, используемых на сегодняшний день. Клетки рака легкого человека РС14Вг4 культивировали сами по себе или с астроцитами (для прямого межклеточного контакта) в среде, содержащей ассоциированный с Р-гликопротеином адриамицин (200 нг/мл), паклитаксел (5 нг/мл), винбластин (3 нг/мл), винкристин (8 нг/мл) и диссоциированный от Р-гликопротеина 5-РИ (500 нг/мл) или цисплатин (2,4 мкг/мл). Сокультивирование с астроцитами индуцировало значимую (Р<0,01) защиту от всех лекарственных средств (фиг. 4). Это неожиданное обнаружение служит дополнительной валидацией системы с использованием сокультивирования на основе клеток. Система с использованием культивирования клеток показывает надежность устойчивости к химиотерапии, индуцируемой астроцитами, до некоторой степени, которая полностью сопоставима с устойчивостью к химиотерапии метастаза в головной мозг, наблюдаемой ίη νίνο в клинической ситуации. Поэтому третьим аспектом настоящего изобретения является ίη νίίτο исследование на основе клеток устойчивости к химиотерапии, которое применимо, например, при исследовании явления опосредуемой астроцитами защиты клеток метостазов в головной мозг от индуцируемой цитотоксической химиотерапией гибели клеток. В конкретных вариантах осуществления ίη νίίτο исследование на основе клеток устойчивости к химиотерапии может использоваться для скрининга одного или нескольких являющихся кандидатами химиотерапевтических средств для оценки степени опосредуемой астроцитами защиты от цитотоксических эффектов химиотерапевтических агентов.
Дополнительные эксперименты, резюмированные на фиг. 5, показывают, что опосредуемая астроцитами защита метастатически распространяющихся в головной мозг клеток от индуцируемой цитотоксической химиотерапией гибели клеток не длится дольше 72 ч после утраты прямого контакта между астроцитами и метастатически распространяющимися в головной мозг клетками. Кроме того, клетки, лишившиеся защитного действия, привносимого прежним контактом с астроцитами, можно вновь защитить с помощью второго сокультивирования с астроцитами для обретения вновь опосредуемой астроцитами защиты от цитотоксических эффектов химиотерапевтических средств. Это служит отражением клинических наблюдений первичных опухолей и даже отличного метастаза не в головной мозг, которые реагируют на химиотерапию, в то время как производные от них метастазы в головной мозг являются устойчивыми к химиотерапии.
Эксперимент 5. Механизм опосредуемой астроцитами защиты от химиотерапии.
Авторы настоящего изобретения использовали вышеприведенное исследование на основе клеток устойчивости к химиотерапии для изучения возможных механизмов, лежащих в основе этого явления. Определение профилей экспрессии генов плюс подтверждение с помощью Вестерн-блоттинга продукции белка использовали для изучения опосредуемой астроцитами защиты клеток метастазов в головной мозг от индуцируемой цитотоксической химиотерапией гибели клеток.
Материалы и методы.
Профили экспрессии генов, определяемые с помощью анализа с использованием микрочипов РНК. В первом ряде экспериментов клетки ΜΌΑ-ΜΒ-231 или РС14Вг4 инкубировали сами по себе, с мышиными астроцитами или с фибробластами ΝΙΗ 3Т3 в 6-луночном планшете с составляющим 35 мм диаметром каждой лунки (каталожный № 353046, ΒΌ Ραίοοη ΤΜ, δαη ίοδο. СА). Для установления межклеточного контакта соотношение опухолевых клеток и мышиных астроцитов или клеток ΝΙΗ 3Т3 составляло 1:2. Спустя 72 ч меченные ОРР мышиные астроциты или фибробласты сортировали с помощью ΡΑСδ, и опухолевые клетки подвергали обработке для анализа с использованием микрочипов. Во втором ряде экспериментов определяли, зависит ли экспрессия генов, связанных с устойчивостью опухолевых клеток к химиотерапевтическим средствам, от непрекращающего контакта с астроцитами. Клетки ΜΌΑ231 или РС14Вг4 подвергали сокультивированию либо с мышиными астроцитами, либо с клетками ΝΙΗ 3Т3 в течение 72 ч. Мышиные астроциты или клетки ΝΙΗ 3Т3 сортировали, и опухолевые клетки либо подвергали обработке для определения профилей экспрессии генов с помощью анализов с использованием микрочипов, либо высевали для второго цикла сокультивирования либо с мышиными астроцитами, либо с фибробластами. Таким образом, опухолевые клетки, сначала подвергнутые культивированию с мышиными астроцитами, подвергали сокультивированию снова с мышиными астроцитами или с фибробластами, и наоборот, опухолевые клетки, сначала подвергнутые культивированию с фибробластами, подвергали сокультивированию снова с фибробластами или с астроцитами. После инкубации в течение 72 ч мышиные астроциты или фибробласты сортировали, и опухолевые клетки подвергали обработке для анализов с использованием микрочипов.
Анализы с использованием микрочипов. Тотальную РНК (500 нг) использовали для мечения и гибридизации согласно протоколам производителя (Шитша, 1пс., δαη Όίο^ο, СА). Вкратце, кДНК создавали на основе тотальной РНК, используя набор для амплификации РНК Шитша® ΤοΙαΙ Ргер ΡΝΑ АшрППсаίίοη Κίί (АррйеД Β^ο8у8ίет, ΑυδΙίη, ΤΧ). Затем в течение 4 ч при 37°С проводили ίη νίίτο транскрипцию с включением меченных биотином нуклеотидов в кРНК. Всего 1500 нг меченной биотином кРНК подвергали гибридизации с чипами ВеаДСЬтр для анализа экспрессии 6-ν2 у людей δеηί^^x® от Шитша при
- 11 023864
58°С в течение ночи (16 ч) согласно инструкциям производителя.
Подвергнутую гибридизации, биотилированную кРНК детектировали с помощью 1 мкг/мл цианин3-стрептавидина (ОБ НеаЙЬсаге, Р1кса1а№ау, N1), и чипы ВеайСЫр сканировали с использованием считывающего устройства Шитша ВеайАггау Кеайег (Шитта, 1пс.). Результаты сведений, полученных с использованием микрочипов, получали с помощью Веай δΐυάίο 3.7 (Шитша, 1пс.) без какой-либо нормализации или вычитания фона. Относящиеся к экспрессии генов данные нормализовали, используя основанный на квантилях метод нормализации в пакете ЫММА в К (\у\у\у.г-рго]ес1.огд) (812). Уровень экспрессии каждого гена преобразовывали в 1од2 до дальнейшего анализа. Для отбора генов с дифференциальной экспрессией в двух группах тканей авторы настоящего изобретения использовали средство для сравнения классов в инструментальных средствах для ранжированных рядов ВКВ (версии 3.6; Вютейтск КекеагсЬ ВгапсЬ, №-10опа1 Сапсег 1п8Ши1е, ВеШекйа, МИ) в качестве метода проверки по двухвыборочному критерию Стьюдента с приблизительной оценкой РИК.
Анализ с использованием Вестерн-блоттинга.
Вестерн-блоттинг использовали для подтверждения результатов, полученных с использованием микрочипа. Вкратце, цельноклеточные лизаты отсортированных с использованием РАС8 опухолевых клеток готовили, используя 1 мл буфера для лизиса (10 мМ Трис [рН 8,0], 1 мМ ΕΌΤΑ, 0,1% δΌδ, 1% дезоксихолата, 1% ΝΡ40, 0,14 М №С1, 1 мкг/мл лейпептина, 1 мкг/мл апротинина и 1 мкг/мл пепстатина), содержащего смесь ингибиторов протеаз (КосЬе, ШФапаройк, ΙΝ). Образцы, содержащие равные количества белка (30 Гад), разделяли посредством электрофореза в 4-12% Νυ-ΡΑΟΕ гелях (Шуйгодеп) и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. После блокирования с использованием ΤΊΒδ (ТВ8 + 0,1% Т\\ееп 20), содержащего 5% обезжиренного молока, мембраны инкубировали при 4°С в течение ночи с мышиным моноклональным антителом против ВСБ2 (1:1000, ВО РЬагМшдеп, 8ап И1едо, СА), кроличьим поликлональным антителом против ВСЕ2Б1 (1:1000, Се11 81дпаПпд, Веуег1у, МА), кроличьим поликлональным антителом против ΤνίδΤ (1:1000, Се11 δ^диа1^ηд), мышиным моноклональным антителом против глутатион-8-трансферазы (1:1000, ВО РЬагМшдеп) и мышиным моноклональным антителом против β-актина (81дта). Затем блоты подвергали воздействию конъюгированных с пероксидазой хрена вторых антител (1:3000) и визуализировали с помощью системы для увеличенной хемилюминесценции от АтегкЬат (Р18са1а№ау, N1). Загрузку равного количества белка подтверждали посредством очистки блотов и повторного зондирования их с использованием антитела против β-актина.
Статистический анализ.
Для статистического анализа профилей экспрессии генов уровень экспрессии каждого гена преобразовывали в 1од2 до дальнейшего анализа. Средство для сравнения классов в инструментальных средствах для ранжированных рядов ВКВ (версии 3.6; Вютейтск Кекеагсй ВгапсЬ, №Юопа1 Сапсег 1п5Й1и1е, Ва1йтоге, МО) для проверки по двухвыборочному критерию Стьюдента с приблизительной оценкой РОК было методом, используемым для определения статистической значимости генов с дифференциальной экспрессией между опухолевыми клетками, подвергнутыми сокультивированию с различными клеткамихозяевами. Гены для диаграммы Венна отбирали с помощью одномерного критерия (двухвыборочного критерия Стьюдента) с использованием критерия множественных перестановок (10000 произвольных перестановок). Авторы настоящего изобретения применяли отсечку Р-значения, составляющую менее 0,001, для сохранения генов, экспрессия которых значимо отличается между двумя группами проверенных тканей.
Результаты.
Авторы настоящего изобретения идентифицировали гены в опухолевых клетках, экспрессия которых, как правило, изменена после сокультивирования с астроцитами, посредством использования проверок по двухвыборочному критерию Стьюдента (Р<0,001). Используя этот метод, авторы настоящего изобретения идентифицировали 1069 генов в клетках МИА-МВ-231 и 594 гена в клетках РС14Вг4, которые характеризовались дифференциальной экспрессией (фиг. 7). В результате двухгенного множественного сопоставления выявлена увеличенная экспрессия нескольких генов, которые, как хорошо известно, связаны с противодействием апоптозу и выживанием: глутатион-8-трансфераза 5 (ОδΤΑ5), ВСР2Б1, ΤνίδΤ (фиг. 7). Экспрессия этих генов была подтверждена на уровне белка с помощью анализа с использованием Вестерн-блоттинга (фиг. 8). Затем авторы настоящего изобретения определяли, является ли измененный характер экспрессии генов в опухолевых клетках, подвергнутых сокультивированию с астроцитами (но не с фибробластами), долговременным или кратковременным. Авторы настоящего изобретения подвергли опухолевые клетки сокультивированию в течение одного цикла с астроцитами или фибробластами, а затем собрали опухолевые клетки и засеяли их во втором цикле на астроциты или фибробласты. После сбора относящихся к экспрессии генов данных на основе экспериментов с использованием двух циклов сокультивирования влияние второго сокультивирования было главенствующим в характерах экспрессии генов в раковых клетках. Независимо от условия первого сокультивирования, раковые клетки, подвергнутые сокультивированию с астроцитами во втором цикле, продемонстрировали дифференциальные характерные черты экспрессии генов, которые были выявлены в экспериментах с использованием культивирования в первом цикле (высокую экспрессию ОδΤΑ5, ВСР2Б1 и ΤνίδΤ), тогда как раковые
- 12 023864 клетки, подвергнутые сокультивированию с астроцитами в первом цикле, утрачивали специфические черты экспрессии генов, когда их подвергали сокультивированию с фибробластами во втором цикле (фиг. 9). Этот результат соответствует результатам ίη νίίτο исследования защиты от химиотерапии, резюмированным на фиг. 5, и подтверждает, что характер экспрессии генов в опухолевых клетках зависит от постоянного контакта с астроцитами. Опухолевые клетки, подвергнутые во втором цикле сокультивированию с астроцитами, также экспрессировали гены ТСР4, СЭ24. САКИ14 и ΕΡΝΒ2 на высоком уровне (не представленные данные). Клинические исследования показали, что имеется корреляция между экспрессией этих генов в опухолевых клетках и плохим прогнозом. Поэтому четвертым аспектом настоящего изобретения является ίη νίίτο исследование на основе клеток устойчивости к химиотерапии, имеющее компонент молекулярной диагностики, которое применимо, например, при исследовании явления опосредуемой астроцитами защиты клеток метастазов в головной мозг от индуцируемой цитотоксической химиотерапией гибели клеток в ех νίνο ситуации. В определенных вариантах осуществления компонентом молекулярной диагностики является одно или более из следующего: стадии определения профиля экспрессии генов и анализа внутриклеточных концентраций белков. В конкретных вариантах осуществления заранее определенные характерные черты экспрессии генов используются для оценки эффектов экспериментальных вмешательств, например, для аннулирования опосредуемой астроцитами защиты. Пятым аспектом настоящего изобретения являются характерные черты экспрессии генов или комбинация профилей уровней белков, указывающие на опосредуемую астроцитами защиту клеток метастазов в головной мозг от индуцируемой цитотоксической химиотерапией гибели клеток. Шестым аспектом настоящего изобретения является способ обеспечения указанных характерных черт экспрессии генов или профилей уровней белков, описанных и приведенных в качестве примеров выше.
Эксперимент 6. Экспрессия рецепторов эндотелина опухолевыми клетками и астроцитами.
300000 клеток рака молочной железы человека ΜΌΑ-ΜΒ-231 подвергали в течение 24 ч культивированию с 600000 меченными ОРР астроцитами или с меченными ОРР фибробластами 3Т3. Клетки затем собирали и сортировали с выделением клеток ΜΌΑ-ΜΒ-231. Белки экстрагировали, анализировали с помощью Вестерн-блоттинга и подвергали гибридизации с антителом против ЕТАК. Представленные на фиг. 10 данные четко показывают, что опухолевые клетки, подвергнутые сокультивированию с астроцитами, экспрессируют ЕТАК на более высоком уровне.
В следующем ряде исследований 10000 меченных ОРР клеток ΜΌΑ-ΜΒ-231 подвергали сокультивированию с 20000 астроцитов в планшетах с камерами. Спустя 24 ч культуры обрабатывали в течение 24 ч таксолом (15 нг/мл), а затем окрашивали для выявления фосфорилированной формы рАКТ (фиксации с использованием 4% РРА). Как продемонстрировано на фиг. 11, опухолевые клетки, подвергнутые сокультивированию с астроцитами (и таксолом), экспрессируют рАКТ на высоких уровнях. Следовательно, сокультивирование с астроцитами вызывает увеличение экспрессии ЕТК и факторов выживания опухолевыми клетками, которые связаны с повышенной устойчивостью опухолевых клеток к химиотерапевтическим средствам. Аналогичные исследования с использованием антитела против ЕТВК выявили экспрессию ЕТВК.
Эксперимент 7. Антагонисты рецепторов эндотелина не вызывают цитотоксические эффекты по отношению к опухолевым клеткам.
Используя описанную выше схему ίη νίίτο исследования на основе клеток устойчивости к химиотерапии, авторы настоящего изобретения исследовали два антагониста рецепторов эндотелина, обладающих двойным сродством и к ЕТАК, и к ЕТВК, для оценки степени опосредуемой астроцитами защиты от цитотоксических эффектов химиотерапевтических средств. Одним из исследованных антагонистов ЕТК был бозентан, который разрешен ЕМЕА (Европейским агентством по оценке лекарственных препаратов) для применения в лечении артериальной легочной гипертензии (РАН). Второе исследованное лекарственное средство было названо АСТ-064992 и является производным бозентана, также обладающим двойным ЕТАК/ЕТВК сродством. АСТ-064992 официально называют мацитентаном, и он имеет структуру ^-[5-(4-бромфенил)-6-(2-(5-бромпиримидин-2-илокси)этокси)пиримидин-4-ил]-[№-пропиламиносульфонамид]]:
1д1аг/ Μ., е1 а1., РИата^^^у οί тасйетап, ап οταΙΙν асОуе П88ие-1агдеПпд Ьиа1 емШаНеЮ гееерЮг апία^οηίβί, ί. РЬатта^ Ехр ТНег. 2008 Иес; 327(3): 736-745. ЕриЬ 2008 §ер 9.
- 13 023864
Первоначальный текст описания молекулы АСТ-064992, ее синтеза и ее фармакологической активности можно найти в АО 02/053557. АСТ-064992 примерно в три раза фармацевтически активнее бозентана (т.е. в его случае требуется 1/3 дозы). Детализированные данные, приведенные здесь, относятся к экспериментам с использованием АСТ-064992, однако аналогичные результаты получены согласно экспериментам с использованием более высокой дозы бозентана.
АСТ-064992 (100 нМ) добавляли в описанное выше исследование с помощью сокультивирования клеток с использованием составляющего 1:2 соотношения между опухолевыми клетками и астроцитами или опухолевыми клетками или фибробластами 3Т3 в течение 48 ч, и степень апоптоза определяли, как описано выше. Как продемонстрировано на фиг. 12 (в случае клеток рака молочной железы ΜΌΑ-231) и на фиг. 13 (в случае клеток рака легкого РС14), АСТ-064992, добавленный сам по себе или с астроцитами, или с фибробластами 3Т3, не вызывал какие-либо поддающиеся измерению цитотоксические эффекты.
Эксперимент 8. Антагонисты рецепторов эндотелина в комбинации с химиотерапевтическими средствами.
Как показано выше, антагонисты ΕΤΚ были неэффективными в качестве химиотерапии с использованием одного средства. Этот отрицательный результат сделал в высокой степени неожиданным сильный эффект, наблюдаемый при использовании антагонистов ΕΤΚ в качестве компонента комбинированных терапий. В экспериментах с использованием сокультивирования клеточные соотношения при культивировании являлись составляющими 1:2 соотношениями между опухолевыми клетками и астроцитами (50000:100000), и осуществляли обработки, используя паклитаксел (ΤΑΧΟΌ®) (6 нг/мл) и/или АСТ064992 (100 нМ), в течение 48 ч (фиг. 15; *р<0,01). В случае контрольных экспериментов с использованием клеток ΜΌΑ-ΜΒ-231, проявлялась такая же опосредуемая астроцитами защита от паклитаксела, как и в предшествующих экспериментах. Были получены два неожиданных результата этих экспериментов с использованием комбинаций. Во-первых, комбинация паклитаксела с АСТ-064992 в контролях, в которых отсутствовали астроциты, не привела к значимому увеличению гибели клеток по сравнению с паклитакселом самим по себе. Этот результат был обнаружен в по крайней мере трех независимых экспериментах (фиг. 15). Эти результаты были повторены при использовании клеток рака легкого человека ΡΟ4Βτ4 (фиг. 16). Таким образом, в исследованных условиях антагонисты ΕΤΚ были так же неэффективными в комбинации, как и в случае, наблюдаемом в эксперименте б, когда они использовались в виде единственных средств. При сокультивированиях опухолевых клеток с астроцитами АСТ-064992 продемонстрировал неожиданную способность к своду на нет опосредуемой астроцитами защиты от паклитаксела. Даже более неожиданным было то, что АСТ-064992 в действительности увеличивал эффективность паклитаксела, по сравнению с контрольными экспериментами без астроцитов, с суперсенсибилизацией метастатических опухолевых клеток к паклитакселу. Добавление АСТ-064992 к сокультурам астроцитов и опухолевых клеток ингибировало экспрессию факторов выживания рАКТ и рМАРК (фиг. 17). Отмечалась прямая связь между этим ингибированием и увеличение гибели опухолевых клеток, опосредованной химиотерапевтическим средством. Этот синергизм стал даже более неожиданным, поскольку в экспериментах, в которых отсутствовали астроциты, не проявлялись даже аддитивные эффекты. Эти поразительные результаты показывают значение новых способов скрининга с использованием сокультивирования, описанных здесь, поскольку эффекты антагонистов ΕΤΚ при комбинированной терапии невозможно было бы наблюдать в стандартной схеме анализа с использованием линии опухолевых клеток, в которой отсутствуют подвергнутые сокультивированию астроциты. Поэтому седьмым аспектом настоящего изобретения является применение антагонистов рецепторов эндотелина в комбинации с одним или несколькими другими цитотоксическими химиотерапевтическими средствами и/или лучевой терапией для лечения имеющейся опухоли, развившейся в результате метастазирования в головной мозг, у субъекта. В конкретных вариантах осуществления эта комбинированная терапия суперсенсибилизирует имеющийся метастаз в головной мозг к цитотоксическим химиотерапевтическим средствам и/или лучевой терапии, которые назначают вместе с антагонистом ΕΤΚ.
ίη νίνο терапия с использованием антагонистов рецепторов эндотелина для имеющегося метастаза в головной мозг.
ίη νίνο доставки антагониста(ов) рецепторов эндотелина и совместно вводимых химиотерапевтических средств можно достичь с помощью одной и той же пероральной или системной доставки, уже разработанной и использованной в предшествующих клинических испытаниях различных членов этого класса соединений. Разработка и оптимизация таких схем лечения является общепринятой практикой в данной области техники ^/ΙίηίοαΙ ίΓίαΙδ: а ртасбса1 дшбе ίο бе8щч αηαΐνίφ анб τβροτίίη^ Ε6ίίο6 Ьу Αтееί ΒαΚΙιαί апб ΌιιοΟο Ааид. Кетебюа, Όοη6οη 2005]. Одной проблемой, специфичной для раков головного мозга, является воздействие на гематоэнцефалический барьер. Хотя ее в течение длительного времени именовали технической проблемой, мешающей системным лечениям метастаза в головной мозг, в настоящее время в данной области техники признано, что даже при микрометастазах гематоэнцефалический барьер частично нарушен |Сатайеге К. апб 5>с1иГГ Ό., СЬетοίЬе^аρу апб сегеЬга1 теίа8ίа8е8: т18регсеρί^οη οτ теа1Ьу? №иго8иг§ Роси8. 2007 Μа^ 15; 22(3): Ε6]. Поэтому есть основания ожидать, что при системной доставке антагонист(ы) рецепторов эндотелина будет проникать и оказывать терапевтический
- 14 023864 эффект в опухолях, развившихся в результате метастазирования в головной мозг. Кроме того, некоторые члены семейства антагонистов рецепторов эндотелина обладают способностью пересекать даже ненарушенный гематоэнцефалический барьер, что делает их, таким образом, особенно подходящими для применения при лечении опухоли, развившейся в результате метастазирования в головной мозг, ίη νίνο |Уа11ег Н., с1 а1., СсгсЬгоуа5си1аг сНагайеп/аНоп оГ с1а/05сп1ап. (Нс Пгй попрерйбе епбоЛейп гсссрЮг аШадошй кйо^п Ю Ье с1Ппса11у еГГесНуе Гог Ле йеаНпеШ оГ сегеЬга1 уакокракт. Рай II: еПсс! оп епйоЛейп(В) гесерЮгтеЛа1ей ге1ахайоп. ί. Ыеигокигд. 2005 йт: 102(6): 1108-1114]. Наконец, прямая инфузия или инъекция антагониста(ов) рецепторов эндотелина в опухоли может применяться, когда размер метастатических опухолей делает такой подход возможным.
Л νίуо терапия метастаза в головной мозг у мышей.
Для дальнейшего подтверждения эффективности терапии с использованием антагонистов рецепторов эндотелина в случае имеющегося метастаза в головной мозг авторы настоящего изобретения выполнили показательные ш νί\Ό эксперименты, используя мышей. Бестимусным мышам инъецировали 10000 жизнеспособных клеток ΜΌΑ231 через внутреннюю сонную артерию. При предварительном патологическом исследовании было обнаружено, что видимые укоренившиеся метастазы образуются через две недели после инъекции (не представленные данные). Поэтому авторы настоящего изобретения начинали лечения в этот момент времени.
Эксперимент 9. Эффекты АСТ-064992 и темозоломида на ш νί\Ό рост опухолей.
Бестимусным мышам инъецировали во внутреннюю сонную артерию 10000 жизнеспособных клеток ΜΌΑ231. Группами, подвергнутыми лечению через две недели после инъекции, были группы, подвергнутые лечению контролем (носителем) (фиг. 18А): темозоломидом (ΤΜΖ) 10 мг/кг перорально, ежедневно (фиг. 18В): АСТ-064992 50 мг/кг, перорально, ежедневно (фиг. 18С): или комбинацией ΤΜΖ+ΑΓΤ-064992 (фиг. 18Ό).
Всех мышей убивали в день 28 лечения. Срезы головного мозга фиксировали и окрашивали. Метастазы в головной мозг оценивали визуально. Показательные образцы представлены на фиг. 18А-Э при одних и тех же увеличениях. Как можно детальнее видеть на фиг. 18Е, комбинация ΤΜΖ и АСТ-064992 значительно уменьшала размер и плотность опухолевых метастазов по сравнению с ΤΜΖ самим по себе. Это свидетельствует о том, что имеется прямая корреляция описанных выше результатов применения системы с использованием культивирования клеток с наблюдаемыми ш νί\Ό эффектами.
Эксперимент 10. Эффекты АСТ-064992 и паклитаксела на ш νί\Ό рост опухолей.
Самкам бестимусных мышей (возрастом 10-12 недель) инъецировали во внутреннюю сонную артерию 10000 жизнеспособных клеток ΜΌΑ231. Спустя две недели после инъекции, когда метастазы в головной мозг укоренились, мышей разделяли в случайном порядке на 4 группы, подвергаемые лечению (п=10): 1) контролем (с инъекцией раствора носителя): 2) паклитакселом (8 мг/кг, вводимым внутрибрюшинно один раз в неделю): 3) АСТ-064992 (50 мг/кг, вводимым перорально один раз в день): и 4) комбинацией АСТ-064992 и паклитаксела. Всех мышей подвергали эвтаназии через 28 дней лечения и производили вскрытие трупов. Производили выемку головного мозга для гистологического исследования и иммуногистохимического анализа. Показательные результаты представлены на фиг. 19. Во всех группах, подвергнутых лечению контролем (19А), АСТ-064992 (19В) и паклитакселом (19С), имелись полностью определяемые метастатические опухоли. В отличие от этого, группа, подвернутая лечению комбинацией АСТ-064992 + паклитаксел (19Ό), имела намного меньше колоний опухолевых клеток.
Результаты, полученные при использовании темозоломида и паклитаксела, показывают, что терапия с использованием антагонистов рецепторов эндотелина сенсибилизирует метастаз в головной мозг к химиотерапевтическим средствам в целом.
Эксперимент 11. Эффекты АСТ-064992 и паклитаксела на ш νί\Ό пролиферацию опухолевых клеток.
Репрезентативные срезы головного мозга из четырех групп, подвергнутых лечению, окрашивали на СЭ31 (маркер эндотелиальных клеток) и Κί67 (маркер клеточной пролиферации). В головных мозгах контрольных мышей, мышей, подвергнутых лечению лишь паклитакселом или лишь АСТ-064992, содержалось большое количество пролиферирующих клеток. В резком отличии от этого, в головных мозгах мышей, подвергнутых лечению как паклитакселом, так и АСТ-064992, содержалось лишь небольшое число делящихся клеток. См. фиг. 20А, В, С и Ό соответственно.
Эксперимент 12. Эффекты АСТ-064992 и паклитаксела на ш νί\Ό апоптоз опухолевых клеток.
Срезы головного мозга мышей различных групп, подвернутых лечению, исследовали посредством ш Ли дезоксиуридиного мечения концов в месте разрыва цепей с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы (ТиМЕЬ) [Ыедоекси Α, е( а1., ί. ШкЛсйет СуЮсНет. 1996 §ер, 44(9): 959-968]. В головных мозгах контрольных мышей, мышей, подвергнутых лечению таксолом, и мышей, подвергнутых лечению АСТ-064992, содержалось от небольшого числа апоптозных клеток до их отсутствия. См. фиг. 21 А-С. В резком отличии от этого, в головных мозгах мышей, подвергнутых лечению комбинацией АСТ064992 плюс таксол, содержалось большое число апоптозных опухолевых клеток (зеленых) и эндотелиальных клеток (желтых) (фиг. 21Ό).
- 15 023864
Эксперимент 13.
Срезы головного мозга мышей четырех групп, подвергнутых лечению, подвергали иммуноокрашиванию для выявления совместной локализации ЕТАР (красного) и фосфосерина (зеленого), приводившей к оранжево-желтому цвету. Фосфорилированная форма ЕТАР была представлена в головных мозгах контрольных мышей, как и в головных мозгах мышей, подвергнутых лечению паклитакселом (фиг. 22А-В). Лечение АСТ-064992 самим по себе и комбинацией АСТ-064992 + паклитаксел предотвращало фосфорилирование ЕТаР (фиг. 22С-О). Этот результат подтверждает связь между активностью антагонистов рецепторов эндотелина и сенсибилизацией метастатических опухолей к химиотерапевтическим средствам.
Эксперимент 14. Исследование выживания в случае лечения АСТ064992 и таксолом экспериментального метастаза в головной мозг клеток рака молочной железы человека МЭА231.
Детали эксперимента.
5х103 клеток МЭА231 инъецировали согласно протоколу в эксперименте 10. Лечение начинали в день 14 после инъекции согласно протоколу в эксперименте 10. Вычерчена кривая выживания и установлено р-значение для сопоставления статистической значимости среди подвергнутых лечению групп.
Группы, подвергнутые лечению контролем (носителем): ежедневные пероральные введения и внутрибрюшинные инъекции раз в неделю;
паклитакселом (5 мг/кг): ежедневные пероральные введения носителя и внутрибрюшинные инъекции раз в неделю паклитаксела;
АСТ064992 (10 мг/кг): ежедневные пероральные введения АСТ064992 и внутрибрюшинные инъекции раз в неделю паклитаксела.
Результаты.
День смерти (после лечения) в контрольной группе: 42, 43, 53, 60, 64, 68, 68, 69, 69; в группе, подвергнутой лечению паклитакселом: 49, 53, 60, 63, 74, 74, 78; в группе, подвергнутой лечению АСТ064992: 51, 63, 68, 75, 78, 82; в группе, подвергнутой лечению комбинацией паклитаксел + АСТ: 48;
Результаты представлены на фиг. 23.
Анализ для определения 1С50 по отношению к ЕТА или ЕТВ.
Для исследований конкурентного связывания используют мембраны клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантные рецепторы ЕТА или ЕТВ человека. Из рекомбинантных клеток СНО готовят микросомные мембраны и анализ связывания осуществляют, как описано ранее (Вгеи V., е! а1., РЕВ§ Ьей. (1993), 334, 210).
Анализ выполняют в 200 мкл 50 мМ Трис/НС1 буфера, рН 7,4, включающего 25 мМ МпС12, 1 мМ ЕИТА и 0,5% (мас./об.) ΒδΑ в титрационных микропланшетах из полипропилена. Мембраны, содержащие 0,5 мкг белка, инкубируют в течение 2 ч при 20°С с 8 пМ [1251]ЕТ-1 (4000 импульсов в минуту) и увеличивающимися концентрациями немеченых антагонистов. Максимальное и минимальное связывание оценивают в образцах без 100 нМ ЕТ-1 и с ним соответственно. Спустя 2 ч мембраны отфильтровывают на планшетах с фильтрами, содержащими фильтры ОР/С (ип1П11егр1а1е от СапЬегга Раскагб δ.Α. ΖιιγχΙι, Швейцария). В каждую лунку добавляют 50 мкл сцинтилляционной смеси (Мюго8ст1 20, СапЬегга Раскагб δ.Α. ΖιιγχΗ Швейцария), и планшеты с фильтрами подсчитывают в счетчике для микропланшетов (ТорСоий, СапЬегга Раскагб δ.Α. ΖιιγΚΙι, Швейцария).
Все исследуемые соединения растворяют, разбавляют и добавляют в ΌΜδΟ. Анализ выполняют в присутствии 2,5% ΌΜδΟ, которые, как установлено, не мешают значительно связыванию. 1С50 рассчитывают как концентрацию антагониста, ингибирующую 50% специфического связывания ЕТ-1.
Ссылки предшествующего уровня техники.
1. НАМ Миске 'Ъта11-то1еси1е епбоШейп гесерЮг айадойкй: А ге\ае\у оГ ра1епйпд асйуйу асгокк Шегареийс агеак ГОгидк 2009, 12:366-375.
2. УокЫтте Т, е! а1. (1985), 1ттипоЫкЮсНет1са1 к!ибу оГ те!ак!аНс Ьгат !итогк \уНН ак!горго!ет (ОРАР), а дНа-кресйю рго!ет. ТЫкие агсНйесЫге апб 1Не ойдш оГ Ь1ооб уекке1к. ί. Ыеигокигд 62: 414-418.
3. №1коп 1В., е! а1., РНаке 3, гапбопп/еб, сойгойеб !па1 оГ а!гакеп!ап ш райейк юНН поптейкййс, Ногтопе-геГгайогу ргок!а!е сапсег. Сапсег. 2008 Ыоу 1; 113(9):2376-8.
4. СЫарроп А.А., е! а1. РНаке Ι/ΙΙ к!ибу оГ айакейап, ап епбоШейп А гесерЮг айадошкк ш сотЫпайоп юИН рас1Нахе1 апб сагЬор1айп ак Пгк!-1те Шегару т абуапсеб поп-кта11 се11 1ипд сапсег. Сйп Сапсег Рек. 2008 Маг 1; 14(5):1464-9.
5. Сагбеп С.Р., е! а1., ЕйдЫйНу оГ райейк юНН Ьгат те!ак!акек Гог рНаке Ι !па1к: йте Гог а геШшк? ТНе Бапсе! Опсо1оду, ^1ите 9, Ыкие 10, Радек 1012-1017, ОйоЬег 2008 бог:10.1016/81470-2045(08)70257-2.
6. кНаппа А. 1оусе1 & ЛеГГгеу РоНагб, МюгоепуйоптепБй гедиЫйоп оГ те!ак!ак1к, ЫаЫге Ре\ае\ук
Сапсег 9, 239-252 (Арп1 2009) | бог10.1038/пгс2618.
7. Сауайеге Р. апб 5сШГГ Ό., СНето!Негару апб сегеЬга1 те!ак!акек: тйрегсерйоп ог геа1Ну? Ыеигокигд Росик. 2007 Маг 15; 22(3):Е6.
- 16 023864
8. Уа!!ег Н., е! а1., СегеЪгоуазси1аг сНагайеп/айоп оГ с1а/озейап, (Не йгз! попрерййе епйоФеПп гесер!ог айадойз! зНо^п (о Ъе сНтсаНу ейесйуе Гог (Не (геа(теп( оГ сегеЪга1 уазозразт. Раг( II: еГГес! оп епйо(Не1ш(В) гесер(ог-теФа(ей ге1ахайоп. I. №игозигд. 2005 Нт; 102(6):1108-14.
9. 1д1аг/ М., е( а1., РНагтасо1оду оГ тасНейап, ап ога11у асйуе йззие-йгдейпд йиа1 епйоФеПп гесер!ог айадойз!, I. РНагтасо1 Ехр ТНег. 2008 Оес; 327 (3): 736-45. ЕриЪ 2008 8ер 9.
10. УО 02/053557.
Список технической литературы.
8. Υапо е! а1. СНп. Сапсег Кез. 6, 957-965 (2000).
8.1. Кт е! а1. I. Сапсег 1пз!. 98, 783-793 (2006).
Ό. СНе1оисНе Ьеу е! а1. СНп. Сапсег Кез. 11, 306-314 (2005).
К.К. Ьапд1еу е! а1. Сапсег Кез. 64, 3727-3730 (2004).
Т. 1)и11 е! а1. I Уйо1. 72, 8463-8471 (1998)
I. СаНреаи е! а1. Сапсег Кез. 59, 2384-2394 (1999).
Ь. 2ата1 е! а1. Су!оте!гу 44, 57-64 (2001).
Ό. Рап е! а1. Сапсег Кез. 50, 3619-3626 (1990).
М.Н. Уайе, ЕЕ. Тгозко, М. 8сйпй1ег, 8аепсе 232, 525-528 (1986).
ЕН. Ьт е! а1. №й №игозсГ 1, 494-500 (1998).
Р.С. Ропзеса е! а1. Су!оте!гу 69А, 487-493 (2006).
В.М. Во1з!ай, К.А. Ы/аггу, М. Азйапй, Т.Р. 8реей, ВюшГогтайсз 19, 185-193 (2003).
Согу А.Н., О\уеп Т.С., Ваг1!гор ЕА., Согу ТС. (Фйу 1991). Изе оГ ап ациеоиз зо1иЪ1е !е!га/оПит/Гогта/ап аззау Гог се11 дгоМН аззауз ш си1!иге. Сапсег соттитсайопз 3 (7): 207-12.
СНтса1 1па1з: а ргасйса1 дшйе !о йез1дп, апа1уз1з апй герогйпд ЕйНей Ъу Атее! ВакНа1 апй Эио1ао Уапд. КетеФса, Ьопйоп 2005.
№доезси А., е! а1., I. Н1з!осНет Су!осНет. 1996 8ер; 44 (9): 959-68.
Все ссылки, приводимые или иначе идентифицируемые здесь, включены тем самым посредством ссылки в их полных объемах и, в частности, ради любой конкретной информации, ради которой они приводятся.

Claims (6)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, или лучевой терапией или как лучевой терапией, так и цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида, для предупреждения распространения метастазов в головной мозг или лечения метастазов в головном мозге.
  2. 2. Применение по п.1, где мацитентан используется в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида.
  3. 3. Применение по п.1, где мацитентан используется в комбинации с лучевой терапией.
  4. 4. Применение по п.3, где лучевая терапия представляет собой лучевую терапию всего головного мозга или стереотаксическую радиохирургию.
  5. 5. Применение по п.1, где мацитентан используется в комбинации как с лучевой терапией, так и с цитотоксическим химиотерапевтическим средством, выбранным из паклитаксела, темозоломида и смеси паклитаксела и темозоломида.
  6. 6. Применение по любому из пп.1-5, отличающееся тем, что предупреждение распространения метастазов включает снижение риска и/или степени распространения метастазов в головной мозг.
EA201270264A 2009-08-10 2010-08-09 Применение мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством и/или лучевой терапией для лечения метастазов в головном мозге EA023864B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23268709P 2009-08-10 2009-08-10
PCT/US2010/044832 WO2011019630A2 (en) 2009-08-10 2010-08-09 Treatment of astrocytes-tumor cells with inhibitors of endothelin receptors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201270264A1 EA201270264A1 (ru) 2013-02-28
EA023864B1 true EA023864B1 (ru) 2016-07-29

Family

ID=42938154

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270264A EA023864B1 (ru) 2009-08-10 2010-08-09 Применение мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством и/или лучевой терапией для лечения метастазов в головном мозге

Country Status (28)

Country Link
US (2) US8999934B2 (ru)
EP (1) EP2464218B1 (ru)
JP (1) JP2013501791A (ru)
KR (1) KR20120088665A (ru)
CN (1) CN102510719B (ru)
AU (1) AU2010282744B2 (ru)
BR (1) BR112012003103A2 (ru)
CA (1) CA2770397A1 (ru)
CL (1) CL2012000333A1 (ru)
DK (1) DK2464218T3 (ru)
EA (1) EA023864B1 (ru)
ES (1) ES2543280T3 (ru)
HK (1) HK1171336A1 (ru)
HR (1) HRP20150890T1 (ru)
HU (1) HUE026005T2 (ru)
IL (1) IL217915A0 (ru)
IN (1) IN2012DN01261A (ru)
MA (1) MA33571B1 (ru)
MX (1) MX2012001562A (ru)
NZ (1) NZ598078A (ru)
PL (1) PL2464218T3 (ru)
PT (1) PT2464218E (ru)
SG (1) SG178828A1 (ru)
SI (1) SI2464218T1 (ru)
TN (1) TN2012000054A1 (ru)
TW (1) TWI483938B (ru)
WO (1) WO2011019630A2 (ru)
ZA (1) ZA201200980B (ru)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA34952B1 (fr) * 2011-02-04 2014-03-01 Actelion Pharmaceuticals Ltd Combinaisons comprenant du macitentan pour le traitement d'un glioblastome multiforme
EP2723381A4 (en) 2011-06-21 2015-03-18 Univ Johns Hopkins FOCUSED RADIATION FOR THE REINFORCEMENT OF IMMUNE TREATMENTS AGAINST NEOPLASMS
CA2978567A1 (en) 2015-03-06 2016-09-15 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Method of treating cancer associated with a ras mutation using plinabulin
JP6904570B2 (ja) * 2015-03-06 2021-07-21 ビヨンドスプリング ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 脳腫瘍の治療方法
DK3334726T3 (da) 2015-07-13 2022-05-16 Beyondspring Pharmaceuticals Inc Plinabulinsammensætninger
AU2016302254B2 (en) 2015-08-03 2019-09-12 Enb Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating cancers associated with ETBR activation
JP6996728B2 (ja) * 2016-01-07 2022-01-17 学校法人自治医科大学 グルコーストランスポーター１発現用アデノ随伴ウイルスベクター
CN108778267A (zh) 2016-02-08 2018-11-09 万春药业公司 包含妥卡雷琐或其类似物的组合物
WO2017209272A1 (ja) * 2016-06-03 2017-12-07 国立大学法人東京大学 がん転移阻害剤
CN110431135A (zh) 2017-01-06 2019-11-08 大连万春布林医药有限公司 微管蛋白结合化合物及其治疗用途
BR112019015974A2 (pt) 2017-02-01 2020-03-31 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Método para reduzir neutropenia
AU2019206652A1 (en) 2018-01-12 2020-07-16 Enb Therapeutics, Inc. Deuterated compounds, compositions, and methods for treating cancers associated with ETBR activation
US11786523B2 (en) 2018-01-24 2023-10-17 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Composition and method for reducing thrombocytopenia
CN109232546B (zh) 2018-09-25 2020-09-04 中国人民解放军总医院 一种嘧啶磺酰胺类衍生物的医药用途
CN112062857B (zh) * 2019-06-10 2024-08-09 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Eta抗体与bnp的融合蛋白质，及其药物组合物和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004035057A1 (en) * 2002-10-12 2004-04-29 Astrazeneca Ab Therapeutic treatment

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2431675C (en) 2000-12-18 2011-11-08 Actelion Pharmaceuticals Ltd. Novel sulfamides and their use as endothelin receptor antagonists
US20050043233A1 (en) * 2003-04-29 2005-02-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combinations for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apoptosis of myeloma cells or angiogenesis
US20060058311A1 (en) * 2004-08-14 2006-03-16 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combinations for the treatment of diseases involving cell proliferation
PL1928409T3 (pl) 2005-09-12 2013-02-28 Actelion Pharmaceuticals Ltd Trwała kompozycja farmaceutyczna zawierająca pirymidynosulfamid
TWI441639B (zh) 2008-02-20 2014-06-21 Actelion Pharmaceuticals Ltd 用於治療卵巢癌之包含紫杉醇之組合
MA34952B1 (fr) 2011-02-04 2014-03-01 Actelion Pharmaceuticals Ltd Combinaisons comprenant du macitentan pour le traitement d'un glioblastome multiforme

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004035057A1 (en) * 2002-10-12 2004-04-29 Astrazeneca Ab Therapeutic treatment

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AKHAVAN ARDAVAN ET AL.: "Endothelin receptor a blockade enhances taxane effects in prostate cancer", NEOPLASIA (NEW YORK), vol. 8, no. 9, September 2006 (2006-09), pages 725-732, XP002605978, ISSN: 1522-8002, page 727; figure 1, page 729; figure 4 *
BAGNATO A. ET AL.: "The endothelin axis in cancer", INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY, EXETER, GB LNKD- DOI:10.1016/J.BIOCEL.2008.01.022, vol. 40, no. 8, 1 January 2008 (2008-01-01), pages 1443-1451, XP022655988, ISSN: 1357-2725 [retrieved on 2008-02-01], page 1450, left-hand column, paragraph 3-4 *
CHIAPPORI ALBERTO A. ET AL.: "Phase I/II study of atrasentan, an endothelin A receptor antagonist, in combination with paclitaxel and carboplatin as first-line therapy in advanced non-small cell lung cancer", CLINICAL CANCER RESEARCH: AN OFFICIAL JOURNAL OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH 1 MAR 2008 LNKD- PUBMED:18316570, vol. 14, no. 5, 1 March 2008 (2008-03-01), pages 1464-1469, XP002605976, ISSN: 1078-0432, page 1465, right-hand column, paragraph 2-3, page 1466; table 1, page 1468, left-hand column, last paragraph *
PHUPHANICH SURASAK ET AL.: "Phase I safety study of escalating doses of atrasentan in adults with recurrent malignant glioma", NEURO-ONCOLOGY AUG 2008 LNKD- PUBMED:18477765, vol. 10, no. 4, August 2008 (2008-08), pages 617-623, XP002605977, ISSN: 1522-8517, page 621, right-hand column, paragraph 2, page 622, right-hand column, paragraph 1, abstract *
RICHARD KEFFORD ET AL.: "A Phase II study of bosentan, a dual endothelin receptor antagonist, as monotherapy in patients with stage IV metastatic melanoma", INVESTIGATIONAL NEW DRUGS; THE JOURNAL OF NEW ANTICANCER AGENTS, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, B0, vol. 25, no. 3, 5 October 2006 (2006-10-05), pages 247-252, XP019500025, ISSN: 1573-0646, page 251, right-hand column, last paragraph, abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
TWI483938B (zh) 2015-05-11
SG178828A1 (en) 2012-04-27
BR112012003103A2 (pt) 2016-04-19
CL2012000333A1 (es) 2013-01-25
MA33571B1 (fr) 2012-09-01
CN102510719A (zh) 2012-06-20
CN102510719B (zh) 2015-07-22
PL2464218T3 (pl) 2015-12-31
MX2012001562A (es) 2013-01-29
HK1171336A1 (en) 2013-03-28
AU2010282744A1 (en) 2012-03-22
EA201270264A1 (ru) 2013-02-28
IL217915A0 (en) 2012-03-29
HRP20150890T1 (hr) 2015-09-25
US20150352113A1 (en) 2015-12-10
SI2464218T1 (sl) 2015-10-30
JP2013501791A (ja) 2013-01-17
IN2012DN01261A (ru) 2015-05-15
EP2464218B1 (en) 2015-05-27
HUE026005T2 (en) 2016-04-28
WO2011019630A2 (en) 2011-02-17
AU2010282744B2 (en) 2014-08-28
ZA201200980B (en) 2012-10-31
TW201109315A (en) 2011-03-16
US20120144510A1 (en) 2012-06-07
US8999934B2 (en) 2015-04-07
TN2012000054A1 (en) 2013-09-19
KR20120088665A (ko) 2012-08-08
CA2770397A1 (en) 2011-02-17
NZ598078A (en) 2013-07-26
PT2464218E (pt) 2015-09-16
EP2464218A2 (en) 2012-06-20
ES2543280T3 (es) 2015-08-17
WO2011019630A3 (en) 2011-06-03
DK2464218T3 (en) 2015-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA023864B1 (ru) Применение мацитентана в комбинации с цитотоксическим химиотерапевтическим средством и/или лучевой терапией для лечения метастазов в головном мозге
Fang et al. MicroRNA‐29b suppresses tumor angiogenesis, invasion, and metastasis by regulating matrix metalloproteinase 2 expression
CN101888777A (zh) 用拓扑异构酶抑制剂和parp抑制剂的组合治疗癌症
UA127409C2 (uk) Модулятори глюкокортикоїдного рецептора для лікування раку шийки матки
CN103189511B (zh) 利用siRNA导入的新型hiPSC制作法
US20210030836A1 (en) Novel Tumor Microenvironment-Related Target TAK1 and Application Thereof in Inhibition of Tumor
US20070105790A1 (en) Pancreatic cancer treatment using Na+/K+ ATPase inhibitors
RU2637372C2 (ru) Средство для лечения фиброза кишечника
CN107106580A (zh) 治疗癌症干细胞的组合物
JP7039470B2 (ja) がんの治療において治療薬として使用するための、モノカルボン酸トランスポーター４（ｍｃｔ４）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｓｏ）阻害剤
JP2000504670A (ja) 腫瘍細胞の成長を抑制する方法
CN115645539B (zh) Hbo1及其抑制剂在制备治疗去势抵抗性前列腺癌药物中的应用
US20200155594A1 (en) Hornerin: a novel non-vegf mediated angiogenic protein expressed in both human and mouse angiogenic endothelial cells and human pancreatic cancer cells
WO2021261601A1 (ja) レチノイドとがん治療薬との併用療法が有効ながん患者の選択方法およびレチノイドとがん治療薬との併用医薬
KR101191958B1 (ko) Ｔｌｅ1 억제제를 유효성분으로 함유하는 활액막 육종 예방 및 치료용 약학적 조성물
CN109777776B (zh) Rgs16抑制剂在制备抑制胶质瘤细胞迁移和/或增殖能力的产品中的应用
Abouleisa et al. Transient Cell Cycle Induction in Cardiomyocytes to Treat Ischemic Heart Failure
JP2008148693A (ja) 幹細胞の単離方法
KR20220088294A (ko) Oligodendrocyte transcription factor 2 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 치료 효과 증진용 약학적 조성물
Adnani The Role of Neuropeptide Y and NPY5R in Ewing Sarcoma Metastasis
JP2023059508A (ja) 悪性中皮腫の治療薬
CN117838717A (zh) 一种抑制或下调prkcsh基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中应用
CN116539884A (zh) 氧甾醇结合蛋白osbpl2作为结直肠癌分子标志物及其治疗靶点的应用
CN117899220A (zh) Crtc2基因抑制剂在制备抗肝癌药物中的应用
CN115058518A (zh) Otub1基因、其检测试剂和抑制剂的应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU