CN107349417A

CN107349417A - 一种治疗食管鳞癌的ecm复合物以及其在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途

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Publication number: CN107349417A
Application number: CN201710213524.2A
Authority: CN
Inventors: 岳恺
Original assignee: Nanyang City Center Hospital
Current assignee: Nanyang City Center Hospital
Priority date: 2017-04-01
Filing date: 2017-04-01
Publication date: 2017-11-17

Abstract

本发明提供了一种治疗食管鳞癌的ECM复合物以及用途，属于抗癌药物制备技术领域。针对目前食管鳞癌治疗药物选择少、效果差、副作用大的技术问题，一种治疗食管鳞癌的ECM复合物，包括新生儿细胞产生的ECM、具有SEQ ID NO：1的多肽以及具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白。通过设计特殊的培养环境，培养产生胞外基质复合物。通过结构设计鸟苷酸环化酶受体激化剂，使得受体蛋白构象发生改变，得到有效的激活，从而增强生物活性。铜氧蛋白N端具有疏水的苯丙氨酸和酪氨酸，并且具有转导结构域，与细胞膜上的疏水集团相互作用。通过体内和体外实验证明，针对食管鳞癌治疗效果显著。

Description

一种治疗食管鳞癌的ECM复合物以及其在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途

技术领域

本发明属于癌症治疗技术领域，具体涉及一种治疗食管鳞癌的ECM复合物以及其在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途。

背景技术

食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。

食道癌的治疗方法有手术疗法、放射疗法、药物疗法等。

然而，放射疗法对病人带来难以估量的损害，病人的身体器官遭受放射性的危害，在罹患癌症的同时，还要承担放射带来的隐患和痛苦，会造成更多的安全隐患，例如包括乏力、头晕、胃纳减退、恶心、呕吐、口中无味或变味、失眠或嗜睡等。个别患者可以发生血象改变，尤其是白细胞减少现象。而手术切除让病人正常的身体机能同样遭受重创，给病人造成无边的痛苦，现如今化学药物治疗中采用的药物长时间在病人体内使用后，不仅能够产生副作用，而且，治疗癌症的效果也越来越差。开发一种生物相容性好，治疗针对性强，效果显著，副作用小，对患者危害小的治疗药物是如今针对食管鳞癌防治的重要课题。

现有技术中具有针对癌症的治疗药物，集中在中药成分、多肽小分子，铂类药物等。

公开号为CN101891802A的专利文献公开了一种多肽，不仅在单独使用时对癌细胞有着明显的杀伤力，而且可以和临床上常用的化疗药物 ( 如顺氯氨铂 ) 合用，显著地增加化疗药物对癌细胞的敏感性，增强其对癌细胞的杀伤力，降低它的使用剂量。本发明多肽能对肺癌，肝癌，胃癌，结肠癌，直肠癌，食管癌，乳腺癌，白血病等多种癌细胞起杀伤作用。本发明的多肽具有抗肿瘤作用；本发明的多肽与顺氯氨铂合用对癌CN 101891802 A说明书CN 101891803 A 3/11 页5细胞的作用显著强于 RasGAP317-326 肽(RasGAP317-326 肽的氨基酸残基序列为：WMWVTNLRTD) 与顺氯氨铂合用的效果。本发明涉及的多肽对正常细胞无明显的毒性增强作用，且本发明涉及的多肽可以采用化学合成的方法制备得到，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠。

以上文献通过化学方法合成的多肽FLKGDMFIVHNELEDG，SEQ ID NO.2 ：FLKGDMFIVHNELEDGWMWVT在设计中没有针对多肽和细胞之间的相互作用机理进行研究，序列设计没有坚实的理论基础，得到的对肿瘤细胞的作用具有偶然性，更重要的是，其对某种特定的细胞具有效果，对食管鳞癌的治疗效果非常有限。

公开号为CN 103432593 A的专利文献公开了一种用于预防或治疗食管癌的药物组合物，其含有 SLC22A3 基因和 / 或其编码的蛋白，SLC22A3 基因或其编码的蛋白具有抑制食管癌细胞的迁移或成瘤、预防或治疗食管癌的功能。其作为抑癌基因或抑癌蛋白在制备具有食管癌预防和治疗功能的药物组合物上极具临床应用价值，为食管癌的有效治疗提供了新的药物和方法。

然而，上述文献针对的是在癌变过程中的基因以及表达的蛋白对食管癌的治疗作用，不是人工提供的外源的治疗药物，满足不了临床或研究中对外源药物的需要。

本领域迫切需要开发针对食管癌的具有良好治疗效果、副作用小、特异性强的药物。

发明内容

为了解决现有技术中食管鳞癌的药物治疗效果不好，选择少，针对性不强的技术问题，本发明提出如下解决方案。

提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物，包括新生儿细胞产生的ECM、具有SEQ IDNO：1的多肽以及具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白。

进一步地，所述新生儿细胞产生的ECM从适当的培养基中二维或三维表面的培养细胞获得，包括可溶性成分和不溶性成分，所述可溶性成分包括分子量小于20000道尔顿的成分。

提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的试剂盒，包括试剂一、试剂二和试剂三，试剂一为新生儿细胞产生的ECM，试剂二为具有SEQ ID NO：1的多肽，试剂三为具有SEQ IDNO：2的铜氧蛋白。

进一步地，所述试剂盒进一步包括试剂四，为免疫消除剂。

提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的制备方法，包括如下步骤，

步骤一、使用原代人新生儿细胞产生低氧ECM；

步骤二、SEQ ID NO：1和具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白的多肽的合成；

步骤三、将制备的多肽加入所述ECM中，其中ECM、SEQ ID NO：1SEQ ID NO：2的铜氧蛋白的多肽的质量比为4-2:3-1:1，混合均匀，即得ECM复合物。

进一步地，包括步骤四、向步骤三中得到的复合物中加入适量的化疗剂和/或免疫消除剂；

步骤五、将步骤四得到的复合物加入适量的0.9%的生理盐水或5%的葡萄糖溶液中，混匀；

或将步骤四得到的复合物加入一定的缓释材料中制成缓释药物。

提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途，将制备的ECM复合物采用一定的方式和一定的剂量给患者施用。

所述将制备的ECM复合物采用一定的方式为其中所述ECM复合物通过和食管鳞癌细胞相接触来进行施用。

所述和食管鳞癌细胞相接触具体为将所述ECM复合物施用到手术切除后的切口。

所述将制备的ECM复合物采用一定的方式还可以为将一定量的经过紫外照射灭菌ECM复合物加入至适量的生理盐水或5%葡萄糖溶液中，注射或口服。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

在现有技术中，针对食管鳞癌的治疗方法集中于放疗或者化疗，而传统的放疗方式对患者造成放射性的危害，患者在治疗食管鳞癌的过程中可能罹患放射导致的其他危害，例如癌症等。

传统的化疗方式，如顺铂等，副作用大，例如免疫功能下降、骨髓抑制、消化障碍等，在治疗食管鳞癌的前沿技术中，迫切需要开发针对性强、效果显著、生物相容性好的抗癌药物。

本发明通过设计特殊的培养环境，在低氧和高二氧化碳的气体氛围中，采用新生儿细胞，培养产生胞外基质复合物，其中具有和成体细胞不同的表达因子，可溶性分子和不溶性分子具有特异性。

通过结构设计鸟苷酸环化酶受体激化剂，N端具有精氨酸序列，带正电基团和受体上的正电的基团相互排斥，而第五位的羧基基团和受体的正电基团相互结合，使得受体蛋白构象发生改变，得到有效的激活，从而增强生物活性，提高环化鸟苷酸的浓度，诱导目标细胞的凋亡，可以用于治疗细胞内环化鸟苷酸水平降低的癌症、癌症转移等疾病。同时，N端具有的两个精氨酸基团在生理条件下带有正电荷，可溶性强，容易溶解在成纤维细胞产生的ECM中，联合应用更加利于和细胞相互作用。

铜氧蛋白序列为：FYGLDKDYLKPDD。该铜氧蛋白N端具有疏水的苯丙氨酸和酪氨酸，并且具有转导结构域，与细胞膜上的疏水集团相互作用，能够通过包吞作用或者高尔基体介导的作用优先进入癌细胞或肿瘤细胞。

通过以上对胞外基质以及多肽结构的设计，不仅提高了药物的生物相容性，可以体外施用也可以体内施用，抑制食管鳞癌作用显著；由于结构的具体设计，还可以制成多种剂型，增强了施用的选择度。从而为治疗食管鳞癌提供了一种针对性强、效果显著的一种药物以及制备方法和具体应用。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步清楚阐述本发明的内容，但本发明的保护内容不仅仅局限于下面的实施例。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

实施例1

本实施例提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物

一种治疗食管鳞癌的ECM复合物，包括新生儿成纤维细胞产生的ECM、具有SEQ ID NO：1的多肽，具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白，所述成纤维细胞产生的ECM从适当的培养基中二维或三维表面的培养细胞获得，包括可溶性成分和不溶性成分，所述可溶性成分包括分子量小于20000道尔顿的成分。

所述ECM复合物进一步包括化疗剂；

所述化疗剂可以为顺铂；

所述ECM复合物还可以进一步包括免疫消除剂；

所述免疫消除剂可以为环磷酰胺。

新生儿成纤维细胞产生的ECM，为新生儿细胞产生的胞外基质复合物，在低氧压力、高二氧化碳压力下新生儿细胞的基因表达具有与成体细胞不同的特点，在本发明实验中发现，采用新生儿成纤维细胞进行培养，随着培养时间的延长，细胞外产生胞外基质，通过对胞外基质的提取，其中的可溶性因子和不溶性因子为特异性表达的产物，和成体细胞产生的胞外基质具有显著的差异，而本实验进一步研究得出，新生儿成纤维细胞产生的胞外基质对食管鳞癌细胞具有显著的抑制作用。

具有SEQ ID NO：1的多肽为：RRNDDCDLCVNVACTGCL。该序列为鸟苷酸环化酶受体激化剂，N端具有精氨酸序列，带正电基团和受体上的正电的基团相互排斥，而第五位的羧基基团和受体的正电基团相互结合，使得受体蛋白构象发生改变，得到有效的激活，从而增强生物活性，提高环化鸟苷酸的浓度，诱导目标细胞的凋亡，可以用于治疗细胞内环化鸟苷酸水平降低的癌症、癌症转移等疾病。同时，N端具有的两个精氨酸基团在生理条件下带有正电荷，可溶性强，容易溶解在成纤维细胞产生的ECM中，联合应用更加利于和细胞相互作用。

来自SEQ ID NO：2的铜氧蛋白序列为：FYGLDKDYLKPDD。该铜氧蛋白N端具有疏水的苯丙氨酸和酪氨酸，并且具有转导结构域，与细胞膜上的疏水集团相互作用，能够通过包吞作用或者高尔基体介导的作用优先进入癌细胞或肿瘤细胞。

治疗食管鳞癌的ECM复合物在使用时，新生儿成纤维细胞产生的ECM、具有SEQ IDNO：1的多肽，具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白按照质量为3:2:1的比例进行混合，并且可以加入适量的化疗剂如顺铂和/或免疫消除剂如环磷酰胺。

实施例2

本实施例提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的试剂盒

一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的试剂盒，包括试剂一、试剂二和试剂三，三种试剂独立包装，试剂一为新生儿成纤维细胞产生的ECM，试剂二为具有SEQ ID NO：1的多肽，试剂三为具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白。

所述试剂盒还可以进一步包括试剂四，为化疗剂；

所述化疗剂可以为烷化剂；

所述试剂盒还可以进一步包括试剂五，为免疫消除剂；

所述免疫消除剂可以为霉酚酸酯。

所述试剂盒还可以进一步包括试剂六，为0.9%的生理盐水。

所述试剂盒还可以进一步包括试剂七，为5%的葡萄糖溶液。

本试剂盒在使用时，分别打开包装，新生儿成纤维细胞产生的ECM、具有SEQ IDNO：1的多肽，具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白按照质量为4:3:1的比例进行混合，并且可以加入适量的化疗剂如烷化剂和/或免疫消除剂如霉酚酸酯，并且可以将得到的物质混匀于0.9%的生理盐水或5%的葡萄糖溶液中。

实施例3

本实施例提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的制备方法

步骤一、使用原代人新生儿成纤维细胞产生低氧ECM

原代人新生儿成纤维细胞在组织培养瓶中，在10％胎牛血清、 90％DMEM和5mM L-谷氨酰胺(10％FBS/DMEM)的存在下扩增。使用0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液亚培养细胞，在此时将细胞接种到丝素蛋白形成的支架上。所有培养物被保持在正常空气和 5％CO₂中用于扩增和接种，在此点将低氧培养物分开到充满90％氮气 /10％CO₂的密封室，以便在培养基中产生低氧环境。该系统在培养容器中保持约1-5％的氧。在湿润的37℃培养箱中静置过夜。培养物以10％FBS/DMEM持续2-4周，每2-3天更换培养基。同时细胞增殖并且随后开始沉积ECM。培养结束后，轻轻摇晃培养瓶，用吸管小心将培养液移除，加入新鲜的培养基，剧烈摇晃，吸取培养基入离心管中，3500r/min 离心10min，取上清，12000r/min离心20分钟，倒去上清液，取沉淀，加水冻干。

在早期胚胎环境，细胞产生的胞外基质，特别是在低氧、高二氧化碳的环境下，产生胎儿性质的胞外基质和独特的基因表达，显示出特异的性质。

其中的细胞培养可以为二维培养或者三维培养，三维培养可以选择合适的具有生物相容性的材料例如丝素蛋白、胶原蛋白或者壳聚糖，进一步地为了达到好的培养效果，可以为多孔物质或者经过修饰的材料。其中的孔可以为合适粒径的孔，使得细胞能够附着或者穿入，孔径不可过大也不可过小，过大则细胞不分散，和营养成分接触不良，过小则细胞不容易进入，不能进行附着，细胞不能生长增殖。

更重要的是，如果材料的孔径不适，与试验条件中要求的高含量的二氧化碳不能充分接触，不能激活特定的基因表达，最后不能得到能够治疗食管鳞癌的胞外基质复合物。

其中的生长基质还可以为水凝胶、可降解聚合物、纤维蛋白原等。

本细胞培养和普通的环境不同，在进行扩增之后，转移特定的环境中，为了制造低氧环境，到充满90％氮气 /10％CO₂的密封室，细胞在低氧压力下，可以激活特定的基因表达，其中的表达物质具有多种小分子和大分子，包括生长、分化以及增殖的调节物。

步骤二、SEQ ID NO：1和具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白的多肽的合成

采用 Fmoc 固相合成方法合成多肽。多肽在树脂上合成后经 TFA（分析纯）切除，后用冰乙醚（分析纯）沉淀，真空干燥后得粗品。采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析和纯化样品，加水冻干得到纯品。

步骤三、将制备的多肽加入ECM中，其中ECM、SEQ ID NO：1SEQ ID NO：2的铜氧蛋白的多肽的质量比为2:1:1，混合均匀，即得ECM复合物。

所述治疗食管鳞癌的ECM复合物的制备方法还可以进一步包括步骤四、向步骤三中得到的复合物中加入适量的化疗剂和/或免疫消除剂。

所述治疗食管鳞癌的ECM复合物的制备方法还可以进一步包括步骤五、将步骤四得到的复合物加入适量的0.9%的生理盐水或5%的葡萄糖溶液中，混匀。

所述治疗食管鳞癌的ECM复合物的制备方法还可以进一步包括步骤六、将步骤四得到的复合物加入一定的缓释材料中制成缓释药物。

所述缓释材料可以为生物学上已知的水凝胶或其他小分子或者高分子材料。

实施例4

本实施例提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途。

一种治疗食管鳞癌的ECM复合物在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途，将制备的ECM复合物采用一定的方式和一定的剂量给患者施用。

所述将制备的ECM复合物采用一定的方式为其中所述ECM复合物通过和食管鳞癌细胞相接触来进行施用。可以将所述ECM复合物施用到手术切除后的切口，使得药物直接和细胞进行接触。

其中将制备的ECM复合物采用一定的方式和一定的剂量给患者施用，可以取经过紫外照射灭菌24h的0.2039gECM复合物，悬浮于2mL无菌PBS缓冲液中，高速震荡混匀，在手术后留下的切口中，将制备的药剂加入其中。

还可以取经过紫外照射灭菌48h的0.3093gECM复合物，加入适量的临床允许的免疫消除剂，加入5mL无菌0.9%的生理盐水或5%的葡萄糖溶液中，混匀，将制备的药剂加入在手术后留下的切口中。

还可以取经过紫外照射灭菌48h的0.5000gECM复合物，加入适量的临床允许的化疗剂，加入4mL市场上已知的无菌自组装多肽体系中，形成水凝胶后，将制备的缓释材料加入在手术后留下的切口中。

一种治疗食管鳞癌的ECM复合物体内和体外抗食管鳞癌活性测定

体外抗食管鳞癌活性测定

人食管鳞癌细胞 KYSE450在含 10% FBS 的 DMEM 培养基，在 37℃于通入 5% 二氧化碳的培养箱中继代培养。

取对数生长期的肿瘤细胞，将细胞密度调至每毫升 2×10⁵个细胞，按每孔 200微升接种于 96 孔细胞培养板中，分为实验组、对照组和无细胞调零孔，于 37℃通入 5%CO₂的培养箱中培养 4 小时。

实验组分为四组，将实施例4中获得的PBS样品液进行稀释或者浓缩，得到药物浓度分别为1g/mL 、0.1g/mL、0.05g/mL,、0.03g/mL。

实验组按照上述分组每孔加入 2 微升上述获得的PBS样品液，对照组以及无细胞调零孔每孔加入2 微升空白PBS溶液，培养 24 小时后，每孔加 MTT 液（ MTT 的每毫升 5毫克生理盐水溶液） 10 微升，继续培养 4 小时，37℃、2000 转 / 分钟离心 8 分钟，吸去上清。每孔加入 DMSO 各 100 微升，在微量振荡器上振荡 15 分钟，至结晶完全溶解后，利用 MD 公司产SPECTRAMAX Plus 型酶标仪测定每孔在 570nm 处的吸光值（ OD）值。每组五个孔，按 IR (%) =(OD 空白对照 –OD 样品 )/OD 空白对照 × 100% 式计算每个浓度下细胞增殖抑制率 (IR%)，结果如表1。

表1

由表1可知，不同浓度的样品均表现出了明显的抑制活性，而且随着浓度的升高，抑制率显著增大，表明本发明制备的ECM复合物对人食管鳞癌具有显著的抑制效果，作用显著。

体内抗食管鳞癌活性测定

将人食管鳞癌细胞 KYSE450皮下注入裸鼠的下臀部，将裸鼠分为两组，每组五只，分别为实验组和空白组。同时，采用实施例4中的配制方式，实验组分别制备浓度为0.1 g/mL，0.02 g/mL，0.01 g/mL 5%的葡萄糖溶液的药物，对裸鼠进行灌胃服用，每天一次，每次2mL，对照组为服用5%的葡萄糖溶液。一个月后，将裸鼠处死，分离肿瘤，称量食管肿瘤的重量。实验结果见表2。

表2

由表2可以看出，空白组作为没有施用制备的药物的组，其中肿瘤自然生长，在注射细胞一个月后，肿瘤重量达到0.55mg，而施用制备药物组的肿瘤重量出现下降，随着施用剂量的加大，在0.1 g/mL的情况下，重量已经下降到0.15mg左右，显示出体内对食管鳞癌的抑制作用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

[0001] 本发明属于癌症治疗技术领域，具体涉及一种治疗食管鳞癌的ECM复合物以及其在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途。

[0002] 食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。

[0003] 食道癌的治疗方法有手术疗法、放射疗法、药物疗法等。

[0004] 然而，放射疗法对病人带来难以估量的损害，病人的身体器官遭受放射性的危害，在罹患癌症的同时，还要承担放射带来的隐患和痛苦，会造成更多的安全隐患，例如包括乏力、头晕、胃纳减退、恶心、呕吐、口中无味或变味、失眠或嗜睡等。个别患者可以发生血象改变，尤其是白细胞减少现象。而手术切除让病人正常的身体机能同样遭受重创，给病人造成无边的痛苦，现如今化学药物治疗中采用的药物长时间在病人体内使用后，不仅能够产生副作用，而且，治疗癌症的效果也越来越差。开发一种生物相容性好，治疗针对性强，效果显著，副作用小，对患者危害小的治疗药物是如今针对食管鳞癌防治的重要课题。

[0005] 现有技术中具有针对癌症的治疗药物，集中在中药成分、多肽小分子，铂类药物等。

[0006] 公开号为CN101891802A的专利文献公开了一种多肽，不仅在单独使用时对癌细胞有着明显的杀伤力，而且可以和临床上常用的化疗药物 ( 如顺氯氨铂 ) 合用，显著地增加化疗药物对癌细胞的敏感性，增强其对癌细胞的杀伤力，降低它的使用剂量。本发明多肽能对肺癌，肝癌，胃癌，结肠癌，直肠癌，食管癌，乳腺癌，白血病等多种癌细胞起杀伤作用。本发明的多肽具有抗肿瘤作用；本发明的多肽与顺氯氨铂合用对癌CN 101891802A 说明书CN 101891803 A 3/11 页5细胞的作用显著强于 RasGAP317-326 肽(RasGAP317-326 肽的氨基酸残基序列为：WMWVTNLRTD) 与顺氯氨铂合用的效果。本发明涉及的多肽对正常细胞无明显的毒性增强作用，且本发明涉及的多肽可以采用化学合成的方法制备得到，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠。

[0007] 以上文献通过化学方法合成的多肽FLKGDMFIVHNELEDG，SEQ ID NO.2 ：FLKGDMFIVHNELEDGWMWVT在设计中没有针对多肽和细胞之间的相互作用机理进行研究，序列设计没有坚实的理论基础，得到的对肿瘤细胞的作用具有偶然性，更重要的是，其对某种特定的细胞具有效果，对食管鳞癌的治疗效果非常有限。

[0008] 公开号为CN 103432593 A的专利文献公开了一种用于预防或治疗食管癌的药物组合物，其含有 SLC22A3 基因和 / 或其编码的蛋白，SLC22A3 基因或其编码的蛋白具有抑制食管癌细胞的迁移或成瘤、预防或治疗食管癌的功能。其作为抑癌基因或抑癌蛋白在制备具有食管癌预防和治疗功能的药物组合物上极具临床应用价值，为食管癌的有效治疗提供了新的药物和方法。

[0009] 然而，上述文献针对的是在癌变过程中的基因以及表达的蛋白对食管癌的治疗作用，不是人工提供的外源的治疗药物，满足不了临床或研究中对外源药物的需要。

[0010] 本领域迫切需要开发针对食管癌的具有良好治疗效果、副作用小、特异性强的药物。

[0011] 为了解决现有技术中食管鳞癌的药物治疗效果不好，选择少，针对性不强的技术问题，本发明提出如下解决方案。

[0012] 提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物，包括新生儿细胞产生的ECM、具有SEQ IDNO：1的多肽以及具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白。

[0013] 进一步地，所述新生儿细胞产生的ECM从适当的培养基中二维或三维表面的培养细胞获得，包括可溶性成分和不溶性成分，所述可溶性成分包括分子量小于20000道尔顿的成分。

[0014] 提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的试剂盒，包括试剂一、试剂二和试剂三，试剂一为新生儿细胞产生的ECM，试剂二为具有SEQ ID NO：1的多肽，试剂三为具有SEQ IDNO：2的铜氧蛋白。

[0015] 进一步地，所述试剂盒进一步包括试剂四，为免疫消除剂。

[0016] 提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的制备方法，包括如下步骤，

步骤一、使用原代人新生儿细胞产生低氧ECM；

[0017] 进一步地，包括步骤四、向步骤三中得到的复合物中加入适量的化疗剂和/或免疫消除剂；

[0018] 提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途，将制备的ECM复合物采用一定的方式和一定的剂量给患者施用。

[0019] 所述将制备的ECM复合物采用一定的方式为其中所述ECM复合物通过和食管鳞癌细胞相接触来进行施用。

[0020] 所述和食管鳞癌细胞相接触具体为将所述ECM复合物施用到手术切除后的切口。

[0021] 所述将制备的ECM复合物采用一定的方式还可以为将一定量的经过紫外照射灭菌ECM复合物加入至适量的生理盐水或5%葡萄糖溶液中，注射或口服。

[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

[0023] 传统的化疗方式，如顺铂等，副作用大，例如免疫功能下降、骨髓抑制、消化障碍等，在治疗食管鳞癌的前沿技术中，迫切需要开发针对性强、效果显著、生物相容性好的抗癌药物。

[0024] 本发明通过设计特殊的培养环境，在低氧和高二氧化碳的气体氛围中，采用新生儿细胞，培养产生胞外基质复合物，其中具有和成体细胞不同的表达因子，可溶性分子和不溶性分子具有特异性。

[0025] 通过结构设计鸟苷酸环化酶受体激化剂，N端具有精氨酸序列，带正电基团和受体上的正电的基团相互排斥，而第五位的羧基基团和受体的正电基团相互结合，使得受体蛋白构象发生改变，得到有效的激活，从而增强生物活性，提高环化鸟苷酸的浓度，诱导目标细胞的凋亡，可以用于治疗细胞内环化鸟苷酸水平降低的癌症、癌症转移等疾病。同时，N端具有的两个精氨酸基团在生理条件下带有正电荷，可溶性强，容易溶解在成纤维细胞产生的ECM中，联合应用更加利于和细胞相互作用。

[0026] 铜氧蛋白序列为：FYGLDKDYLKPDD。该铜氧蛋白N端具有疏水的苯丙氨酸和酪氨酸，并且具有转导结构域，与细胞膜上的疏水集团相互作用，能够通过包吞作用或者高尔基体介导的作用优先进入癌细胞或肿瘤细胞。

[0027] 通过以上对胞外基质以及多肽结构的设计，不仅提高了药物的生物相容性，可以体外施用也可以体内施用，抑制食管鳞癌作用显著；由于结构的具体设计，还可以制成多种剂型，增强了施用的选择度。从而为治疗食管鳞癌提供了一种针对性强、效果显著的一种药物以及制备方法和具体应用。

[0028] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步清楚阐述本发明的内容，但本发明的保护内容不仅仅局限于下面的实施例。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

[0029] 实施例1

本实施例提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物

[0030] 所述ECM复合物进一步包括化疗剂；

所述化疗剂可以为顺铂；

所述ECM复合物还可以进一步包括免疫消除剂；

所述免疫消除剂可以为环磷酰胺。

[0031] 新生儿成纤维细胞产生的ECM，为新生儿细胞产生的胞外基质复合物，在低氧压力、高二氧化碳压力下新生儿细胞的基因表达具有与成体细胞不同的特点，在本发明实验中发现，采用新生儿成纤维细胞进行培养，随着培养时间的延长，细胞外产生胞外基质，通过对胞外基质的提取，其中的可溶性因子和不溶性因子为特异性表达的产物，和成体细胞产生的胞外基质具有显著的差异，而本实验进一步研究得出，新生儿成纤维细胞产生的胞外基质对食管鳞癌细胞具有显著的抑制作用。

[0032] 具有SEQ ID NO：1的多肽为：RRNDDCDLCVNVACTGCL。该序列为鸟苷酸环化酶受体激化剂，N端具有精氨酸序列，带正电基团和受体上的正电的基团相互排斥，而第五位的羧基基团和受体的正电基团相互结合，使得受体蛋白构象发生改变，得到有效的激活，从而增强生物活性，提高环化鸟苷酸的浓度，诱导目标细胞的凋亡，可以用于治疗细胞内环化鸟苷酸水平降低的癌症、癌症转移等疾病。同时，N端具有的两个精氨酸基团在生理条件下带有正电荷，可溶性强，容易溶解在成纤维细胞产生的ECM中，联合应用更加利于和细胞相互作用。

[0033] 来自SEQ ID NO：2的铜氧蛋白序列为：FYGLDKDYLKPDD。该铜氧蛋白N端具有疏水的苯丙氨酸和酪氨酸，并且具有转导结构域，与细胞膜上的疏水集团相互作用，能够通过包吞作用或者高尔基体介导的作用优先进入癌细胞或肿瘤细胞。

[0034] 治疗食管鳞癌的ECM复合物在使用时，新生儿成纤维细胞产生的ECM、具有SEQID NO：1的多肽，具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白按照质量为3:2:1的比例进行混合，并且可以加入适量的化疗剂如顺铂和/或免疫消除剂如环磷酰胺。

[0035] 实施例2

本实施例提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的试剂盒

[0036] 所述试剂盒还可以进一步包括试剂四，为化疗剂；

所述化疗剂可以为烷化剂；

所述试剂盒还可以进一步包括试剂五，为免疫消除剂；

所述免疫消除剂可以为霉酚酸酯。

[0037] 所述试剂盒还可以进一步包括试剂六，为0.9%的生理盐水。

[0038] 所述试剂盒还可以进一步包括试剂七，为5%的葡萄糖溶液。

[0039] 本试剂盒在使用时，分别打开包装，新生儿成纤维细胞产生的ECM、具有SEQ IDNO：1的多肽，具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白按照质量为4:3:1的比例进行混合，并且可以加入适量的化疗剂如烷化剂和/或免疫消除剂如霉酚酸酯，并且可以将得到的物质混匀于0.9%的生理盐水或5%的葡萄糖溶液中。

[0040] 实施例3

本实施例提供一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的制备方法

步骤一、使用原代人新生儿成纤维细胞产生低氧ECM

[0041] 在早期胚胎环境，细胞产生的胞外基质，特别是在低氧、高二氧化碳的环境下，产生胎儿性质的胞外基质和独特的基因表达，显示出特异的性质。

[0042] 其中的细胞培养可以为二维培养或者三维培养，三维培养可以选择合适的具有生物相容性的材料例如丝素蛋白、胶原蛋白或者壳聚糖，进一步地为了达到好的培养效果，可以为多孔物质或者经过修饰的材料。其中的孔可以为合适粒径的孔，使得细胞能够附着或者穿入，孔径不可过大也不可过小，过大则细胞不分散，和营养成分接触不良，过小则细胞不容易进入，不能进行附着，细胞不能生长增殖。

[0043] 更重要的是，如果材料的孔径不适，与试验条件中要求的高含量的二氧化碳不能充分接触，不能激活特定的基因表达，最后不能得到能够治疗食管鳞癌的胞外基质复合物。

[0044] 其中的生长基质还可以为水凝胶、可降解聚合物、纤维蛋白原等。

[0045] 本细胞培养和普通的环境不同，在进行扩增之后，转移特定的环境中，为了制造低氧环境，到充满90％氮气 /10％CO₂的密封室，细胞在低氧压力下，可以激活特定的基因表达，其中的表达物质具有多种小分子和大分子，包括生长、分化以及增殖的调节物。

[0046] 步骤二、SEQ ID NO：1和具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白的多肽的合成

[0047] 步骤三、将制备的多肽加入ECM中，其中ECM、SEQ ID NO：1SEQ ID NO：2的铜氧蛋白的多肽的质量比为2:1:1，混合均匀，即得ECM复合物。

[0048] 所述治疗食管鳞癌的ECM复合物的制备方法还可以进一步包括步骤四、向步骤三中得到的复合物中加入适量的化疗剂和/或免疫消除剂。

[0049] 所述治疗食管鳞癌的ECM复合物的制备方法还可以进一步包括步骤五、将步骤四得到的复合物加入适量的0.9%的生理盐水或5%的葡萄糖溶液中，混匀。

[0050] 所述治疗食管鳞癌的ECM复合物的制备方法还可以进一步包括步骤六、将步骤四得到的复合物加入一定的缓释材料中制成缓释药物。

[0051] 所述缓释材料可以为生物学上已知的水凝胶或其他小分子或者高分子材料。

[0052] 实施例4

[0053] 一种治疗食管鳞癌的ECM复合物在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途，将制备的ECM复合物采用一定的方式和一定的剂量给患者施用。

[0054] 所述将制备的ECM复合物采用一定的方式为其中所述ECM复合物通过和食管鳞癌细胞相接触来进行施用。可以将所述ECM复合物施用到手术切除后的切口，使得药物直接和细胞进行接触。

[0055] 其中将制备的ECM复合物采用一定的方式和一定的剂量给患者施用，可以取经过紫外照射灭菌24h的0.2039gECM复合物，悬浮于2mL无菌PBS缓冲液中，高速震荡混匀，在手术后留下的切口中，将制备的药剂加入其中。

[0056] 还可以取经过紫外照射灭菌48h的0.3093gECM复合物，加入适量的临床允许的免疫消除剂，加入5mL无菌0.9%的生理盐水或5%的葡萄糖溶液中，混匀，将制备的药剂加入在手术后留下的切口中。

[0057] 还可以取经过紫外照射灭菌48h的0.5000gECM复合物，加入适量的临床允许的化疗剂，加入4mL市场上已知的无菌自组装多肽体系中，形成水凝胶后，将制备的缓释材料加入在手术后留下的切口中。

[0058] 一种治疗食管鳞癌的ECM复合物体内和体外抗食管鳞癌活性测定

体外抗食管鳞癌活性测定

[0059] 取对数生长期的肿瘤细胞，将细胞密度调至每毫升 2×10⁵个细胞，按每孔200 微升接种于 96 孔细胞培养板中，分为实验组、对照组和无细胞调零孔，于 37℃通入5% CO₂的培养箱中培养 4 小时。

[0060] 实验组分为四组，将实施例4中获得的PBS样品液进行稀释或者浓缩，得到药物浓度分别为1g/mL 、0.1g/mL、0.05g/mL,、0.03g/mL。

[0061] 实验组按照上述分组每孔加入 2 微升上述获得的PBS样品液，对照组以及无细胞调零孔每孔加入2 微升空白PBS溶液，培养 24 小时后，每孔加 MTT 液（ MTT 的每毫升 5 毫克生理盐水溶液） 10 微升，继续培养 4 小时，37℃、2000 转 / 分钟离心 8 分钟，吸去上清。每孔加入 DMSO 各 100 微升，在微量振荡器上振荡 15 分钟，至结晶完全溶解后，利用 MD 公司产SPECTRAMAX Plus 型酶标仪测定每孔在 570nm 处的吸光值（OD）值。每组五个孔，按 IR (%) =(OD 空白对照 –OD 样品 )/OD 空白对照 × 100% 式计算每个浓度下细胞增殖抑制率 (IR%)，结果如表1。

[0062] 表1

[0063] 体内抗食管鳞癌活性测定

[0064] 表2

[0065] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种治疗食管鳞癌的ECM复合物，其特征在于：包括新生儿细胞产生的ECM、具有SEQID NO：1的多肽以及具有SEQ ID NO：2的铜氧蛋白。

2.如权利要求1所述的一种治疗食管鳞癌的ECM复合物，其特征在于：所述新生儿细胞产生的ECM从适当的培养基中二维或三维表面的培养细胞获得，包括可溶性成分和不溶性成分，所述可溶性成分包括分子量小于20000道尔顿的成分。

3.一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的试剂盒，其特征在于：包括试剂一、试剂二和试剂三，试剂一为新生儿细胞产生的ECM，试剂二为具有SEQ ID NO：1的多肽，试剂三为具有SEQID NO：2的铜氧蛋白。

4.如权利要求3所述的一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒进一步包括试剂四，为免疫消除剂。

5.一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，

步骤一、使用原代人新生儿细胞产生低氧ECM；

步骤三、将制备的多肽加入所述ECM中，其中ECM、SEQ ID NO：1的多肽、SEQ ID NO：2的铜氧蛋白的多肽的质量比为4-2:3-1:1，混合均匀，即得ECM复合物。

6.如权利要求5所述的一种治疗食管鳞癌的ECM复合物的制备方法，其特征在于：

包括步骤四、向步骤三中得到的复合物中加入适量的化疗剂和/或免疫消除剂；

7.一种如权利要求1-6任一项所述的治疗食管鳞癌的ECM复合物在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途，其特征在于：将制备的ECM复合物采用一定的方式和一定的剂量给患者施用。

8.如权利要求7所述的治疗食管鳞癌的ECM复合物在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途，其特征在于：所述将制备的ECM复合物采用一定的方式为其中所述ECM复合物通过和食管鳞癌细胞相接触来进行施用。

9.如权利要求8所述的治疗食管鳞癌的ECM复合物在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途，其特征在于：所述和食管鳞癌细胞相接触具体为将所述ECM复合物施用到手术切除后的切口。

10.如权利要求7所述的治疗食管鳞癌的ECM复合物在制备治疗食管鳞癌的药物中的用途，其特征在于：所述将制备的ECM复合物采用一定的方式为将一定量的经过紫外照射灭菌ECM复合物加入至适量的生理盐水或5%葡萄糖溶液中，注射或口服。