CN106831956B

CN106831956B - 一种抗肿瘤多肽mudp-21及其应用

Info

Publication number: CN106831956B
Application number: CN201710197189.1A
Authority: CN
Inventors: 童强松; 郑丽端; 方二虎; 宋华杰; 叶霖; 王晓静; 杨枫; 李聃
Original assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2019-11-08
Anticipated expiration: 2037-03-29
Also published as: CN106831956A

Abstract

本发明提供了一种可杀伤肿瘤细胞的多肽及其应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；还涉及一种抗肿瘤多肽及其应用，所述抗肿瘤多肽包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接肿瘤细胞杀伤结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

Description

一种抗肿瘤多肽MUDP-21及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤靶向治疗领域，更特别地，涉及一种可杀伤肿瘤细胞的多肽及其应用。

背景技术

近年来，恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，已成为发达国家和部分发展中国家人口死亡的主要原因，是全球最大的公共问题之一，严重威胁着人类健康和生命安全。因此，癌症的治疗受到国际社会的普遍关注和高度重视，而寻找安全有效、不良反应小的抗肿瘤药物一直是生物医学研究的焦点。传统临床药物治疗是通过直接杀伤肿瘤细胞进而抑制肿瘤的生长，但通常对正常细胞具有毒性，产生骨髓抑制、免疫功能低下等副作用，而且随着药物使用时间的延长，肿瘤细胞易产生抗药性。因此，从不同途径寻找效果好、毒性低、特异性强的抗肿瘤药物是目前肿瘤治疗的主要目标。

生物活性肽(bioactivity peptides)，又称功能肽(functional peptides)，是一类具有生理活性功能的肽，具有抑制肿瘤细胞生长或者抗菌、抗病毒、降血压、降血糖等重要作用。由于其分子量小、易于吸收，可广泛应用于保健品和药物的开发。

因此，需要构建一种既能靶向肿瘤细胞，又能高效入胞的新型多肽。

发明内容

为解决以上问题，发明人制备了一种生物活性肽，并将该多肽与细胞穿膜肽通过共价键连接起来，达到既有靶向肿瘤细胞，又具有高效入胞的效果。

基于该研究，本发明提供了一种可杀伤肿瘤细胞的多肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

本发明还提供了上述可杀伤肿瘤细胞的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤多肽，其包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端

本发明还提供了上述抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的优点在于，本发明的抗肿瘤多肽的穿膜结构域本身没有细胞毒性，但连接肿瘤杀伤结构域后，有明显的抑制肿瘤增殖、迁移侵袭的效应。本发明的抗肿瘤多肽，不仅可以单独作为抗肿瘤的生物治疗药物，还有望结合其他治疗方式来抑制肿瘤。

附图说明

图1为用MUDP-21和对照多肽孵育肿瘤细胞后的荧光显微镜照片；

图2为不同浓度的MUDP-21对SH-SY5Y细胞增殖活性影响的统计图；

图3为分别含有MUDP-21和对照多肽的液体培养基培养SH-SY5Y细胞两周后的培养孔的结晶紫染色照片；

图4为根据图3计算的细胞克隆数的统计图；

图5为分别含有MUDP-21和对照多肽的软琼脂培养基培养SH-SY5Y细胞3-4周后的培养孔的四甲基偶氮唑蓝染色照片；

图6为根据图5计算的细胞克隆数的统计图

图7为细胞划痕实验检测MUDP-21和对照多肽对细胞迁移能力影响；

图8为Transwell实验的结晶紫染色照片；

图9为根据图8计数得到的IMR32细胞的Transwell实验的细胞计数图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.抗肿瘤多肽的合成

通过固相合成法合成一种抗肿瘤多肽，其包括一个肿瘤细胞杀伤结构域和一个穿膜结构域，其中肿瘤细胞杀伤结构域序列如SEQ ID NO:1所示，穿膜结构域序列如SEQ IDNO:2所示，连接于肿瘤细胞杀伤结构域的N端，所得到的序列为：氨基酸序列为YGRKKRRQRRR-METRWGTDGVLMTAVIGAGSC(SEQ ID NO:3)，命名为MUDP-21。为了研究方便，我们还在抗肿瘤多肽的C端标记的异硫氰酸荧光素标记FITC。

2.MUDP-21的细胞定位检测

分别采用人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞进行实验。将对数期生长的细胞种植在24孔板内的盖玻片上，每孔约8000-12000个细胞。以10％胎牛血清，高糖DMEM培养基培养，并加入60μM的多肽，培养24小时。以与该多肽相同组成的氨基酸随机重新排列后的错序肽作为对照肽。采用激光共聚焦显微镜检测带有荧光基团的多肽在细胞内的定位，拍照并保存。实验结果如图1所示，MUDP-21在加入细胞培养体系24小时之后，能有效穿透肿瘤细胞膜进入细胞，呈现强胞浆及胞核染色，说明该多肽能够有效进入肿瘤细胞的胞浆和胞核内。

3.MTT比色法分析检测MUDP-21对SH-SY5Y细胞生长的抑制作用

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，用0.25％的胰酶消化后，加入相应的完全培养基终止消化并重悬细胞，计数并调整细胞悬液的浓度至5×10⁴个/ml，然后加入96孔板中，每孔100μl。将培养板置于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。

培养24小时后，细胞完全贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200μl的含有不同浓度MUDP-21的DMEM基础培养基，以乱序多肽为对照组，将培养板置于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。

48小时后吸出培养液，用PBS洗2次，加入5mg/ml的四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液20μl和新鲜基础培养基180μl；于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养；4小时后，弃去含有MTT的培养液，加入150μl DMSO后于微型振荡器上振荡15分钟。

用在酶联免疫检测仪在490nm处测量各孔的吸光值OD₄₉₀，并计算抑制率：癌细胞生长抑制率(％)＝[(对照组OD-空白组OD)-(给药组OD-空白组OD)]/(对照组OD-空白组OD)×100。

实验结果如图2所示，MUDP-21能显著抑制SH-SY5Y细胞的生长活性，且呈剂量依赖性，IC₅₀为60μM，而对照肽无抑制作用。

4.克隆形成实验检测MUDP-21对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，用0.25％的胰酶消化并吹打成单个细胞。细胞计数，并用培养基调整细胞浓度。将细胞悬液作梯度倍数稀释，分别以每孔100、200、500个细胞的梯度密度接种于含2ml培养基的六孔板中，并轻轻摇动，使细胞分散均匀。将MUDP-21按照60μM浓度加入培养基中。将培养板置于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养2周左右。

当培养孔中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去培养液，用PBS洗3次。加入4％多聚甲醛室温固定细胞15分钟，然后弃去多聚甲醛，用PBS洗3次，每次5分钟。加入适量结晶紫，染色30分钟后吸去染液，然后用清水洗去染色液，空气干燥。

实验结果如图3和4所示，60μM的MUDP-21能显著抑制SH-SY5Y细胞的增殖活性。

5.软琼脂克隆形成实验检测MUDP-21对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，用0.25％胰酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，每孔加入300个细胞。用蒸馏水分别制备出1.2％和0.7％两个浓度的溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持40℃温度，以防凝固。

将MUDP-21按照60μM浓度加入培养基中。按1:1比例使1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取3ml混合液加入六孔板中，冷却凝固，作底层琼脂。将培养板置于恒温37℃、5％CO2的细胞培养箱备用。

按1:1比例使0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基混合后，再加入适量的细胞悬液，充分混匀，注入铺有底层琼脂的培养板中，逐渐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养3-4周。

向六孔板中加入5mg/ml MTT溶液，4℃染色4小时后，取出观察照相。计数细胞克隆形成数目(每个克隆至少50个细胞)。

实验结果如图5和6所示，60μM的MUDP-21能显著抑制SH-SY5Y细胞的增殖活性。

6.划痕实验检测MUDP-21对SH-SY5Y细胞迁移的抑制作用

用记号笔在六孔板背面画横线以进行标记；细胞消化后，取适量细胞进行接种，将培养板置于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。

待细胞长满板底后，用100μl枪头比着直尺，垂直于培养板背后的横线划痕；吸去细胞培养液，用PBS洗3次，洗去悬浮的细胞；加入无血清培养基，拍照记录。将培养板置于恒温37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养24小时后，再次拍照记录。

实验结果如图7所示，60μM的MUDP-21能显著抑制SH-SY5Y细胞的迁移活性。

7.Transwell实验检测MUDP-21对SH-SY5Y细胞迁移的抑制作用

在24孔培养板中加入含完全培养基，将Transwell小室放入孔中；取对数生长期的SH-SY5Y细胞，用0.25％胰酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数。每孔加入2.5×10⁵个细胞，并向上室加入60μM的多肽；将24孔板置于恒温37℃、5％CO₂细胞培养箱内，培养24小时。

取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗2遍；甲醇固定20分钟，将小室风干；0.1％结晶紫染色30分钟，用棉签轻轻擦掉上层未穿过小孔的细胞；显微镜下随机五个视野观察细胞，记数。

实验结果如图8和9所示：60μM多肽能显著抑制SH-SY5Y细胞的迁移活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> 一种抗肿瘤多肽MUDP-21及其应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Thr Arg Trp Gly Thr Asp Gly Val Leu Met Thr Ala Val Ile

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ser Cys

20

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Glu Thr Arg Trp

1 5 10 15

Gly Thr Asp Gly Val Leu Met Thr Ala Val Ile Gly Ala Gly Ser Cys

20 25 30

Claims

1.一种可杀伤肿瘤细胞的多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的可杀伤肿瘤细胞的多肽在制备抑制SH-SY5Y细胞生长活性、增殖活性和迁移活性药物中的应用。

3.一种抗肿瘤多肽，其特征在于，包括肿瘤细胞杀伤结构域和穿膜结构域，所述肿瘤细胞杀伤结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求3或4所述的抗肿瘤多肽，其特征在于，所述穿膜结构域连接于所述肿瘤细胞杀伤结构域的N端。

6.权利要求3-5中任一项所述的抗肿瘤多肽在制备抑制SH-SY5Y细胞生长活性、增殖活性和迁移活性药物中的应用。