CN107446022A - 一种可拮抗parp1蛋白rna结合活性的多肽pip‑14及其应用 - Google Patents
一种可拮抗parp1蛋白rna结合活性的多肽pip‑14及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽及其应用,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;还涉及一种抗肿瘤多肽及其应用,所述抗肿瘤多肽包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域,肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性,但连接肿瘤细胞杀伤结构域后,有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明的抗肿瘤多肽,不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物,还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤靶向治疗领域,更特别地,涉及一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽及其应用。
背景技术
肿瘤严重影响着人类的健康,是世界范围内一个主要的致死因素。目前已有的抗肿瘤方法虽对大多数肿瘤有一定疗效,但仍存在疗效低、选择性差、毒副反应大、易产生耐药等问题。因此,寻找新型高效低毒的抗肿瘤药物一直是国内外医药研发的热点。
肿瘤靶向治疗是指在分子水平上,通过药物靶向作用于肿瘤细胞,使其特异性死亡,而不影响正常组织细胞。与传统细胞毒化疗不一样,肿瘤分子靶向治疗具有特异性抗肿瘤作用,且毒性明显减少。肽类药物不仅毒性低、活性高、易于吸收,还可以通过提高机体免疫功能,抑制肿瘤的生长和转移,增强抗肿瘤作用,因此,越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。例如,抗肿瘤尿蛋白(ANUP)是人体尿液中一种具有抗肿瘤和抗血管生成作用的蛋白质。Kathleen等人工合成了与ANUP的N端同源的2个多肽,发现对人宫颈癌细胞HeLa的抑制率达到70%,鸡胚胎尿绒毛膜试验结果表明,这2个多肽都具有抑制血管生成的作用。
人多聚ADP-核糖聚合酶1(PARP1)广泛表达于肿瘤细胞中,其主要参与DNA损伤修复,影响放化疗药物的作用。研究表明:对PARP1活性的抑制可增加放化疗的敏感性。PARP1在肿瘤中的广泛表达使得它成为肿瘤治疗的潜在靶标。
人类PARP1蛋白由1014个氨基酸残基组成,相对分子量为116kDa,含有四个功能域(图1),即N端的DNA结合区(包括三个锌指结构域ZnⅠ、ZnⅡ、ZnⅢ)、C端的催化域(CAT)、中间的自修饰域(BRCT)与RNA结合域(WGR)。经典的PARP1抑制剂如PJ-34通过抑制PARP1的酶活性,从而达到抗肿瘤的作用。其中,WGR结构域是一段由79个氨基酸组成的活性区域,存在于polyA聚合酶和调控大肠杆菌钼酸盐代谢的因子中,目前推测该区域具有结合核酸的能力。对WGR进行靶向阻遏,能够影响蛋白质-核酸复合物的形成,从而达到治疗肿瘤的作用。多肽代谢快、无毒副作用的特点对靶向治疗药物的研发具有指导意义,有望推动恶性肿瘤分子靶向治疗的发展与进程。靶向PARP1蛋白WGR结构域的多肽尚未见报道。
因此,需要构建一种既能靶向肿瘤细胞,又能高效入胞的新型多肽。
发明内容
为解决以上问题,发明人制备了一种生物活性肽,并将该多肽与细胞穿膜肽通过共价键连接起来,达到既有靶向肿瘤细胞,又具有高效入胞的效果。
基于该研究,本发明提供了一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。实验证明,该多肽可竞争性拮抗促癌蛋白PARP1与RNA的结合,并在细胞水平表现出明显的肿瘤抑制作用。
本发明还提供了上述可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了一种抗肿瘤多肽,其包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域,所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地,所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地,所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端。
本发明还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的优点在于,本发明的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性,但连接PARP1的RNA结合活性肽段后,有明显的抑制肿瘤活性的作用。
附图说明
图1为PARP1蛋白的结构域示意图;
图2为对照肽和PIP-14处理肿瘤细胞48小时后的荧光显微镜照片;
图3为PC-3细胞活性随PIP-14浓度变化的曲线图;
图4为SH-SY5Y细胞活性随PIP-14浓度变化的曲线图;
图5为50μmol/L的PIP-14或对照肽处理PC-3细胞不同时间的细胞活性统计图;
图6为50μmol/L的PIP-14或对照肽处理SH-SY5Y细胞不同时间的细胞活性统计图;
图7为平板克隆形成实验照片;
图8为根据图7计算的细胞克隆数的统计图;
图9为软琼脂克隆形成实验照片;
图10为根据图9计算的细胞克隆数的统计图;
图11为Transwell细胞侵袭实验照片;
图12为根据图11计算的肿瘤细胞的迁移数目的统计图;
图13为肿瘤细胞的血管形成活性抑制实验照片;
图14为根据图13计算的肿瘤细胞的相对血管形成活性统计图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
1.抗肿瘤多肽的合成
通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽,其包括一个肿瘤细胞杀伤结构域和一个穿膜结构域,其中肿瘤细胞杀伤结构域序列如SEQ ID NO:1所示,穿膜结构域序列如SEQ IDNO:2所示,连接于肿瘤细胞杀伤结构域的N端,所得到的序列为:氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-DIVKGTNSYYKLQK(SEQ ID NO:3),命名为PIP-14。为了研究方便,我们在抗肿瘤多肽的C端连接异硫氰酸荧光素标记FITC,N端连接生物素标记Biotin。
2.PIP-14的细胞定位检测
取对数期生长的肿瘤细胞,用无菌1×PBS重悬,经过计数后按每孔10000个细胞种植于内置无菌爬片的24孔板内,吹打均匀后置于37℃恒温培养箱、含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养,培养过夜后加入20μmol/L的多肽,维持48小时。弃去上清,1×PBS洗两次后采用4%多聚甲醛固定,室温固定30分钟后弃甲醛,用1×PBS洗两次,然后采用DAPI染核,3-5分钟后再次用1×PBS洗两次,然后纯甘油制片,整个操作过程均要求严格避光;制片结束后在激光共聚焦显微镜下观察带有FITC荧光基团的多肽在细胞内的定位。实验结果如图2所示,PIP-14能够有效被细胞摄取,并积聚于肿瘤细胞的细胞核,呈现强胞核染色。
3.MTT比色法分析检测PIP-14对肿瘤细胞生长的抑制作用
取对数生长期的SH-SY5Y、PC-3细胞,用0.25%的胰酶消化后,加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞,计数并调整细胞悬液的浓度至5×104个/ml,然后加入96孔板中,每孔100μl。将培养板置于恒温37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。培养24小时后,细胞完全贴壁,吸出废旧培养液,加入终体积为200μl的含有不同浓度多肽的DMEM基础培养基,并以另一合成多肽为对照组,将培养板置于恒温37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。48小时后吸出培养液,用PBS洗2次,加入5mg/ml的MTT溶液20μl和新鲜基础培养基180μl;于恒温37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。
48小时后吸出培养液,用PBS洗2次,加入5mg/ml的MTT溶液20μl和新鲜基础培养基180μl;于恒温37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。4小时后,弃去含有MTT的培养液,加入150μl DMSO后于微型振荡器上振荡15min。在OD490nm用酶标仪处测量各孔的吸光值,计算IC50。
结果如图3-6所示,该多肽能显著抑制SH-SY5Y和PC-3细胞的增殖活性,且呈剂量依赖性,经计算IC50约为50μmol/L,而对照肽无此抑制作用(图3和4)。用50μmol/L剂量的多肽,处理不同时间,显示出时间依赖性(图5和6)
4.克隆形成实验检测PIP-14对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用
取经对数生长期SH-SY5Y、PC-3细胞,用0.25%的胰酶消化并吹打成单个细胞。细胞计数,并用培养基调整细胞浓度。将细胞悬液作梯度倍数稀释,分别以每孔100、200、500个细胞的梯度密度接种于含2ml培养基的六孔板中,并轻轻摇动,使细胞分散均匀。将多肽按照50μmol/L浓度加入培养基中。将培养板置于恒温37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养2周左右。当培养孔中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去培养液,用PBS洗3次。加入4%多聚甲醛室温固定细胞15分钟,然后弃去多聚甲醛,用PBS洗3次,每次5分钟。加入适量考马斯亮蓝,染色30分钟后吸去染液,然后用清水洗去染色液,空气干燥,将平皿倒置在显微镜下计数。
实验结果如图7和8所示,与对照组多肽相比,PIP-14多肽处理的肿瘤细胞的克隆集落形成显著降低,说明该新型多肽可有效抑制肿瘤细胞的增殖能力。
5.软琼脂克隆形成实验
取多肽处理的对数生长期SH-SY5Y、PC-3细胞,用0.25%胰酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,每孔加入300个细胞。用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持40℃ 温度,以防凝固。按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3ml混合液加入六孔板中,冷却凝固,作底层琼脂。将培养板置于恒温37℃、5%CO2的细胞培养箱备用。按1:1比例使0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基混合后,再加入适量的细胞悬液,充分混匀,注入铺有底层琼脂的培养板中,逐渐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后,置于恒温37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养3-4周。向六孔板中加入5mg/ml MTT溶液,4℃染色4小时后,取出观察照相。计数细胞克隆形成数目(每个克隆至少50个细胞)。
结果如图9和10所示,与对照组多肽相比,PIP-14多肽处理的肿瘤细胞的克隆集落形成显著降低,说明该新型多肽可有效抑制肿瘤细胞的增殖能力。
6.Transwell实验检测PIP-14对肿瘤细胞迁移活性的影响
在24孔培养板中加入完全培养基,将Transwell小室放入孔中。取经多肽处理的对数生长期SH-SY5Y、PC-3细胞,用0.25%胰酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数。每孔加入2.5×105个细胞。将24孔板置于恒温37℃、5%CO2细胞培养箱内,培养24小时。取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用PBS洗2遍。甲醇固定20分钟,将小室风干。0.1%结晶紫染色30分钟,用棉签轻轻擦掉上层未穿过小孔的细胞。显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。
结果如图11和12所示,与对照组多肽相比,PIP-14处理的肿瘤细胞的迁移个数明显降低,说明该新型多肽可有效抑制肿瘤细胞的迁移能力。
7.PIP-14抑制肿瘤细胞血管生成活性检测
在6孔板中PC-3细胞以80%密度铺板,每孔加入2ml培养基,再加入多肽,同时设对照孔。在37℃、5%CO2环境培养48小时,收集培养孔内的上清液。实验前一天,从-80℃取出基质胶,放置冰上过夜溶解。取48孔细 胞培养板,每孔加入150μl基质胶至孔底,水平放置于37℃培养箱30分钟,待基质胶凝固。制备HUVEC单细胞悬液,计数后,向48孔板每孔加入约6000个细胞,再加入收集的上清100μl。在37℃、5%CO2环境培养4-6小时,在倒置显微镜下动态观察HUVEC小管形成状态,适时拍照。
结果如图13和14所示,与对照肽相比,PIP-14能显著抑制人脐静脉内皮细胞的血管生成。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院
<120> 一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽PIP-14及其应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Ile Val Lys Gly Thr Asn Ser Tyr Tyr Lys Leu Gln Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Asp Ile Val Lys Gly
1 5 10 15
Thr Asn Ser Tyr Tyr Lys Leu Gln Lys
20 25
Claims (6)
1.一种可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽,其特征在于,氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的可拮抗PARP1蛋白RNA结合活性的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.一种抗肿瘤多肽,其特征在于,包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域,所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求3所述的抗肿瘤多肽,其特征在于,所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求3或4所述的抗肿瘤多肽,其特征在于,所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端。
6.权利要求3-5中任一项所述的抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
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